水稻缺鐵誘導(dǎo)啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種水稻缺鐵誘導(dǎo)啟動(dòng)子及其應(yīng)用，具有：i)SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列；或ii)SEQID?NO.1所示核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸且同等功能的由i)衍生的核苷酸序列。本發(fā)明還提供含有上述啟動(dòng)子的載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系以及工程菌。還提供上述啟動(dòng)子在啟動(dòng)目的基因表達(dá)中的應(yīng)用。還提供上述啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用；方法為將重組載體導(dǎo)入所述目的植物，從而在所述目的植物中用所述DNA片段啟動(dòng)GUS基因的表達(dá)。本發(fā)明有益的效果是：本發(fā)明啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)及其功能的闡釋，將對(duì)水稻耐受缺鐵逆境生理機(jī)制的研究，有效地開(kāi)展水稻抗缺鐵環(huán)境脅迫及富鐵育種均具有重要理論和實(shí)踐意義。
【專利說(shuō)明】水稻缺鐵誘導(dǎo)啟動(dòng)子及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，主要是一種水稻缺鐵誘導(dǎo)啟動(dòng)子及 其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 鐵是植物生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)元素之一。鐵元素作為許多重要酶和蛋白質(zhì)的組成成分 參與了生命活動(dòng)中最基本的生化反應(yīng)，如光合作用和呼吸作用。缺鐵是各種人類微量元素 缺乏癥中最普遍的一種，據(jù)2002年世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全世界有近半數(shù)的人口受鐵營(yíng)養(yǎng)缺 乏的困擾（如缺鐵性貧血病，嬰幼兒的智力和體能發(fā)育障礙等）。因而提高和改良糧食作物 中鐵元素含量變得尤為重要。
[0003] 土壤中總鐵含量很高，但可被植物吸收利用的有效鐵含量卻很低。其中的絕大部 分都以可溶性極低的三價(jià)鐵形式存在，因而使得植物常常表現(xiàn)出缺鐵失綠癥狀。在農(nóng)業(yè)生 產(chǎn)中，鐵素缺乏一直是限制作物生長(zhǎng)發(fā)育以及作物產(chǎn)量和品質(zhì)提高的主要因子之一。植物 主要以兩種方式吸收鐵：策略I和策略II。策略II是禾本科植物吸收土壤鐵素的主要途 徑，禾本科植物的根系向環(huán)境中分泌一種麥根酸類（MAs)天然鏊合劑，與環(huán)境中的Fe(III) 鏊合形成Fe (III) -MAs復(fù)合物，然后通過(guò)植物特殊的轉(zhuǎn)運(yùn)載體YS1被植物所吸收。在缺鐵 條件下，禾本科植物能增加 MA合成和分泌。禾本科以外的植物都通過(guò)氧化還原的策略I方 式來(lái)吸收鐵。
[0004] 水稻是重要的糧食作物之一，為世界一半以上的人口提供了食物來(lái)源。研究發(fā)現(xiàn)， 水稻的根不但通過(guò)策略II途徑吸收Fe (III)，水稻的根也具有吸收Fe (II)的能力。由于水 稻中并未發(fā)現(xiàn)有功能的Fe(III)還原酶活性，水稻有可能對(duì)Fe(II)是直接轉(zhuǎn)運(yùn)吸收的，這 可能與水稻長(zhǎng)期適應(yīng)淹水的特殊生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種水稻缺鐵誘導(dǎo)啟動(dòng)子及其應(yīng)用，該 啟動(dòng)子含有IDE1和IDE2等缺鐵響應(yīng)元件，對(duì)于水稻耐缺鐵分子機(jī)制的研究，以及水稻耐缺 鐵分子育種具有重要的理論與實(shí)踐意義。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：本發(fā)明的水稻缺鐵誘導(dǎo)啟 動(dòng)子，該啟動(dòng)子DNA片段具有：i)SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；或ii)SEQ ID NO. 1所示 核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸且同等功能的由i)衍生的核苷酸序 列。
[0007] 本發(fā)明還提供含有上述啟動(dòng)子的載體、含有上述啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系以及含有 上述啟動(dòng)子的工程菌。
[0008] 本發(fā)明還提供上述啟動(dòng)子在啟動(dòng)目的基因表達(dá)中的應(yīng)用，所述目的基因的表達(dá)為 缺鐵誘導(dǎo)表達(dá)。
[0009] 本發(fā)明還提供上述啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，如培育耐缺鐵的轉(zhuǎn)基因水稻， 所述目的植物為水稻；所述目的基因?yàn)镚US基因；所述缺鐵條件為不供鐵的水稻培養(yǎng)液；方 法為將重組載體導(dǎo)入所述目的植物，從而在所述目的植物中用所述DNA片段啟動(dòng)GUS基因 的表達(dá)。
