本發(fā)明涉及一種植物耐鹽性相關(guān)蛋白VvMas及其編碼基因與應(yīng)用，特別是來源于葡萄的耐鹽性相關(guān)蛋白VvMas及其編碼基因與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

世界上存在大面積的鹽漬化的土地。據(jù)統(tǒng)計，全世界共有8億hm²鹽堿地，在灌溉地區(qū)還有占耕地面積33％的次生鹽漬化土地，土壤的鹽潰化嚴(yán)重影響現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展。就我國而言，在全國18億畝耕地中有近十分之一的次生鹽潰化土地，另外還有2000萬hm²鹽堿荒地。一般來說，鹽濃度在0.2％-0.5％會影響作物的生長，但是鹽堿地的鹽分大都在0.6％-10％。大面積的鹽漬化土地的存在嚴(yán)重影響了糧食生產(chǎn)，成為限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要因素。隨著世界人口的劇增及可耕地面積的逐年下降，糧食生產(chǎn)安全受到了嚴(yán)重威脅，對于人均耕地面積相對較小的中國更是日益嚴(yán)重的問題。通過對植物耐鹽機(jī)理的深入研究，培育耐鹽作物新品種是利用鹽堿地資源最經(jīng)濟(jì)、有效的措施之一。

植物的耐鹽機(jī)理相當(dāng)復(fù)雜，它涉及到生長發(fā)育、形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理特征以及代謝調(diào)節(jié)等諸多方面。當(dāng)植物受到鹽脅迫時，植物的形態(tài)、生理生化等方面都會發(fā)生一系列的變化，才能維持其生存。鹽害抑制植物組織、器官的生長和分化，影響植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞膜透性增大，降低光合速率，導(dǎo)致大量電解質(zhì)和非電解質(zhì)外滲，膜脂組分發(fā)生改變，膜蛋白的組分和活性受到影響，進(jìn)而影響植物的生理代謝。因此植物在長期的進(jìn)化及適應(yīng)過程中，逐步形成了一系列抵御外界不良環(huán)境變化的機(jī)制。

植物在鹽脅迫條件下，會采用一定的策略去阻止或減輕鹽的危害，在長期的進(jìn)化過程中，植物發(fā)展出了一系列的耐鹽機(jī)制。隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，植物耐鹽生理生化機(jī)制日益明確，使得克隆與植物耐鹽相關(guān)基因成為可能。加強(qiáng)植物耐鹽生理的研究，探明植物在逆境下的生命活動規(guī)律并加以人為調(diào)控，培育具有抵抗不良環(huán)境性狀的優(yōu)良品種，以提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，對于獲得農(nóng)業(yè)高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

技術(shù)問題：為了解決現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種植物耐鹽性相關(guān)蛋白VvMas及其編碼基因，還提供了上述蛋白的應(yīng)用。

技術(shù)方案：本發(fā)明提供的與植物耐鹽性相關(guān)蛋白，其名稱為VvMas(α/β水解酶)，來源于葡萄(Vitis vinifera)是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(b)將序列表中序列SEQ ID NO：2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐鹽性相關(guān)的由SEQ ID NO：2衍生的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明還提供了編碼蛋白VvMas的基因。

所述基因，與碳氮代謝相關(guān)蛋白，為如下(1)-(3)中任一所述的基因：

(1)其核苷酸序列為SEQ ID NO：1所示的DNA分子；

(2)在嚴(yán)格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼植物耐鹽性相關(guān)蛋白的DNA分子；

(3)與(1)或(2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或者至少具有99％同源性且編碼植物耐鹽性相關(guān)蛋白的DNA分子。

上述嚴(yán)格條件可為用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下雜交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

序列SEQ ID NO：1由1224個堿基組成，編碼序列表中序列SEQ ID NO：2所示的蛋白。

本發(fā)明還提供了含有所述與植物耐鹽性相關(guān)蛋白的編碼基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。

