本發(fā)明屬于生物技術領域，具體來說涉及一種單細胞基因表達定量分析的方法。

背景技術：

傳統(tǒng)的基因表達分析方法如qPCR、Microarray、RNA-seq等，通常以群體細胞為研究對象。這類分析的結果，忽視了群體細胞中的異質性。世界上沒有兩個完全一樣的細胞，而單個細胞是生命體基因組調控的根本單元。近幾年，單細胞水平的基因表達分析技術，成為了世界范圍的研究熱點。這項技術正對生命科學的研究和重大疾病的診斷，產生著革命性的影響，改變著基礎和臨床試驗的基本方式和思路。

然而，現(xiàn)有的單細胞分析技術，如單細胞RNA-seq等，需要復雜的技術流程，和昂貴的儀器設備。市場上常見的單細胞qPCR試劑，通常只能分析單個基因在單個細胞中的表達，細胞被分析后便不復存在。

技術實現(xiàn)要素：

為此，我們研發(fā)了一套簡單、實用、靈敏的高通量單細胞基因表達定量分析系統(tǒng)(SSA體系)。能夠一步擴增單細胞轉錄組中的多達500個特定基因位點。擴增后的產物可用任何熒光定量PCR系統(tǒng)，對已擴增的基因位點進行qPCR定量分析。

具體來說，本發(fā)明采用了以下技術方案：

一種單細胞基因表達定量分析的方法，其特征在于，所述方法包括：在反應容器中加入單細胞，裂解該單細胞，在反應容器中加入反應體系，執(zhí)行多位點RT，以該多位點RT獲得的cDNA為模板執(zhí)行多位點PCR擴增，最后以多位點PCR擴增獲得的序列為底物，加入特異性引物執(zhí)行特異性定量PCR來分析該單細胞中特定基因的表達量，其中在反應容器中加入的反應體系包括反應混合物、引物池、逆轉錄酶/聚合酶及無核酸酶去離子水，引物池中包含至多500對的多對引物，其中所述反應混合物包括緩沖體系、dNTP和特異性增強因子。

其中優(yōu)選地，執(zhí)行多位點RT與執(zhí)行多位點PCR所用的反應體系為向反應容器中加入的同一套反應體系，并且該兩個反應是在一個步驟中同時執(zhí)行。

反應中的關鍵組分反應混合物包括以下成分或者是由以下成分組成：50-100mM Tris-HCl pH8.5，10-50mM KCl，10-50mM(NH₄)₂SO₄，2-5mM MgCl₂，適量dNTP和特異性增強因子。優(yōu)選地，所述反應混合物中的緩沖體系包括：50-100mM Tris-HCl pH8.5，10-50mM KCl，10-50mM(NH₄)₂SO₄，2-5mM MgCl₂，濃度以終反應體積計。

反應混合物中包含的特異性增強因子是針對RT-PCR、pre-PCR檢測特別優(yōu)化的復合型PCR添加劑，有效提高了檢測的靈敏度和均一性。該特異性增強因子是由以下成分組成：0.2-0.4M海藻糖+0-0.2M甜菜堿+1％-3％甘油+0-20mM山梨醇+0-50mM精氨酸，濃度以終反應體積計。在更優(yōu)選的情況下，所述反應混合物中的特異性增強因子是由以下成分組成：1％-3％甘油+0.2-0.4M海藻糖+0-25mM精氨酸，濃度以終反應體積計。

進一步，反應體系中每一個引物的濃度為0.1μM，反應的過程為50℃60min、95℃3min，然后執(zhí)行20個循環(huán)，每個循環(huán)為95℃15sec、60℃15min。

在上述方法中，單細胞的裂解優(yōu)選是在加入反應體系后封口冷凍裂解，然后離心以釋放細胞內容物。

進一步，冷凍裂解條件為在反應容器中加入反應體系后加入單細胞，封口，置于-80℃下5分鐘，然后3000rpm離心2分鐘。

本發(fā)明巧妙地利用了SSA反應體系實現(xiàn)了單細胞的裂解和多達500個基因位點的一步法預擴增。在獲得充足擴增產物后，便可對多達500個基因進行單獨的qPCR定量分析。該方法能夠有效的獲取單個細胞中的大量基因表達及基因突變信息，實現(xiàn)普通RT-qPCR無法實現(xiàn)的高通量和高靈敏度。

采用本發(fā)明的方案具有如下優(yōu)點：

1、操作步驟簡單，重復性好；

2、靈敏度高；

3、分析通量高，最多可達500個基因；

4、分析成本低；

5、兼容各類下游分析系統(tǒng)，無昂貴平臺要求；

6、應用廣泛，適用于1-10000個細胞的樣品或10pg-100ng RNA的樣品。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的方案的技術原理圖；

