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一種用于檢測(cè)EGFR基因突變的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒的制作方法

文檔序號(hào):12098021閱讀:259來源:國(guó)知局
一種用于檢測(cè)EGFR基因突變的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒的制作方法與工藝
本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域
,具體涉及一種用于檢測(cè)EGFR基因突變的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)
:人類表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)存在于所有正常上皮和部分間葉來源的細(xì)胞,對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化的調(diào)節(jié)有重要作用。EGFR可以激活酪氨酸激酶,從而打開下游信號(hào)通路。因此,EGFR成為腫瘤尤其是非小細(xì)胞肺癌靶向治療研究的一個(gè)重要靶點(diǎn)。目前,臨床上EGFR靶向治療主要包括小分子酪氨酸激酶抑制劑和單克隆抗體兩個(gè)部分,如阿斯利康公司的吉非替尼(易瑞沙),羅氏公司的惡羅替尼(特羅凱)。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)一些肺癌病人EGFR基因的編碼區(qū),主要是在外顯子18-21上會(huì)發(fā)生突變,而這些突變與吉非替尼和惡羅替尼等藥物的臨床療效有關(guān),即與藥物反應(yīng)性有關(guān),原因可能是因?yàn)檫@些突變改變了EGFR胞內(nèi)ATP結(jié)合區(qū)的結(jié)構(gòu),提高了EGFR對(duì)吉非替尼的結(jié)合能力。目前,雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)不下30種突變,不過主要是外顯子19上的缺失突變和外顯子21上L858R的點(diǎn)突變;外顯子19上747-750位氨基酸的大約有20多種不同缺失約占突變的45%,其中以2235_2249del15和2236_2250del15最為常見;外顯子21上858位氨基酸的替代約占突變的40-45%;外顯子18點(diǎn)突變(G719S或G719C)約占突變的5%;外顯子20上的插入突變約占突變的1%左右。外顯子18的G719X突變約占突變的5%左右。但是,在肺癌患者中EGFR的突變率并不高,美國(guó)肺癌病人中EGFR基因的突變率僅有2%,日本為40%。中國(guó)女性非小細(xì)胞肺癌的病人中EGFR基因的突變率為30%,如果這部分患者均能應(yīng)用吉非替尼或惡羅替尼治療將會(huì)明顯改善預(yù)后。這些靶向藥物雖然對(duì)某些人群療效非常,但是價(jià)格昂貴,如果病人不攜帶有EGFR突變而服用此類藥物,不僅耽誤病情還造成巨額藥費(fèi)的浪費(fèi)。因此,在用藥前篩查檢測(cè)病人是否攜帶有EGFR基因突變顯得尤為重要,也是未來腫瘤個(gè)體化治療的發(fā)展方向。所以,如何快速準(zhǔn)確地檢測(cè)這些與藥物反應(yīng)性有關(guān)的EGFR基因突變成為人們亟待解決的問題。目前檢測(cè)EGFR基因稀有突變的方法有多種,檢測(cè)能力在1%~20%。主要有兩大類,一類是非實(shí)時(shí)PCR,主要有測(cè)序和DHPLC,檢測(cè)能力僅為20%和5%,而且需要PCR后處理,步驟繁瑣,耗時(shí)長(zhǎng),容易污染;另一類是實(shí)時(shí)PCR,雖然都是基于實(shí)時(shí)PCR的技術(shù)平臺(tái),但是為了提高檢測(cè)方法的選擇能力,不同學(xué)者所用策略不盡相同。主要有完全依賴DNA序列自身識(shí)別特異性和依賴酶識(shí)別特異性兩大類策略,有TaqMan探針、高分辨熔解曲線分析、競(jìng)爭(zhēng)性抑制實(shí)時(shí)PCR方法,檢測(cè)能力5%~20%之間,DxS蝎子引物法檢測(cè)能力可達(dá)1%。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷,提供一種用于檢測(cè)EGFR基因突變的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:一種用于檢測(cè)EGFR基因突變的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒,包括:E-18引物組、E-19引物組、E-20引物組、E-21引物組、E-2引物組、E-18檢測(cè)探針、E-19檢測(cè)探針、E-20檢測(cè)探針、E-21檢測(cè)探針、E-2檢測(cè)探針和內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針;E-18檢測(cè)探針、E-19檢測(cè)探針、E-20檢測(cè)探針、E-21檢測(cè)探針和E-2檢測(cè)探針的5’端均修飾有第一熒光報(bào)告基團(