所述重組表達(dá)載體為將上述基因插入表達(dá)載體中即得。

具體地，所述重組載體是在載體pCBGUS的多克隆位點間插入所述編碼基因得到的。

其中，所述載體pCBGUS是通過包括如下步驟的方法得到的：

(1)將pCAMBIA1301載體經(jīng)過Hind III和EcoR I雙酶切，回收載體大片段；

(2)將pBI 121載體經(jīng)過Hind III和EcoR I雙酶切，回收包含gusA基因的片段；

(3)將步驟(1)中回收的載體大片段與步驟(2)中回收的包含gusA基因的片段連接，即得載體pCBGUS。

所述pCAMBIA1301載體購自CAMBIA公司；所述pBI 121載體購自Clontech公司。

本發(fā)明還提供了擴(kuò)增所述與植物耐鹽性相關(guān)蛋白的編碼基因全長或其任一片段的引物對。

具體地，所述引物對序列如下：

GSP-1：5’-CTGAGACGAGTTGGGGTGGAA-3’

GSP-2：5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’

GSP-3：5’-GACTTGGCCTCCAGGTTGACCTTGA-3’

GSP-4：5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG-3’

GSP-5：5’-ATGAAAGGCGTCTTTTCGGCGCCAG-3’

GSP-6：5’-TTACACAAGACATCTACTTTTCCAA-3’

本發(fā)明還提供了蛋白VvMas、其編碼基因或其重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌在提高植物耐鹽性中的應(yīng)用；所述植物為雙子葉植物或單子葉植物。

本發(fā)明還提供了一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括以下步驟：將權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参铮吹谩?/p>

具體地，權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因是通過權(quán)利要求4或5所述的重組載體導(dǎo)入目的植物；所述植物具體為雙子葉植物或單子葉植物。

所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物優(yōu)選擬南芥或水稻。

有益效果：本發(fā)明提供的VvMas基因所編碼的蛋白可以提高植物的耐鹽性，具有重要的應(yīng)用價值，為提高葡萄耐鹽性的研究提供重要的依據(jù)。

本發(fā)明的蛋白及其編碼基因?qū)ε嘤望}性植物品種具有重要的應(yīng)用價值，從而提高農(nóng)作物產(chǎn)量具有重要意義，將在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用空間和市場前景。

附圖說明

圖1本發(fā)明葡萄VvMas基因植物表達(dá)載體簡圖。

圖2本發(fā)明VvMas轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的PCR檢測結(jié)果圖。

圖3本發(fā)明VvMas轉(zhuǎn)基因水稻植株的PCR檢測結(jié)果圖。

圖4本發(fā)明VvMas轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的耐鹽性盆栽鑒定圖。

圖5本發(fā)明VvMas轉(zhuǎn)基因水稻植株的耐鹽性離體鑒定圖。

圖6本發(fā)明VvMas轉(zhuǎn)基因水稻植株的耐鹽性水培鑒定圖。

圖7本發(fā)明VvMas轉(zhuǎn)基因水稻植株的耐鹽性盆栽鑒定圖。

具體實施方式

下述實施例中，所用的試驗材料及其來源包括：

葡萄(Vitis vinifera)品種PN40024，由淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院江蘇省植物生產(chǎn)與加工實踐教育中心實驗室保存。

擬南芥(Arabidopsis thaliana)的種子經(jīng)過2.5％(v/v)CaClO₂消毒后種植在黑土：蛭石：珍珠巖(1:1:1)的混合基質(zhì)中，22℃，16h光照培養(yǎng)(16h光照，8h黑暗，冷光源)生長2周。

水稻(Oryza sativa)品種中花11號，由淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院江蘇省植物生產(chǎn)與加工實踐教育中心實驗室保存。

大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α由淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院江蘇省植物生產(chǎn)與加工實踐教育中心實驗室保存?？寺≥d體PMD-18-Simple T、各類限制性內(nèi)切酶、Taq聚合酶、連接酶、dNTP、10×PCR buffer和DNA marker購自寶生物工程大連有限公司。所有的化學(xué)試劑都從美國西格瑪化學(xué)公司和上海國藥化學(xué)試劑公司購買。

本發(fā)明中常規(guī)的分子生物學(xué)操作具體參見《分子克隆》【Molecular Cloning.2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989】。

