本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵物提取技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種海洋真菌爪曲霉溴代縮酚酸環(huán)醚類化合物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

目前在臨床治療中發(fā)現(xiàn)病原微生物的耐藥性越來越強(qiáng)，尤其是耐甲氧基青霉素金黃色葡萄球菌（MRSA）、銅綠假單胞菌（俗稱綠膿桿菌）和白色假絲酵母（俗稱白色念珠菌）造成的感染越來越嚴(yán)重，很多傳統(tǒng)抗生素已基本喪失療效，因此有必要尋找新型的抗生素來應(yīng)對(duì)此挑戰(zhàn)。此外，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)因?yàn)檫^度使用各種化學(xué)合成農(nóng)藥，造成嚴(yán)重的食品、土壤及水污染，并經(jīng)過食物鏈危及人體健康和生態(tài)平衡，農(nóng)藥殘留也嚴(yán)重阻礙了我國的農(nóng)產(chǎn)品出口；而生物農(nóng)藥具有不易產(chǎn)生抗藥性、對(duì)非靶生物安全、環(huán)境友好且易于自然降解等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于人類健康、環(huán)境保護(hù)及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。海洋真菌來源的抗生素及殺蟲劑具有易于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)、高效、易于克服抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，易于實(shí)現(xiàn)藥源穩(wěn)定供給，具有較好的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)與環(huán)境效益。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有抗生素及殺蟲劑的缺陷和不足，提供一種提取自海洋真菌爪曲霉的溴代縮酚酸環(huán)醚類化合物，該化合物具有抗真菌、抗細(xì)菌活性和殺蟲活性，在制備抗真菌劑、抗細(xì)菌劑及農(nóng)用殺蟲劑中具有廣泛的應(yīng)用前景。

本發(fā)明的目的是提供一種海洋真菌爪曲霉溴代縮酚酸環(huán)醚類化合物。

本發(fā)明的另一目的是提供上述化合物的制備方法。

本發(fā)明的再一目的是提供上述化合物的應(yīng)用。

本發(fā)明的上述目的是用過以下技術(shù)方案給予實(shí)現(xiàn)的。

本發(fā)明采用的海洋真菌爪曲霉（Aspergillus unguis）CGMCC No.3372菌種，于2009年10月28日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC），保藏編號(hào)為CGMCC No.3372，株號(hào)為DLEP2008001。

一種海洋真菌爪曲霉（Aspergillus unguis）溴代縮酚酸環(huán)醚類化學(xué)物，其特征在于，所述化學(xué)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如（）所示：

（）

上述海洋真菌爪曲霉溴代縮酚酸環(huán)醚類化學(xué)物的制備方法包括如下步驟：

S1. 發(fā)酵：將爪曲霉DLEP2008001接種于真菌培養(yǎng)基中靜置發(fā)酵后，分別收集菌絲體和發(fā)酵液；；

S2. 粗提：將步驟S1的發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯萃取后濃縮，菌絲體經(jīng)有機(jī)溶劑提取后濃縮，合并后得粗提物；

S3. 分離純化：將步驟S2的粗提物進(jìn)行硅膠柱梯度層析，經(jīng)硅膠薄層層析檢測(cè)，將含有目標(biāo)物質(zhì)的洗脫組分繼續(xù)進(jìn)行硅膠柱、凝膠柱層析和正相制備液相色譜分離純化得到目標(biāo)化合物；

其中，步驟S1所述真菌液體培養(yǎng)基的配方為：每升中含有如下組分：土豆汁400～600 mL，NaBr 15～25g，蔗糖15～25g，純水或自來水400～600 mL。

優(yōu)選地，所述真菌液體培養(yǎng)基的配方為：每升中含有如下組分：土豆汁500 mL，NaBr 20 g，蔗糖20 g，純水或自來水500 mL。

具體地，上述海洋真菌爪曲霉溴代縮酚酸環(huán)醚類化學(xué)物的制備方法包括如下步驟：

S1. 發(fā)酵：將爪曲霉（Aspergillus unguis）CGMCC No.3372接種于真菌液體培養(yǎng)基中靜置發(fā)酵，發(fā)酵2～4天后，加入終濃度為0.5～2 mM（優(yōu)選1mM）的普魯卡因溶液，繼續(xù)發(fā)酵18～22天，過濾，分別收集菌絲體和發(fā)酵液；

S2. 粗提：將步驟S1獲得的發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯萃取并濃縮，將步驟S1獲得的菌絲體用有機(jī)溶劑提取并濃縮，將所得濃縮物合并，即為粗提物；

