本發(fā)明涉及腸炎沙門氏菌檢測
技術領域：
，具體涉及一種腸炎沙門氏菌PCR檢測引物、檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術：
：腸炎沙門氏菌是最常見的沙門氏菌感染類型之一，是一種人獸共患的重要病原菌，其主要引起胃腸炎以及食物中毒。腸炎沙門氏菌在自然界廣泛存在，無宿主特異性，各種動物源性食物是引起沙門氏菌感染的最常見媒介物。各種家禽、家畜在飼養(yǎng)、屠宰、加工、運輸?shù)忍幚磉^程中均有污染的可能，人類通常是由于攝入被污染的蛋類或未完全煮熟的肉類而被感染的。近年來，由腸炎沙門氏菌致病的病例不斷增多，已經(jīng)引起了公共衛(wèi)生的關注，建立實用、快速、高效的腸炎沙門氏菌檢驗方法尤為必要。傳統(tǒng)的腸炎沙門氏菌的檢測主要是依靠細菌，通過生化反應及血清學特征來進行鑒定，整個操作過程費時費力，復雜繁瑣，通常需要3-5天才能出檢測結(jié)果。PCR技術以其操作簡便、快速、靈敏度高、特異性強等特點，逐步應用于腸炎沙門氏菌的檢測中。目前，已針對一些靶基因建立了相應的PCR檢測方法，但是，現(xiàn)有技術中選擇的許多靶點特異性不強，易出現(xiàn)假陽性。雖然，也有用多重PCR方法檢測腸炎沙門氏菌的報道，但多重PCR在實驗成本和技術要求上都較普通PCR高，因而也存在一定的不足之處。技術實現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術存在的上述不足，本發(fā)明所要解決的技術問題是：針對現(xiàn)有技術中腸炎沙門氏菌PCR檢測方法或特異性不強、容易出現(xiàn)假陽性，或存在實驗成本和技術要求高的技術問題，而提供一種特異性強、檢測靈敏度高、實驗成本低、操作簡便的腸炎沙門氏菌PCR檢測引物、檢測試劑盒及檢測方法。為了解決上述技術問題，本發(fā)明采用如下技術方案實現(xiàn)：一種腸炎沙門氏菌PCR檢測引物，所述引物包括核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的下游引物。本發(fā)明針對現(xiàn)有技術中PCR反應檢測腸炎沙門氏菌選擇的靶基因不合理，容易造成檢測特異性低、容易出現(xiàn)假陽性的技術問題，特別通過生物信息學分析，從腸炎沙門氏菌基因組DNA序列中找到了特異性更好的DNA序列（如SEQIDNO.1所示），將該序列作為本發(fā)明腸炎沙門氏菌的檢測靶點，并針對該靶點設計了檢測引物，經(jīng)過檢測采用本發(fā)明檢測引物檢測靶點基因具有單一特異性，檢測結(jié)果特異性強的優(yōu)異效果，檢測結(jié)果更加真實可靠。一種腸炎沙門氏菌檢測試劑盒，組分包括所述腸炎沙門氏菌PCR檢測引物。本發(fā)明腸炎沙門氏菌檢測試劑盒中的PCR檢測引物特異性強，檢測精度高，采用本發(fā)明檢測試劑盒對腸炎沙門氏菌進行PCR擴增檢測，無需使用抗血清，降低了檢測成本，且檢測時間短，避免了采用傳統(tǒng)檢測方法繁瑣、耗時的缺點。進一步，其組分還包括dNTP、TaqDNA聚合酶、Mg2+和PCR反應緩沖液。這些組分可以為擴增反應提供堿基原料，催化PCR反應擴增，使擴增反應的反應環(huán)境更加適宜擴增，增強擴增的特異性，并為擴增反應提供能量，促進擴增反應更快進行。更進一步，所述腸炎沙門氏菌PCR檢測引物的濃度為10μM，所述dNTP的濃度為2.5mM，所述Mg2+的濃度為25mM，所述PCR反應緩沖液為10×PCR反應緩沖液。采用這樣濃度的組分，可以使擴增反應的穩(wěn)定性和特異性更強，能夠獲得清晰的擴增片段，電泳中不容易出現(xiàn)彌散背景，電泳產(chǎn)物判斷結(jié)果更加準確。一種腸炎沙門氏菌的PCR檢測方法，以待檢測樣品DNA為模板，所述腸炎沙門氏菌PCR檢測引物為引物進行PCR擴增，對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，在紫外線下觀察電泳結(jié)果，若在488bp處出現(xiàn)單一擴條帶，則判定待檢測樣品中含有腸炎沙門氏菌。這樣，以待檢測樣品DNA為模板，本發(fā)明檢測引物為引物進行PCR擴增，若待檢測樣品中含有腸炎沙門氏菌，則會在引物和PCR反應作用下進行腸炎沙門氏菌特征基因片段的擴增，進而擴增產(chǎn)物進行電泳分析時，能夠在488bp處檢測到單一擴條帶，若待檢測樣品中沒有腸炎沙門氏菌，則不會進行PCR反應擴增出特定基因片段，進而不能在488bp處檢測到單一擴條帶，達到了對待檢測樣品中是否含有腸炎沙門氏菌進行檢測的目的。