本發(fā)明涉及一種快速批量提取魚組織總RNA的方法，尤其是一種適合快速批量提取魚組織總RNA的方法，屬于魚類RNA提取技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

總RNA提取技術(shù)是分子生物學(xué)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一。純度高、完整性好的總RNA是進(jìn)行基因克隆、基因表達(dá)、基因功能分析等研究的必要前提。目前試驗(yàn)室常用的總RNA提取技術(shù)是低溫勻漿后Trizol法提取。低溫勻漿一般采用液氮研磨法、手動(dòng)或電動(dòng)勻漿器研磨法。液氮研磨法處理樣品時(shí)，由于液氮極易揮發(fā)，研磨過程中需要持續(xù)地向研缽中添加液氮，耗費(fèi)時(shí)間長，操作不方便，存在安全隱患。手動(dòng)或者電動(dòng)勻漿器研磨法要求在冰上完成，防止樣品過熱引起RNA降解。但是實(shí)踐中極易引起樣品局部溫度升高。并且，兩者的共同不足之處在于（1）每次只能處理一個(gè)樣品，無法批量操作；（2）損耗部分樣品，這對于初始樣品量少的試驗(yàn)影響大；（3）處理過程中樣品位于開放容器中，容易引起樣品污染。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服上述不足之處，提供一種適合快速批量提取魚組織總RNA的方法，既實(shí)現(xiàn)樣品批量操作，又能降低樣品損耗和污染。

按照本發(fā)明提供的技術(shù)方案，一種快速批量提取魚組織總RNA的方法，步驟如下：

（1）處理前準(zhǔn)備：取研磨珠，用乙醇溶液浸泡15-30分鐘后晾干；取若干2mL凍存管，每個(gè)凍存管中均添加研磨珠，并加入1mL Trizol；

（2）魚的前處理：解剖魚，取得魚組織20-100mg，經(jīng)焦碳酸二乙酯DEPC處理過的水漂洗后，剪碎組織塊，迅速投入步驟（1）處理過的凍存管中，旋上管蓋，投入液氮冷凍；

（3）研磨：取步驟（2）處理后的樣品1-50個(gè)，裝入高通量組織研磨儀，以100-120次/分的速度研磨5-10分鐘；

（4）離心：取步驟（3）處理后的若干樣品室溫放置4-6分鐘，分別轉(zhuǎn)移至1.5mL的離心管中，每支離心管加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15-30秒，室溫放置2-4分鐘；2-8℃、10000×g離心14-16分鐘；

（5）二次離心：取步驟（4）所得上清液轉(zhuǎn)移到新管中，加入等量異丙醇，室溫放置10分鐘；2-8℃、10000×g離心10分鐘，移去上清，得到RNA沉淀；

（6）干燥：用1mL乙醇溶液洗滌步驟（5）所得RNA沉淀，2-8℃、7500×g離心5分鐘，棄去上清，得到RNA沉淀；

（7）溶解：室溫放置干燥或真空抽干步驟（6）所得RNA沉淀，加入20-200μL無RNase的水，-70℃保存。

所述乙醇溶液的質(zhì)量濃度為70%-75%。

步驟（1）所述研磨珠為2mm的氧化鋯珠，每個(gè)2mL凍存管中加入研磨珠2-4顆。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明將樣品、研磨珠和Trizol加入冷凍管中，經(jīng)液氮冷凍以后裝入高通量研磨儀中處理，一方面保證樣品研磨過程中始終處于Trizol保護(hù)和低溫狀態(tài)，雙重保護(hù)RNA防止降解；另一方面，相比于液體狀態(tài)下（手動(dòng)或者電動(dòng)勻漿器勻漿）勻漿，低溫干磨能縮短勻漿時(shí)間、勻漿更徹底。同時(shí)，研磨過程中樣品始終在封閉的凍存管中，基本無樣品損耗，因此本發(fā)明對初始樣品量要求低，適于微量組織樣品的總RNA提取。最后，本發(fā)明可同時(shí)研磨1-50個(gè)樣品，實(shí)現(xiàn)樣品的批量處理，大大縮短了試驗(yàn)時(shí)間。

附圖說明

圖1是實(shí)施例1對提取羅非魚肝總RNA后進(jìn)行瓊脂糖電泳后的結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

以下實(shí)施例中液氮和Trizol均為市場上采購的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1 采用從羅非魚分離的肝作為樣品，具體包括以下工藝步驟：

（1）處理前準(zhǔn)備：取研磨珠，用乙醇溶液浸泡15分鐘后晾干；取若干2mL凍存管，每個(gè)凍存管中均添加研磨珠，并加入1mL Trizol；

（2）魚的前處理：解剖魚，取得魚組織30mg，經(jīng)焦碳酸二乙酯DEPC處理過的水漂洗后，剪碎組織塊，迅速投入步驟（1）處理過的凍存管中，旋上管蓋，投入液氮冷凍；

