本發(fā)明涉及一種乳酸菌生產(chǎn)β-甘露聚糖酶的方法。
背景技術(shù)：
β-甘露聚糖酶(β-mannanase，簡稱甘露聚糖酶，EC3.2.1.78)，是能夠?qū)Ｒ恍运夂?1,4-甘露糖苷鍵的甘露多糖的內(nèi)切水解酶，屬于半纖維素酶類。甘露聚糖酶在工業(yè)尤其是食品行業(yè)有廣泛用途，如用于果汁澄清進(jìn)而提高出汁率；含有2-10個殘基的降解產(chǎn)物，即寡聚糖可促進(jìn)人體腸道益生菌生長等。微生物甘露聚糖酶具有來源廣、活性高、作用條件溫和等優(yōu)點，是基礎(chǔ)研究及工業(yè)應(yīng)用的最重要來源。產(chǎn)甘露聚糖酶酶微生物類群主要是真菌中的霉菌和細(xì)菌中的芽孢桿菌，但往往因為發(fā)酵周期長或生物安全性差等原因，限制了工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模和應(yīng)用領(lǐng)域。
乳酸菌是一類發(fā)酵糖類產(chǎn)生乳酸的無芽孢、革蘭氏染色陽性細(xì)菌的總稱。乳酸菌在自然界中分布廣泛，具有多種生態(tài)學(xué)功能。更重要的是，人體中的乳酸菌，具有改善腸胃功能、調(diào)節(jié)菌群平衡、抑制膽固醇吸收、抗腫瘤預(yù)防癌癥、消除自由基抗衰老等作用，積極的生理學(xué)意義和益生功能不容忽視。
魔芋是多年生天南星科草本根莖植物，主要產(chǎn)自東南亞地區(qū)。世界范圍內(nèi)，我國是魔芋種植量最大的國家。因此，以魔芋為原料制成的粉末魔芋粉，廉價易得。魔芋粉中富含葡甘聚糖，是微生物胞外甘露聚糖酶的理想碳源。
目前，真菌產(chǎn)甘露聚糖酶發(fā)酵周期較長，細(xì)菌產(chǎn)甘露聚糖酶存在生物安全隱患，乳酸菌產(chǎn)甘露聚糖酶的活性較低。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明是要解決現(xiàn)有真菌產(chǎn)甘露聚糖酶發(fā)酵周期較長，產(chǎn)甘露聚糖酶細(xì)菌存在生物安全隱患，乳酸菌產(chǎn)甘露聚糖酶活性較低的問題，提供一種利用魔芋粉為碳源培養(yǎng)乳酸菌生產(chǎn)β-甘露聚糖酶的方法。
本發(fā)明利用魔芋粉為碳源培養(yǎng)乳酸菌生產(chǎn)β-甘露聚糖酶的方法，包括以下步驟：
一、將-80℃保存的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)HDRS1接種于MRS固體培養(yǎng)基平板上，25～32℃恒溫靜置倒置培養(yǎng)36～60小時；
二、挑取單菌落至MRS液體培養(yǎng)基中，25～32℃、120～180rpm振蕩培養(yǎng)24～48小時；
三、5000～9000轉(zhuǎn)/分離心10～15分鐘，棄上清收集菌體，以空白液體MRS培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至108個/mL，作為種子液；
四、以1％～3％(v/v)接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、140rpm振蕩培養(yǎng)36～48小時，得發(fā)酵液；
五、將發(fā)酵液于5000～9000轉(zhuǎn)/分離心10～15分鐘，棄菌體，上清即為甘露聚糖酶粗酶液。
步驟一所述MRS固體培養(yǎng)基配方為：葡萄糖1g/100mL、蛋白胨1g/100mL、吐溫800.1mL/100mL、磷酸氫二鉀0.2g/100mL、乙酸鈉0.5g/100mL、檸檬酸三銨0.2g/100mL、硫酸鎂0.02g/100mL、瓊脂2g/100mL和蒸餾水，pH值6.0-6.5。
步驟二所述MRS液體培養(yǎng)基配方為：葡萄糖1g/100mL、蛋白胨1g/100mL、吐溫800.1mL/100mL、磷酸氫二鉀0.2g/100mL、乙酸鈉0.5g/100mL、檸檬酸三銨0.2g/100mL、硫酸鎂0.02g/100mL和蒸餾水，pH值6.0-6.5。
步驟四所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：魔芋粉1g/100m、蛋白胨1g/100mL、吐溫80 0.1mL/100mL、磷酸氫二鉀0.2g/100mL、乙酸鈉0.5g/100mL、檸檬酸三銨0.2g/100mL、硫酸鎂0.02g/100mL和蒸餾水pH值6.0-6.5。