作為優(yōu)化，所述待檢測樣品DNA采用如下方法獲得：將待檢測樣品接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，對培養(yǎng)菌液進行離心和沉淀重懸處理后，將重懸菌液煮沸后冷卻，將冷卻后的重懸菌液離心取上清液，獲得待檢測樣品DNA。采用這樣的方法獲取待檢測樣品DNA，方法簡單易于操作，且獲得的樣品DNA模板在后續(xù)PCR擴增過程中擴增效果好，檢測結(jié)果可靠性強。作為優(yōu)化，將待檢測樣品于接種于LB液體培養(yǎng)基中于37℃下培養(yǎng)8h，取培養(yǎng)菌液于10000r/min下離心2min后棄上清液，重懸沉淀菌體得到重懸菌液，對重懸菌液再次于10000r/min下離心2min后再次重懸菌液，得到二次重懸菌液，將二次重懸菌液于沸水中煮沸，于-20℃冷卻，將冷卻后的二次重懸菌液于12000r/min下離心10min后取上清液，得到待檢測樣品DNA。采用多次離心重懸的方法，可以使獲得的待檢測樣品DNA中雜質(zhì)更少，避免了在PCR反應中帶來干擾問題。作為另一優(yōu)化，PCR反應體系以25μL計，組分為：滅菌雙蒸水12μL、10×PCR反應緩沖液2.5μL、10μM權利要求1所述上游引物1.0μL、10μM權利要求1所述下游引物1.0μL、2.5mMdNTP1.5μL、Taq酶1.0μL、25mMMg2+2.0μL和待檢測樣品DNA4.0μL。作為進一步改進，所述PCR反應的條件為：先于94℃預變性5min；接著開始循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃變性30s，60℃退火40s，72℃延伸40s，共30個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后于72℃延伸5min，最后降溫至16℃，完成PCR反應操作。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：1、采用本發(fā)明的檢測引物和PCR檢測方法檢測腸炎沙門氏菌，檢測時間短，無需使用抗血清，降低了檢測成本，避免了采用傳統(tǒng)檢測方法繁瑣、耗時等缺點。2、本發(fā)明的檢測方法可以用于檢測某些抗血清不能檢測出的菌株，如抗原不表達的菌株，彌補免疫檢測的缺陷。3、本發(fā)明PCR檢測方法的檢測靶點具有單一特異性，檢測結(jié)果特異性好，不容易產(chǎn)生誤判；且檢測方法操作簡便，耗時短，無需進行大量的結(jié)果分析步驟，檢測結(jié)果判斷簡單。4、采用本發(fā)明PCR擴增檢測方法進行檢測成本低，試驗技術要求不高，便于進行市場化推廣。附圖說明圖1為PCR檢測方法特異性評價實驗凝膠電泳圖；圖2為PCR檢測方法靈敏性評價實驗凝膠電泳圖。具體實施方式下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。本實施案例在以本發(fā)明技術為前提下進行實施，現(xiàn)給出詳細的實施方式和具體的操作過程來說明本發(fā)明具有創(chuàng)造性，但本發(fā)明的保護范圍不限于以下的實施例。1、引物設計針對現(xiàn)有技術中PCR反應檢測腸炎沙門氏菌靶基因選擇不合理，檢測特異性低，容易出現(xiàn)假陽性的技術問題，本發(fā)明申請人通過生物信息學分析，從腸炎沙門氏菌基因組DNA序列中尋找特異的DNA序列（序列如SEQIDNO.1所示），將其作為檢測腸炎沙門氏菌的靶點，將此序列輸入PrimerPremier5.0引物設計軟件設計引物，設置GC范圍為40-60%，產(chǎn)物大小范圍為100-1000bp，從備選引物中選擇引物，結(jié)果選擇的腸炎沙門氏菌檢測引物如下：如SEQIDNO.2所示的上游引物，核苷酸序列為5’tgtcagaaaccgctctggttatcg3’；如SEQIDNO.3所示的下游引物，核苷酸序列為5’attccaggtggaaagcattaacgac3’。引物由寶生物工程大連有限公司合成。2、模板準備將腸炎沙門氏菌接種至20mLLB液體培養(yǎng)液中，于37℃搖床培養(yǎng)8h；取1mL菌液于1.5mL離心管中，10,000r/min離心2min，棄上清；向離心沉淀物中加入500μL滅菌雙蒸水重懸菌體，再次于10,000r/min離心2min，棄上清，向離心沉淀中加100μL滅菌雙蒸水再次重懸菌體；將再次重懸菌體于沸水中煮6min，立即取出，于-20℃冷卻后，再以12,000r/min離心10min，取上清液于1.5mL離心管中，放置-20℃作為PCR擴增的DNA模板。