其中，所述有機(jī)溶劑為氯仿、丙酮、乙酸乙酯、乙醇、甲醇中一種或幾種；

S3. 分離純化：a. 將步驟S2獲得的粗提物經(jīng)硅膠柱層析，用石油醚-二氯甲烷或石油醚-氯仿進(jìn)行預(yù)洗脫，繼而用氯仿-甲醇或二氯甲烷-甲醇進(jìn)行梯度洗脫，收集以洗脫液體積比100:0～100:1梯度的洗脫的組分；組分特征為硅膠薄層層析板上展開劑為體積比15:1的氯仿-甲醇溶液展開下，比移值為0.29～0.74的混合物組分；

b. 將步驟a收集的洗脫組分再進(jìn)行硅膠柱層析，洗脫液為體積比5:1的石油醚-丙酮；

c. 將步驟b收集的洗脫組分進(jìn)行葡聚糖凝膠柱層析，洗脫液為甲醇，流速0.5～0.7 mL/min；

d. 將步驟c收集的洗脫組分進(jìn)行正向制備液相色譜純化，洗脫液為體積比3～5:1（優(yōu)選4:1）的氯仿-石油醚，在硅膠柱填充20～30g（優(yōu)選25 g）硅膠、流速2～4 mL/min（優(yōu)選3 mL/min）情況下，收集保留時(shí)間為14～28 min的組分；

e. 將步驟d收集的洗脫組分繼續(xù)進(jìn)行正向制備液相色譜純化，洗脫液為純氯仿，在硅膠柱填充10～15g（優(yōu)選12 g）硅膠、流速1～3 mL/min（優(yōu)選2mL/min）情況下，收集保留時(shí)間為14～35 min的主峰，得到收集物。

優(yōu)選地，步驟a或b所述硅膠柱層析的硅膠為200～300目。

另外，具體地，所述溴代縮酚酸環(huán)醚類化合物在薄層色譜上的比移值及化學(xué)顯色特征如下：層析展開劑為純氯仿時(shí)，所述化合物在GF254薄層硅膠板上的Rf值為0.26，254nm紫外線照射下呈單個(gè)、均勻的黑色～暗藍(lán)色斑點(diǎn)，茴香醛硫酸顯色為棕褐色。

優(yōu)選地，所述化合物在高效液相分析條件下保留時(shí)間為4.0～5.0 min的單一色譜峰。

更優(yōu)選地，所述高效液相色譜分析條件為Acquity UPLC?BEH C18柱，填料粒徑1.7微米，柱尺寸2.1 mm×50 mm，流動(dòng)相為添加萬分之一體積的改性劑甲酸的乙腈水溶液，0～2.5 min乙腈比例為60%，2.5～2.6 min乙腈比例線性升至100%，2.6～3.0 min乙腈比例為100%，3.0～3.1 min乙腈比例線性降至60%，3.1～5.0 min乙腈比例為60%，流速0.3 ml/min。

優(yōu)選地，所述溴代縮酚酸環(huán)醚類化合物在常溫常壓下為無色針晶。

經(jīng)抗菌實(shí)驗(yàn)得出，本發(fā)明所述化合物對(duì)白色假絲酵母的MIC值為6.4 μmol/L，具有抑制白色假絲酵母的活性；對(duì)銅綠假單胞菌的MIC為1.6 μmol/L，表明該化合物具有抑制銅綠假單胞菌生長的活性；對(duì)耐甲氧基青霉素的金黃色葡萄球菌的MIC值為25.6 μmol/L，具有抑制MRSA的活性；對(duì)鹵蟲的半致死劑量LC50為12.0 μmol/L，表明其具有殺蟲活性。

所以，上述溴代縮酚酸環(huán)醚類化學(xué)物在抗真菌、抗細(xì)菌或殺蟲上的應(yīng)用，以及在制備抗真菌劑、抗細(xì)菌劑或殺蟲劑中的應(yīng)用，都應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

優(yōu)選地，所述真菌為白色假絲酵母。

優(yōu)選地，所述細(xì)菌為革蘭氏陰性菌。

更優(yōu)選地，所述革蘭氏陰性菌為銅綠假單胞桿菌。

另外，更優(yōu)選地，所述細(xì)菌為銅綠假單胞桿菌或耐甲氧基青霉素金黃色葡萄球菌。

優(yōu)選地，所述蟲為農(nóng)業(yè)害蟲。

更優(yōu)選地，所述農(nóng)業(yè)害蟲為鹵蟲、線蟲、甜菜夜蛾、蚜蟲、庫蚊幼蟲或朱砂葉螨等害蟲。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：

