專利名稱：蜂膠抗粉塵螨過敏活性物質(zhì)的分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蜂膠的深度利用，更具體地說，本發(fā)明涉及蜂膠活性物質(zhì)的提取方法以及蜂膠活性物質(zhì)在抑制粉塵螨過敏原中的應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蜂膠英文Propolis來源于古代希臘語(yǔ)，是由"pro"(在前方)和“l(fā)is”(城堡)組成，含義是蜂膠有縮小蜂巢入口的作用(Castaldo and Capasso 2002)。蜂膠一般是由工蜂采集植物的嫩芽、嫩枝，再混以樹膠、花粉、蜂蜜等物質(zhì)送至蜂巢，經(jīng)由內(nèi)勤蜂的舌腺、蠟腺等腺體加工轉(zhuǎn)化而形成的不透明膠體狀物質(zhì)，多呈棕褐色、灰褐色、黃褐色、灰綠色、暗綠色，極少數(shù)呈深黑色(Rakl996)。由于蜂巢內(nèi)部空間狹小、潮濕的特性使其有利于微生物的生存，內(nèi)勤蜂便將蜂膠涂抹于蜂巢縫隙或其他需要的地方，以阻止外部細(xì)菌的進(jìn)入、風(fēng)干入侵者尸體，保證蜂巢內(nèi)部環(huán)境的整潔，有利于蜂王漿、花粉等蜂產(chǎn)品的保存。
·
蜂膠作為一種匯集了動(dòng)植物的多種產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物而存在的天然物質(zhì)，成分極為復(fù)雜(見下表1-1)?，F(xiàn)階段已經(jīng)分離鑒定出的蜂膠成分達(dá)三百多種，其中黃酮類物質(zhì)71種，氨基酸25種，芳香族酸、酯類59種，以及多種酯、醛、醇類化合物，還有多種維生素和鐵、鋅、鎘等微量元素?；瘜W(xué)成分的多樣性賦予了蜂膠豐富的生物學(xué)活性，目前蜂膠已經(jīng)被證實(shí)的生物學(xué)活性主要有抗腫瘤、抗氧化、抗菌消炎、護(hù)肝等生物學(xué)活性，還有資料顯示蜂膠制劑對(duì)呼吸道疾病、皮膚疾病、心血管疾病等方面的疾病有顯著療效。蜂膠資源稀少，一個(gè)五六萬(wàn)只得蜂群蜂膠的年產(chǎn)量?jī)H為100多克，因此國(guó)外市場(chǎng)稱蜂膠為“紫色黃金”。據(jù)調(diào)查I支濃度為25%、凈含量為30g的蜂膠口服液在美國(guó)市場(chǎng)上的零售價(jià)為30美元左右，I支普通的蜂膠口服液(15ml，20g)的售價(jià)也在20美元以上，尤其是巴西蜂膠在世界上享譽(yù)盛名，其相關(guān)商品售價(jià)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他產(chǎn)地蜂膠產(chǎn)品，也已經(jīng)分離出多種具有生物活性的化學(xué)成分。表1-1蜂膠的主要成分列表
'主要成分
Mmn iiigredienfcontent
M Hli50%=5%Situ30%=5%
揮發(fā)油10%
花粉5%
K Wi 物 ftfi5%中國(guó)蜂膠研發(fā)起步較晚，早期主要以原材料的形式出口，加工利用率和附加值均較低。但是中國(guó)蜂膠相對(duì)于外國(guó)蜂膠而言具有儲(chǔ)量大、分布范圍廣等資源優(yōu)勢(shì)。自2005年起蜂膠被列入《藥典》后，蜂膠被廣泛應(yīng)用于在醫(yī)療衛(wèi)生、食品貯藏加工、日用品加工和中醫(yī)藥等方方面面。加大中國(guó)蜂膠的活性成分研究，開發(fā)具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的蜂膠產(chǎn)品將會(huì)為中國(guó)蜂膠的產(chǎn)業(yè)化和標(biāo)準(zhǔn)化提供更好的理論依據(jù)。隨著現(xiàn)代分析技術(shù)的發(fā)展，關(guān)于蜂膠活性成分的提取、分離與鑒定成為研究的熱點(diǎn)。從九十年代至今國(guó)內(nèi)外對(duì)中國(guó)蜂膠樣品的研究報(bào)道萬(wàn)余篇，現(xiàn)階段也已經(jīng)明確中國(guó)蜂膠化學(xué)組分和生物學(xué)活性具有豐富的多樣性。