專利名稱：一種水稻愈傷組織特異性啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種水稻愈傷組織特異性啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
篩選標(biāo)記基因作為一種有效的手段用于植物遺傳轉(zhuǎn)化后的陽性轉(zhuǎn)化子的篩選，但目前介導(dǎo)標(biāo)記基因表達(dá)均采用組成性啟動(dòng)子，其中在植物遺傳轉(zhuǎn)化最為廣泛地是煙草花葉病毒的CaMV35S啟動(dòng)子(徐春波、王勇、李興酉、趙海霞，兩種啟動(dòng)子調(diào)控下的 CBF4基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建，生物技術(shù)，2010)，其次是WDiquitin啟動(dòng)子(Garbarino， J. Ε.，Τ. Oosumi, and W. R. Belknap, Isolation of a polyubiquitin promoter and its expression in transgenic potato plants. Plant Physiol，1995)，這些啟動(dòng)子雖然在植物遺傳轉(zhuǎn)化得到了廣泛應(yīng)用，但由于是組成性表達(dá)，在轉(zhuǎn)基因的生物安全性存在標(biāo)記基因的安全性的擔(dān)憂，為了克服現(xiàn)有廣泛采用的啟動(dòng)子外源性和組成性表達(dá)的缺點(diǎn)，我們?cè)噲D從水稻基因組內(nèi)克隆具有愈傷組織特異性表達(dá)的啟動(dòng)子，不僅能有效地解決組成表達(dá)啟動(dòng)子介導(dǎo)標(biāo)記基因存在的安全擔(dān)憂，還能解決外源DNA序列的問題，同時(shí)可打破使用國外的組成性啟動(dòng)子在我國轉(zhuǎn)基因研究的知識(shí)產(chǎn)權(quán)壁壘。在植物轉(zhuǎn)基因研究中，標(biāo)記基因的表達(dá)量大小對(duì)篩選效果至關(guān)重要，目前應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因的選擇標(biāo)記基因主要有兩大類一類是編碼抗生素抗性的基因，新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因II (nptH)、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hpt)和二氫葉酸還原酶基因(dhfr)等； 另一類是編碼除草劑抗性的基因，例如，草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(bar)、5_烯醇丙酮酰草酸-3-磷酸合成酶基因(epsps)等。從水稻轉(zhuǎn)基因的篩選來看，以潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 (hpt)篩選效果最好，草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(bar)次之，其他標(biāo)記基因在水稻上的利用較差，而提高標(biāo)記基因的表達(dá)量可以提高的選擇效率，而提高基因表達(dá)可以從轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平以及翻譯水平入手，從提高轉(zhuǎn)錄水平主要是選用較強(qiáng)的啟動(dòng)子，在轉(zhuǎn)錄后或翻譯水平主要是增加翻譯效率。由于目前使用的選擇性標(biāo)記基因都來自于真菌，由于遺傳密碼存在簡(jiǎn)并性，各物種之間對(duì)密碼子使用頻率上存在較大差異，椐文獻(xiàn)報(bào)道，外源基因經(jīng)密碼子優(yōu)化后的基因表達(dá)量提高 100 1000倍(Mason，H. S.，et al. ,Edible vaccine protects mice against Escherichia coli heat-labile enterotoxin(LT) -potatoes expressing a synthetic LT-B gene. Vaccine，1998)，因此根據(jù)物種不同對(duì)選擇性標(biāo)記基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，可以提高選擇標(biāo)記基因的表達(dá)，從而可以達(dá)到提高選擇效應(yīng)的目的。由于密碼子的數(shù)量(64)比氨基酸的數(shù)量00)多，所以大多數(shù)的氨基酸都有超過一個(gè)密碼子編碼。編碼相同或相近氨基酸的密碼子在序列上往往相似，四個(gè)編碼同一種氨基酸的密碼子只在第三位上不同，有時(shí)這一位點(diǎn)上的不同會(huì)是嘌呤和嘧啶之間的不同造成的。密碼子最后一位堿基專一性降低的現(xiàn)象稱為第三位堿基的簡(jiǎn)并性。密碼子的翻譯需要與相應(yīng)的氨酰-tRNA上的反密碼子配對(duì)。雖然，一種tRNA經(jīng)常能識(shí)別超過一種的密碼子， 但是不同的tRNA使用頻率是不同的。不同物種對(duì)使用密碼子的偏愛性不同，各物種在密碼子第一和第二位堿基的使用率變化不大，但是在第三位堿基上表示出極大差異，具有偏愛性。如果在植物轉(zhuǎn)化時(shí)使用植物偏愛密碼子，可以提高tRNA的識(shí)別效率，從而提高翻譯效率。