本發(fā)明涉及一種提高水蛭透明質(zhì)酸酶酶活的方法，屬于酶工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

透明質(zhì)酸酶是一類主要降解HA的酶的總稱，于1928年被Duran Reynals發(fā)現(xiàn)并稱為“擴(kuò)散因子”，1940年被Chain和Duthie正式命名為透明質(zhì)酸酶(hyaluronidase,HAase)。HAase廣泛存在于真核生物和原核生物中，是一種重要的生理活性物質(zhì)并在動物機(jī)體內(nèi)參與許多重要的生物學(xué)過程，例如細(xì)胞分裂、細(xì)胞間的連接、生殖細(xì)胞的活動、DNA的轉(zhuǎn)染、胚胎發(fā)育、受傷組織的修復(fù)以及正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞增生等。根據(jù)HAase的來源、催化機(jī)制和底物與產(chǎn)物特異性，HAase可以分為三類：內(nèi)切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.35，主要存在于哺乳動物以及蜜蜂、蛇、蜘蛛等毒液)、內(nèi)切-β-葡萄糖醛酸苷酶(EC 3.2.1.36，主要存在于水蛭)以及HA裂解酶(EC 4.2.2.1，主要存在于細(xì)菌、噬菌體以及真菌)。

第一類HAases和第三類HA裂解酶的相關(guān)研究已有較多文獻(xiàn)報道。第一類是來源于哺乳動物的透明質(zhì)酸4-糖基水解酶家族，這類HAase(EC 3.2.1.35)是具有水解和轉(zhuǎn)糖苷活性的糖苷酶，通過水解HA的β-1,4-糖苷鍵，產(chǎn)物以四糖HA分子為主。也可作用于硫酸軟骨素、4-硫酸軟骨素和6-硫酸軟骨素產(chǎn)生硫酸皮膚素產(chǎn)物。第一類中比較常見的有來自于哺乳動物的睪丸、蛇毒、蜂毒以及溶菌體的HAases。第三類為微生物HAases，這類HAase(EC 4.2.2.1)通過β-消除反應(yīng)裂解HA的β-糖苷鍵，產(chǎn)生以不飽和的雙糖分子2-acetamido-2-deoxy-3-O-(β-D-gluco-4-enepyranosyluronic acid)-D-glucose為主要產(chǎn)物。這類HA裂解酶來源于包括Clostridium,Micrococcus,Streptococcus,和Streptomyces等菌株，并且它們的底物特異性也不同。第二類代表性的HAase(EC 3.2.1.36)主要來源于水蛭，屬于透明質(zhì)酸3-糖基水解酶家族，通過水解HA的β-1,3-糖苷鍵，生產(chǎn)以四糖分子HA且還原端帶有葡萄糖醛酸為主的產(chǎn)物。水蛭來源的HAase對底物的專一性強(qiáng)，對硫酸軟骨素、4-硫酸軟骨素和6-硫酸軟骨素不具有活性，并且不具有轉(zhuǎn)糖苷活性。

HAase能夠降低組織HA的黏稠性，從而提高組織中液體滲透能力。許多病理變化過程往往伴隨著HAase和HA的變化，暗示它們可能起著重要的作用。同時HAase也可以改變機(jī)體內(nèi)一些藥物和生理活性物質(zhì)的分布狀況。因此，HAase作為一種藥理活性物質(zhì)可促使皮下輸液、局部積貯的滲出液或血液加快擴(kuò)散而利于吸收，廣泛用作臨床藥物滲透劑、促進(jìn)藥物的吸收、促進(jìn)手術(shù)及創(chuàng)傷后局部水腫或血腫消散。研究表明HAase對治療心肌梗塞效果顯著， 能夠降解心肌HA顯著減少間隙體積，阻止由缺血引起的動脈阻力增大，增加血流量。HAase在抗腫瘤方面也具有重要的作用，HAase能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，因此腫瘤細(xì)胞上結(jié)合的HAase可以作為腫瘤藥物作用的靶點(diǎn)。如它可以加強(qiáng)阿霉素對乳腺癌的抗癌能力，降低膀胱癌的復(fù)發(fā)率等。此外，HAase在臨床上也作為藥物擴(kuò)散助劑，眼科手術(shù)后用于降低眼內(nèi)壓，配合麻醉劑利多卡因鹽酸鹽使用可加快進(jìn)入麻醉狀態(tài)和延長麻醉時間。