tuán),3’端均修飾有第一熒光猝滅基團(tuán);內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針的序列與E-2檢測(cè)探針的序列相同,其5’端修飾有與第一熒光報(bào)告基團(tuán)不同的第二熒光報(bào)告基團(tuán),3’端均修飾有第二熒光猝滅基團(tuán);其中,E-18引物組由正向引物E-18-M1-F、E-18-M2-F、E-18-M3-F和反向引物E-18-R組成,依次包括如SEQIDNO01至04所示的序列;E-19引物組由正向引物E-19-M1-F、E-19-M2-F、E-19-M3-F、E-19-M4-F、E-19-M5-F、E-19-M6-F、E-19-M7-F、E-19-M8-F、E-19-M9-F、E-19-M10-F、E-19-M11-F、E-19-M12-F、E-19-M13-F、E-19-M14-F、E-19-M15-F、E-19-M16-F、E-19-M17-F、E-19-M18-F、E-19-M19-F和反向引物E-19-R組成,依次包括如SEQIDNO05至24所示的序列;E-20引物組由正向引物E-20-M1-F、E-20-M2-F、E-20-M3-F、E-20-M4-F、E-20-M5-F和反向引物E-20-R組成,依次包括如SEQIDNO25至30所示的序列;E-21引物組由正向引物E-21-M1-F、E-21-M2-F和反向引物E-21-R組成,依次包括如SEQIDNO31至33所示的序列;E-2引物組由正向引物E-2-F和反向引物E-2-R組成,依次包括如SEQIDNO34和35所示的序列;上述E-18-M1-F、E-18-M2-F、E-18-M3-F、E-19-M1-F、E-19-M2-F、E-19-M3-F、E-19-M4-F、E-19-M5-F、E-19-M6-F、E-19-M7-F、E-19-M8-F、E-19-M9-F、E-19-M10-F、E-19-M11-F、E-19-M12-F、E-19-M13-F、E-19-M14-F、E-19-M15-F、E-19-M16-F、E-19-M17-F、E-19-M18-F、E-19-M19-F、E-20-M1-F、E-20-M2-F、E-20-M3-F、E-20-M4-F、E-20-M5-F、E-21-M1-F和E-21-M2-F依次對(duì)應(yīng)肺癌患者表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因29種常見突變,具體見下表1:表1:肺癌患者表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因的29種突變?cè)摱嘀責(zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒的每一反應(yīng)體系的組成如下:E-18引物組、E-19引物組、E-20引物組和E-21引物組之一中的一正向引物和一反向引物對(duì)應(yīng)的E-18檢測(cè)探針、E-19檢測(cè)探針、E-20檢測(cè)探針、E-21檢測(cè)探針和E-2檢測(cè)探針之一E-2引物組內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針1×PCR緩沖液MgCl2dNTPsTaq酶H2ODNA模板;該多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒的每一反應(yīng)體系的反應(yīng)條件均為:95℃預(yù)變性5min,1個(gè)循環(huán);95℃變性25s,60℃退火20s,72℃延伸10s,15個(gè)循環(huán);95℃變性25s,60℃退火35s,72℃延伸10s,30個(gè)循環(huán),后30個(gè)循環(huán)在退火時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述E-18檢測(cè)探針為E-18-P,包括如SEQIDNO36所示的序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述E-18檢測(cè)探針為E-19-P,包括如SEQIDNO37所示的序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述E-18檢測(cè)探針為E-20-P,包括如SEQIDNO38所示的序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述E-18檢測(cè)探針為E-21-P,包括如SEQIDNO39所示的序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述E-2檢測(cè)探針為E-2-P,所述內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針為E-2-I,均包括如SEQIDNO40所示的序列。上述各因物及探針具體序列如下表所示:進(jìn)一步優(yōu)選的,所述第一熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM,所述第一熒光猝滅基團(tuán)為BHQ,所述第二熒光報(bào)告基團(tuán)為HEX、ROX或VIC,第二熒光猝滅基團(tuán)為BHQ。