從富含脂肪的組織中提取mRNA的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從富含脂肪的組織中提取mRNA的方法。該方法包括以下步驟：S1.取富含脂肪的組織，采用Trizol法獲得總RNA溶液；S2.采用RNA純化柱對總RNA溶液進行純化，得到mRNA。采用本發(fā)明的技術方案提取的mRNA樣品純度高、完整性好，能很好地滿足高通量測序轉錄組建庫要求，并且，耗時短，成本低。
【專利說明】從富含脂肪的組織中提取mRNA的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學【技術領域】，具體而言，涉及一種從富含脂肪的組織中提取mRNA的方法。
【背景技術】[0002]總RNA的提取是分子生物學的基本內容之一，高質量的RNA是進行基因克隆、基因表達、基因功能分析等研究的必要前提。RT-PCR、Real-Time PCR、Northern、cDNA文庫構建等分子生物學研究的開展首先必須獲得純度高、完整性好的總RNA。總RNA的質量如何是通過安捷倫2100芯片生物分析儀來判定的，該分析儀已被證明可替代費時費力的凝膠電泳技術，可以提供快速自動化的高品質數字化數據，用RNA完整數(RIN)來表示。對于動物組織來說，當RIN值達到7.0時才能滿足后續(xù)建庫要求。脂肪組織是一個重要的內分泌器官，它參與機體的多種生理生化代謝，動物脂肪組織的研究對脂肪組織生長發(fā)育、肉品質等具有重要意義。脂肪組織單位體積細胞數較少，且單位細胞內的總RNA含量也相對較少(Mersmann, Harry J.Seminars in Plastic Srugery, 2002，16 (2): 195 ~197),這增加了從脂肪組織中提取總RNA的難度。
[0003]目前，提取脂肪組織的方法有Trizol和一些試劑盒的方法，但是直接按照試劑盒說明書操作提取的總RNA效果并不理想。于是人們對試劑盒和Trizol方法進行了改進，改進之后能較好的提取總RNA (吳江維，楊公社，孫超.脂肪組織RNA提取方法的改進[J].生物技術通報，2005，5:75-77，81)。但在實驗過程中發(fā)現，用上述改進的Trizol方法提取出的牛腸脂總RNA并不能滿足后續(xù)的轉錄組建庫要求。因此，亟需開發(fā)出一種提取牛腸脂mRNA的方法以滿足后續(xù)的轉錄組建庫要求。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明旨在提供一種從富含脂肪的組織中提取mRNA的方法，以解決現有技術中從富含脂肪的組織中提取的mRNA不能滿足轉錄組建庫要求的技術問題。
[0005]為了實現上述目的，根據本發(fā)明的一個方面，提供了一種從富含脂肪的組織中提取mRNA的方法。該方法包括以下步驟:S1，取富含脂肪的組織，采用Trizol法獲得總RNA溶液；S2，采用RNA純化柱對總RNA溶液進行純化，得到mRNA。
[0006]進一步地，Trizol法為吳江維改進的Trizol法。
[0007]進一步地，富含脂肪的組織為牛腸脂。
[0008]進一步地，SI包括:對牛腸脂進行勻漿、裂解、離心去除油脂、氯仿抽提、異丙醇沉淀、乙醇清洗和沉淀溶解，得到總RNA溶液。
[0009]進一步地，SI包括:在液氮中將牛腸脂研磨成粉末，向牛腸脂中加入Trizol，并震蕩混勻后靜置；離心去除油脂，用氯仿對獲得的上清液進行抽提后，用異丙醇進行沉淀，將得到的沉淀用75%乙醇進行洗滌后用水溶解，得到總RNA溶液。
[0010]進一步地，SI包括:S11，取液氮速凍的牛腸脂，在液氮中將牛腸脂研磨成粉末，取100~150mg牛腸脂放入裝有1.5ml Trizol的第一離心管中，將牛腸脂與Trizol震蕩混勻后，在室溫下靜置IOmin ;S12，將第一離心管在4°C，12000rpm,離心lOmin，離心后去除上層油脂，將下層液體轉入第二離心管，離心5min，去除上層油脂，將下清液轉入第三離心管中；S13，向第三離心管中加入300 μ I氯仿，在漩渦振蕩器上振蕩混勻，室溫靜置3~5min，自然分相；然后將第三離心管在4°C，12000rpm離心IOmin ;將上清液轉入第四離心管，加入與上清液等體積的氯仿，漩渦振蕩器上振蕩混勻，室溫靜置3~5min，自然分相，然后將第四離心管在4°C，12000rpm離心IOmin ;S14，取第四離心管中的上清液到第五離心管中，加入與第五離心管中的上清液等體積的異丙醇，混勻后置于_80°C中放置20min，然后4°C，12000rpm離心15min ;去除上清液，得到沉淀；S15，用體積百分比為75%乙醇清洗步驟S14中得到的沉淀2次，離心2min，用槍頭吸取乙醇，置于室溫干燥5~lOmin，用100 μ I DEPC處理過的水徹底溶解沉淀，得到總RNA溶液。