[0010] 本發(fā)明有益的效果是：本發(fā)明啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)及其功能的闡釋，將對(duì)水稻耐受缺鐵 逆境生理機(jī)制的研究，有效地開(kāi)展水稻抗缺鐵環(huán)境脅迫及富鐵育種均具有重要理論和實(shí)踐 意義。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1為real-time PCR方法檢測(cè)在正常供鐵和缺鐵脅迫條件下基因的表達(dá)。
[0012] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例中構(gòu)建的啟動(dòng)子載體圖譜。
[0013] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例中轉(zhuǎn)基因水稻的葉片、根尖和側(cè)根的GUS組織染色結(jié)果；其 中，A為正常供鐵培養(yǎng)條件，B缺鐵脅迫條件。

【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明：
[0015] 以下實(shí)施例中未注明具體的實(shí)驗(yàn)方法，均可按照常規(guī)方法進(jìn)行或按照制造生產(chǎn)廠 商的使用說(shuō)明。
[0016] 水稻缺鐵誘導(dǎo)基因啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)
[0017] 1. 1水稻缺鐵誘導(dǎo)基因的發(fā)現(xiàn)
[0018] 本發(fā)明的發(fā)明人先前對(duì)正常供鐵和缺鐵脅迫培養(yǎng)的水稻為材料進(jìn)行芯片（芯 片Affimetrix公司的水稻全基因組芯片GencChip? Rice Genome Array)雜交，在芯片 數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)上，篩選缺鐵誘導(dǎo)相關(guān)基因 （Cheng LJ等Mutation in nicotianamine aminotransferase stimulated the Fe(II)acquisition system and led to iron accumulation in rice. Plant Physiology2007, 145:1647-1657 ；Zheng LQ 等 Physiological and transcriptome analysis of iron and phosphorus interaction in rice seedlings. Plant Physiology2009, 151: 262-274·)。根據(jù)基因的序列設(shè)計(jì)定量 PCR 分析的特異性引物，從圖1中可以看出，在缺鐵處理?xiàng)l件下，基因在水稻葉片和根中的表達(dá) 量明顯增加。
[0019] 1. 2水稻缺鐵誘導(dǎo)啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)
[0020] 按照水稻數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站（http://rice. plantbiology. msu. edu/index. shtml)公布 的水稻基因組序列，設(shè)計(jì)其上游啟動(dòng)子序列的PCR擴(kuò)增引物，并在兩條引物的5'端分別添 加酶切位點(diǎn)序列和保護(hù)堿基。引物序列分別為：pr⑶S-F :5' -gcgtcgacTCTTCTGACTCCTTTT ACTCTAC-3' ；pr⑶S-R :5' -cgggtaccCACGCTGCCCCAGTACGTACC-3'。以日本晴水稻的基因組 DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為熱啟動(dòng)95°C 5分鐘；然后95°C 20秒，60°C 30秒， 72°C 2分鐘，30個(gè)循環(huán)后72°C延伸10分鐘。獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明PCR產(chǎn)物 具有SEQ ID NO. 1所示的2Kb核苷酸片段。
[0021] 對(duì)啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在其區(qū)域內(nèi)含有與缺鐵脅迫相關(guān)的順式作用元件 IDE1 和 IDE2。
[0022] 實(shí)施例：缺鐵誘導(dǎo)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因水稻的獲得
[0023] 2· 1生物材料
[0024] 2· 1· 1植物材料
[0025] 水稻轉(zhuǎn)基因受體材料為粳稻日本晴
[0026] 2. 1. 2菌株和載體
[0027] 使用的農(nóng)桿菌菌株為ΕΗΑ105,載體為pCAMBIA1300。
[0028] 2. 2 方法
[0029] 2. 2. 1缺鐵誘導(dǎo)啟動(dòng)子植物表達(dá)載體的構(gòu)建
[0030] 用Sal I和Κρη I (ΝΕΒ公司）酶切實(shí)施例1回收的PCR產(chǎn)物。
[0031] 通過(guò)Sal I和Κρη I雙酶切植物表達(dá)載體pCAMBIA1300,回收載體骨架。
[0032] 用T4DNA連接酶連接上述酶切的PCR產(chǎn)物與載體骨架。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，所 構(gòu)建的pCAMBIA1300-Pr〇-GUS載體圖譜如圖2所示。