水蛭HAase具有強(qiáng)力的抗菌活性，能溶解細(xì)菌體內(nèi)外被膜形成的抗體，從而增強(qiáng)藥物對宿主的治療效果。特別是水蛭HAase由于其底物專一性強(qiáng)，與其它來源的HAase相比，它不能降解軟骨素或硫酸軟骨素。雖然哺乳動物HAase作為“擴(kuò)散因子”被廣泛應(yīng)用于藥物擴(kuò)散助劑，然而這類HAase活性易受肝素抑制。因此，理論上來講，水蛭HAase活性不受肝素影響，在臨床上作為“藥物擴(kuò)散因子”、治療血栓、青光眼和其它藥用方面更具醫(yī)療價值意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的是提供一種酶活提高的透明質(zhì)酸酶突變體，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明的第二個目的是提供編碼所述透明質(zhì)酸酶突變體的基因。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述基因序列如SEQ ID NO.3所示。

本發(fā)明的第三個目的是提供表達(dá)所述透明質(zhì)酸酶突變體的載體或細(xì)胞系。

本發(fā)明的第四個目的是提供一種產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的基因工程菌，是以枯草芽孢桿菌為宿主，以pPNMK為載體，表達(dá)所述透明質(zhì)酸酶突變體。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述枯草芽孢桿菌為Bacillus subtilis168。

本發(fā)明的第五個目的是提供一種提高透明質(zhì)酸酶酶活的方法，是將SEQ ID NO.2所示透明質(zhì)酸酶氨基酸序列的L⁵⁰-G⁵⁷區(qū)域替換為SLESISPS，并將K¹²⁰-R¹²⁵替換為SKSKMQ，并將K¹⁶³-D¹⁶⁷區(qū)域替換為EGYGS，并將P²⁸⁰-W²⁸⁷區(qū)域替換為RHKDKPTG，并將V³⁰⁷-L³¹³區(qū)域替換為WSGFLNI，并將T³⁴⁴替換為K³⁴⁴。

本發(fā)明的第六個目的是提供一種提高透明質(zhì)酸酶酶活的生產(chǎn)方法，是將所述基因工程菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30～37℃培養(yǎng)16～72h。

本發(fā)明還提供所述透明質(zhì)酸酶在食品、生物、化工、醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述應(yīng)用包括制備含透明質(zhì)酸的醫(yī)藥配制品、保健品、化妝品。

有益效果：采用本發(fā)明的方法構(gòu)建的基因工程菌MHyal培養(yǎng)48小時后發(fā)酵酶活達(dá)到6030U/mL，與對照菌株相比酶活提高了500U/mL。

附圖說明

圖1為突變菌株和野生菌株的酶活變化趨勢圖。

具體實施方式

透明質(zhì)酸酶的DNS檢測分析方法：

透明質(zhì)酸酶專一作用于透明質(zhì)酸的葡萄糖苷酸鍵，產(chǎn)生具有還原端為葡萄糖醛酸小分子多糖。采用3，5—二硝基水楊酸(DNS)比色法測定水解透明質(zhì)酸產(chǎn)生的還原糖當(dāng)量，用分析純葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算酶活，用pH 5.5、50mM的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配制2mg mL^–1的透明質(zhì)酸底物，1mL反應(yīng)體系含有800μL的透明質(zhì)酸溶液、100μL的酶液，緩沖液補(bǔ)足至1mL。在38℃反應(yīng)20min，立即沸水終止反應(yīng)，采用DNS法測定產(chǎn)生的還原糖當(dāng)量(相當(dāng)于等量葡萄糖的還原力)，計算酶比活。為確保數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，DNS的吸光值控制在0.25-0.85之間。