[0011]進一步地，75%乙醇是由7.5體積份無水乙醇和2.5體積份DEPC處理過的ddH20配制而成。
[0012]進一步地，DEPC處理過的CldH2O為將0.1體積份DEPC加入99.9體積份ddH20中渦旋混勻過夜(此處過夜為生物學中通常所說的過夜，一般是12~16小時)再經高溫高壓滅菌得到的水。
[0013]進一步地，S2為采用天根RNA純化試劑盒對總RNA溶液進行純化。
[0014]進一步地，S2包括:向總RNA溶液中加入350 μ I溶液RK，混勻；加入250 μ I無水乙醇，混勻，將所得溶液和沉淀一起轉入吸附柱CR2中，12，OOOrpm離心30秒，棄掉收集管中的廢液；向吸附柱CR2中加入500 μ I漂洗液RW，室溫放置2min后，12，OOOrpm,離心30秒，棄廢液，將CR2放入收集管中，重復漂洗一次，12，OOOrpm離心5min，去除殘余液體，將吸附柱CR2轉入第六離心管中，加入RNase-Free水,室溫放置2min后，12, OOOrpm離心2min,再重復洗脫一次，獲得純化的`mRNA。
[0015]針對Trizol法提取富含脂肪組織的總RNA效果不能滿足高通量測序轉錄組建庫要求的問題，本發(fā)明中使用的吳江維改進的Trizol法初步提取富含脂肪組織中的總RNA，能快速從富含脂肪的組織中分離出總RNA，整個過程可在Ih內完成；并且因為含有RNase抑制劑可以保證總RNA產品的完整性；該方法提取的總RNA可大大的降低蛋白和DNA的污染。然后選用天根RNA純化試劑盒對通過上述方法提取得到的總RNA進行繼續(xù)純化，該試劑盒是利用離心吸附柱技術，在高鹽條件下mRNA與硅膠膜高效、專一地結合，可同時最大限度除去蛋白質、無機鹽離子和許多有機雜質，使得獲得的mRNA樣品純度高、完整性好，能很好地滿足高通量測序轉錄組建庫要求，并且耗時短，成本低。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]構成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構成對本發(fā)明的不當限定。在附圖中:
[0017]圖1示出了用改進的Trizol方法提取得到的總RNA電泳結果，其中M代表Marker，為Trans2K Plus，樣品牛腸脂原液上樣1μ I ；
[0018]圖2示出了用改進的Trizol方法提取得到的總RNA安捷倫2100檢測結果；
[0019]圖3示出了根據本發(fā)明實施例的方法提取得到的mRNA電泳結果，其中M代表Marker,為Trans2K Plus,樣品牛腸脂原液上樣I μ I。
[0020]圖4示出了根據本發(fā)明實施例的方法提取得到的mRNA安捷倫2100檢測結果?！揪唧w實施方式】
[0021]需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特征可以相互組合。下面將參考附圖并結合實施例來詳細說明本發(fā)明。
[0022]針對Trizol法提取富含脂肪組織的mRNA效果不能滿足高通量測序轉錄組建庫要求的問題，本發(fā)明提供了一種從富含脂肪的組織中提取mRNA的方法。
[0023]根據本發(fā)明一種典型的實施方式，提供一種從富含脂肪的組織中提取mRNA的方法。該方法包括以下步驟:S1，取富含脂肪的組織，采用Trizol法獲得總RNA溶液；S2，采用RNA純化柱對總RNA溶液進行純化，得到mRNA。應用該方法獲得的mRNA樣品純度高、完整性好，能很好地滿足高通量測序轉錄組建庫要求，并且操作過程簡單，成本低。
[0024]優(yōu)選的,Trizol法為吳江維改進的Trizol法(吳江維，楊公社，孫超.脂肪組織RNA提取方法的改進[J],生物技術通報，2005，5:75-77，81)。
[0025]根據本發(fā)明一種典型的實施方式，富含脂肪的組織為牛腸脂。所述SI包括:對牛腸脂進行勻漿、裂解、離心去除油脂、氯仿抽提、異丙醇沉淀、乙醇清洗和沉淀溶解，得到總RNA溶液。優(yōu)選的，在液氮中將牛腸脂研磨成粉末，向牛腸脂中加入Trizol，并震蕩混勻后靜置；離心去除油脂，用氯仿對獲得的上清液進行抽提后，用異丙醇進行沉淀，將得到的沉淀用75%乙醇進行洗滌后用水溶解，得到總RNA溶液。