本發(fā)明中甘露聚糖酶活性測定方法為改良的DNS法：以pH 4.0檸檬酸緩沖液配制0.5％去除還原糖的魔芋粉溶液為反應(yīng)底物。取發(fā)酵液上清2mL，加入2mL反應(yīng)底物，50℃保溫15分鐘。加入DNS試劑3mL，沸水浴中煮沸5分鐘，冷卻后加蒸餾水補(bǔ)足體積至25mL。540nm下測定吸光度值，計算還原糖量。一個酶活單位以每分鐘產(chǎn)生1微摩爾甘露糖計。
本發(fā)明制備的甘露聚糖酶粗酶液，酶活為100-200U/mL。
步驟一所述植物乳桿菌HDRS1為乳桿菌屬細(xì)菌，2009年4月13日保藏于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，編號：CCTCC M209069，已在專利“一種工業(yè)發(fā)酵酸菜的方法”(授權(quán)公告號101697751B)中公布。
本發(fā)明的有益效果：
本發(fā)明首次提出以植物乳桿菌為出發(fā)菌株，以魔芋粉為唯一碳源發(fā)酵生產(chǎn)甘露聚糖酶，以液態(tài)發(fā)酵工藝培養(yǎng)乳酸菌生產(chǎn)甘露聚糖酶，制備含有高活性甘露聚糖酶的粗酶液。
乳酸菌是公認(rèn)的益生菌，植物乳桿菌也包含在內(nèi)。以植物乳桿菌生產(chǎn)甘露聚糖酶，可以解決目前產(chǎn)酶微生物帶來的生物安全隱患，大大拓展含有該菌株的甘露聚糖酶粗酶液的應(yīng)用范圍，如食品、飼料和保健品領(lǐng)域。
本方法首次提出已魔芋粉作為植物乳桿菌產(chǎn)甘露聚糖酶的發(fā)酵底物。相比培養(yǎng)乳酸菌用的碳源葡萄糖，顯著降低了成本。因為魔芋粉在我國種植廣泛，廉價易得。以魔芋粉為唯一碳源供給植物乳桿菌HDRS1發(fā)酵產(chǎn)甘露聚糖酶，使得該方法的工業(yè)化應(yīng)用成為可能。
本發(fā)明方法獲得的粗酶液中，甘露聚糖酶活性高達(dá)100-200U/mL。與真菌發(fā)酵產(chǎn)甘露聚糖酶相比，本方法縮短了發(fā)酵周期。本發(fā)明中植物乳桿菌HDRS1發(fā)酵周期僅需1.5～2天，而通常真菌產(chǎn)甘露聚糖酶發(fā)酵周期需要4～7天。
綜上，本發(fā)明拓展了產(chǎn)甘露聚糖酶的微生物來源，確保了生物安全性因為拓展了應(yīng)用范疇，生產(chǎn)成本低，周期短，生產(chǎn)菌株無生物安全隱患，且本發(fā)明方法生產(chǎn)的粗酶液酶活顯著高于現(xiàn)有報道。對于拓展產(chǎn)甘露聚糖酶的微生物來源，深入挖掘乳酸菌應(yīng)用范疇具有重要意義。
具體實施方式
本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實施方式，還包括各具體實施方式間的任意組合。
具體實施方式一：本實施方式利用魔芋粉為碳源培養(yǎng)乳酸菌生產(chǎn)β-甘露聚糖酶的方法，包括以下步驟：
一、將-80℃保存的植物乳桿菌HDRS1接種于MRS固體培養(yǎng)基平板上，25～32℃恒溫靜置倒置培養(yǎng)36～60小時；
二、挑取單菌落至MRS液體培養(yǎng)基中，25～32℃、120～180rpm振蕩培養(yǎng)24～48小時；
三、然后于5000～9000轉(zhuǎn)/分離心10～15分鐘，棄上清收集菌體，以空白液體MRS培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至108個/mL，作為種子液；
四、以1％～3％接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、140rpm振蕩培養(yǎng)36～48小時，得發(fā)酵液；
五、將發(fā)酵液于5000～9000轉(zhuǎn)/分離心10～15分鐘，棄菌體，上清即為甘露聚糖酶粗酶液。
步驟一所述植物乳桿菌HDRS1為乳桿菌屬細(xì)菌，2009年4月13日保藏于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，編號：CCTCC M209069。
具體實施方式二：本實施方式與具體實施方式一不同的是：步驟一所述MRS固體培養(yǎng)基配方為：葡萄糖1g/100mL、蛋白胨1g/100mL、吐溫80 0.1mL/100mL、磷酸氫二鉀0.2g/100mL、乙酸鈉0.5g/100mL、檸檬酸三銨0.2g/100mL、硫酸鎂0.02g/100mL、瓊脂2g/100mL和蒸餾水，pH值6.0-6.5。其它與具體實施方式一相同。
具體實施方式三：本實施方式與具體實施方式一或二不同的是：步驟一中28～31℃恒溫靜置倒置培養(yǎng)40～55小時。其它與具體實施方式一或二相同。