表1引物

實施例1：采用突變的方法對功能區(qū)域進(jìn)行突變

在SEQ ID NO.1所示透明質(zhì)酸酶的基礎(chǔ)上，進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變。以Hyal基因(SEQ ID NO.4所示)為模板，設(shè)計引物，分別以F0和R2、F1和R4、F3和R6、F5和R0為引物(如表1所示)，進(jìn)行PCR。具體操作程序如下：以Hyal基因為模板(SEQ ID NO.4所示基因)1μmol、上下游引物各1μL、Primestar 25μL、無菌水22μL，混合于PCR管內(nèi)，混勻后置于PCR儀，按如下程序運(yùn)行：94℃3min，[94℃30s，55℃30s，72℃30s]×30,72℃5min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行柱回收，回收產(chǎn)物進(jìn)行Gibson重組，操作程序如下：加入PCR產(chǎn)物(體積＝0.02×片段長度/DNA濃度μL)，ExnaseII加入2μL，5×CE buffer 1μL，加入無菌水補(bǔ)足10μL 體系，與質(zhì)粒pPNMK在37℃30min，0℃5min連接，再將基因突變質(zhì)粒pP43-MHyal轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109，挑取長出的單菌落接種至含100μL/100mL氨芐的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h，離心收集菌體，提取質(zhì)粒。

將提取的質(zhì)粒pP43-MHyal轉(zhuǎn)入Bacillus subtilis 168，挑取陽性克隆MHyal，并將其接種至含100μL/100mL的卡納霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h，再將80μL菌液加入含800μL發(fā)酵培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基組分為30g/L蔗糖、20g/L酵母膏、2g/L蛋白胨、15.6g/L磷酸氫二鈉、5.94g/L磷酸二氫鉀)的96深孔板，在37℃、220rpm條件下培養(yǎng)48h。將發(fā)酵液3000rpm離心20min，使用DNS的方法通過酶活進(jìn)行篩選，篩選出酶活最高的菌株進(jìn)行發(fā)酵，每隔一段時間取樣、測酶活，并繪制出酶活變化趨勢圖(如圖1所示)。

采用與基因工程菌相同的載體和宿主表達(dá)Hyal基因(SEQ ID NO.4所示)，以其作為對照菌株，其它實施方式與基因工程菌相同。

與對照菌株相比，本發(fā)明構(gòu)建的基因工程菌MHyal培養(yǎng)48小時后發(fā)酵酶活達(dá)到6030U/mL，相比對照菌株提高了500U/mL(酶活提高了10％)。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大學(xué)

<120> 一種提高水蛭透明質(zhì)酸酶酶活的方法

<160> 17

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 488

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Lys Glu Ile Ala Val Thr Ile Asp Asp Lys Asn Val Ile Ala Ser