但是，如上所述，蜂膠的成分復(fù)雜，要從中提取出有活性的物質(zhì)非常困難，本發(fā)明人長(zhǎng)期致力于蜂膠的深度開發(fā)利用，并在長(zhǎng)期研究的基礎(chǔ)上建立了一套的從蜂膠中提取活性物質(zhì)的方法體系。而且，在建立優(yōu)化該方法體系的過程中，意外地發(fā)現(xiàn)所提取得到的物質(zhì)能夠有效地抑制粉塵螨過敏原的活性。眾所周知，粉塵螨是一類主要存在于室內(nèi)塵土中的 螨類，在世界范圍內(nèi)有60余種，僅中國(guó)就有34種。世界范圍內(nèi)統(tǒng)計(jì)結(jié)果證明居室內(nèi)最優(yōu)勢(shì)的粉塵螨類是Dermatophagoides farinae品系。由于粉塵螨普遍存在于人類居住環(huán)境的灰塵中，可引起人體許多過敏反應(yīng)如過敏性哮喘、過敏性鼻炎、過敏性皮膚疾患等。因此,粉塵螨越來越得到人們的重視。
toon] 粉塵螨過敏原的組成非常復(fù)雜，種類繁多。目前國(guó)際免疫聯(lián)合會(huì)(mis)已經(jīng)把粉塵螨過敏原進(jìn)行了歸納和分類，共有14種之多。粉塵螨屬于吸入性過敏原中最重要的一種，當(dāng)灰塵被揚(yáng)起時(shí)粉塵螨的蟲體、尸體、糞便、卵及脫落下的皮殼等過敏原，隨之進(jìn)入人的呼吸系統(tǒng)，進(jìn)而引發(fā)呼吸系統(tǒng)的過敏性疾病。從粉塵螨過敏原的免疫學(xué)參數(shù)比較可知，90%以上的粉塵螨過敏患者的IgE檢測(cè)屬于25kDa和14kDa兩組過敏原，國(guó)際上將這兩組最重要的過敏原組分分別命名為Der I和Der II過敏原。針對(duì)主要過敏原進(jìn)行篩選確定和研究不僅有助于粉塵螨引發(fā)的過敏性疾病的臨床診斷、提高免疫學(xué)治療的安全性，而且有助于闡述粉塵螨的發(fā)病機(jī)理。粉塵螨引發(fā)的過敏性疾病引發(fā)的過敏性疾病包括支氣管哮喘、過敏性鼻炎、過敏性皮膚疾病等疾病。隨著人們生活水平的提高、生活方式的變化和環(huán)境污染，過敏性疾病的發(fā)病率普遍上升。研究發(fā)現(xiàn)通過減少環(huán)境中的粉塵螨數(shù)量，能有效降低兒童和青少年患過敏性疾病的危險(xiǎn)，提高免疫治療的效果。由此為降低過敏反應(yīng)的發(fā)生，就要對(duì)粉塵螨相關(guān)的指標(biāo)進(jìn)行嚴(yán)格干預(yù)，如粉塵螨的活體數(shù)量、粉塵螨過敏原數(shù)量等。減少粉塵螨的數(shù)量可以通過物理方法和化學(xué)方法來實(shí)現(xiàn)常見的物理方法比如降低房間的相對(duì)濕度、使用防塵布、更換地毯、家具和及時(shí)清潔床上用品等，但是這些方法較為繁瑣也難于控制；早在1976年Wharton就總結(jié)了 30種化學(xué)試劑對(duì)塵螨的室內(nèi)活性測(cè)定，僅1%林丹(lindane)的殺螨活性較好。由于林丹毒性較高不容易降解，并沒有被應(yīng)用為室內(nèi)殺螨劑商品化使用。當(dāng)前市場(chǎng)上常用的殺螨劑仍主要集中于農(nóng)用方向的開發(fā)，如擬除蟲菊酯類(Pyrethroids)、l%蟲螨磷(pirimiphos methyl)等多數(shù)為薰蒸毒劑,不能在室內(nèi)長(zhǎng)期使用；而且多數(shù)化學(xué)殺螨劑僅僅能夠減少活體的數(shù)量，而不能有效的降低粉塵螨排泄物、殘?bào)w等過敏原的數(shù)量，仍然會(huì)引起過敏性疾病的發(fā)生。所以化學(xué)方法控制粉塵螨數(shù)量在商品化應(yīng)用中至今還存在很大的空白。常規(guī)物理化學(xué)方法的局限性以及現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，為治療粉塵螨引起的過敏反應(yīng)提出了新的思路有效的規(guī)避和減少粉塵螨過敏原在環(huán)境中的數(shù)量，才是針對(duì)致敏源頭進(jìn)行控制的有效措施。
目前急需能夠有效抑制灰塵螨過敏原、低毒、綠色環(huán)保的抑螨/殺螨劑。本發(fā)明人為了解決這個(gè)問題。本發(fā)明不僅為蜂膠的深度開發(fā)提供了高效的方法體系，而且還提供了蜂膠抗粉塵螨過敏活性物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
