技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及過(guò)敏原檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速檢測(cè)室塵中粉塵螨變應(yīng)原第1組分含量的熒光實(shí)時(shí)定量PCR的方法。

背景技術(shù)：

目前，我國(guó)室內(nèi)環(huán)境塵螨過(guò)敏原含量檢測(cè)普及度不高,臨床上主要是對(duì)就診患者通過(guò)皮試等體內(nèi)方法或檢測(cè)患者血清中特異性IgE抗體等體外方法對(duì)其進(jìn)行診斷,或是利用紅外線掃描檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)患者進(jìn)行與病史相關(guān)的過(guò)敏原檢測(cè)。但這些手段都只能起到診斷作用,并不能起到一個(gè)預(yù)防作用。上個(gè)世紀(jì)80年代以來(lái),國(guó)內(nèi)外學(xué)者先后建立了放射性過(guò)敏原吸附試驗(yàn) (Radioallergosorbent Test,RAST)抑制試驗(yàn)、放射免疫測(cè)定(Radioimmunoassay,RIA)、ELISA雙抗體夾心法用于定量測(cè)定室塵中的塵螨過(guò)敏原含量。RAST抑制試驗(yàn)測(cè)定空氣中塵螨過(guò)敏原的含量,但RAST抑制試驗(yàn)是對(duì)塵螨過(guò)敏原總活性的檢測(cè),不能分別檢測(cè)塵螨中各種過(guò)敏原組分的濃度,并且它的費(fèi)用較昂貴和存在環(huán)境污染。放射免疫測(cè)定(RIA)法測(cè)定粉塵螨(Dermatophagoides farina, Der f)和屋塵螨(Dermatophagoides pteronyssinus, Der p)I組過(guò)敏原的共有 抗原(抗原P1)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)塵螨進(jìn)行分型，克服了RAST法不能檢測(cè)塵螨的不同組別的過(guò)敏原含量的缺陷,但由于它也同樣存在放射性同位素有半衰期及污染環(huán)境等缺點(diǎn)。ELISA的雙抗體夾心法應(yīng)用廣泛，但其費(fèi)用昂貴,檢測(cè)速度慢，多用于科學(xué)研究，并不適用于流行病學(xué)調(diào)查中大量普及檢測(cè)室塵中的塵螨過(guò)敏原含量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測(cè)室塵中粉塵螨變應(yīng)原第1組分含量的熒光實(shí)時(shí)定量PCR的方法，該方法檢測(cè)速度快、價(jià)格低、環(huán)保無(wú)污染。

為解決現(xiàn)有技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的采取的技術(shù)方案為：

一種快速檢測(cè)室塵中粉塵螨變應(yīng)原第1組分含量的熒光實(shí)時(shí)定量PCR的方法，利用Der f 1（粉塵螨變應(yīng)原第1組分）重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，設(shè)計(jì)Der f 1的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物、TaqMan探針，采用實(shí)時(shí)熒光TaqMan探針定量PCR方法，通過(guò)構(gòu)建了Der f 1實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)現(xiàn)對(duì)室內(nèi)灰塵中塵螨過(guò)敏原Der f 1含量的快速定量檢測(cè)。

作為優(yōu)選的是，實(shí)時(shí)熒光TaqMan探針定量PCR方法的參數(shù)為： 95℃預(yù)變性1min; 95℃ 變性15s; 60 ℃退火和延伸1min,循環(huán)數(shù)40。

作為優(yōu)選的是，Der f 1實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R²=0.98，擴(kuò)增效率E=1.216, 標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-2.893，截距為32.677，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y=-2.893x+32.677。

有益效果

本發(fā)明方法適用方便，快捷，定量監(jiān)測(cè)環(huán)境中塵螨過(guò)敏原含量，結(jié)果準(zhǔn)確，可引導(dǎo)人群主動(dòng)回避過(guò)敏原，從而預(yù)防塵螨過(guò)敏性疾病的發(fā)生有極強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。本發(fā)明方法的提出，為實(shí)現(xiàn)具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的塵螨過(guò)敏原定量檢測(cè)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化、商品化提供了科學(xué)依據(jù)。

附圖說(shuō)明

圖1為Der f 1的實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖2為本發(fā)明方法和ELISA測(cè)定Der f 1的結(jié)果對(duì)比圖。

具體實(shí)施步驟

實(shí)施例1 Der f 1質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備

根據(jù)GenBank AB034946公布的粉塵螨變應(yīng)原第1組分Der f 1核酸序列設(shè)計(jì)引物，并在加入BamH I/Xho I酶切位點(diǎn)，合成引物上游引物F：5′-GGATCCATGAAATTCGTTTTGGCCATTG-3′(SEQ ID NO:1)，下游引物R0：5′-TC GCAAGAGTAGTTGTTTTTAT-3′(SEQ ID NO:2)，下游引物R：5′-CTCGAGTCACATGATT ACAACATATGGATATT-3′(SEQ ID NO:3)。解剖鏡下挑取粉塵螨約600只，勻漿后用RNAiso Reagent試劑盒提取Total RNA；以Total RNA為模板，用RT-PCR合成cDNA；回收上述PCR產(chǎn)物，加“A”尾、DNA精制后，將目的基因片段與pMD19-T 載體連接后，用 BamH I和Xho I雙酶切鑒定pMD19-T-Der f 1重組子，序列測(cè)定驗(yàn)證獲得的目的基因。用TaKaRa DNA Ligation Kit將目的基因片段和pET28a(+)連接后，轉(zhuǎn)入工程菌 BL21 (DE3)，添加IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE和Western blotting鑒定重組蛋白后，采用親和柱層析法純化獲得重組蛋白。隨后進(jìn)行Der f 1編碼基因合成及PCR擴(kuò)增，取5 ml PCR產(chǎn)物上樣電泳，觀察目的條帶?；厥丈鲜鯬CR產(chǎn)物，加“A”尾、DNA精制后，將目的基因片段與pMD19-T simple連接后，取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliJM109，涂布于含氨芐青霉素(100 mg/ml)的LB平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。從含氨芐青霉素的LB平板上隨機(jī)挑取16個(gè)白色菌落，利用載體上的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后行瓊脂糖凝膠電泳，含有目的條帶的菌落為陽(yáng)性克隆菌。取陽(yáng)性克隆菌置于含氨芐青霉素的TB培養(yǎng)液中，37℃振搖培養(yǎng)過(guò)夜。取重組陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒DNA，用 BamH I和XhoI雙酶切鑒定pMD19T-Der f 1重組子。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切片段的大小。以重組質(zhì)粒DNA為模板，序列測(cè)定，將測(cè)序正確并可以正確表達(dá)的重組質(zhì)粒稀釋作為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品備用。