1 5 10 15

Val Ser Glu Ser Phe His Gly Val Ala Phe Asp Ala Ser Leu Phe Ser

20 25 30

Pro Lys Gly Leu Trp Ser Phe Val Asp Ile Thr Ser Pro Lys Leu Phe

35 40 45

Lys Ser Leu Glu Ser Ile Ser Pro Ser Tyr Phe Arg Val Gly Gly Thr

50 55 60

Phe Ala Asn Trp Leu Phe Phe Asp Leu Asp Glu Asn Asn Lys Trp Lys

65 70 75 80

Asp Tyr Trp Ala Phe Lys Asp Lys Thr Pro Glu Thr Ala Thr Ile Thr

85 90 95

Arg Arg Trp Leu Phe Arg Lys Gln Asn Asn Leu Lys Lys Glu Thr Phe

100 105 110

Asp Asp Leu Val Lys Leu Thr Ser Lys Ser Lys Met Gln Leu Leu Phe

115 120 125

Asp Leu Asn Ala Glu Val Arg Thr Gly Tyr Glu Ile Gly Lys Lys Met

130 135 140

Thr Ser Thr Trp Asp Ser Ser Glu Ala Glu Lys Leu Phe Lys Tyr Cys

145 150 155 160

Val Ser Glu Gly Tyr Gly Ser Asn Ile Asp Trp Glu Leu Gly Asn Glu

165 170 175

Pro Asp His Thr Ser Ala His Asn Leu Thr Glu Lys Gln Val Gly Glu

180 185 190

Asp Phe Lys Ala Leu His Lys Val Leu Glu Lys Tyr Pro Thr Leu Asn

195 200 205

Lys Gly Ser Leu Val Gly Pro Asp Val Gly Trp Met Gly Val Ser Tyr

210 215 220

Val Lys Gly Leu Ala Asp Gly Ala Gly Asp His Val Thr Ala Phe Thr

225 230 235 240

Leu His Gln Tyr Tyr Phe Asp Gly Asn Thr Ser Asp Val Ser Thr Tyr

245 250 255

Leu Asp Ala Thr Tyr Phe Lys Lys Leu Gln Gln Leu Phe Asp Lys Val

260 265 270

Lys Asp Val Leu Lys Asn Ser Arg His Lys Asp Lys Pro Thr Gly Leu

275 280 285

Gly Glu Thr Ser Ser Gly Tyr Asn Ser Gly Thr Lys Asp Val Ser Asp

290 295 300

Arg Tyr Trp Ser Gly Phe Leu Asn Ile Asp Lys Leu Gly Leu Ser Ala

305 310 315 320

Ala Asn Asn Val Lys Val Val Ile Arg Gln Thr Ile Tyr Asn Gly Tyr

325 330 335

Tyr Gly Leu Leu Asp Lys Asn Lys Leu Glu Pro Asn Pro Asp Tyr Trp

340 345 350

Leu Met His Val His Asn Ser Leu Val Gly Asn Thr Val Phe Lys Val

355 360 365

Asp Val Ser Asp Pro Thr Asn Lys Ala Arg Val Tyr Ala Gln Cys Thr

370 375 380

Lys Thr Asn Ser Lys His Thr Gln Ser Arg Tyr Tyr Lys Gly Ser Leu

385 390 395 400

Thr Ile Phe Ala Leu Asn Val Gly Asp Glu Asp Val Thr Leu Lys Ile

405 410 415

Asp Gln Tyr Ser Gly Lys Lys Ile Tyr Ser Tyr Ile Leu Thr Pro Glu

420 425 430

Gly Gly Gln Leu Thr Ser Gln Lys Val Leu Leu Asn Gly Lys Glu Leu

435 440 445

Lys Leu Val Ser Asp Gln Leu Pro Glu Leu Asn Ala Asp Glu Ser Lys

450 455 460

Thr Ser Phe Thr Leu Ser Pro Lys Thr Phe Gly Phe Phe Val Val Ser

465 470 475 480

Asp Ala Asn Val Glu Ala Cys Lys

485

<210> 2

<211> 489

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Lys Glu Ile Ala Val Thr Ile Asp Asp Lys Asn Val Ile Ala Ser