[0026]進一步優(yōu)選的，SI包括:S11，取液氮速凍的牛腸脂，在液氮中將牛腸脂研磨成粉末,取100~150mg牛腸脂放入裝有1.5ml Trizol的第一離心管中，將牛腸脂與Trizol震蕩混勻后，在室溫下靜置10min ;S12，將第一離心管在4°C，12000rpm，離心lOmin，離心后去除上層油脂，將下層液體轉入第二離心管，離心5min，去除上層油脂，將下清液轉入第三離心管中；S13，向第三離心管中加入300 μ I氯仿，在漩渦振蕩器上振蕩混勻，室溫靜置3~5min，自然分相；然后將第三離心管在4°C，12000rpm離心10min ;將上清液轉入第四離心管，加入與上清液等體積的氯仿，漩渦振蕩器上振蕩混勻，室溫靜置3~5min，自然分相，然后將第四離心管在4°C，12000rpm離心IOmin ;S14，取第四離心管中的上清液到第五離心管中，加入與第五離心管中的上清液等體積的異丙醇，混勻后置于_80°C中放置20min，然后4°C，12000rpm離心15min ;去除上清液，得到沉淀；S15，用體積百分比為75%乙醇清洗步驟S14中得到的沉淀2次,離心2min,用槍頭吸取乙醇，置于室溫干燥5~IOmin,用100 μ IDEPC (Diethypyrocar-bonate,焦碳酸二乙酯)處理過的水徹底溶解沉淀,得到總RNA溶液。
[0027]根據本發(fā)明一種典型的實施方式，S2為采用天根RNA純化試劑盒對總RNA溶液進行純化，當然并不限于天根RNA純化試劑盒。當采用天根RNA純化試劑盒對總RNA溶液進行純化時，S2包括:向RNA溶液中加入350 μ I溶液RK，混勻；加入250 μ I無水乙醇，混勻，將所得溶液和沉淀一起轉入吸附柱CR2中，12，000rpm離心30秒，棄掉收集管中的廢液；向吸附柱CR2中加入500 μ I漂洗液RW，室溫放置2min后，12，000rpm,離心30秒，棄廢液，將CR2放入收集管中，重復漂洗一次，12，000rpm離心5min，去除殘余液體，將吸附柱CR2轉入第六離心管中，加入RNase-Free水,室溫放置2min后，12, 000rpm離心2min,再重復洗脫一次，獲得純化的mRNA。[0028]其中，用體積百分比為75%的乙醇是由7.5體積份無水乙醇和2.5體積份DEPC處理過的ddH20配制而成。DEPC處理過的ddH20為將0.1體積份DEPC加入99.9體積份ddH20中渦旋混勻過夜再經高溫高壓滅菌得到的水。
[0029]下面結合實施例進一步說明本發(fā)明的有益效果。
[0030]實施例1
[0031]本實施例中所用的牛腸脂是新鮮、健康的材料。
[0032]實施過程如下:
[0033](I)取液氮速凍的牛腸脂樣品500mg，用液氮迅速將其研磨成粉末，快速將約150mg樣品轉移至裝有1.5ml Trizol的離心管中，上下劇烈震蕩5min左右，待樣品和溶液完全混勾后在室溫下靜直IOmin ；
[0034](2)4°C，12000rpm，離心lOmin，離心后上層含有大量油脂，用吸頭除去，將下層液體轉入一新管，然后再離心5min，去除上層油脂，將下清轉入一新管中；
[0035](3)加入300μ I氯仿，蓋緊管蓋，漩渦振蕩器上振蕩混勻，室溫靜置3_5min，使其自然分相；4°C, 12000rpm離心IOmin ;將上清轉入一新管,加入等體積氯仿,鏇潤振蕩器上振蕩混勻，室溫靜置3-5min,使其自然分相,4?, 12000rpm離心IOmin ；
[0036]( 4 )取上清到新的離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后置于-8(TC中放置20min,接著 4°C，12000rpm 離心 15min ；
[0037](5)用75% (v/v)乙醇清洗沉淀2次，再空離2min，用槍頭吸取乙醇，置于室溫干燥5-10min，用100 μ I DEPC處理過的水徹底溶解RNA沉淀；
[0038](6)向RNA溶液中加入350 μ I溶液RK，充分混勻。之后加入250 μ I無水乙醇，充分混勻，立即將所得溶液和沉淀一起轉入吸附柱CR2中，12，OOOrpm離心30sec,棄掉收集管中的廢液。向吸附柱CR2中加入500 μ I漂洗液RW，室溫放置2min后，12，OOOrpm，離心30sec,棄廢液，將CR2放入收集管中。重復漂洗一次，12，OOOrpm離心5min，去除殘余液體，將吸附柱CR2轉入一個新離心管中，加適量RNase-Free /K，室溫放置2min后，12，OOOrpm離心2min，之后再重復洗脫一次，獲得純化后的mRNA。
[0039]質量檢測:經瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用改良的Trizol方法和本發(fā)明的方法的結果見圖1和圖3，通過圖1可以看出將經Trizol方法提取的總RNA電泳后，在該泳道出現了三條比較清晰的條帶，沒有一直拖帶以及大片發(fā)光區(qū)域的存在，表明總RNA的完整性較好，圖3上的經本發(fā)明提供的方法提取的mRNA的泳道上的電泳條帶也是沒有出現拖帶以及一大片發(fā)光區(qū)域的存在，也表明mRNA完整性均很好?？梢?，使用改良的Trizol方法和本發(fā)明的方法所獲得的RNA的完整性均良好。使用安捷倫2100精確檢測mRNA完整性結果見圖2和圖4，圖2的結果表明，使用改良的Trizol方法RIN值只有5.8，達不到高通量測序轉錄組建庫要求(RIN值最低為7.0)，通過圖4可見，使用本發(fā)明的方法RIN值達到8.0，該樣品能很好地滿足了高通量測序轉錄組建庫要求。