蜂膠雖然含有很多不同的活性物質(zhì)，但是由于蜂膠的成分復(fù)雜，特別是由于其含有大量的樹脂、蜂蠟和花粉，因此從蜂膠中提取或分離出活性物質(zhì)一直是一個(gè)非常棘手的技術(shù)難題。另一方面，蜂膠由于產(chǎn)量低，原料價(jià)格高，因此非常希望鑒定出蜂膠中的活性物質(zhì)以期能夠利用任何合成的方式合成出同樣的活性物質(zhì)，從而減少對(duì)蜂膠原料的依賴。根據(jù)本發(fā)明，提供了一種蜂膠抗粉塵螨過敏活性物質(zhì)的分離方法，其中，所述方法包括如下步驟1)使用乙醇溶劑對(duì)蜂膠進(jìn)行浸提；和2)進(jìn)行固液分離然后去除液相中的乙醇，獲得作為蜂膠抗粉塵螨過敏活性物質(zhì)的浸提膏。其中，所述乙醇溶劑為乙醇水溶液，濃度為35體積％至95體積％。
·
其中，所述濃度為55體積至95體積％。其中，所述濃度為75%。其中，在浸提時(shí)液料比為1:3至1:20，所述液料比為蜂膠克數(shù)與乙醇溶劑毫升數(shù)的比例。其中，所述液料比為1:5至1:15。其中，所述液料比為1:5。其中，浸提是在4°C至50°C進(jìn)行。其中，浸提是在25 °C至45 °C進(jìn)行。其中，所述方法進(jìn)一步包括利用層析法對(duì)所述浸提膏分離的初次分離步驟，以得到作為蜂膠抗粉塵螨過敏活性物質(zhì)的初次分離物。其中，所述層析法使用薄層層析法進(jìn)行。其中，所述層析法使用的樣品為所述浸提膏在三氯甲烷中的分散體。 其中，所述層析法使用的洗脫劑為三氯甲烷與甲醇的混合洗脫劑。其中，所述三氯甲烷和甲醇的體積比為99:1至5:5。其中，所述三氯甲烷和甲醇的體積比為99:1至95:5。其中，所述三氯甲烷和甲醇的體積比為99:1。其中，所述方法進(jìn)一步包括利用薄層層析法對(duì)所述初次分離物進(jìn)行分離的二次分離步驟，以得到作為蜂膠抗粉塵螨過敏活性物質(zhì)的二次分離物。其中，所述薄層層析法為基于玻璃的薄層層析法。其中，所述二次分離物包含作為蜂膠抗粉塵螨過敏活性物質(zhì)的山奈酚和/或白楊素。本發(fā)明還提供了由以上技術(shù)方案的方法分離得到的蜂膠抗粉塵螨過敏活性物質(zhì)。本發(fā)明還提供了由上述技術(shù)方案所述的蜂膠抗粉塵螨過敏活性物質(zhì)在制備用于治療由粉塵螨過敏原引起的疾病的藥物中的用途。本發(fā)明方法能夠從蜂膠中有效地提取活性物質(zhì)，并且提供了蜂膠抗粉塵螨過敏活性物質(zhì)，因此不僅能夠?yàn)榉淠z的深度開發(fā)利用提供了高效的方法體系，而且粉塵螨過敏原引起的各種疾病提供了新的預(yù)防和治療途徑。


圖I是不同蜂膠樣品處理后粉塵螨SDS凝膠電泳圖。M為分子標(biāo)記(Marker,Bio-Rad All Blue:Catalog#161-0373);C為空白對(duì)照粉塵螨浸提液蛋白質(zhì)條帶；1 13為經(jīng)YP-I YP-13處理的粉塵螨浸提液蛋白質(zhì)條帶。圖2是YP-7初次分離產(chǎn)物薄層層析色譜圖。展開劑為三氯甲烷甲醇=9:1。圖3是YP-7初次分離產(chǎn)物處理后粉塵螨SDS凝膠電泳圖。注M為MarkeKBio-RadAll Blue:Catalog#161-0373);C為空白對(duì)照粉塵螨浸提液蛋白質(zhì)條帶；C1 C8為經(jīng)Cl CS處理的粉塵螨浸提液蛋白質(zhì)條帶。圖4是YP-7-C2第二次分離產(chǎn)物色譜圖。對(duì)C21、C22、C23進(jìn)行粉塵螨過敏原抑制活性分析。C21和C22組分的抑制活性均較好，可以進(jìn)行深入的分析，確定其化學(xué)組成?！D5是YP-7-C2 二次分離產(chǎn)物處理后粉塵螨SDS凝膠電泳圖，M為分子標(biāo)記(Marker, Bio-Rad All Blue:Catalog#161_0373);C為空白對(duì)照粉塵螨浸提液蛋白質(zhì)條帶；C21 C23為經(jīng)C21 C23處理的粉塵螨浸提液蛋白質(zhì)條帶。圖6是YP-7-C21高效液相色譜圖。圖7是YP-7-C21多級(jí)質(zhì)譜圖。圖8是YP-7-C21核磁共振波譜圖。圖9是YP-7-C22高效液相色譜圖。圖10是YP-7-C21多級(jí)質(zhì)譜圖。 圖11是YP-7-C22核磁共振波譜圖。