因此，在不改變氨基酸序列的前提下，根據(jù)水稻密碼子的偏愛性對(duì)hpt基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，使其核苷酸序列100%的使用水稻偏愛的密碼子，然后將其克隆至OsCSP啟動(dòng)子的下游，構(gòu)建了用于與表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化的載體。并且將整個(gè)表達(dá)元件(包括啟動(dòng)子，篩選基因，終止子)都克隆到了載體的T-border之間，構(gòu)建了可用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的載體。本研究水稻的半胱氨酸蛋白酶基因克隆了一個(gè)愈傷組織特異性(Rice Callus-Specific Promoter，，簡(jiǎn)稱OsCSP)啟動(dòng)子，并用于介導(dǎo)篩選性標(biāo)記基因表達(dá)，通過對(duì)篩選性標(biāo)記基因hpt基因的密碼子優(yōu)化，明顯地提高了 OsCSP在水稻轉(zhuǎn)基因選擇的轉(zhuǎn)化效率，在轉(zhuǎn)化效率、假陽性率、共轉(zhuǎn)化率均達(dá)到了 pCambia的WDiquitin啟動(dòng)子介導(dǎo)標(biāo)記基因的效果，建立了以水稻單子葉作物的利用OsCSP啟動(dòng)子介導(dǎo)潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 (hpt)的水稻或單子葉作物的遺傳轉(zhuǎn)化的篩選標(biāo)記體系，為建立轉(zhuǎn)基因作物的轉(zhuǎn)基因生物安全性提供了一個(gè)新的途徑和方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種水稻愈傷組織特異性表達(dá)的啟動(dòng)子，即半胱氨酸蛋白酶基因的啟動(dòng)子-OsCSP啟動(dòng)子，提高了在轉(zhuǎn)基因作物的篩選標(biāo)記基因的生物安全性。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有所述OsCSP啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供含有所述OsCSP啟動(dòng)子序列的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述OsCSP啟動(dòng)子與密碼子優(yōu)化后的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hpt)融合在轉(zhuǎn)基因水稻篩選中的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，從水稻種子中克隆了半胱氨酸蛋白酶(OsCSP)啟動(dòng)子， 其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，在一種實(shí)施方式中顯示本發(fā)明的OsCSP啟動(dòng)具有愈傷組織特異性，為轉(zhuǎn)基因作物的篩選標(biāo)記基因的安全性提供了新的方法。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，所述植物表達(dá)載體是采用基因工程方法，將OsCSP啟動(dòng)子插入到適宜的表達(dá)載體中而獲得。優(yōu)選的是在所述表達(dá)載體中包含潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hpt基因)作為篩選基因，更優(yōu)選地，根據(jù)水稻密碼子的偏愛性對(duì)hpt基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，使其核苷酸序列100%的使用水稻偏愛的密碼子，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，然后將其克隆至OsCSP啟動(dòng)子的下游，構(gòu)建了用于與表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化的載體，使其在陽性轉(zhuǎn)基因的篩選效果達(dá)到或優(yōu)于現(xiàn)有國際上等同載體在水稻轉(zhuǎn)基因篩選中的作用。在一種實(shí)施方式中，構(gòu)建了 p0sPMP522植物表達(dá)載體，其具有如圖2所示的結(jié)構(gòu)。根據(jù)本發(fā)明的第三方面，將上述植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適宜的宿主即可高效地獲得本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體。在一種實(shí)施方式中，采用共轉(zhuǎn)化法將含有OsCSP啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體 p0sPMP522轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌菌株EHA105中獲得了與國際上采用外源的啟動(dòng)子介導(dǎo)篩選標(biāo)記基因的水稻轉(zhuǎn)化體。