下述實施例中常規(guī)的基因操作參照分子克隆文獻(xiàn)進(jìn)行【Sambook J,Frets EF,Mannsdes T et al.In:Molecular Cloning.2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989】。

實施例1葡萄耐鹽性相關(guān)的蛋白及其編碼基因的獲得

1.實驗材料

將葡萄品種PN40024無菌苗展開葉葉片取下，液氮速凍，-80℃保存。

2.葉片總RNA提取和純化

取PN40024無菌苗展開葉葉片約2.0g，在液氮中研磨成粉狀，加入10mL離心管，用Applygen植物RNA提取試劑盒(Applygen Technologies Inc，Beijing)提取甘薯塊根總RNA，試劑盒中包括：Plant RNA Reagent，植物組織裂解、分離RNA、去除植物多糖和多酚；Extraction Reagent，有機(jī)抽提去除蛋白質(zhì)、DNA、多糖和多酚；Plant RNA Aid，去除植物多糖多酚和次生代謝產(chǎn)物。利用QIAGEN Oligotex Mini mRNA Kit(QIAGEN，GmbH，Germany)從總RNA中純化mRNA。最后，取1μL于1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，另取2μL稀釋至500μL，用紫外分光光度計檢測其質(zhì)量(OD260)和純度(OD260/OD280)，提取的PN40024無菌苗葉片總RNA，經(jīng)非變性膠瓊脂糖凝膠電泳檢測，28S和18S條帶清晰，且二者亮度比值為1.5～2︰1，表明總RNA沒有降解，純化所得mRNA符合實驗要求，可用于葡萄VvMas蛋白cDNA全長的克隆。

3.VvMas蛋白cDNA的全長克隆

以本實驗室獲得的VvMas EST片段設(shè)計引物進(jìn)行VvMas蛋白cDNA的全長克隆。

(1)3’-RACE

以PN40024cDNA為模板，用VvMas EST正向引物GSP-1和反向引物GSP-2進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物序列如下：

GSP-1：5’-CTGAGACGAGTTGGGGTGGAA-3’

GSP-2：5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’

PCR得到的3’RACE片段，回收后連接pMD19-T載體(購自北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司，產(chǎn)品目錄號為D102A)進(jìn)行TA克隆，以BcaBESTTM Sequencing Primers/M13Primers通用引物進(jìn)行測序。

(2)5’-RACE

以PN40024cDNA為模板，用VvMas EST正向引物GSP-3和反向引物GSP-4進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物序列如下：

GSP-3：5’-GACTTGGCCTCCAGGTTGACCTTGA-3’

GSP-4：5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG-3’

PCR得到的5’RACE片段，回收后連接pMD19-T載體(購自北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司，產(chǎn)品目錄號為D102A)進(jìn)行TA克隆，以BcaBESTTM Sequencing Primers/M13Primers通用引物進(jìn)行測序。

(3)PCR擴(kuò)增VvMas蛋白cDNA的編碼區(qū)

利用DNAMAN 7.0軟件拼接候選的葡萄VvMas蛋白cDNA序列。進(jìn)一步設(shè)計正向引物GSP-5和反向引物GSP-6進(jìn)行PCR擴(kuò)增VvMas蛋白cDNA的編碼區(qū)。引物序列如下：

GSP-5：5’-ATGAAAGGCGTCTTTTCGGCGCCAG-3’

GSP-6：5’-TTACACAAGACATCTACTTTTCCAA-3’

以PN40024葉片總RNA經(jīng)Oligo(dT)反轉(zhuǎn)錄為模板，用高保真的FastPfu酶，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件為95℃1min，隨后95℃20s，53℃20s和72℃1min，進(jìn)行40個循環(huán)，最后72℃延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得1224bp長度的擴(kuò)增片段。

綜合上述步驟的結(jié)果，獲得了目的cDNA序列，其核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID NO：1所示。序列表中序列SEQ ID NO：1由1224個堿基組成，自5’端第1位-第1224位堿基為其開放閱讀框，編碼具有序列表中序列SEQ ID NO：2所示的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。序列表中序列SEQ ID NO：2由407個氨基酸殘基組成。將該基因命名為VvMas，將其編碼的蛋白命名為VvMas。