本發(fā)明獲得了一種新的海洋真菌爪曲霉溴代縮酚酸環(huán)醚類化合物，具有良好的抗真菌、抗細(xì)菌活性與殺蟲活性，而且化合物制備方法簡單，易于大規(guī)模生產(chǎn)，在制備抗真菌劑、抗細(xì)菌劑或農(nóng)用殺蟲劑中具有廣泛的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述溴代縮酚酸環(huán)醚類化合物的核磁共振氫譜。

圖2為本發(fā)明所述溴代縮酚酸環(huán)醚類化合物的核磁共振碳譜。

圖3為本發(fā)明所述溴代縮酚酸環(huán)醚類化合物的ESI^-質(zhì)譜。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作出進(jìn)一步地詳細(xì)闡述，所述實(shí)施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。

本發(fā)明所述海洋真菌爪曲霉（Aspergillus unguis）CGMCC No.3372菌種，于2009年10月28日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC），保藏編號(hào)為CGMCC No.3372，株號(hào)為DLEP2008001。

實(shí)施例1 海洋真菌溴代縮酚酸環(huán)醚類化合物的制備方法

1. 發(fā)酵

將爪曲霉（Aspergillus unguis）CGMCC No.3372接種于真菌液體培養(yǎng)基中靜止發(fā)酵，發(fā)酵2天后，加入終濃度為1mM的普魯卡因溶液，繼續(xù)發(fā)酵20天，過濾，分別收集菌絲體和發(fā)酵液。

其中，所述真菌液體培養(yǎng)基的配方為：

每升中含有如下組分：土豆汁500 mL，NaBr 20 g，蔗糖20 g，純水或自來水500 mL。

2. 粗提

將步驟1獲得的發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯萃取三次，減壓濃縮，得濃縮液。同時(shí)將步驟1獲得的菌絲體用有甲醇提取液提取三次，減壓濃縮，得濃縮液。將所得濃縮物合并，即為粗提物；

3. 分離純化

a. 將步驟2獲得的粗提物經(jīng)硅膠柱層析，用石油醚-氯仿進(jìn)行預(yù)洗脫，繼而用氯仿-甲醇進(jìn)行梯度洗脫，收集以洗脫液體積比100:0～100:1梯度的洗脫的組分；組分特征為硅膠薄層層析板上展開劑為體積比15:1的氯仿-甲醇溶液展開下，比移值為0.29～0.74的混合物組分；

b. 將步驟a收集的洗脫組分再進(jìn)行硅膠柱層析，洗脫液為體積比5:1的石油醚-丙酮；

c. 將步驟b收集的洗脫組分進(jìn)行葡聚糖凝膠柱層析，洗脫液為甲醇，流速0.5～0.7 mL/min；

d. 將步驟c收集的洗脫組分進(jìn)行正向制備液相色譜純化，洗脫液為體積比4:1的氯仿-石油醚，在硅膠柱填充25 g硅膠、流速3 mL/min情況下，收集保留時(shí)間為14～28 min的組分；

e. 將步驟d收集的洗脫組分繼續(xù)進(jìn)行正向制備液相色譜純化，洗脫液為純氯仿，在硅膠柱填充12 g硅膠、流速2 mL/min情況下，收集保留時(shí)間為14～35 min的主峰；所收集目標(biāo)物質(zhì)還符合下述特征：

（1）TLC檢測(cè)收集在254nm紫外線照射下呈單個(gè)、均勻的黑色～暗藍(lán)色斑點(diǎn)，茴香醛硫酸顯色為棕褐色的物質(zhì)；

（2）在檢測(cè)用的薄層層析條件下Rf值為0.26的物質(zhì)；所述的檢測(cè)用薄層層析板為GF254硅膠板，展開劑為純氯仿；

（3）在檢測(cè)用的超高效液相分析條件下保留時(shí)間為4.36 min的單一色譜峰的組分；所述的檢測(cè)用高效液相色譜分析條件為Acquity UPLC?BEH C18柱，填料粒徑1.7微米，柱尺寸2.1 mm×50 mm，流動(dòng)相為添加萬分之一體積的改性劑甲酸的乙腈水溶液，0～2.5 min乙腈比例為60%，2.5～2.6 min乙腈比例線性升至100%，2.6～3.0 min乙腈比例為100%，3.0～3.1 min乙腈比例線性降至60%，3.1-5.0 min乙腈比例為60%，流速0.3 ml/min。