根據(jù)本發(fā)明的第四方面，通過將篩選標(biāo)記基因克隆至位于本發(fā)明所述水稻愈傷組織特異性啟動(dòng)子的下游，構(gòu)建含有所述水稻愈傷組織特異性啟動(dòng)子、篩選標(biāo)記基因和目標(biāo)基因的植物表達(dá)載體；利用該植物表達(dá)載體用于水稻農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化愈傷組織；利用篩選標(biāo)記基因?qū)τ鷤M織進(jìn)行篩選，而在愈傷組織除外的以后的發(fā)育階段的各組織沒有表達(dá)，從而提高了在谷物作物中利用選擇性標(biāo)記基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因篩選的生物安全性。本發(fā)明提供了一種水稻愈傷組織特異性啟動(dòng)子-OsCSP啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子在水稻愈傷組織中特異性表達(dá)，可通過該啟動(dòng)子控制篩選標(biāo)記標(biāo)記基因在正常水稻植株中的表達(dá)來對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行篩選。同時(shí)結(jié)合對(duì)篩選標(biāo)記基因的密碼子優(yōu)化，不僅由于篩選標(biāo)記基因的表達(dá)主要在愈傷組織階段進(jìn)行，而且提高了篩選標(biāo)記基因在愈傷組織的表達(dá)，提高了陽性轉(zhuǎn)基因的篩選效率，克服了因使用內(nèi)源或外源的組成性表達(dá)啟動(dòng)子減少外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入水稻基因組的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)使篩選標(biāo)記基因的表達(dá)限定在愈傷組織，提高篩選標(biāo)記基因?qū)D(zhuǎn)基因水稻的生物安全性，同時(shí)減少公眾對(duì)轉(zhuǎn)基因中的篩選標(biāo)記基因的安全擔(dān)憂。


圖1 :0sCSP啟動(dòng)子擴(kuò)增中的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖譜；圖2 植物表達(dá)載體p0sPMP522的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3 =OsCSP啟動(dòng)子的組織特異性表達(dá)⑶S染色結(jié)果；其中1為非轉(zhuǎn)基因愈傷組織； 2、3、4、5分別為p0sPMP43轉(zhuǎn)基因抗性愈傷、葉、根、種子。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但以下描述并不對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限定，任何對(duì)本發(fā)明的變形和改變，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的范圍。材料試劑植物材料為水稻粳稻(Oryza sativa. subsp. japonica)品種 TP309。大腸桿菌菌株為DH10B，購自hvitrogen公司；農(nóng)桿菌菌株為EHA105，購自hvitrogen公司；載體pCAMBIA1300，pCAMBIA1301，購自 hvitrogen 公司，pBI221，pUC57，購自南京金斯瑞生物科技有限公司；p0sPMP05，p0sPMP122, p0sPMP209, p0sPMP522, p0sPMP43 為本發(fā)明構(gòu)建的載體。載體構(gòu)建過程中所用限制性內(nèi)切酶，購自NEB和!^ermentas公司；Taq酶、T4DNA Ligase購自美國hvitrogen公司；凝膠回收試劑盒購自X-gene ；所用化學(xué)試劑除特殊說明外均為分析純，購自上海國藥。實(shí)施例1水稻愈傷組織特異性啟動(dòng)子(OsCSP)的克隆1、提取水稻TP309基因組DNAA)取0. 1克幼葉置于研缽中，加入0. 6ml CTAB提取液，將葉片研磨均勻；B)在65°C水浴鍋中溫浴30min，其間溫和搖蕩2 3次，溫浴后取出自然冷卻至室C)加入0. 6ml抽提液(氯仿異戊醇=24 1)后輕搖5分鐘，離心(IOOOOrpm) 5 分鐘；D)吸取上清置于另一個(gè)1. 5ml離心管，加入75 μ L的3Μ醋酸鈉和Iml的預(yù)冷無水乙醇；Ε)在室溫下離心(12000rpm) 10分鐘，棄去上清，加入Iml 70%乙醇，離心洗滌沉淀，倒掉乙醇，干燥DNA;F)待DNA充分干燥后，加200 μ 1無菌ddH20溶解DNA，4°C備用。2、從半胱氨酸蛋白酶基因序列(Genbank登錄號(hào)為AL732346)擴(kuò)增愈傷組織特異性啟動(dòng)子(OsCSP)以水稻TP309基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)克隆OsCSP啟動(dòng)子所需的引物(兩端帶有 HindIII和NaeI的酶切位點(diǎn))正向引物5，-cgccaagcttGCATGCCTGCAGCCA-3，(SEQID NO. 4)反向引物5，-ccatgccggcGACGTGGAGACGAGC-3，(SEQ ID NO. 5)利用上述引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，從水稻基因組中擴(kuò)增OsCSP啟動(dòng)子。