實施例2 VvMas基因過表達(dá)載體的構(gòu)建

將實施例1中測序鑒定正確的含有序列表SEQ ID NO：1所示核苷酸的DNA片段用BamH I和Sac I進(jìn)行雙酶切，用1％瓊脂糖凝膠回收DNA片段，通過T₄DNA連接酶將回收的VvMas基因片段與含有雙35S啟動子pYPx245質(zhì)粒連接，酶切鑒定和序列分析測定獲得了含有葡萄VvMas基因的重組質(zhì)粒AH128。該表達(dá)載體還包含gusA報告基因和帶內(nèi)含子卡那霉素抗性標(biāo)記基因，載體如圖1所示。

實施例3VvMas基因轉(zhuǎn)化擬南芥

將實施例2構(gòu)建的葡萄VvMas基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-VvMas用蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥，具體方法如下：

1.農(nóng)桿菌的準(zhǔn)備

(1)將pCAMBIA1301-VvMas用電擊法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404菌株(Biovector Co.,LTD)，得到含有pCAMBIA1301-VvMas的重組農(nóng)桿菌，并涂布于含有卡那霉素抗性的平板篩選轉(zhuǎn)化子。

(2)挑取農(nóng)桿菌單菌接種于5mL LB液體培養(yǎng)基(利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL)中，28℃，250rpm培養(yǎng)20h。

(3)取1mL菌液轉(zhuǎn)接入20-30mL LB液體培養(yǎng)基(利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL)中，28℃，250rpm培養(yǎng)約12h，測OD 600≈1.5。

(4)8000rpm，4℃，10min離心收集菌體，重懸于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化滲透液(5％蔗糖，0.05％Silwet L-77)并稀釋至OD 600≈0.8。

2.擬南芥蘸花法轉(zhuǎn)化

(1)將擬南芥的花薹浸入上述侵染液中，輕輕攪動約10s后取出，全部轉(zhuǎn)化完畢后，用保鮮袋罩住擬南芥，以保持濕潤環(huán)境，水平放置，22℃避光培養(yǎng)，24h后去掉保鮮袋直立培養(yǎng)。

(2)初次轉(zhuǎn)化四天后，可再進(jìn)行一次轉(zhuǎn)化，重復(fù)兩次，總共轉(zhuǎn)化三次，這樣可以對花序上發(fā)育的不同時期的花蕾進(jìn)行轉(zhuǎn)化，提高轉(zhuǎn)化效率。

(3)生長約兩個月后，收集種子，4℃冰箱儲存待用。

經(jīng)過蘸花法轉(zhuǎn)化的擬南芥生長約兩個月后，正常開花結(jié)子。

實施例3 VvMas基因轉(zhuǎn)水稻

將實施例2構(gòu)建的葡萄VvMas基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-VvMas轉(zhuǎn)化水稻，具體方法如下：

1.農(nóng)桿菌的準(zhǔn)備

(1)將pCAMBIA1301-VvMas用電擊法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株(Biovector Co.,LTD)，得到含有pCAMBIA1301-VvMas的重組農(nóng)桿菌，并涂布于含有卡那霉素抗性的平板篩選轉(zhuǎn)化子。

(2)挑取農(nóng)桿菌單菌接種于5mL LB液體培養(yǎng)基(利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL)中，28℃，250rpm培養(yǎng)20h。

(3)取1mL菌液轉(zhuǎn)接入20-30mL LB液體培養(yǎng)基(利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL)中，28℃，250rpm培養(yǎng)約12h，測OD 600≈1.5。

(4)8000rpm，4℃，10min離心收集菌體，重懸于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化滲透液(5％蔗糖，0.05％Silwet L-77)并稀釋至OD 600≈0.8。

2.水稻成熟胚愈傷的獲取

(1)將成熟的水稻品種中花11號種子去掉穎殼，用70％酒精消毒1-2min；

(2)然后用20％的次氯酸鈉浸泡30-40min，用無菌蒸餾水沖洗4遍，將種子轉(zhuǎn)移到滅過菌的濾紙上吸干表面水分，然后接種在NB誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；