具體實施方式四：本實施方式與具體實施方式一或二不同的是：步驟一中30℃恒溫靜置倒置培養(yǎng)48小時。其它與具體實施方式一或二相同。
具體實施方式五：本實施方式與具體實施方式一至四之一不同的是：步驟二所述MRS液體培養(yǎng)基配方為：葡萄糖1g/100mL、蛋白胨1g/100mL、吐溫80 0.1mL/100mL、磷酸氫二鉀0.2g/100mL、乙酸鈉0.5g/100mL、檸檬酸三銨0.2g/100mL、硫酸鎂0.02g/100mL和蒸餾水，pH值6.0-6.5。其它與具體實施方式一至四之一相同。
具體實施方式六：本實施方式與具體實施方式一至五之一不同的是：步驟二中于28～31℃、130～160rpm振蕩培養(yǎng)30～40小時。其它與具體實施方式一至五之一相同。
具體實施方式七：本實施方式與具體實施方式一至五之一不同的是：步驟二中于30℃、140rpm振蕩培養(yǎng)24小時。其它與具體實施方式一至五之一相同。
具體實施方式八：本實施方式與具體實施方式一至七之一不同的是：步驟三中于8000轉(zhuǎn)/分離心10～15分鐘。其它與具體實施方式一至七之一相同。
具體實施方式九：本實施方式與具體實施方式一至八之一不同的是：步驟四中以2％接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基。其它與具體實施方式一至八之一相同。
具體實施方式十：本實施方式與具體實施方式一至九之一不同的是：步驟四所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：魔芋粉1g/100mL、蛋白胨1g/100mL、吐溫80 0.1mL/100mL、磷酸氫二鉀0.2g/100mL、乙酸鈉0.5g/100mL、檸檬酸三銨0.2g/100mL、硫酸鎂0.02g/100mL和蒸餾水pH值6.0-6.5。其它與具體實施方式一至九之一相同。
具體實施方式十一：本實施方式與具體實施方式一至十之一不同的是：步驟五中將發(fā)酵液于8000轉(zhuǎn)/分離心10～15分鐘。其它與具體實施方式一至十之一相同。
下面對本發(fā)明的實施例做詳細(xì)說明，以下實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實施，給出了詳細(xì)的實施方案和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實施例。
實施例1：本實施例利用魔芋粉為碳源培養(yǎng)乳酸菌生產(chǎn)β-甘露聚糖酶的方法，包括以下步驟：
一、將-80℃保存的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)HDRS1接種于MRS固體培養(yǎng)基平板上，30℃恒溫靜置倒置培養(yǎng)48小時；
二、挑取單菌落至MRS液體培養(yǎng)基中，30℃、140rpm振蕩培養(yǎng)24小時；
三、然后于8000轉(zhuǎn)離心10分鐘，棄上清收集菌體，以空白液體MRS培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至108個/mL，作為種子液；
四、以2％(v/v)接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、140rpm振蕩培養(yǎng)72小時，得發(fā)酵液；
五、將發(fā)酵液于8000轉(zhuǎn)離心10分鐘，棄菌體，上清即為甘露聚糖酶粗酶液。
步驟一所述植物乳桿菌HDRS1為乳桿菌屬細(xì)菌，2009年4月13日保藏于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，編號：CCTCC M209069。
本方法中甘露聚糖酶活性測定方法為改良的DNS法：以pH 4.0檸檬酸緩沖液配制0.5％去除還原糖的魔芋粉溶液為反應(yīng)底物。取發(fā)酵液上清2mL，加入2mL反應(yīng)底物，50℃保溫15分鐘。加入DNS試劑3mL，沸水浴中煮沸5分鐘，冷卻后加蒸餾水補(bǔ)足體積至25mL。540nm下測定吸光度值，計算還原糖量。一個酶活單位以每分鐘產(chǎn)生1微摩爾甘露糖計。
本實施例制備的粗酶液甘露聚糖酶活力為195.6U/mL。
本實施例以廉價原料魔芋粉為唯一碳源培養(yǎng)基，以植物乳桿菌為生產(chǎn)菌株，發(fā)酵生產(chǎn)甘露聚糖酶。該方法生產(chǎn)成本低、發(fā)酵周期短僅為1.5天、生產(chǎn)菌株無生物安全隱患。