4、經(jīng)上述分離過程得到的化合物，確定為純化合物。

經(jīng)波譜分析，結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果顯示，其為一種溴代縮酚酸環(huán)醚類天然產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)式如（I）所示：

。

（I）

該化合物具有以下理化和波譜特性：

無色針晶，核磁共振氫譜 (¹H NMR，CDCl₃, 500 MHz) δ6.76 (s), 5.38 (q, 6.8), 2.46 (s), 2.33 (s), 1.95 (s) , 1.82 (dd, 6.8, 1.0)，如圖1所示。

核磁共振碳譜(¹³C NMR，CDCl₃, 125 MHz) δ162.0 (s), 160.2 (s), 156.5 (s), 148.8 (s), 145.3 (s), 142.9 (s), 142.5 (s), 136.1 (s), 132.1 (s), 128.1 (d), 116.1 (s), 115.3 (d), 114.5 (s), 108.0 (s), 99.6 (s), 21.7 (q), 17.9 (q), 14.5 (q), 10.6 (q)，如圖2所示。

ESI^-質(zhì)譜顯示準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-的同位素峰簇質(zhì)荷比為m/z 481/483/485，其峰強(qiáng)度為1：2：1，為典型的二溴代特征且與分子式C₁₉H₁₇O₅Br₂相符，如圖3所示。

實(shí)施例2 溴代縮酚酸環(huán)醚類化合物的抑真菌活性實(shí)驗(yàn)

1、白色假絲酵母（Candida albicans）是一種常見的條件致病真菌，可侵犯人體許多部位，引起皮膚念珠菌病、粘膜念珠菌病（鵝口瘡、口角炎、陰道炎最常見）以及內(nèi)臟及中樞神經(jīng)念珠菌病，是最常見的真菌病。臨床癥狀錯(cuò)綜復(fù)雜，急緩不一。近年來隨著抗生素、激素、免疫抑制劑的大劑量應(yīng)用，以及器官移植術(shù)的開展，念珠菌病發(fā)病率漸趨增高，并可危及生命造成嚴(yán)重后果。該菌已成為抗真菌藥物研發(fā)的重要針對(duì)目標(biāo)。

2、實(shí)驗(yàn)方法：

采用國際標(biāo)準(zhǔn)的微量肉湯稀釋法（National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1997. Reference methed for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts: approved standard M27-A, 7th ed. NCCLS, Wayne, Pa.）測(cè)定化合物對(duì)白色假絲酵母的最小抑菌濃度（MIC值）。

同時(shí)設(shè)置對(duì)照組：兩性霉素B。

3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

結(jié)果顯示，上述實(shí)施例1獲得的該溴代縮酚酸環(huán)醚類化合物對(duì)白色假絲酵母的MIC值為6.4 μmol/L，具有顯著的抑制白色假絲酵母的活性。

而且，兩性霉素B對(duì)白色假絲酵母的MIC值為12.8 μmol/L，本發(fā)明溴代縮酚酸環(huán)醚類化合物對(duì)白色假絲酵母的抑制活性顯著強(qiáng)于陽性對(duì)照兩性霉素B。

實(shí)施例3 溴代縮酚酸環(huán)醚類化合物的抑革蘭氏陰菌活性實(shí)驗(yàn)

1、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）又稱綠膿桿菌，是一種條件致病菌，也是醫(yī)院內(nèi)感染的主要病原菌之一?；即x性疾病、血液病和惡性腫瘤的患者，以及術(shù)后或某些治療后的患者易感染本菌。該菌常引起術(shù)后傷口感染，也可引起褥瘡、膿腫、化膿性中耳炎等。其引起的感染病灶可導(dǎo)致血行散播，而發(fā)生菌血癥和敗血癥。燒傷后感染了銅綠色假單胞菌可造成死亡。而且，隨著廣譜抗生素、激素以及免疫抑制劑的廣泛臨床使用，銅綠假單胞菌已對(duì)多種抗生素快速產(chǎn)生了耐藥性，使得臨床的抗感染治療顯得越來越困難。目前，針對(duì)該菌的藥物研發(fā)也是抗生素研發(fā)的一個(gè)重點(diǎn)。

2、實(shí)驗(yàn)方法：

采用國際標(biāo)準(zhǔn)的微量肉湯稀釋法（National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2003. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically, 5th ed. Approved standard M7–A6.）測(cè)定該化合物對(duì)銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度（MIC值）。

3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

上述實(shí)施例1獲得的該溴代縮酚酸環(huán)醚類化合物對(duì)銅綠假單胞菌的MIC為1.6 μmol/L，表明該化合物具有很好的抑制銅綠假單胞菌生長的活性。