具體實(shí)施例方式下面將對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
進(jìn)行說明，但是這些實(shí)施方式僅為舉例說明目的，不應(yīng)解釋為是對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行的限制。如上所述，蜂膠的成分非常復(fù)雜，并且由于含有樹脂、蜂蠟、花粉等物質(zhì)，非常難以將其中的活性物質(zhì)進(jìn)行提取或分離。而且蜂蠟產(chǎn)量少，價(jià)格高，非常需要確認(rèn)其中的活性物質(zhì)，以期使用其他途徑來源的活性物質(zhì)來代替蜂蠟。本發(fā)明人長(zhǎng)期致力于蜂蠟的深度開發(fā)利用，意外地發(fā)現(xiàn)蜂蠟浸提物的產(chǎn)率在特定的溶劑、溶劑濃度、液料比和/或溫度條件下可以得到明顯的提高，從而建立了一種高效的用于蜂蠟浸提的方法體系。于是，在本發(fā)明的第一方面，提供了一種從蜂膠中分離抗粉塵螨過敏活性物質(zhì)的方法，其中，所述方法包括如下步驟1)使用乙醇溶劑對(duì)蜂膠進(jìn)行浸提；和2)進(jìn)行固液分離然后去除液相中的乙醇，以由液相獲得作為蜂膠抗粉塵螨過敏活性物質(zhì)的浸提膏。在一些實(shí)施方式中，所述乙醇溶劑優(yōu)選為乙醇水溶液，該水溶液的濃度優(yōu)選為35體積％至95體積％，更優(yōu)選為所述濃度為55體積至95體積％，最優(yōu)選為75%。在一些實(shí)施方式中，在浸提時(shí)蜂膠與乙醇溶劑的體積重量比(g/mL，簡(jiǎn)稱液料比)為1:3至1:20，更優(yōu)選為1:5至1:15，最優(yōu)選為1:5。在一些實(shí)施方式中，浸提是在4°C至50°C進(jìn)行，更優(yōu)選在在25°C至45°C進(jìn)行，最優(yōu)選為在45°C進(jìn)行。
本發(fā)明方法對(duì)固液分離方式?jīng)]有特別限制，例如可以過濾或離心的方式進(jìn)行。本發(fā)明對(duì)去除固液分離后得到的液相中的乙醇的方式也沒有特別限制，但是考慮到乙醇具有易揮發(fā)性，因此優(yōu)選采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方式進(jìn)行。由以上方法得到的浸提膏可以直接用于制備抑制粉塵螨過敏原的藥物，也可以用于活性物質(zhì)的進(jìn)一步分離純化。在一些實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括利用層析法對(duì)所述浸提膏分離的初次分離步驟，以得到作為蜂膠抗粉塵螨過敏活性物質(zhì)的初次分離物。優(yōu)選的是，所述層析法使用柱層析法和/或薄層層析法進(jìn)行。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述層析法優(yōu)選為薄層層析法。用于進(jìn)行層析法的樣品優(yōu)選為將以上方法得到的浸提膏分散在三氯甲烷中的分散體。本發(fā)明對(duì)于分散體中的浸提膏與三氯甲烷的比例沒有特別限制，只要浸提膏能夠充分分散在三氯甲烷中即可。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述層析法使用的洗脫劑為 三氯甲烷與甲醇的混合洗脫劑，更優(yōu)選的是，所述三氯甲烷和甲醇的體積比為99:1至5:5，進(jìn)一步優(yōu)選的是，所述三氯甲烷和甲醇的體積比為99:1至95:5，最優(yōu)選的是，所述三氯甲烷和甲醇的體積比為99:1。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括利用柱層析法和/或薄層層析法對(duì)所述初次分離物進(jìn)行分離的二次分離步驟，以得到作為蜂膠抗粉塵螨過敏活性物質(zhì)的二次分離物。在一些實(shí)施方式中，優(yōu)選使用薄層層析法。更優(yōu)選的是，所述薄層層析法為基于玻璃的薄層層析法。