本發(fā)明屬于中藥材來(lái)源品種鑒定
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及用SNP分子標(biāo)記鑒定寧夏枸杞和枸杞的方法。
背景技術(shù)：
：寧夏枸杞(Lyciumbarbarum)和枸杞(Lyciumchinense)均為茄科枸杞屬植物，2015年版《中國(guó)藥典》收載此二者的干燥根皮為中藥材地骨皮的來(lái)源。此外，《中國(guó)藥典》還規(guī)定寧夏枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果實(shí)為中藥材枸杞子的唯一來(lái)源，而枸杞LyciumchinenseMill.的果實(shí)不作藥用。此二者在外觀性狀上差異較小，鑒別特征為種子大小，鑒于寧夏枸杞產(chǎn)業(yè)效益可觀，經(jīng)營(yíng)者將寧夏枸杞同屬近緣物種枸杞的果實(shí)當(dāng)做枸杞子在市場(chǎng)上出售，后者價(jià)格低廉，大幅降低枸杞子深加工產(chǎn)品的生產(chǎn)成本，因而經(jīng)營(yíng)者能夠從中謀取更高利潤(rùn)。為維護(hù)消費(fèi)者利益，保證藥品質(zhì)量，需要尋找一種穩(wěn)定可靠的方法將寧夏枸杞和枸杞加以鑒定區(qū)分。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明第一個(gè)目的在于提供寧夏枸杞和枸杞鑒定用SNP。本發(fā)明第二個(gè)目的在于提供寧夏枸杞和枸杞鑒定用SNP在寧夏枸杞和枸杞鑒定中的應(yīng)用。本發(fā)明第三個(gè)目的在于提供寧夏枸杞和枸杞SNP快速鑒定方法。本發(fā)明提供的寧夏枸杞和枸杞鑒定用SNP，自核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，其中，SEQIDNo.1所示序列的5’端起第97位、第173位為C或T，第200位為G或A。本發(fā)明提供的SNP可用于鑒定寧夏枸杞和枸杞，如果自SEQIDNo.1所示序列的5’端起第97位、第173位為C，第200位為G，則鑒定為寧夏枸杞，如果自SEQIDNo.1所示序列的5’端起第97位、第173位為T，第200位為A，則鑒定為枸杞。本發(fā)明提供的寧夏枸杞和枸杞SNP快速鑒定方法，其包括如下步驟：1)以待測(cè)樣品DNA為模板，擴(kuò)增含有SEQIDNo.1所示序列的片段；2)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，拼接后去除序列兩端5.8S和28S基因區(qū)，獲得完整ITS2基因間隔區(qū)，通過(guò)分析SEQIDNo.1所示的序列，確定自SEQIDNo.1所示序列的5’端起第97位、第173位、第200位的堿基。其中，如果自SEQIDNo.1所示序列的5’端起第97位、第173位為C，第200位為G，則鑒定為寧夏枸杞，如果自SEQIDNo.1所示序列的5’端起第97位、第173位為T，第200位為A，則鑒定為枸杞。擴(kuò)增引物使用ITS2序列引物，其序列為：正向引物：ATGCGATACTTGGTGTGAAT；反向引物：GACGCTTCTCCAGACTACAAT。上述引物用于擴(kuò)增寧夏枸杞或枸杞的ITS2序列。本發(fā)明還提供含有上述引物的寧夏枸杞和枸杞鑒定試劑盒。本發(fā)明方法適用性廣，能檢測(cè)任何能提取出DNA的寧夏枸杞和枸杞樣品。因此，能夠?qū)崿F(xiàn)寧夏枸杞、枸杞原植物、藥材和生飲片的快速、準(zhǔn)確鑒定。附圖說(shuō)明圖1所示為ITS2序列的擴(kuò)增結(jié)果(注：M：Marker(100bpDNALadder)CK：陰性對(duì)照1-9：樣品YC0026MT06-14)。圖2所示為寧夏枸杞和枸杞ITS2序列的三個(gè)SNP位點(diǎn)序列比對(duì)結(jié)果。