實(shí)施例4 溴代縮酚酸環(huán)醚類化合物的抑革蘭氏陽性耐藥菌活性實(shí)驗(yàn)

1、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是非常常見的病菌，有時(shí)候它會(huì)進(jìn)入人體內(nèi)而引起感染。這種感染輕微的會(huì)在皮膚上長瘡和丘疹，嚴(yán)重的則可引起肺炎或血液感染。對(duì)葡萄球菌引起的感染通常用青霉素類的抗生素甲氧西林治療，在大部分情況下非常有效。但是有些葡萄球菌菌株對(duì)甲氧西林形成了抗藥性，也就是耐甲氧基青霉素的金黃色葡萄球菌（methicillin—resistant Staphylococcus aureus, MRSA）。1961年在英國發(fā)現(xiàn)了首例MRSA，之后以驚人的速度在世界范圍內(nèi)蔓延，是臨床最常見的革蘭氏陽性耐藥細(xì)菌，據(jù)估計(jì)每年大約有十萬人因?yàn)楦腥綧RSA而住院治療,也是新抗生素研發(fā)的重要靶標(biāo)病原微生物。

2、實(shí)驗(yàn)方法：

采用國際標(biāo)準(zhǔn)的微量肉湯稀釋法（National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2003. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically, 5th ed. Approved standard M7–A6.）測(cè)定化合物對(duì)耐甲氧基青霉素的金黃色葡萄球菌（MRSA）的最小抑菌濃度（MIC值）。

3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

上述實(shí)施例1獲得的該溴代縮酚酸環(huán)醚類化合物的MIC值為25.6 μmol/L，具有很好的抑制MRSA的活性。

實(shí)施例5 溴代縮酚酸環(huán)醚類化合物的殺蟲活性實(shí)驗(yàn)

1、鹵蟲（brine shrimp）又稱鹽水豐年蟲，屬節(jié)肢動(dòng)物門、甲殼綱、無甲目、鹽水豐年蟲科、鹵蟲屬，是一種具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的魚類餌料生物，也是一種對(duì)于毒素較為敏感的重要實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的2~3齡幼蟲可用于評(píng)價(jià)殺蟲劑的活性強(qiáng)弱。

2、殺蟲活性實(shí)驗(yàn)方法（詳見申請(qǐng)人論文Toxicology Mechanisms and Methods, 2012, 22(1), 23~30）。

3、鹵蟲孵化與收集：經(jīng)過室內(nèi)自然光刺激復(fù)蘇的凍存鹵蟲卵加入一個(gè)雙室連通器式培養(yǎng)裝置的孵化池中培養(yǎng)，連通器中盛有天然粗海鹽配制的海水（30 g/L），卵投放量為1 g/L，先關(guān)閉連通器通道。經(jīng)28℃下約2000勒克斯光照24小時(shí)孵化后，開啟連通器通道，并將孵化池遮光，而收集池保持光照12~24 h，進(jìn)行光誘導(dǎo)；然后關(guān)閉連通器通道，用開口光潤的移液槍頭吸取收集池中的鹵蟲幼蟲進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

4、鹵蟲生物致死法：將樣品在96孔板中用無水甲醇連續(xù)倍半稀釋成系列濃度，真空干燥除去有機(jī)溶劑，每孔加入200微升鹵蟲幼蟲懸液（含20~30只蟲體），并設(shè)置空白對(duì)照組，28℃培養(yǎng)24 h后在雙目體視顯微鏡下計(jì)數(shù)每孔中幼蟲總數(shù)及死亡數(shù)，計(jì)算每孔的校正死亡率，

校正死亡率=（對(duì)照組死亡率—處理孔死亡率）/對(duì)照組存活率×100%；

以校正死亡率—濃度的log2對(duì)數(shù)做圖，在線性較好的10%~90%死亡率區(qū)間取線性趨勢(shì)線，計(jì)算半致死劑量LC50。

5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

上述獲得的該溴代縮酚酸環(huán)醚類化合物的半致死劑量LC50為12.0 μmol/L，表明其具有殺蟲活性。

而且，硫酸銅對(duì)鹵蟲的LC50為102.4 μmol/L，溴代縮酚酸環(huán)醚類化合物對(duì)鹵蟲的殺蟲活性強(qiáng)于陽性對(duì)照硫酸銅。

另外，研究顯示，該化合物對(duì)線蟲、甜菜夜蛾、蚜蟲、庫蚊幼蟲或朱砂葉螨等害蟲，都有較好的殺蟲活性。