(3)暗培養(yǎng)7-10d后，當(dāng)盾片膨大，胚乳變軟時，去掉胚和芽，把剝下的胚性愈傷轉(zhuǎn)移到NB繼代培養(yǎng)基上，大約3w繼代一次，繼代2-3次后就可以作為受體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

3.農(nóng)稈菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織

(1)選取良好的胚性愈傷組織放于上述侵染液中，浸泡30min；

(2)將愈傷組織取出，用無菌濾紙吸去多余菌液，然后置于NB共培養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)至剛有菌落出現(xiàn)(大約2-3d)；

(3)用無菌水振蕩清洗3-4次，直至上清液完全清潔為止，用500mg/L頭孢霉素溶液振蕩清洗40min；

(4)取出愈傷組織，放入只帶濾紙的無菌培養(yǎng)皿中0.4m/s風(fēng)干4h，轉(zhuǎn)入NB篩選培養(yǎng)基篩選兩輪(每輪3-4w)；

(5)將抗性愈傷進(jìn)行預(yù)分化2-3w，然后轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)2-3w；

(6)待幼芽長至約1cm時轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基培養(yǎng)30d左右；

(7)揭去封口膜煉苗培養(yǎng)一周左右，然后移栽到土中。

實施例4 VvMas基因轉(zhuǎn)基因擬南芥植株P(guān)CR檢測

1.轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的篩選

(1)稱25-30mg種子放入1.5mL離心管；

(2)1mL 75％乙醇消毒1min(不停搖晃振蕩)，8000rpm離心5s，去上清；

(3)加入1mL過濾后的漂白粉(2.5％)消毒15min(不停搖晃振蕩，充分消毒)，8000rpm離心5s，去上清；

(4)無菌水洗滌3-4次；

(5)將種子均勻的播撒到1/2MS平板(潮霉素50μg/mL)上，Parafilm膜封口，4℃冰箱放置兩天，22℃，16h光照培養(yǎng)10天。

(6)將抗性植株移栽到盆中培養(yǎng)，苗稍大后，進(jìn)行GUS活性檢測，選出陽性植株(T₁)培養(yǎng)至開花結(jié)實，收集T₁植株上所結(jié)T₂種子，進(jìn)一步篩選得到T₃種子。

2.轉(zhuǎn)基因擬南芥植株P(guān)CR檢測

(1)試驗方法

用CTAB法提取T₃擬南芥轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的基因組DNA。用常規(guī)方法進(jìn)行PCR檢測，所使用的VvMas基因引物為：primer 1：5’-ACAGCGTCTCCGACCTGATGCA-3’和primer2：5’-AGTCAATGACCGCTGTTATGCG-3’。在0.2mL Eppendorf離心管中加入10×PCR buffer 2μL、4dNTP(10mol/L)1μL、引物(10μmol/L)均為1μL、模板DNA(50ng/uL)2μL、Taq DNA聚合酶0.25μL，加ddH₂O至總體積20μL。反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃復(fù)性30s，72℃延伸2min，共35個循環(huán)。

(2)試驗結(jié)果

電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果見圖2(圖2中，泳道M為Maker；泳道W：水；泳道P：陽性對照(重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-VvMas)；泳道Col-0：野生型擬南芥植株；泳道#1-#5：為轉(zhuǎn)化pCAMBIA1301-VvMas的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株)。從圖中可見，轉(zhuǎn)化pCAMBIA1301-VvMas的擬南芥擬轉(zhuǎn)基因植株和陽性對照擴(kuò)增出591bp的目標(biāo)條帶，表明VvMas基因已經(jīng)整合到擬南芥的基因組中，并證明這些再生植株為轉(zhuǎn)基因植株；野生型擬南芥植株沒有擴(kuò)增出591bp的目標(biāo)條帶。轉(zhuǎn)基因植株為后續(xù)功能分析。