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述二次分離物包含作為蜂膠抗粉塵螨過敏活性物質(zhì)的山奈酚和/或白楊素，更優(yōu)選的是，所述二次分離物包含作為主要活性物質(zhì)的山奈酚和/或白楊素。在一些實(shí)施方式中，所述二次分離物包含作為主要活性物質(zhì)的山奈酚。在一些實(shí)施方式中，所述二次分離物包含作為主要活性物質(zhì)的白楊素。本發(fā)明的方法對(duì)于蜂膠的來源沒有特別限制，但是優(yōu)選所述蜂膠為中國(guó)蜂膠。在本發(fā)明的第二方方面，提供了由以上方法浸提或分離得到的蜂膠抗粉塵螨過敏活性物質(zhì)。在本發(fā)明的第三方面，提供了由以上方法浸提或分離得到的蜂膠抗粉塵螨過敏活性物質(zhì)在制備用于治療由粉塵螨過敏原引起的疾病的藥物中的用途。實(shí)施例為了進(jìn)一步更容易理解本發(fā)明，本發(fā)明在下文將以實(shí)施例的形式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更為詳細(xì)地說明，但是這些實(shí)施例僅為說明目的，不應(yīng)理解為式對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。實(shí)施例I蜂膠浸提方法體系的建立I材料和方法I. I 材料I. I. I材料的采集實(shí)驗(yàn)人員從2009年在以湖北省康思農(nóng)蜂產(chǎn)品有限公司為依托，通過與蜂農(nóng)直接聯(lián)系及自己采樣的方式，獲得了蜂膠樣品。該蜂膠呈棕褐色、團(tuán)塊狀，蜂種為意蜂采集地環(huán)境多有楊樹和松樹等。將采集樣品置于一 20°C下冷藏?cái)?shù)日，待其處于堅(jiān)硬狀態(tài)后，粉碎為小塊狀，存放于4 °C冰箱中備用。表2-1中國(guó)不同地域蜂膠樣品特征
代碼采集時(shí)間采集地點(diǎn)顏色外形蜂種膠源植物
12009.12.25湖北武漢棕褐色團(tuán)塊狀意蜂楊樹，松樹等
22010.04,02山東沂蒙山E蒙陰縣棕綠色團(tuán)塊狀意蜂楊樹、松樹等
32010.04.18山東濟(jì)寧黃綠色團(tuán)塊狀意蜂+ 蜂揚(yáng)樹、松樹等
42010.04.18山東濟(jì)寧灰褐色團(tuán)塊狀意蜂蜂楊樹、松樹等· 52010.03.22湖北黃陂深黃色肢塊狀意蜂楊樹、松樹等
62010.04.18山東濟(jì)寧黑色膠體狀意蜂楊樹、松樹等
72010.03.20河北燕山山脈毛家裕黃棕色團(tuán)塊狀意蜂楊樹、松樹等 §2010.04.09山東棗莊黃棕色固塊狀意蜂楊樹、松樹等
92010.04.18山東濟(jì)寧墨綠色固塊狀意蜂楊樹，松樹等
102010.04.05河南漯河舞陽(yáng)縣黃褐色團(tuán)塊狀意蜂場(chǎng)樹，松樹等
112010.04.05山東棗莊黃褐色國(guó)塊狀意蜂楊樹，松樹等
122010.03.15湖北武漢洪山S黃褐色碎渣狀意蜂楊樹、松樹等
132010.03.27哈爾濱虎林市褐色片塊狀意蜂輪樹、松財(cái)?shù)菼. I. 2主要儀器
恒溫水浴鍋KAB-201EYELA
微型試樣輸碎機(jī)FW80江蘇國(guó)華電器有限公司
旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀NAJ-160EYELA
紫外分光光度計(jì) UV-1700SHIMADZU
電子天平FA1004上海天平儀器廠1.1.3主要試劑無水乙醇、甲醇、乙酸乙酯、三氯甲烷，均為分析純，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；I. 2 方法I. 2. I中國(guó)不同地域產(chǎn)蜂膠樣品有效物質(zhì)提取工藝優(yōu)化蜂膠有效物質(zhì)的提取產(chǎn)量由有機(jī)溶劑類型、液料比、提取溫度、提取時(shí)間等因素影響，不同環(huán)境條件下所需要的最佳條件有很大差異。以湖北采集I號(hào)樣品為例對(duì)以上因素進(jìn)行考察，尋找最適合的實(shí)驗(yàn)室提取工藝。