圖2為本發(fā)明方案的技術路線圖；

圖3至6是優(yōu)化前后qPCR檢測的擴增曲線；

圖7是驗證實驗的熱圖結果；

圖8是小鼠胚胎干細胞和小鼠成纖維細胞的單細胞表達水平的檢測結果的熱圖。

具體實施方式

本發(fā)明的技術原理如圖1和2所示。參見圖1和圖2，本發(fā)明巧妙地利用了SSA反應體系實現(xiàn)了單細胞的裂解和多達500個基因位點的一步法預擴增。在獲得充足擴增產物后，便可對多達500個基因進行單獨的qPCR定量分析。該方法能夠有效的獲取單個細胞中的大量基因表達及基因突變信息，實現(xiàn)普通RT-qPCR無法實現(xiàn)的高通量和高靈敏度。

在一個示例性實施方案中，采用本發(fā)明的方案的具體實驗步驟如下：

1、0.1μM分析引物池準備

混合1μL所有準備分析的100μM的引物(至多混合500對，共1000個引物)后用不含核酸酶的水補齊至1mL(此時每個引物的終濃度為0.1μM)。

2、預擴增

1)配制RT-PreAmp Master Mix(SSA體系)

2)加樣、預擴增反應

取5μL RT-PreAmp Master Mix到8連管或96孔板的每一孔中。利用口吸管或流式分選儀向每孔中加入單細胞樣品，立即用8連管蓋或封口膜封口并置于-80℃5分鐘，取出后3000rpm離心2min，確保封口緊密后立即置于PCR儀上進行如下反應：

3、樣品稀釋

預擴增反應結束之后，每個樣品加入20μL無核酸酶水(1:5稀釋)，渦旋混勻，3000rpm離心2min。

4、qPCR分析(96孔qPCR儀)

混勻，3000rpm離心2min，立即進行如下反應：

(擴增產物也可用384孔板qPCR儀，或Fluidigm Biomark進行分析)

下面進一步結合具體實施例來對本發(fā)明的方案進行更詳細的說明。應了解，雖然以下給出了具體實施例，并且各實施例中對反應條件、各相關參數(shù)給出了具體的數(shù)值或參數(shù)，但是業(yè)內相關技術人員應該了解的是，所給出的數(shù)值和參數(shù)僅僅是作為用來對本發(fā)明具體說明的示例，而不應理解為對本發(fā)明的具體限制，因此不應對本發(fā)明的保護范圍造成限制，本發(fā)明的保護范圍只受權利要求書限定。

實施例1.多位點逆轉錄、預擴增條件優(yōu)化(2×反應混合物優(yōu)化)特異性增強因子篩選和組合

常見的RT、pre-PCR反應體系可以分步實現(xiàn)逆轉錄和預擴增過程，但是不能實現(xiàn)一步法從細胞到dsDNA的過程，更加不能保證反應的靈敏度與均一性。而本發(fā)明中的SSA體系不僅克服了傳統(tǒng)工藝的復雜步驟，實現(xiàn)了一步法反應即可得到目的ds DNA；而且在原有基礎上了提高了反應均一性，可以實現(xiàn)同時擴增1-10000個細胞或10pg-100ng RNA樣品的500個基因。

(1)檢測靈敏度的優(yōu)化

2×反應混合物包含：100-200mM Tris-HCl(pH8.5)，20-100mM KCl，20-100mM(NH₄)₂SO₄，0.4mM dNTP，4-10mM MgCl₂和特異性增強因子。根據(jù)文獻報道，海藻糖能夠提高酶的熱穩(wěn)定性，提高產量，同時促進高GC片段的擴增；甜菜堿能夠降低DNA的Tm值，提高PCR擴增效率和特異性；甘油能增加酶的熱穩(wěn)定性，提高產量，減少非特異性擴增。另外，有科學家發(fā)現(xiàn)山梨醇和精氨酸在維持蛋白結構穩(wěn)定性方面具有良好的作用，為了提高反應的靈敏度和均一性，本發(fā)明率先在PCR反應中測試山梨醇和精氨酸兩種物質，并且發(fā)現(xiàn)其可以顯著提高PCR的反應性。

海藻糖測試濃度范圍為：0-0.8M；甜菜堿的測試濃度范圍為：0-0.4M；甘油測試的濃度范圍為：0-6％；山梨醇測試的濃度范圍為：0-40mM；精氨酸測試的濃度范圍為：0-100mM。本發(fā)明對以上5種不同濃度梯度的添加劑進行正交，配制成324種2×反應混合物。

96對與小鼠早期胚胎發(fā)育相關的引物被用來制作0.1μM引物池：100μM的每個引物各取1μL混在一起，共192μL，后補808μL無核酸酶水至1mL(每個引物的終濃度為0.1μM)。

0.01pg/μl的小鼠雜交瘤細胞RNA被用作擴增模板。按以下體系配制RT-PreAmp Master Mix，并加入1μL RNA樣品。

將加好樣的8連管置于PCR儀上進行如下反應：

預擴增反應結束之后，每個樣品加入20μL無核酸酶水(1:5稀釋)，渦旋混勻，3000rpm離心2min，取5ul加入45ul DDW進一步稀釋(1:10稀釋)，渦旋混勻，3000rpm離心2min。

qPCR分析(384孔qPCR儀)