實施例5 VvMas基因轉(zhuǎn)基因水稻植株P(guān)CR檢測

(1)試驗方法

用CTAB法提取T₂水稻轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的基因組DNA。用常規(guī)方法進(jìn)行PCR檢測，所使用的VvMas基因引物為：primer 1：5’-ACAGCGTCTCCGACCTGATGCA-3’和primer2：5’-AGTCAATGACCGCTGTTATGCG-3’。在0.2mL Eppendorf離心管中加入10×PCR buffer 2μL、4dNTP(10mol/L)1μL、引物(10μmol/L)均為1μL、模板DNA(50ng/uL)2μL、Taq DNA聚合酶0.25μL，加ddH₂O至總體積20μL。反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃復(fù)性30s，72℃延伸2min，共35個循環(huán)。

(2)試驗結(jié)果

電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果見圖3(圖3中，泳道M為Maker；泳道W：水；泳道P：陽性對照(重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-VvMas)；泳道WT：野生型水稻植株；泳道OE1-OE11：為轉(zhuǎn)化pCAMBIA1301-VvMas的水稻轉(zhuǎn)基因植株)。從圖中可見，轉(zhuǎn)化pCAMBIA1301-VvMas的水稻擬轉(zhuǎn)基因植株和陽性對照擴(kuò)增出591bp的目標(biāo)條帶，表明VvMas基因已經(jīng)整合到水稻的基因組中，并證明這些再生植株為轉(zhuǎn)基因植株；野生型水稻植株沒有擴(kuò)增出591bp的目標(biāo)條帶。轉(zhuǎn)基因植株為后續(xù)功能分析。

實施例6 VvMas基因轉(zhuǎn)基因擬南芥植株耐鹽性鑒定

(1)試驗方法

將轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型種子在1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)2w后，將植株移栽到盆中培養(yǎng)2w后，進(jìn)行鹽脅迫處理。用含有300mM NaCl的1/2霍格蘭營養(yǎng)液每個2d灌溉1次，每次200mL，處理4w，觀察植株生長情況并照相、統(tǒng)計存活率。

(2)試驗結(jié)果

結(jié)果顯示，通過耐鹽性盆栽鑒定，結(jié)果見圖4，鹽處理4w后，轉(zhuǎn)基因植株的生長狀態(tài)顯著優(yōu)于野生型植株，轉(zhuǎn)基因植株的存活率顯著高于野生性植株。表明過表達(dá)VvMas基因顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的耐鹽性。

實施例7 VvMas基因轉(zhuǎn)基因水稻植株耐鹽性鑒定

1.轉(zhuǎn)基因水稻植株生長勢比較

(1)試驗方法

將轉(zhuǎn)基因水稻材料和野生型材料的種子消毒，種子播種在MS固體平板上，種子發(fā)芽2-3d后，選取發(fā)芽狀態(tài)一致的種子，分別播種在MS和MS+NaCl(200mM)的不同中指管培養(yǎng)基上，苗生長7-10d之后，不同處理的苗長勢開始出現(xiàn)差異，進(jìn)行照相和生長勢統(tǒng)計，包括苗長和鮮重數(shù)據(jù)。

(2)試驗結(jié)果

結(jié)果顯示，在鹽脅迫處理條件下，結(jié)果見圖5，轉(zhuǎn)基因材料和野生型WT材料均因為鹽脅迫條件的存在，植株變?。坏寝D(zhuǎn)基因材料和野生型WT相比，生長狀態(tài)相對較好，生長勢數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，轉(zhuǎn)基因材料的的苗長和鮮重均優(yōu)于野生型WT材料。

2.轉(zhuǎn)基因水稻植株耐鹽性水培鑒定

(1)試驗方法

將純合的T₂轉(zhuǎn)基因水稻和野生型水稻種子接種在MS培養(yǎng)基上，生長大約3-4d。挑選長勢一致的幼苗，移栽到96孔PCR板(其底部已經(jīng)被剪掉)中，每隔1d更換一次營養(yǎng)液，避免苗根部長菌，正常生長4w后；將其轉(zhuǎn)移到200mM NaCl霍格蘭溶液中進(jìn)行脅迫處理2w，觀察其表型，進(jìn)行照相并調(diào)查其存活率。