首先將經(jīng)冷凍粉碎的I號(hào)蜂膠樣品(10g)，分別溶于200mL的95%甲醇、乙醇、乙酸乙酯和三氯甲烷中，靜置3d，過濾后在25°C條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，每種溶劑進(jìn)行三次重復(fù)，計(jì)算其蜂膠提取率，進(jìn)而篩選出最佳有機(jī)溶劑。同理依次對(duì)有機(jī)溶劑的濃度梯度、液料比和最佳溫度進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。以最佳組合條件對(duì)所有樣品進(jìn)行提取，各個(gè)樣品取得的有效物質(zhì)EEP (蜂膠乙醇提取物)編碼為YP-I YP-13 ；2結(jié)果與分析
2. I中國(guó)不同地域產(chǎn)蜂膠樣品有效物質(zhì)提取最佳工藝2. I. I有機(jī)溶劑的選擇用極性大小不同的有機(jī)溶劑對(duì)蜂膠樣品進(jìn)行粗提取，結(jié)果如表2-2。當(dāng)選用甲醇、乙醇作為提取溶劑時(shí)，無顯著性差異提取率均為40%以上，原則上均可以選為常用提取試劑。但是本研究以探索高效無毒的天然產(chǎn)物為目標(biāo)，盡量避免有毒試劑的使用，故選擇乙醇為浸提溶劑。表2-2不同有機(jī)溶劑對(duì)蜂膠有效物質(zhì)產(chǎn)量的影響
^有效物質(zhì)得率,％'·
溶剩重復(fù)I重復(fù)1丨重復(fù) +
__IIl_
'~f W40.2840.6743.76 41.570±1.907 ab
乙醇41.3544.5746.22 44.047±2.477 a
乙酸乙酯39.9935.4140.23 38.543±2.716 b
三氯甲烷35.4133.2333.19 33.943土 1.270 c注提取溫度為25°C，樣品量為IOg (n=3)，顯著水平p < 0. 05。2. I. 2乙醇溶液濃度的選擇在選定提取液為乙醇后，對(duì)不同濃度的乙醇提取物進(jìn)行有效物質(zhì)得率的測(cè)定，選定最佳的濃度，結(jié)果如表2-3所不。表2-3不同乙醇濃度對(duì)蜂膠有效物質(zhì)產(chǎn)量的影響
—乙...........................................................^tTog蜂膠的提取量/g 平均值土標(biāo)準(zhǔn)差有效物質(zhì)
濃度/% 重復(fù)I重復(fù)n重復(fù)in%_得率/%
35 0.634 0.547 0.584 0.588士0.0445.88遺44 d~
45 0.876 0.961 0.847 0.895±0.0598.95±0.59 d
55 2.652 2.938 2.99 2.86ft±0.18228.60士 1.82 c
65 3.593 3.302 3.957 3.617±0.32836.17±3.28b
75 4.645 4.789 4.888 4.774+0.12247.74+1.22 a
85 4.356 4.746 4.389 4.497土0.21644.97土2.16 a
95_4.683_4.792_4.462 4.646土0.16846.46土丨.68 a注提取溫度為25°C，樣品量為IOg (n=3)，顯著水平p=0. 05。統(tǒng)計(jì)分析表明，乙醇濃度在35% 75%的范圍內(nèi)進(jìn)行梯度變化時(shí)，其有效物質(zhì)的含量隨乙醇浸提液濃度的升高而逐漸增加，平均提取率也逐步上升。各個(gè)濃度下的提取率存在顯著性差異；乙醇濃度在75% 95%時(shí)有效物質(zhì)的平均提取率無顯著性差異。綜合比較實(shí)驗(yàn)的可操作性，并為了更好的進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化推廣應(yīng)用，選取75%的乙醇濃度作為蜂膠提取的最佳濃度，進(jìn)行后續(xù)提取操作。2. I. 3液料比的選擇在對(duì)天然物質(zhì)的有效物質(zhì)進(jìn)行提取的過程中，當(dāng)樣品量一定時(shí)，增加溶劑的量可以降低樣品粒子周圍的濃度極差，更有利于有效成分的溶出。