本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明以人類EGFR基因突變?yōu)闄z測(cè)對(duì)象,通過特異引物的優(yōu)化組合以及熒光探針,從而實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快速地同時(shí)檢測(cè)EGFR基因突變,而且檢測(cè)突變的能力高。附圖說明圖1為本發(fā)明實(shí)施例2的多重?zé)晒釶CR反應(yīng)程序圖。圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中多重?zé)晒釶CR檢測(cè)EGFR基因L858R突變陰性對(duì)照樣品檢測(cè)曲線圖。圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中多重?zé)晒釶CR檢測(cè)EGFR基因L858R突變的樣品檢測(cè)曲線圖。具體實(shí)施方式以下通過具體實(shí)施方式結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步的說明和描述。一種用于檢測(cè)EGFR基因突變的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒,包括:E-18引物組、E-19引物組、E-20引物組、E-21引物組、E-2引物組、E-18檢測(cè)探針、E-19檢測(cè)探針、E-20檢測(cè)探針、E-21檢測(cè)探針、E-2檢測(cè)探針和內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針;E-18檢測(cè)探針、E-19檢測(cè)探針、E-20檢測(cè)探針、E-21檢測(cè)探針和E-2檢測(cè)探針的5’端均修飾有第一熒光報(bào)告基團(tuán),3’端均修飾有第一熒光猝滅基團(tuán);內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針的序列與E-2檢測(cè)探針的序列相同,其5’端修飾有與第一熒光報(bào)告基團(tuán)不同的第二熒光報(bào)告基團(tuán),3’端均修飾有第二熒光猝滅基團(tuán);優(yōu)選的,所述第一熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM,所述第一熒光猝滅基團(tuán)為BHQ,所述第二熒光報(bào)告基團(tuán)為HEX、ROX或VIC,第二熒光猝滅基團(tuán)為BHQ;其中,E-18引物組由正向引物E-18-M1-F、E-18-M2-F、E-18-M3-F和反向引物E-18-R組成,依次包括如SEQIDNO01至04所示的序列;E-19引物組由正向引物E-19-M1-F、E-19-M2-F、E-19-M3-F、E-19-M4-F、E-19-M5-F、E-19-M6-F、E-19-M7-F、E-19-M8-F、E-19-M9-F、E-19-M10-F、E-19-M11-F、E-19-M12-F、E-19-M13-F、E-19-M14-F、E-19-M15-F、E-19-M16-F、E-19-M17-F、E-19-M18-F、E-19-M19-F和反向引物E-19-R組成,依次包括如SEQIDNO05至24所示的序列;E-20引物組由正向引物E-20-M1-F、E-20-M2-F、E-20-M3-F、E-20-M4-F、E-20-M5-F和反向引物E-20-R組成,依次包括如SEQIDNO25至30所示的序列;E-21引物組由正向引物E-21-M1-F、E-21-M2-F和反向引物E-21-R組成,依次包括如SEQIDNO31至33所示的序列;E-2引物組由正向引物E-2-F和反向引物E-2-R組成,依次包括如SEQIDNO34和35所示的序列;該多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒的每一反應(yīng)體系的組成如下:E-18引物組、E-19引物組、E-20引物組和E-21引物組之一中的一正向引物和一反向引物對(duì)應(yīng)的E-18檢測(cè)探針、E-19檢測(cè)探針、E-20檢測(cè)探針、E-21檢測(cè)探針和E-2檢測(cè)探針之一E-2引物組內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針1×PCR緩沖液MgCl2dNTPsTaq酶H2ODNA模板;該多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒的每一反應(yīng)體系的反應(yīng)條件均為:95℃預(yù)變性5min,1個(gè)循環(huán);95℃變性25s,60℃退火20s,72℃延伸10s,15個(gè)循環(huán);95℃變性25s,60℃退火35s,72℃延伸10s,30個(gè)循環(huán),后30個(gè)循環(huán)在退火時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)。所述E-18檢測(cè)探針為E-18-P,包括如SEQIDNO36所示的序列。所述E-18檢測(cè)探針為E-19-P,包括如SEQIDNO37所示的序列。所述E-18檢測(cè)探針為E-20-P,包括如SEQIDNO38所示的序列。