3、方法建立腸炎沙門氏菌檢測試劑盒，其組分包括如SEQIDNO.2所示的上游引物、如SEQIDNO.3所示的下游引物、dNTP、TaqDNA聚合酶、Mg2+、水和PCR反應緩沖液。25μLPCR樣品檢測體系組成為：滅菌雙蒸水12μL，10×PCRBuffer2.5μL，上游引物（10μM）1.0μL，下游引物（10μM）1.0μL，dNTP（2.5mM）1.5μL，Taq酶1.0μL，Mg2+（25mM）2.0μL，模板DNA4.0μL。以無菌水為模板作為陰性對照，即25μLPCR陰性對照體系組成為：滅菌雙蒸水12μL，10×PCRBuffer2.5μL，上游引物（10μM）1.0μL，下游引物（10μM）1.0μL，dNTP（2.5mM）1.5μL，Taq酶1.0μL，Mg2+（25mM）2.0μL，無菌水4.0μL。PCR反應參數(shù)為：首先94℃預變性5min；接著開始循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃變性30s，60℃退火40s，72℃延伸40s，共30個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸5min，最后降溫至16℃，結(jié)束操作。依據(jù)下述判斷標準確定樣品中是否含腸炎沙門氏菌：取3μL上述PCR擴增產(chǎn)物，經(jīng)1.5wt.%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈照射下進行觀察，如果PCR擴增產(chǎn)物電泳后在488bp處出現(xiàn)單一擴條帶，則表面樣品中含腸炎沙門氏菌，如果在488bp處未出現(xiàn)單一擴條帶，則表面樣品中不含腸炎沙門氏菌。以上述“2、模板準備”得到的腸炎沙門氏菌DNA作為模板DNA，按照“3、方法建立”建立的體系組成和PCR反應方法進行PCR擴增，擴增結(jié)果顯示在488bp處觀察到單一擴增條帶，說明所建立的PCR方法能夠成功檢測出腸炎沙門氏菌。4、特異性評價取腸炎沙門氏菌(SalmonellaEnteriditis)、雞沙門氏菌(SalmonellaGallinarum)、豬霍亂沙門氏菌(SalmonellaCholeraesuis)、鼠傷寒沙門氏菌(SalmonellaTyphimurium)、甲型副傷寒沙門氏菌(SalmonellaParatyphiA)、乙型副傷寒沙門氏菌(SalmonellaParatyphiB)、雞白痢沙門氏菌(SalmonellaPullorosis)、都柏林沙門氏菌(SalmonellaDublin)、傷寒沙門氏菌(SalmonellaTyphi)、鴨沙門氏菌(SalmonellaAnatum)等11株菌，其血清型及菌株編號見表1，按照“2、模板準備”的方法培養(yǎng)各菌株并提取各菌株基因組DNA模板。按照與“3、方法建立”中相同的體系和反應方法對提取得到的各菌株基因組DNA模板分別進行PCR擴增，分別取4mL各菌株基因組DNA作為模板加入PCR反應體系中進行PCR反應，反應產(chǎn)物經(jīng)1.5wt.%凝膠電泳，紫外燈下觀察，結(jié)果如圖1和表1所示，圖1中1泳道:DNAMarker；2泳道:ddH2O陰性對照；3泳道:鼠傷寒沙門氏菌；4泳道:雞沙門氏菌；5泳道:豬霍亂沙門氏菌；6泳道:傷寒沙門氏菌；7泳道:腸炎沙門氏菌；8泳道:腸炎沙門氏菌。圖1可見，腸炎沙門氏菌的PCR擴增產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后在488bp處出現(xiàn)單一條帶，而其它菌株的PCR擴增產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后無任何條帶，說明所建立的PCR檢測方法可以特異檢測到腸炎沙門氏菌。