[0040]其中，圖2中的參數如表1中所示:
[0041]表1
【權利要求】
1.一種從富含脂肪的組織中提取mRNA的方法，其特征在于，包括以下步驟: S1，取所述富含脂肪的組織，采用Trizol法獲得總RNA溶液； S2，采用RNA純化柱對所述總RNA溶液進行純化，得到mRNA。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述Trizol法為吳江維改進的Trizol法。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述富含脂肪的組織為牛腸脂。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述SI包括:對所述牛腸脂進行勻漿、裂解、離心去除油脂、氯仿抽提、異丙醇沉淀、乙醇清洗和沉淀溶解，得到所述總RNA溶液。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述SI包括:在液氮中將所述牛腸脂研磨成粉末，向所述牛腸脂中加入Trizol，并震蕩混勻后靜置；離心去除油脂，用氯仿對獲得的上清液進行抽提后，用異丙醇進行沉淀，將得到的沉淀用75%乙醇進行洗滌后用水溶解，得到所述總RNA溶液。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述SI包括: S11，取液氮速凍的所述牛腸脂，在液氮中將所述牛腸脂研磨成粉末，取100~150mg所述牛腸脂放入裝有1.5ml Trizol的第一離心管中，將所述牛腸脂與所述Trizol震蕩混勻后，在室溫下靜直IOmin ； S12，將所述第一離心管在4°C，12000rpm,離心lOmin，離心后去除上層油脂，將下層液體轉入第二離心管，離心5min，去除上層油脂，將下清液轉入第三離心管中； S13，向所述第三離心管中加入300 μ I氯仿，在漩渦振蕩器上振蕩混勻，室溫靜置3~5min，自然分相；然后將所述第三離心管在4°C，12000rpm離心IOmin ;將上清液轉入第四離心管，加入與所述上清液等體積的氯仿，漩渦振蕩器上振蕩混勻，室溫靜置3~5min，自然分相，然后將所述第四離心管在4°C，12000rpm離心IOmin ； S14，取所述第四離心管中的上清液到第五離心管中，加入與所述第五離心管中的上清液等體積的異丙醇，混勻后置于_80°C中放置20min，然后4°C，12000rpm離心15min ;去除上清液，得到沉淀； S15，用體積百分比為75%乙醇清洗所述步驟S14中得到的沉淀2次，離心2min，用槍頭吸取乙醇，置于室溫干燥5~lOmin，用100 μ I DEPC處理過的水徹底溶解沉淀，得到所述總RNA溶液。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述75%乙醇是由7.5體積份無水乙醇和2.5體積份DEPC處理過的ddH20配制而成。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述DEPC處理過的ddH20為將0.1體積份DEPC加入99.9體積份ddH20中渦旋混勻過夜再經高溫高壓滅菌得到的水。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述S2為采用天根RNA純化試劑盒對所述總RNA溶液進行純化。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，所述S2包括: 向所述總RNA溶液中加入350 μ l溶液RK，混勻；加入250 μ I無水乙醇，混勻，將所得溶液和沉淀一起轉入吸附柱CR2中，12，OOOrpm離心30秒，棄掉收集管中的廢液；向吸附柱CR2中加入500 μl漂洗液RW，室溫放置2min后，12，OOOrpm,離心30秒，棄廢液，將CR2放入收集管中，重復漂洗一次，12，OOOrpm離心5min，去除殘余液體，將吸附柱CR2轉入第六離心管中，加入RNase-Free水，室溫放置2min后，12，OOOrpm離心2min，再重復洗脫一次，獲得純化的mRNA。`
【文檔編號】C12N15/10GK103820433SQ201410086548
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月10日 優(yōu)先權日:2014年3月10日
【發(fā)明者】丁雪, 王棪, 孔曉敏 申請人:北京諾禾致源生物信息科技有限公司