（3）研磨：取步驟（2）處理后的樣品6個(gè)，裝入高通量組織研磨儀，以100次/分的速度研磨7分鐘；

（4）離心：取步驟（3）處理后的樣品室溫放置6分鐘，隨后轉(zhuǎn)移至1.5mL的離心管中，每支離心管加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩30秒，室溫放置4分鐘；4℃、10000×g離心16分鐘；

（5）二次離心：取步驟（4）所得上清液轉(zhuǎn)移到新管中，加入等量異丙醇，室溫放置10分鐘；隨后在4℃、10000×g離心10分鐘，移去上清，得到RNA沉淀；

（6）干燥：用1mL乙醇溶液洗滌步驟（5）所得RNA沉淀，4℃、7500×g離心5分鐘，棄去上清，得到RNA沉淀；

（7）保存：室溫放置干燥或真空抽干步驟（6）所得RNA沉淀，加入30μL無RNase的水，-70℃保存。

所述乙醇溶液的質(zhì)量濃度為70%。

步驟（1）所述研磨珠為2mm的氧化鋯珠，每個(gè)2mL凍存管中加入研磨珠2顆。

實(shí)施例2采用從羅非魚分離的頭腎組織作為樣品，具體包括以下工藝步驟：

（1）處理前準(zhǔn)備：取研磨珠，用乙醇溶液浸泡30分鐘后晾干；取若干2mL凍存管，每個(gè)凍存管中均添加研磨珠，并加入1mL Trizol；

（2）魚的前處理：解剖魚，取得魚組織70 mg，經(jīng)焦碳酸二乙酯DEPC處理過的水漂洗后，剪碎組織塊，迅速投入步驟（1）處理過的凍存管中，旋上管蓋，投入液氮冷凍；

（3）研磨：取步驟（2）處理后的樣品40個(gè)，裝入高通量組織研磨儀，以120次/分的速度研磨6分鐘；

（4）離心：取步驟（3）處理后的樣品室溫放置4分鐘，轉(zhuǎn)移至1.5mL的離心管中，每支離心管加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩20秒，室溫放置2分鐘；4℃、10000×g離心15分鐘；

（5）二次離心：取步驟（4）所得上清液轉(zhuǎn)移到新管中，加入等量異丙醇，室溫放置10分鐘； 4℃、10000×g離心10分鐘，移去上清，得到RNA沉淀；

（6）干燥：用1mL乙醇溶液洗滌步驟（5）所得RNA沉淀，4℃、7500×g離心5分鐘，棄去上清，得到RNA沉淀；

（7）溶解：室溫放置干燥或真空抽干步驟（6）所得RNA沉淀，加入50μL無RNase的水，-70℃保存。

所述乙醇溶液的質(zhì)量濃度為75%。

步驟（1）所述研磨珠為2mm的氧化鋯珠，每個(gè)2mL凍存管中加入研磨珠3顆。

實(shí)施例3采用從羅非魚分離的肌肉組織作為樣品，具體包括以下工藝步驟：

（1）處理前準(zhǔn)備：取研磨珠，用乙醇溶液浸泡30分鐘后晾干；取若干2mL凍存管，每個(gè)凍存管中均添加研磨珠，并加入1mL Trizol；

（2）魚的前處理：解剖魚，取得魚組織90mg，經(jīng)焦碳酸二乙酯DEPC處理過的水漂洗后，剪碎組織塊，迅速投入步驟（1）處理過的凍存管中，旋上管蓋，投入液氮冷凍；

（3）研磨：取步驟（2）處理后的樣品50個(gè)，裝入高通量組織研磨儀，以120次/分的速度研磨10分鐘；

（4）離心：取步驟（3）處理后的樣品室溫放置4分鐘，轉(zhuǎn)移至1.5mL的離心管中，每支離心管加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩30秒，室溫放置2分鐘；4℃、10000×g離心15分鐘；

（5）二次離心：取步驟（4）所得上清液轉(zhuǎn)移到新管中，加入等量異丙醇，室溫放置10分鐘； 4℃、10000×g離心10分鐘，移去上清，得到RNA沉淀；

（6）干燥：用1mL乙醇溶液洗滌步驟（5）所得RNA沉淀，4℃、7500×g離心5分鐘，棄去上清，得到RNA沉淀；

（7）溶解：室溫放置干燥或真空抽干步驟（6）所得RNA沉淀，加入60μL無RNase的水，-70℃保存。

所述乙醇溶液的質(zhì)量濃度為75%。

步驟（1）所述研磨珠為2mm的氧化鋯珠，每個(gè)2mL凍存管中加入研磨珠4顆。