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，而并非對(duì)發(fā)明的限定，依照本領(lǐng)域公知的現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的實(shí)施方式并不限于此，因此凡依照本公開(kāi)內(nèi)容所做出的本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例11)從國(guó)內(nèi)不同產(chǎn)地收集的37份寧夏枸杞和11份枸杞葉片及果實(shí)樣品(表1)，分別取20mg葉片，50mg果實(shí)，加入樣本量10％的PVP-40，在MM400高通量組織研磨儀(德國(guó)Retsch)上進(jìn)行研磨，用植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)的提取總DNA。表1寧夏枸杞和枸杞葉片及果實(shí)樣品信息2)PCR擴(kuò)增引物序列正向引物：ATGCGATACTTGGTGTGAAT；反向引物：GACGCTTCTCCAGACTACAAT，由生工生物工程公司有限公司(北京)合成。引物用無(wú)菌去離子溶解并稀釋至2.5μmol/μL。25μL反應(yīng)體系：PCRMasterMix12.5μL，引物各1.0μL(2.5μmol/L)，模板DNA20～100ng，加滅菌雙蒸水至25μL，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序：在PCR儀上按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)：分別取4μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上樣，用1％的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳后在凝膠成像儀上檢測(cè)結(jié)果(圖1)。3)測(cè)序PCR產(chǎn)物直接送中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院重大工程實(shí)驗(yàn)室測(cè)序。測(cè)序引物同PCR引物。為確保DNA條形碼序列的可靠性，需要進(jìn)行正反向測(cè)序或重復(fù)測(cè)序，然后將正反向測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接獲得DNA條形碼序列。4)序列拼接本實(shí)施例采用應(yīng)用軟件CodonCodeAlignerV3.7.1(CodonCodeCo.，USA)進(jìn)行序列拼接及校對(duì)。首先，進(jìn)行測(cè)序質(zhì)量評(píng)估及預(yù)處理，即去除測(cè)序結(jié)果兩端的低質(zhì)量部分，并對(duì)剩余部分進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，如果滿足質(zhì)量要求，方可用于序列拼接，具體方法是：以20bp的窗口分別從序列5’端和3’端進(jìn)行滑動(dòng)，如果窗口內(nèi)有多于2個(gè)堿基的Q值小于20，則刪除一個(gè)堿基，窗口繼續(xù)滑動(dòng)，如果窗口內(nèi)堿基Q值小于20的數(shù)目小于或等于2個(gè)，窗口停止滑動(dòng)。測(cè)序結(jié)果的剩余部分需大于150bp，且平均Q值大于等于30(Chenetal.2010)。最后進(jìn)行序列拼接，根據(jù)HiddenMarkovModel(HMM)模型，去除序列兩端5.8S和28S基因區(qū)，獲得完整的寧夏枸杞和枸杞ITS2基因間隔區(qū)序列。5)序列比對(duì)用MEGA6.0軟件對(duì)測(cè)序并拼接后的各個(gè)樣品的ITS2基因間隔區(qū)序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如圖2所示。從圖2中可以看出，共獲得三個(gè)SNP位點(diǎn)，所有寧夏枸杞樣品的ITS2基因間隔區(qū)序列(SEQIDNo.1)的第97位、第173位為C，第200位為G，而所有澤瀉樣品的ITS2基因間隔基因區(qū)序列的第97位、第173位為T，第200位為A，表明這三個(gè)SNP位點(diǎn)可特異性地用于鑒定寧夏枸杞和枸杞。