1 5 10 15

Val Ser Glu Ser Phe His Gly Val Ala Phe Asp Ala Ser Leu Phe Ser

20 25 30

Pro Lys Gly Leu Trp Ser Phe Val Asp Ile Thr Ser Pro Lys Leu Phe

35 40 45

Lys Leu Leu Glu Gly Leu Ser Pro Gly Tyr Phe Arg Val Gly Gly Thr

50 55 60

Phe Ala Asn Trp Leu Phe Phe Asp Leu Asp Glu Asn Asn Lys Trp Lys

65 70 75 80

Asp Tyr Trp Ala Phe Lys Asp Lys Thr Pro Glu Thr Ala Thr Ile Thr

85 90 95

Arg Arg Trp Leu Phe Arg Lys Gln Asn Asn Leu Lys Lys Glu Thr Phe

100 105 110

Asp Asp Leu Val Lys Leu Thr Lys Gly Ser Lys Met Arg Leu Leu Phe

115 120 125

Asp Leu Asn Ala Glu Val Arg Thr Gly Tyr Glu Ile Gly Lys Lys Met

130 135 140

Thr Ser Thr Trp Asp Ser Ser Glu Ala Glu Lys Leu Phe Lys Tyr Cys

145 150 155 160

Val Ser Lys Gly Tyr Gly Asp Asn Ile Asp Trp Glu Leu Gly Asn Glu

165 170 175

Pro Asp His Thr Ser Ala His Asn Leu Thr Glu Lys Gln Val Gly Glu

180 185 190

Asp Phe Lys Ala Leu His Lys Val Leu Glu Lys Tyr Pro Thr Leu Asn

195 200 205

Lys Gly Ser Leu Val Gly Pro Asp Val Gly Trp Met Gly Val Ser Tyr

210 215 220

Val Lys Gly Leu Ala Asp Gly Ala Gly Asp His Val Thr Ala Phe Thr

225 230 235 240

Leu His Gln Tyr Tyr Phe Asp Gly Asn Thr Ser Asp Val Ser Thr Tyr

245 250 255

Leu Asp Ala Thr Tyr Phe Lys Lys Leu Gln Gln Leu Phe Asp Lys Val

260 265 270

Lys Asp Val Leu Lys Asn Ser Pro His Lys Asp Lys Pro Leu Trp Leu

275 280 285

Gly Glu Thr Ser Ser Gly Tyr Asn Ser Gly Thr Lys Asp Val Ser Asp

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Arg Tyr Val Ser Gly Phe Leu Thr Leu Asp Lys Leu Gly Leu Ser Ala

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Ala Asn Asn Val Lys Val Val Ile Arg Gln Thr Ile Tyr Asn Gly Tyr

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Tyr Gly Leu Leu Asp Lys Asn Thr Leu Glu Pro Asn Pro Asp Tyr Trp

340 345 350

Leu Met His Val His Asn Ser Leu Val Gly Asn Thr Val Phe Lys Val

355 360 365

Asp Val Ser Asp Pro Thr Asn Lys Ala Arg Val Tyr Ala Gln Cys Thr

370 375 380

Lys Thr Asn Ser Lys His Thr Gln Ser Arg Tyr Tyr Lys Gly Ser Leu

385 390 395 400

Thr Ile Phe Ala Leu Asn Val Gly Asp Glu Asp Val Thr Leu Lys Ile

405 410 415

Asp Gln Tyr Ser Gly Lys Lys Ile Tyr Ser Tyr Ile Leu Thr Pro Glu

420 425 430

Gly Gly Gln Leu Thr Ser Gln Lys Val Leu Leu Asn Gly Lys Glu Leu

435 440 445

Lys Leu Val Ser Asp Gln Leu Pro Glu Leu Asn Ala Asp Glu Ser Lys

450 455 460

Thr Ser Phe Thr Leu Ser Pro Lys Thr Phe Gly Phe Phe Val Val Ser

465 470 475 480

Asp Ala Asn Val Glu Ala Cys Lys Lys

485

<210> 3

<211> 1470

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgaaagaga tcgcggtgac aatagacgat aagaacgtta ttgcctctgt ctccgaaagt 60