(2)試驗結(jié)果

結(jié)果顯示，在鹽脅迫處理條件2w后，結(jié)果見圖6，轉(zhuǎn)基因材料與野生型材料相比，差異很明顯，轉(zhuǎn)基因材料的生長狀態(tài)顯著優(yōu)于野生型材料，轉(zhuǎn)基因植株的存活率顯著高于野生性植株。表明過表達(dá)VvMas基因顯著提高轉(zhuǎn)基因水稻植株的耐鹽性。

3.轉(zhuǎn)基因水稻植株耐鹽性盆栽鑒定

(1)試驗方法

為了進(jìn)一步驗證轉(zhuǎn)基因水稻材料的耐鹽性，將純合的T₂轉(zhuǎn)基因水稻和野生型水稻種子表面消毒，用純凈水催芽，接種在MS培養(yǎng)基上，生長大約3-4d。挑選長勢一致的幼苗，種植在以營養(yǎng)土：蛭石＝1:2的營養(yǎng)土中，注意每天澆水，等到植株長到4片真葉時開始進(jìn)行鹽脅迫處理。用含有200mM NaCl的1/2霍格蘭營養(yǎng)液每個2d灌溉1次，每次200mL，處理2w，觀察其表型，進(jìn)行照相并調(diào)查其存活率。

(2)試驗結(jié)果

圖7結(jié)果顯示在鹽脅迫處理條件2w后，耐鹽盆栽實驗表明轉(zhuǎn)基因材料與野生型材料相比，差異很明顯，轉(zhuǎn)基因材料的生長狀態(tài)顯著優(yōu)于野生型材料，轉(zhuǎn)基因植株的存活率顯著高于野生性植株。表明過表達(dá)VvMas基因顯著提高轉(zhuǎn)基因水稻植株的耐鹽性。

<110> 淮陰工學(xué)院

<120> 蛋白VvMas、編碼基因及其在提高植物耐鹽性中的應(yīng)用

<130> 20161118002

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1224

<212> DNA

<213> Vitis vinifera

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1224)

<400> 1

atgaaaggcg tcttttcggc gccaggagat tacatccact tcaagtctca ggtccctctt 60

cacaagatcc ccattggcac aaagcagtgg cggtattatg attttggtcc aaaagtggtc 120

cctccactta tttgtcttcc tgggacagca ggaactgcag atgtctatta caaacagata 180

atgtcattgt ccataaaggg ttaccgggtg atctctgttg atattcctcg cgtatggaac 240

catcatgagt ggattcaagc atttgaaaag tttttggatg ctattgatgt gcaccatata 300

catctttatg gcacatccct tggaggcttc ctggcacaac tttttgctca gcatcgtcca 360

agacgggtta ggtcgttgat tctctcaaat tcatttttgg agacacgcag tttctcatct 420

gcaatgccat gggcccctat tgtcagttgg accccttctt ttttgctgaa gagatatgtc 480

ttaacgggaa ttccagatgg cccccatgaa ccatttattg cagattcagt agactttgtt 540

gtttcccagg ttgaaacact ctcaagagag gacttggcct ccaggttgac cttgactgtt 600

gatgctgctt ccattggacc tcttcttctc tcagattcat tcatcactct aatggataca 660

aatgactact gttcaattcc tcaacaactc aaagatcagc tgagtgaaag gtaccctgga 720

gcaaggcgag catacttaaa aactggaggt gatttcccat ttctttcacg ttcagatgaa 780

gtaaacctac atcttcagtt acacctgaga cgagttgggg tggaagcccg tccagatttg 840

gtcaagggta tctcaaagga tggtagtggt gggagttcta gtgaaaagaa tgatgaaaga 900

gaagattcag atgttcctcc taaggacaat gggggaagtc ctgaaagccc ttccactgaa 960

acccaattgc cagaggctcc agaaagttcg ggttctcata gcttagatga ccagctcctc 1020

agcaatgcaa aggtttgctt caccagtcct gaacatgtga ggcttcccat atctcatgca 1080

ttttttgaga aacagcaaga cattgtatcc acaaggtttg tccaaccggc ttgggagatt 1140

tttattcttt gtctgcttcc tctctatgtg gaaacaatgt acattacttg gattttttgt 1200

tggaaaagta gatgtcttgt gtaa 1224

<210> 2

<211> 407

<212> PRT

<213> Vitis vinifera

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(407)