所述E-18檢測(cè)探針為E-21-P,包括如SEQIDNO39所示的序列。所述E-2檢測(cè)探針為E-2-P,所述內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針為E-2-I,均包括如SEQIDNO40所示的序列。上述各因物及探針具體序列如下表所示:實(shí)施例1本實(shí)施例以人類EGFR基因21外顯子的L858R突變?yōu)闄z測(cè)對(duì)象,通過特異引物的優(yōu)化組合以及熒光探針,從而實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快速地同時(shí)檢測(cè)L858R突變,而且檢測(cè)突變的能力高達(dá)1%。野生型細(xì)胞系H460的基因組DNA為野生型模板,以L858R突變質(zhì)粒為陽性對(duì)照模板,以本試劑盒進(jìn)行多重PCR檢測(cè),最終以達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所需要的循環(huán)次數(shù)Ct值作為結(jié)果判斷的標(biāo)準(zhǔn)(本實(shí)施例中的第一熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM,第二熒光報(bào)告基團(tuán)為VIC、ROX或HEX,第一和第二熒光猝滅基團(tuán)均為BHQ)。上述多重?zé)晒釶CR檢測(cè)的擴(kuò)增反應(yīng)體系為:序號(hào)物料物料濃度用量(μL)11×PCR緩沖液1×102MgCl225mM83dNTPs10mM54E-21-M1-F50mM25E-21-M1-R50mM0.16E-21-P50mM0.17E-2-F50mM0.18E-2-R50mM0.19內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針50mM0.110Taq酶5U0.511H2O純化水18.912DNA模板2ng/ul513總體積50以上試劑組分:1×PCR緩沖液,MgCl2,Taq酶,dNTP均購(gòu)自中國(guó)大連寶生物公司。上述多重?zé)晒釶CR檢測(cè)的反應(yīng)條件是95℃預(yù)變性5min,1個(gè)循環(huán);95℃變性25s,60℃退火20s,72℃延伸10s,15個(gè)循環(huán);95℃變性25s,60℃退火35s,72℃延伸10s,30個(gè)循環(huán),后30個(gè)循環(huán)在退火時(shí)檢測(cè)第一熒光報(bào)告基團(tuán)和第二熒光報(bào)告基團(tuán)的熒光信號(hào)。上述檢測(cè)第一熒光報(bào)告基團(tuán)和第二熒光報(bào)告基團(tuán)的熒光信號(hào)的Ct值,是采用Mx3000P熒光PCR擴(kuò)增儀或Mx3005P熒光PCR擴(kuò)增儀或ABI7500熒光PCR擴(kuò)增儀。,一次可檢測(cè)96份樣品(包括陰陽性對(duì)照)。根據(jù)熒光PCR擴(kuò)增儀顯示的Ct值判斷結(jié)果:檢測(cè)反應(yīng)體系的第一熒光報(bào)告基團(tuán)和第二熒光報(bào)告基團(tuán)熒光強(qiáng)度,以第二熒光報(bào)告基團(tuán)的信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值(Ct>18)時(shí)表明上樣DNA量在允許范圍內(nèi),第一熒光報(bào)告基團(tuán)的信號(hào)結(jié)果可信;以第一熒光報(bào)告基團(tuán)的信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所需要的循環(huán)次數(shù)Ct值作為陰陽性判斷的標(biāo)準(zhǔn),Ct值為0或30:陰性;Ct小于30:陽性。實(shí)施例2本實(shí)施例中以EGFR基因熱點(diǎn)突變外顯子21上的L858R突變?yōu)槔齺矸治霰景l(fā)明的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)EGFR基因21外顯子L858R突變的方法。實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞系3株和1個(gè)質(zhì)粒,分別為H460(EGFR基因野生型)、293T(EGFR基因野生型)、SW480(EGFR基因野生型)和L858R突變質(zhì)粒;45份健康的無償獻(xiàn)血者全血樣品、45份臨床肺癌樣品(包括新鮮組織、石蠟切片、胸腔積液、全血)。利用上述熒光PCR檢測(cè)EGFR基因外顯子21上的L858R突變的方法包括以下步驟:(1)樣品處理和模板提取質(zhì)控:樣品適用范圍包括手術(shù)切除的新鮮病理組織,甲醛固定石蠟包埋病例組織,石蠟切片,全血,血漿,血清,胸腔積液等標(biāo)本。新鮮病理組織,取綠豆大小,約1g重,使用Qiagen公司組織DNA提取試劑盒提取基因組DNA,具體步驟按試劑盒操作說明。蠟塊樣品切成5~8μm切片,取5片,或已經(jīng)制成的5~8μm切片取5片,經(jīng)過二甲苯脫蠟后,使用Qiagen公司石蠟包埋DNA提取試劑盒提取基因組DNA,具體步驟按試劑盒操作說明。全血、血漿、血清以及胸腔積液樣品,使用Qiagen公司組織DNA提取試劑盒提取基因組DNA,具體步驟按試劑盒操作說明。