混勻，3000rpm離心2min，立即進行如下反應。

qPCR反應結束后分析比較324種2×反應混合物的Ct值和溶解曲線，獲得了4組靈敏度和特異性俱佳的組合，分別為：0-6％甘油+0.4-0.8M海藻糖+0-20mM山梨醇，2％-6％甘油+0.4-0.8M海藻糖+0-50mM精氨酸，0.2-0.8M海藻糖+0.2-0.4M甜菜堿+50-100mM精氨酸，0.4-0.8M海藻糖+20-40mM山梨醇+0-0.2M甜菜堿。

(2)檢測均一度的優(yōu)化

在保證檢測靈敏度的同時，本發(fā)明在檢測均一性上也有很好的表現(xiàn)，根據(jù)上述靈敏度優(yōu)化的結果，選擇靈敏度和特異性較好的4種2×反應混合物進行檢測均一度的比較和優(yōu)化。

96對與小鼠早期胚胎發(fā)育相關的引物被用來制作0.1μM引物池：100μM的每個引物各取1μL混在一起，共192μL，后補808μL無核酸酶水至1mL(每個引物的終濃度為0.1μM)。

100pg的小鼠胚胎成纖維細胞RNA被用來做1：10的逐級稀釋，最后稀釋到0.01pg RNA。每份稀釋的RNA取1μL并混合5μL RT-PreAmp Master Mix。

配制RT-PreAmp Master Mix

將加好樣的8連管置于PCR儀上進行如下反應：

預擴增反應結束之后，每個樣品加入20μL無核酸酶水(1:5稀釋)，渦旋混勻，3000rpm離心2min取5ul加入45ul DDW進一步稀釋(1:10稀釋)，渦旋混勻，3000rpm離心2min。

qPCR分析(96孔qPCR儀)

混勻，3000rpm離心2min，立即進行如下反應。

圖3-6所示為2％-6％甘油+0.4-0.8M海藻糖+0-50mM精氨酸的擴增曲線，具有較好的均一度，擴增效率在0.9-1.1之間。

實施例2.RNA稀釋實驗驗證SSA體系的靈敏性。

96對與小鼠早期胚胎發(fā)育相關的引物被用來制作0.1μM引物池：100μM的每個引物各取1μL混在一起，共192μL，后補808μL無核酸酶水至1mL(每個引物的終濃度為0.1μM)。

8ng/μl的小鼠胚胎成纖維細胞RNA被用來做1：4的逐級稀釋，最后稀釋到0.03pgRNA。每份稀釋的RNA取1μL并混合9μL RT-PreAmp Master Mix(SSA體系)。

配制RT-PreAmp Master Mix(SSA體系)

將加好樣的8連管置于PCR儀上進行如下反應：

預擴增反應結束之后，每個樣品加入40μL無核酸酶水(1:5稀釋)，渦旋混勻，3000rpm離心2min。

qPCR分析(96孔qPCR儀)

混勻，3000rpm離心2min，立即進行如下反應。

實驗結果參見如圖7所示的熱圖，該熱圖示出了Log2基因表達量(背景Ct＝35減去特定基因的檢測Ct值)。

這一結果表明：本發(fā)明的SSA基因表達定量分析系統(tǒng)有極高的靈敏性，能夠檢測到少于1pg的RNA樣品，而且具有較好的動態(tài)量程。

實施例3.利用SSA體系檢測小鼠胚胎干細胞和小鼠成纖維細胞的單細胞表達水平。

1、準備引物池

96對與小鼠早期胚胎發(fā)育相關的引物被用來制作0.1μM引物池：100μM的每個引物各取1μL混在一起，共192μL，后補808μL無核酸酶水至1mL(每個引物的終濃度為0.1μM)。

2、預擴增

1)配制RT-PreAmp Master Mix(SSA體系)

2)加樣、預擴增反應

取5μL RT-PreAmp Master Mix到8連管的每一孔中。利用口吸管加入小鼠胚胎干細胞或小鼠胚胎成纖維細胞的單細胞樣品，立即封口并置于-80℃2分鐘，取出后離心1min，并立即置于PCR儀上進行如下反應：

3、樣品稀釋

預擴增反應結束之后，每個樣品加入20μL無核酸酶水(1:5稀釋)，渦旋混勻，3000rpm離心2min。

4、qPCR分析(96孔qPCR儀)

混勻，3000rpm離心2min，立即進行如下反應：

實驗結果參見圖8所示的熱圖，該熱圖示出了Log2基因表達量(背景Ct＝35減去特定基因的檢測Ct值)，及小鼠胚胎干細胞和小鼠胚胎成纖維細胞的單細胞表達譜分析。

以上結果表明，本發(fā)明的SSA單細胞基因表達定量分析系統(tǒng)，不僅能夠從單細胞水平上區(qū)分小鼠的胚胎干細胞和小鼠的成纖維細胞，還能夠發(fā)現(xiàn)這兩類細胞中的異質性，如Nanog在胚胎干細胞中的異質性表達。

上面結合附圖和具體實例對本發(fā)明的實施方式作了詳細的說明，但是本發(fā)明不限于上述實施方式，在所屬技術領域普通技術人員所具備的知識范圍內，還可以在不脫離本發(fā)明宗旨的前提下做出各種變化。