<400> 2

Met Lys Gly Val Phe Ser Ala Pro Gly Asp Tyr Ile His Phe Lys Ser

1 5 10 15

Gln Val Pro Leu His Lys Ile Pro Ile Gly Thr Lys Gln Trp Arg Tyr

20 25 30

Tyr Asp Phe Gly Pro Lys Val Val Pro Pro Leu Ile Cys Leu Pro Gly

35 40 45

Thr Ala Gly Thr Ala Asp Val Tyr Tyr Lys Gln Ile Met Ser Leu Ser

50 55 60

Ile Lys Gly Tyr Arg Val Ile Ser Val Asp Ile Pro Arg Val Trp Asn

65 70 75 80

His His Glu Trp Ile Gln Ala Phe Glu Lys Phe Leu Asp Ala Ile Asp

85 90 95

Val His His Ile His Leu Tyr Gly Thr Ser Leu Gly Gly Phe Leu Ala

100 105 110

Gln Leu Phe Ala Gln His Arg Pro Arg Arg Val Arg Ser Leu Ile Leu

115 120 125

Ser Asn Ser Phe Leu Glu Thr Arg Ser Phe Ser Ser Ala Met Pro Trp

130 135 140

Ala Pro Ile Val Ser Trp Thr Pro Ser Phe Leu Leu Lys Arg Tyr Val

145 150 155 160

Leu Thr Gly Ile Pro Asp Gly Pro His Glu Pro Phe Ile Ala Asp Ser

165 170 175

Val Asp Phe Val Val Ser Gln Val Glu Thr Leu Ser Arg Glu Asp Leu

180 185 190

Ala Ser Arg Leu Thr Leu Thr Val Asp Ala Ala Ser Ile Gly Pro Leu

195 200 205

Leu Leu Ser Asp Ser Phe Ile Thr Leu Met Asp Thr Asn Asp Tyr Cys

210 215 220

Ser Ile Pro Gln Gln Leu Lys Asp Gln Leu Ser Glu Arg Tyr Pro Gly

225 230 235 240

Ala Arg Arg Ala Tyr Leu Lys Thr Gly Gly Asp Phe Pro Phe Leu Ser

245 250 255

Arg Ser Asp Glu Val Asn Leu His Leu Gln Leu His Leu Arg Arg Val

260 265 270

Gly Val Glu Ala Arg Pro Asp Leu Val Lys Gly Ile Ser Lys Asp Gly

275 280 285

Ser Gly Gly Ser Ser Ser Glu Lys Asn Asp Glu Arg Glu Asp Ser Asp

290 295 300

Val Pro Pro Lys Asp Asn Gly Gly Ser Pro Glu Ser Pro Ser Thr Glu

305 310 315 320

Thr Gln Leu Pro Glu Ala Pro Glu Ser Ser Gly Ser His Ser Leu Asp

325 330 335

Asp Gln Leu Leu Ser Asn Ala Lys Val Cys Phe Thr Ser Pro Glu His

340 345 350

Val Arg Leu Pro Ile Ser His Ala Phe Phe Glu Lys Gln Gln Asp Ile

355 360 365

Val Ser Thr Arg Phe Val Gln Pro Ala Trp Glu Ile Phe Ile Leu Cys

370 375 380

Leu Leu Pro Leu Tyr Val Glu Thr Met Tyr Ile Thr Trp Ile Phe Cys

385 390 395 400

Trp Lys Ser Arg Cys Leu Val

405

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> GSP-1

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<400> 3

ctgagacgag ttggggtgga a 21

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> GSP-2

<220>

<221> misc_feature

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<400> 4

gttttcccag tcacgac 17

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> GSP-3

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(25)

<400> 5

gacttggcct ccaggttgac cttga 25

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<212> DNA

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<220>

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<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

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<212> DNA

<213> Artificial

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<221> misc_feature

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(25)

<400> 8

ttacacaaga catctacttt tccaa 25