實(shí)施例2 Der f 1的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物、TaqMan探針設(shè)計(jì)：

使用Primer Express 2.0 軟件和遵循TaqMan探針設(shè)計(jì)原則，根據(jù)GenBank(AB034946)序列設(shè)計(jì)Der f 1熒光定量PCR引物及 TaqMan 探針。見(jiàn)表1。

表 1 Der f 1引物及探針序列。

實(shí)施例3 Der f 1的實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

將測(cè)序鑒定為Der f 1重組陽(yáng)性質(zhì)粒的質(zhì)粒樣品在DNA/RNA定量?jī)x上測(cè)定樣品質(zhì)粒濃度，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的計(jì)算公式計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù)。將Der f 1重組陽(yáng)性質(zhì)粒做10倍遞增稀釋?zhuān)謩e以5.0×10⁸-5.0×10¹ copies/μL8個(gè)梯度為模板，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上按照反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行反應(yīng)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并記錄標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)R²、擴(kuò)增效率E、斜率K，進(jìn)而建立回歸方程。質(zhì)?？截悢?shù)（copies/μL）=（重組質(zhì)粒濃度ng/μL×10^-9） ×6.02×10²³／（660×重組質(zhì)粒堿基數(shù)）。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)程序: 按照一定的順序，往0.1ml PCR管，依次加入如下組份：10μL 2X Realtime PCR Master Mix 、1μL稀釋Der f 1質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品、2μL引物探針MIX( F/ R/ P各10μM)、7μL 0.1% DEPC水，總體系20μL。采用如下程序?qū)嵤?shí)時(shí)熒光定量PCR程序, 95℃預(yù)變性1min; 95℃ 變性15s; 60 ℃退火和延伸1min,循環(huán)數(shù)40。

應(yīng)用熒光定量PCR儀根據(jù)已知拷貝的模板繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示，獲得相關(guān)系數(shù)R²=0.98，擴(kuò)增效率E=1.216, 標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率（Slope）為-2.893，截距為32.677。Der f 1實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y=-2.893x+32.677。

實(shí)施例4 Der f 1的實(shí)時(shí)熒光定量PCR重復(fù)性及可靠性

Der f 1質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品做10倍倍比稀釋, 每個(gè)樣品重復(fù)3個(gè)批次(組間重復(fù)),每個(gè)批次重復(fù)3個(gè)復(fù)孔(組內(nèi)重復(fù))，Der f 2重組質(zhì)粒濃度為5.0×108copies/μL及無(wú)菌水分別進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè),分別獲得各自的ct值的平均數(shù)和變異系數(shù)，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的重復(fù)性和可靠性進(jìn)行評(píng)價(jià)。Der f 1標(biāo)準(zhǔn)曲線的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，同一模板不同稀釋度組內(nèi)重復(fù)測(cè)定時(shí)其CV值在0.92%-1.76%之間，組間重復(fù)測(cè)定時(shí)其CV值在0.73%-1.88%之間，均低于2%，表明Der f 1的實(shí)時(shí)熒光定量PCR重復(fù)性好。以Der f 2的陽(yáng)性質(zhì)粒和無(wú)菌水做為對(duì)照，均未擴(kuò)增出曲線，表明方法結(jié)果可靠性高。

表 2 Der f 1實(shí)時(shí)熒光定量PCR重復(fù)性及可靠性試驗(yàn)結(jié)果。

實(shí)施例5 室塵樣品中Der f 1的實(shí)時(shí)熒光定量PCR與ELISA相關(guān)性結(jié)果

室塵提取液中 Der f 1的濃度用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定,具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行(Der f 1 ELISA kit (6A8/4C1, EL-DF1, Indoor公司)。對(duì)采集室塵樣品應(yīng)用Der f 1的實(shí)時(shí)熒光定量PCR與ELISA試劑盒分別檢測(cè)，圖2顯示，兩種方法檢測(cè)結(jié)果相關(guān)系數(shù)R=0.94, P<0.05，可見(jiàn)兩種方法線性關(guān)系良好。

從上述結(jié)果可以看出，本發(fā)明方法檢測(cè)效果好，結(jié)果準(zhǔn)確，具有良好的市場(chǎng)前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院

<120> 一種快速檢測(cè)室塵中粉塵螨變應(yīng)原第1組分含量的熒光實(shí)時(shí)定量PCR的方法

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

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<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggatccatga aattcgtttt ggccattg 28

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<211> 22

<212> DNA

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