每次提取全血200μl,血漿、血清以及胸腔積液不少于800μl。所提DNA溶于Tris-HCl(10mmol/L,pH8.0),經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取質(zhì)量,并確定濃度,用Tris-HCl溶液(10mmol/L,pH8.0)調(diào)整DNA濃度到100ng/μl或2ng/μl作為PCR擴(kuò)增的模板。(2)用本發(fā)明的多重?zé)晒釶CR試劑盒(本實(shí)施例中的第一熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM,第二熒光報(bào)告基團(tuán)為VIC、ROX或HEX,第一和第二熒光猝滅基團(tuán)均為BHQ)對(duì)步驟(1)所得的模板進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增檢測(cè),配制反應(yīng)體系:序號(hào)物料物料濃度用量(μL)11×PCR緩沖液1×102MgCl225mM83dNTPs10mM54E-21-M1-F50mM25E-21-M1-R50mM0.16E-21-P50mM0.17E-2-F50mM0.18E-2-R50mM0.19內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針50mM0.110Taq酶5U0.511H2O純化水18.912DNA模板2ng/ul513總體積50所述熒光PCR的反應(yīng)條件如圖1所示:95℃預(yù)變性5min,1個(gè)循環(huán);95℃變性25s,60℃退火20s,72℃延伸10s,15個(gè)循環(huán);95℃變性25s,60℃退火35s,72℃延伸10s,30個(gè)循環(huán)。(3)檢測(cè):采用Mx3000P實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增儀(StrataGene公司)后30個(gè)循環(huán)退火階段檢測(cè)第一熒光報(bào)告基團(tuán)和第二熒光報(bào)告基團(tuán)熒光信號(hào),一次可以檢測(cè)92份樣品(包括陰陽性對(duì)照)。結(jié)果判斷:根據(jù)熒光PCR擴(kuò)增儀顯示的Ct值判斷結(jié)果:檢測(cè)反應(yīng)體系的第一熒光報(bào)告基團(tuán)和第二熒光報(bào)告基團(tuán)熒光強(qiáng)度,以第二熒光報(bào)告基團(tuán)信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值(Ct>18)時(shí)表明上樣DNA量在允許范圍內(nèi),第一熒光報(bào)告基團(tuán)信號(hào)結(jié)果可信;以第一熒光報(bào)告基團(tuán)的信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所需要的循環(huán)次數(shù)Ct值作為陰陽性判斷的標(biāo)準(zhǔn),Ct值為0或30:陰性;Ct小于30:陽性,檢測(cè)結(jié)果具體如圖2和圖3所示。前述45份健康獻(xiàn)血者全血樣品以及細(xì)胞系H460(EGFR基因野生型)、293T(EGFR基因野生型)、SW480(EGFR基因野生型),L858R突變質(zhì)粒經(jīng)本發(fā)明的體系檢測(cè),只有L858R突變質(zhì)粒有熒光信號(hào),其他樣品無熒光信號(hào),進(jìn)一步證明了熒光PCR的特異性。靈敏度分析:將突變型L858R突變質(zhì)粒從10的4次方連續(xù)10倍梯度稀釋,分別為10的3次方,10的2次方,10的1次方,10的0次方。每次反應(yīng)加入5μLDNA。結(jié)果表明本發(fā)明的熒光PCR方法的靈敏度高,5拷貝DNA基因組即可檢出。選擇性能力分析:固定每次PCR反應(yīng)總DNA用量,100ng/反應(yīng)和10ng/反應(yīng)。先將L858R突變質(zhì)粒DNA和野生型細(xì)胞系(H460)DNA濃度都調(diào)整為20ng/μL和2ng/μL。這樣每個(gè)反應(yīng)加5μL模板即為100ng/反應(yīng)和10ng/反應(yīng)。按下述方法配置模擬DNA模板。A:50%即為10的3次方L858R突變細(xì)胞DNA。B:30%取A液60μL后混入40μL10的3次方L858R突變細(xì)胞DNA,震蕩混均。C:20%取A液40μL后混入60μL10的3次方L858R突變細(xì)胞DNA,震蕩混均。D:15%取B液50μL后混入50μL10的3次方L858R突變細(xì)胞DNA,震蕩混均。E:10%取C液50μL后混入50μL10的3次方L858R突變細(xì)胞DNA,震蕩混均。F:5%取E液50μL后混入50μL10的3次方L858R突變細(xì)胞DNA,震蕩混均。G:1%取F液20μL后混入80μL10的3次方L858R突變細(xì)胞DNA,震蕩混均。H:0.5%取G液50μL后混入50μL10的3次方L858R突變細(xì)胞DNA,震蕩混均。I:0.1%取H液20μL后混入80μL10的3次方L858R突變細(xì)胞DNA,震蕩混均。