ttccatggcg ttgcctttga tgcgagttta ttttcaccga aagggttgtg gtcatttgtt 120

gacatcacat caccgaaatt gtttaagagc ttggagagca tctctccaag ctatttccgc 180

gtcggaggga cgtttgctaa ctggttattc tttgacctcg atgaaaacaa caaatggaaa 240

gactattggg cgtttaaaga taagacacct gagacagcaa cgatcacacg ccggtggctt 300

tttcgaaaac agaacaacct gaagaaagaa acttttgatg atctggtcaa actcaccagc 360

aagagcaaaa tgcagctgct gtttgattta aacgctgaag tcagaacagg ttatgaaatt 420

ggaaagaaaa tgacatccac atgggatagc agtgaagctg aaaaactctt caagtactgt 480

gtctccgagg gctatggaag caacattgac tgggaacttg gtaatgaacc ggatcatacg 540

tccgcacaca atcttactga aaaacaagta ggagaggact ttaaagccct gcataaagtg 600

ctggaaaaat atccgacgtt gaataaagga tcattagtgg gccctgacgt tggctggatg 660

ggagtgtctt atgtgaaagg actggcggac ggagccgggg atcatgtaac ggccttcacg 720

cttcaccagt actactttga cggcaatacc agcgatgtca gcacatacct ggacgctaca 780

tatttcaaaa agctacagca gctttttgat aaagtgaagg atgtccttaa aaatagcagg 840

cataaagata agccgaccgg cttaggagaa acctcttcag gctataattc tggcaccaaa 900

gatgtttcgg atcgttattg gagcggtttt cttaacatag acaaactggg tctgtctgcc 960

gcgaacaatg ttaaggtagt aattagacaa acgatctata atggatatta cggccttctg 1020

gacaaaaaca aacttgagcc gaatccagat tattggctga tgcatgtgca taactcgtta 1080

gtagggaata cggtctttaa agtggacgtt agtgatccta caaataaagc tagagtgtac 1140

gcacaatgca ccaaaacaaa ctcaaaacac actcagagtc gttactacaa gggctcatta 1200

acgatctttg ctttaaatgt tggggatgag gatgtgacgt tgaaaattga tcaatattct 1260

ggcaagaaga tttattcata tatacttaca cctgaaggcg gccaattgac ttcacaaaaa 1320

gttttattga atggtaaaga attaaaactt gtcagcgatc agttgccgga actgaatgca 1380

gacgagtcga agacctcgtt tactctgtcc ccgaagacat tcgggttctt tgtagtcagc 1440

gatgcaaatg ttgaagcgtg caaaaagtaa 1470

<210> 4

<211> 1468

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgaaagaga tcgcggtgac aatagacgat aagaacgtta ttgcctctgt ctccgaaagt 60

ttccatggcg ttgcctttga tgcgagttta ttttcaccga aagggttgtg gtcatttgtt 120

gacatcacat caccgaaatt gtttaagctc ttggagggtc tctctccagg ttatttccgc 180

gtcggaggga cgtttgctaa ctggttattc tttgacctcg atgaaaacaa caaatggaaa 240

gactattggg cgtttaaaga taagacacct gagacagcaa cgatcacacg ccggtggctt 300

tttcgaaaac agaacaacct gaagaaagaa acttttgatg atctggtcaa actcaccaaa 360

ggatctaaaa tgcggctgct gtttgattta aacgctgaag tcagaacagg ttatgaaatt 420

ggaaagaaaa tgacatccac atgggatagc agtgaagctg aaaaactctt caagtactgt 480

gtctccaaag gctatggaga taacattgac tgggaacttg gtaatgaacc ggatcatacg 540

tccgcacaca atcttactga aaaacaagta ggagaggact ttaaagccct gcataaagtg 600

ctggaaaaat atccgacgtt gaataaagga tcattagtgg gccctgacgt tggctggatg 660

ggagtgtctt atgtgaaagg actggcggac ggagccgggg atcatgtaac ggccttcacg 720

cttcaccagt actactttga cggcaatacc agcgatgtca gcacatacct ggacgctaca 780

tatttcaaaa agctacagca gctttttgat aaagtgaagg atgtccttaa aaatagccca 840

cataaagata agccgctctg gttaggagaa acctcttcag gctataattc tggcaccaaa 900

gatgtttcgg atcgttatgt aagcggtttt cttactcttg acaaactggg tctgtctgcc 960

gcgaacaatg ttaaggtagt aattagacaa acgatctata atggatatta cggccttctg 1020

gacaaaaaca cacttgagcc gaatccagat tattggctga tgcatgtgca taactcgtta 1080

gtagggaata cggtctttaa agtggacgtt agtgatccta caaataaagc tagagtgtac 1140

gcacaatgca ccaaaacaaa ctcaaaacac actcagagtc gttactacaa gggctcatta 1200

acgatctttg ctttaaatgt tggggatgag gatgtgacgt tgaaaattga tcaatattct 1260

ggcaagaaga tttattcata tatacttaca cctgaaggcg gccaattgac ttcacaaaaa 1320

gttttattga atggtaaaga attaaaactt gtcagcgatc agttgccgga actgaatgca 1380

gacgagtcga agacctcgtt tactctgtcc ccgaagacat tcgggttctt tgtagtcagc 1440

gatgcaaatg ttgaagcgtg caaaaagt 1468

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Ser Leu Glu Ser Ile Ser Pro Ser

1 5

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<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Ser Lys Ser Lys Met Gln

1 5

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

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Glu Gly Tyr Gly Ser

1 5

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Arg His Lys Asp Lys Pro Thr Gly

1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Trp Ser Gly Phe Leu Asn Ile

1 5

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ccggaattcc accaccacca ccaccacatg aaagagatcg cggtga 46

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

attgtttnnb nnbttggagn nbnnbtctcc annbtatttc 40

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

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<210> 13

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

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<210> 14

<211> 42

<212> DNA

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<400> 14

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<210> 15

<211> 40

<212> DNA

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<400> 15

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<210> 16

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ttctcctaan nbnnbcggct tatctttatg nnbgctattt t 41

<210> 17

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

aataatctgg attcggctca agnnbgtttt tgtc 34