表1特異性試驗所用菌株及結(jié)果菌株編號菌數(shù)結(jié)果SalmonellaTyphimuriumATCC140281-SalmonellaGallinarumCMCC507701-SalmonellaCholeraesuisAS1.11901-SalmonellaTyphiCMCC500861-SalmonellaEnteriditisCVCC33771+SalmonellaEnteriditisCMCC503351+SalmonellaPullorosisCVCC20011-SalmonellaParatyphiAATCC91501-SalmonellaParatyphiBCMCC500041-SalmonellaDublinCVCC21991-SalmonellaAnatumCMCC507741--:PCR結(jié)果為陰性；+:PCR結(jié)果為陽性5、靈敏性試驗按照“2、模板準備”的方法提取腸炎沙門氏菌基因組DNA模板，經(jīng)測定所提取的DNA模板溶液中DNA濃度為18.73μg/mL，用無菌水10倍稀釋該模板DNA，共稀釋4個梯度，每個稀釋度分別取4mL作為模板DNA加入與“3、方法建立”中相同的PCR反應體系中進行PCR反應，反應產(chǎn)物經(jīng)1.5wt.%凝膠電泳，紫外燈下觀察，結(jié)果如圖2所示，圖2中1泳道:DNAMarker；2泳道:ddH2O陰性對照；3泳道:74.92ng；4泳道:7.492ng；5泳道:749.2pg；6泳道:74.92pg。圖2表明，3-5泳道在488bp處能看到清晰的條帶，其對應的DNA濃度分別為74.92ng/PCR、7.492ng/PCR和0.7492ng/PCR，濃度低于0.7492ng/PCR以后泳道在該處看不到條帶，說明PCR檢測靈敏度為749.2pg/PCR，具有較高的靈敏度。6、腸炎沙門氏菌疑似菌株檢測利用所建立的腸炎沙門氏菌特異性PCR檢測方法，對從食品中自行分離的45株疑似沙門氏菌進行了檢測，這些食品樣品采集于鄉(xiāng)村農(nóng)貿(mào)市場，參照國標GB4789.4-2010進行樣品處理和疑似菌株分離。按照與“2、模板準備”相同的方法提取各個分離得到的菌株的基因組DNA模板，采用與“3、方法建立”中相同的體系和反應方法對提取得到的各個分離菌株的基因組DNA模板分別進行PCR擴增，結(jié)果從中檢出6株疑似菌株腸炎沙門氏菌陽性，進一步對這6株疑似菌株進行沙門氏菌屬診斷血清（蘭州生物制品研究所）鑒定，結(jié)果是9：g,m:-，與腸炎沙門氏菌的血清型（1,9,12：g,m:-）相符合，判斷其為腸炎沙門氏菌（血清鑒定步驟參見產(chǎn)品說明書及國標GB4789.4-2010），其它疑似菌株經(jīng)鑒定都不是腸炎沙門氏菌，說明所建立的腸炎沙門氏菌特異性PCR檢測方法具有非常高的可靠性。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的宗旨和范圍，其均應涵蓋在本發(fā)明的權利要求范圍當中。<110>重慶理工大學；<120>一種腸炎沙門氏菌PCR檢測引物、檢測試劑盒及檢測方法；<160>3<170>PatentInversion3.5<210>1<211>537<212>DNA<213>人工序列<220><223>SEQIDNO.1的核苷酸序列<400>1ttgagagttattgatatgtcagaaaccgctctggttatcgtaaaattcctaattggtaaa60tccgtcggacaatttatgctcacagtggctttatttttcttaattatcatcttcattcct120agagatattacggagcttattgaggcgcgtagcgatttaccatatgccgttcagattttt180agttttgctgtggcttaccttatagtgctgatcctcaaagtcactggttattttttcgtg240tcggcgctgccgttgtgccagcgtaggggcagggcaaaacgcatgttaaaaacgcttaat300tcattgagtactgaacagctgtttttacttgaaccctttcttaaaactcattctcccact360ttccgggcgtcctgggataaccctgatgcagatgctctggttaaggcaggtatcgttcgt420ccggctggttcgtgtatcgacggtgtttctgtgatgttcaaaatcgaacccgagtatgag480tcgttaatgctttccacctggaatccctgcacaaaacggttcgatattagccgttag537<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>上游引物<400>2tgtcagaaaccgctctggttatcg24<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>下游引物<400>3attccaggtggaaagcattaacgac25當前第1頁1 2 3