結(jié)果表明本發(fā)明的熒光PCR方法的選擇性檢測(cè)能力為在10ng總DNA中可以檢出5拷貝的突變DNA,檢測(cè)能力為1%。重復(fù)性試驗(yàn):每個(gè)反應(yīng)分別加入突變L858R質(zhì)粒DNA10ng、1ng和100pg,重復(fù)10次進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增,10次Ct值相差不到0.1個(gè)循環(huán)。收集手術(shù)切除的肺癌標(biāo)本,全血和血漿標(biāo)本以及胸水標(biāo)本共45例,其中30組織樣品,5例血漿,5例胸水,5例全血。其中男性31例,女性14例。年齡為36-71歲,平均年齡為55歲。對(duì)于外顯子21的L858R突變,本發(fā)明檢測(cè)結(jié)果與DNA測(cè)序結(jié)果完全一致:45例樣品中有12例發(fā)生外顯子21的L858R突變,33例均為野生型。本發(fā)明可以同時(shí)檢測(cè)EGFR外顯子21的L858R突變,檢測(cè)時(shí)間僅需90min,因此本發(fā)明準(zhǔn)、簡(jiǎn)單、快捷可滿足突變的快速診斷。而且,多重?zé)晒釶CR方法和傳統(tǒng)測(cè)序方法結(jié)果的符合率為100%,熒光PCR靈敏度和選擇性檢測(cè)能力高于傳統(tǒng)測(cè)序方法,10ng樣品DNA中含1%的突變DNA即可檢出。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可知,用本發(fā)明的試劑盒中的E-18引物組、E-19引物組、E-20引物組、E-21引物組的其他正向引物及E-18檢測(cè)探針、E-19檢測(cè)探針、E-20檢測(cè)探針、E-21檢測(cè)探針或E-2檢測(cè)探針檢測(cè)其他相應(yīng)基因突變,仍然能夠得到與上述實(shí)施例相同或相近的技術(shù)效果,仍然屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。以上所述,僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已,故不能依此限定本發(fā)明實(shí)施的范圍,即依本發(fā)明專利范圍及說明書內(nèi)容所作的等效變化與修飾,皆應(yīng)仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。<110>廈門飛朔生物技術(shù)有限公司<120>一種用于檢測(cè)EGFR基因突變的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒<160>40<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>1caaaaagatcaaagtgctggc21<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2ttcaaaaagatcaaagtgctga22<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>3ttcaaaaagatcaaagtgctgt22<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>4tctgggctccccaccagac19<210>5<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>5gaaagttaaaattcccgtcgctatcaa27<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>6gaaagttaaaattcccgtcgctatcaagac30<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>7gagaaagttaaaattcccgtcgctatc27<210>8<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>8gagaaagttaaaattcccgtcgctatcaaaa31<210>9<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>9gagaaagttaaaattcccgtcgctatc27<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>10gagaaagttaaaattcccgtcgct24<210>11<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>11gagaaagttaaaattcccgtcgcta25<210>12<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>12gagaaagttaaaattcccgtcgc23<210>13<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>13ttaaaattcccgtcgctatcaaggat26<210>14<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>14ttaaaattcccgtcgctatcaagga25<210>15<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>15ttaaaattcccgtcgctatcaaggatc27<210>16<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>16ttaaaattcccgtcgctatcaagg24<210>17<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>17aattcccgtcgctatcaaggaacc24<210>18<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>18aattcccgtcgctatcaaggaacc24<210>19<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>19aattcccgtcgctatcaaggaacc24<210>20<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>20aattcccgtcgctatcaaggaacc24<210>21<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>21aattcccgtcgctatcaaggaacc24<210>22<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>22aattcccgtcgctatcaaggaacc24<210>23<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>23aattcccgtcgctatcaaggaacc24<210>24<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>24cctgaggttcagagccatggacc23<210>25<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>25cctccaccgtgcaactcatcct22<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>26gaagcctacgtgatggcgat20<210>27<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>27cgtggacaacccccacca18<210>28<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>28tggccagcgtggacgg16<210>29<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>29gtgatggccagcgtggctag20<210>30<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>30ccagttgagcaggtactgggag22<210>31<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>31gcagcatgtcaagatcacagattttgggag30<210>32<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>32cagattttgggctggccaaaga22<210>33<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>33ggaaaatgctggctgacctaaag23<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>34gcacgagtaacaagctcacg20<210>35<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>35gatcataattcctctgcacataggtaa27<210>36<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>36ctccggtgcgttcggca17<210>37<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>37cctcgatgtgagtttctgct20<210>38<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>38cccttcggctgcctcctgg19<210>39<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>39tgcagaaggaggcaaagtaagg22<210>40<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>40cagcctccagaggatgttcaa21當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3 
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