實(shí)施例2基本同實(shí)施例1，所不同的是試驗(yàn)材料為將實(shí)施例1中的寧夏枸杞和枸杞果實(shí)制備成的飲片，以該飲片為樣品，提取DNA，進(jìn)行鑒定，結(jié)果也能特異性地檢測(cè)到上述的三個(gè)SNP位點(diǎn)。實(shí)施例3基本同實(shí)施例1，所不同的是試驗(yàn)材料為購(gòu)買自10個(gè)藥材市場(chǎng)和藥店的23份枸杞子藥材樣品(表2)，以該藥材為樣品，提取DNA，進(jìn)行鑒定，結(jié)果也能特異性地檢測(cè)到上述的三個(gè)SNP位點(diǎn)。表2市售枸杞子藥材信息序號(hào)樣品編號(hào)購(gòu)買地點(diǎn)1YC0026MT01四川成都荷花池藥市2YC0026MT02四川成都荷花池藥市3YC0026MT03四川成都荷花池藥市4YC0026MT04四川成都荷花池藥市5YC0026MT05四川成都荷花池藥市6YC0026MT06北京市某藥店7YC0026MT07北京市某藥店8YC0026MT08北京市某藥店9YC0026MT09北京市某藥店10YC0026MT10北京市某藥店11YC0026MT11寧夏中寧縣某藥店12YC0026MT12寧夏永寧縣某藥店13YC0026MT13青海諾木洪某藥店14YC0026MT14青海諾木洪某藥店15YC0026MT15新疆精河縣某藥店16YC0026MT16新疆精河縣某藥店17YC0026MT17內(nèi)蒙古烏拉特前旗某藥店18YC0026MT18內(nèi)蒙古某公司19YC0026MT19河北安國(guó)藥市20YC0026MT20河北安國(guó)藥市21YC0026MT21河北安國(guó)藥市22YC0026MT22河北安國(guó)藥市23YC0026MT23河北巨鹿縣實(shí)施例4基本同實(shí)施例1，所不同的是試驗(yàn)材料為采集自韓國(guó)首爾市的枸杞葉片及果實(shí)樣品(表3)，提取DNA，進(jìn)行鑒定，結(jié)果也能特異性地檢測(cè)到上述的三個(gè)SNP位點(diǎn)。表3韓國(guó)采集枸杞葉片及果實(shí)樣品信息序號(hào)樣品編號(hào)物種名稱取樣部位采樣地點(diǎn)1PS1139MT22枸杞果實(shí)韓國(guó)首爾市2PS1139MT23枸杞果實(shí)韓國(guó)首爾市3PS1139MT24枸杞葉片韓國(guó)首爾市實(shí)施例5基本同實(shí)施例1，所不同的是試驗(yàn)材料為從國(guó)內(nèi)不同產(chǎn)地收集的14份寧夏枸杞和1份枸杞根皮樣品(表4)，取栓皮內(nèi)部的組織約50mg，提取DNA，進(jìn)行鑒定，結(jié)果也能特異性地檢測(cè)到上述的三個(gè)SNP位點(diǎn)。表4寧夏枸杞和枸杞根皮樣品信息序號(hào)樣品編號(hào)物種名稱采樣地點(diǎn)1YC0026MT24寧夏枸杞寧夏銀川市2YC0026MT25寧夏枸杞寧夏中寧縣3YC0026MT26寧夏枸杞寧夏中寧縣4YC0026MT27寧夏枸杞寧夏中寧縣5YC0026MT28寧夏枸杞甘肅景泰縣6YC0026MT29寧夏枸杞甘肅景泰縣7YC0026MT30寧夏枸杞甘肅靖遠(yuǎn)縣8YC0026MT31寧夏枸杞青海都蘭縣9YC0026MT32寧夏枸杞寧夏中寧縣10YC0026MT33寧夏枸杞甘肅景泰縣11YC0026MT34寧夏枸杞甘肅景泰縣12YC0026MT35寧夏枸杞青海格爾木13YC0026MT36寧夏枸杞青海格爾木14YC0026MT37寧夏枸杞寧夏銀川市15YC0095MT14枸杞河北巨鹿縣實(shí)施例6基本同實(shí)施例1，所不同的是試驗(yàn)材料為購(gòu)買自10個(gè)藥材市場(chǎng)和藥店的份地骨皮藥材樣品(表5)，取栓皮內(nèi)部的組織約50mg，提取DNA，進(jìn)行鑒定，結(jié)果也能特異性地檢測(cè)到上述的三個(gè)SNP位點(diǎn)。表5市售地骨皮藥材信息以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3