因此實(shí)際生產(chǎn)過程中常常采用加大溶劑用量來獲得較高的有效物質(zhì)提取率。由表2-4統(tǒng)計(jì)分析表明，當(dāng)蜂膠樣品與75%乙醇溶液的液料比(蜂膠克數(shù)與乙醇毫升數(shù)的比例)在1:5 1:15范圍內(nèi)時(shí)，其有效物質(zhì)的得率大于45%且均顯著性差異。但是在天然物質(zhì)的提取過程中，液料比過高雖然也可以將有效物質(zhì)提取，但是會(huì)降低液料中蜂膠樣品的濃度，大大延長(zhǎng)了有效物質(zhì)濃縮所需時(shí)間和能耗，不利于實(shí)際生產(chǎn)的使用。綜合比較選取1:5的液料比作為75%的乙醇溶液提取過程中最佳液料比。表2-4不同液料比對(duì)蜂膠有效物質(zhì)產(chǎn)量的影響
權(quán)利要求
1.一種蜂膠抗粉塵螨過敏活性物質(zhì)的分離方法，其中，所述方法包括如下步驟 1)使用乙醇溶劑對(duì)蜂膠進(jìn)行浸提；和 2)進(jìn)行固液分離然后去除液相中的乙醇，獲得作為蜂膠抗粉塵螨過敏活性物質(zhì)的浸提膏。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述乙醇溶劑為乙醇水溶液，濃度為35體積％至95體積％。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述濃度為55體積至95體積％。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述濃度為75%。
5.如權(quán)利要求I至4任一項(xiàng)所述的方法，其中，在浸提時(shí)液料比為1:3至1:20，所述液料比為蜂膠克數(shù)與乙醇溶劑毫升數(shù)的比例。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述液料比為1:5至1:15。
7.如權(quán)利要求I至6任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述方法進(jìn)一步包括利用層析法對(duì)所述浸提膏分離的初次分離步驟，以得到作為蜂膠抗粉塵螨過敏活性物質(zhì)的初次分離物。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述層析法使用柱層析法和/或薄層層析法進(jìn)行。
9.由權(quán)利要求I至8任一項(xiàng)所述的方法分離得到的蜂膠抗粉塵螨過敏活性物質(zhì)。
10.權(quán)利要求9所述的蜂膠抗粉塵螨過敏活性物質(zhì)在制備用于治療由粉塵螨過敏原引起的疾病的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種蜂膠抗粉塵螨過敏活性物質(zhì)的分離方法。在所述方法中，首先使用乙醇溶劑對(duì)蜂膠進(jìn)行浸提。其次，進(jìn)行固液分離然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，獲得作為蜂膠抗粉塵螨過敏活性物質(zhì)的浸提膏。所述方法還通過柱層析和薄層層析法對(duì)浸提膏進(jìn)一步分離得到活性組份。在所述方法中還可以包括對(duì)活性組份的化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定，該步驟鑒定得到的物質(zhì)為山奈酚和/或白楊素。本發(fā)明提供了從蜂膠中分離得到天然活性物質(zhì)的方法以及該活性物質(zhì)在抗粉塵螨過敏中的新用途。本發(fā)明不僅為蜂膠的深度開發(fā)利用提供了高效的方法體系，而且為粉塵螨過敏原引起的疾病提供了新的預(yù)防和治療途徑。
文檔編號(hào)A61P33/14GK102784170SQ20121016244
公開日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2012年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月23日
發(fā)明者安龍濬, 王沫, 陶文琦 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)