擴(kuò)增體系擴(kuò)增程序:94°C5min，94°C 30s，58°C 30s,68°C lmin，35 個(gè)循環(huán)，68°C延伸 lOmin， 25°C保存。反應(yīng)結(jié)束后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，回收目的條帶(圖1)。將回收片段送至南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明OsCSP啟動(dòng)子具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，由1111個(gè)堿基組成，與網(wǎng)上公布的序列一致。實(shí)施例2構(gòu)建含有OsCSP啟動(dòng)子的載體1、OsCSP-stuff-nos 載體的構(gòu)建用Hindlll/Nael分別雙酶切OsCSP啟動(dòng)子的擴(kuò)增片段回收產(chǎn)物和pBI221質(zhì)粒。 沉淀回收酶切后的啟動(dòng)子，插入到酶切后回收的4. Skb的pBI221載體，轉(zhuǎn)化DH10B后篩選正確的轉(zhuǎn)化子。所得載體OsCSP-stuff-nos編號(hào)為p0sPMP209。2、OsCSP-gus-nos 載體的構(gòu)建以 pCAMBIA1301 為模版，擴(kuò)增 GUS 基因。正向引物為 5，_cggtgccggcATGGTAGATCTG AGGG-3，(SEQ ID NO. 6)，反向引物為 5’-ccgctcgagTCACACGTGGT GGTG-3，(SEQ ID NO. 7), 擴(kuò)增溫度60°C。用NaeIAhoI消化PCR凝膠回收產(chǎn)物，酶切產(chǎn)物沉淀回收，插入到經(jīng)NaeI/ XhoI雙酶切的p0sPMP209質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH10B后篩選正確的轉(zhuǎn)化子。所得載體OsCSP-gus-nos 編號(hào)為p0sPMP43。3、JH-0sCSP-hpt-nos 載體的構(gòu)建以 pCAMBIA1301 為模版，擴(kuò)增 hpt 基因。正向引物5，-aaaagtactATGAAAAAGCCTG
權(quán)利要求
1.一種水稻愈傷組織特異性啟動(dòng)子，其具有如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。
2.含有權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子的表達(dá)載體。
3.權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，其包含水稻密碼子優(yōu)化的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。
4.權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其中所述的水稻密碼子優(yōu)化的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因具有如SEQ ID NO. 2所示的序列。
5.如權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，其具有如圖2所示的結(jié)構(gòu)。
6.如權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，其具有如SEQID NO. 3所示的序列
7.由權(quán)利要求2-6任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主獲得的轉(zhuǎn)化體。
8.權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子或權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)
全文摘要
本發(fā)明提供了一個(gè)從水稻中克隆的愈傷組織特異性啟動(dòng)子，含有該啟動(dòng)子與經(jīng)水稻密碼子優(yōu)化的篩選標(biāo)記基因的表達(dá)載體及轉(zhuǎn)化體。該啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其具有愈傷組織表達(dá)特異性，在愈傷組織中有較高的活性。通過該啟動(dòng)子控制經(jīng)密碼子優(yōu)化的篩選標(biāo)記基因(序列如SEQ ID No.2所示的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)在正常水稻植株中表達(dá)，可以高效地篩選轉(zhuǎn)基因水稻，可徹底解決篩選標(biāo)記基因?qū)ι锃h(huán)境安全問題，提高了轉(zhuǎn)基因水稻的生物安全性，同時(shí)增加了選擇效率。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102181444SQ201110054109
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月7日
發(fā)明者寧婷婷, 楊代常, 汪相宏 申請(qǐng)人:武漢禾元生物科技有限公司