[0033] 2. 2. 2轉(zhuǎn)基因水稻的獲得
[0034] 選取成熟飽滿的日本晴種子脫殼后，經(jīng)消毒濾干后接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行 誘導(dǎo)培養(yǎng)。選擇外觀顏色嫩黃、生長(zhǎng)良好的顆粒狀愈傷組織用于遺傳轉(zhuǎn)化。采用農(nóng)桿菌介 導(dǎo)法將pCAMBIA1300-Pr〇-GUS轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織中，用含有乙酰丁香酮和0D600為0. 5的 農(nóng)桿菌的AAM轉(zhuǎn)化液進(jìn)行浸泡，將浸泡過(guò)的愈傷組織轉(zhuǎn)至共培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)3天。然后轉(zhuǎn) 移至選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每10天繼代一次。30天后將篩選出的抗性愈傷轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基 上分化培養(yǎng)40天。將分化出的綠色小苗移至生根培養(yǎng)基上生根并進(jìn)行煉苗。當(dāng)幼苗長(zhǎng)至 10cm高時(shí)，取出幼苗并用無(wú)菌水洗凈根部附著的固體培養(yǎng)基。
[0035] 培養(yǎng)基配制如下：
[0036] 誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為：N6大量+B5微量+NB有機(jī)+鐵鹽+2. 0mg/L2, 4-D+O. 5g/L L-谷 氨酰胺+2. 8g/L L-脯氨酸+0. 3g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖，pH調(diào)至5. 8后加入植物凝膠 4g/L。
[0037] 共培養(yǎng)基配方為：N6大量+B5微量+NB有機(jī)+鐵鹽+2. 0mg/L2, 4-D+O. 5g/L L-谷 氨酰胺+2. 8g/L L-脯氨酸+0. 6g/L水解酪蛋白+10g/L葡萄糖+30g/L蔗糖，pH調(diào)至5. 2后 加入植物凝膠4g/L。滅菌后，加入乙酰丁香酮200 μ mol/L。
[0038] 選擇培養(yǎng)基配方為：N6大量+B5微量+NB有機(jī)+鐵鹽+2. 0mg/L2, 4-D+O. 5g/L L-谷 氨酰胺+2. 8g/L L-脯氨酸+0. 6g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖，pH調(diào)至5. 8后加入植物凝膠 4g/L。滅菌后加入30mg/L潮霉素和400mg/L頭孢。
[0039] 分化培養(yǎng)基配方為：N6大量+B5微量+NB有機(jī)+鐵鹽+0. 5g/L L-谷氨酰胺+0. 5g/ L L-脯氨酸 +lg/L 水解酪蛋白 +3. 0mg/L6-BA+0. 5mg/L NAA+30g/L 鹿糖 +20g/L 山梨醇，pH 調(diào)至5. 8后加入植物凝膠4g/L。
[0040] 2. 2. 3轉(zhuǎn)基因水稻缺鐵誘導(dǎo)⑶S目的基因的表達(dá)
[0041] 取生長(zhǎng)7天的轉(zhuǎn)基因水稻分別進(jìn)行正常供鐵和缺鐵脅迫培養(yǎng)7天，隨后分別取葉 片和根部材料，同時(shí)進(jìn)行GUS組織染色。結(jié)果如圖3所示，轉(zhuǎn)基因植株在正常培養(yǎng)時(shí)沒(méi)有 GUS表達(dá)活性，而缺鐵處理后植株葉片和根中的GUS表達(dá)活性很強(qiáng)，表明該啟動(dòng)子能調(diào)控目 的基因在植株受到缺鐵脅迫時(shí)表達(dá)。
[0042] GUS 染色液配方為：100mmol/L 磷酸緩沖液（ρΗ7· 0)，5mmol/L EDTA，0· 5mmol/L 鐵 氰化鉀，〇· 5mmol/L 亞鐵氰化鉀，0· 5% Triton Χ-100,0· 2mg/L X-gluc，以水配制。
[0001] 說(shuō)明書核苷酸及氨基酸序列表 序列表 <1〗〇>浙江6'農(nóng)業(yè)利學(xué)院 <120)水稻缺鐵誘導(dǎo)啟動(dòng)子及其應(yīng)用 <130'> 無(wú) <140> <141> <160> 1 <210> 1 <211> 2000 <212> DNA <213> 7_)C稻(Oryza. sativa ssp. japonica) <400> 1 tctlct^act ccttttautc tactctcltc ctattctagt atacaatata i；tacaaiaga 60 gcctcttata atttatctca a^cttggaag Tgtatgttga agtgagtgag atgat^tcct 120 tatatagggg taggtatgac ggttggcgaa gggaaaatgt ccgaagtgcc ctccaaccgt 180 catcagggat gtatctggga cgtccacgcc aaaccccaca tccaacggtg gaggtggtgg 240 ttcggccgna cc1ggctagg cctat ctd^c ctggcciltd gcccttgi tc tcccctggtc 300 ctcctctatt cattcttcgg tattttggRt tgattcact^ atgttttcat gaaattcaca 360 acccatcctt gtatggatac ataattctcc tcactttagt ctagatttcc tccaacatca 420 gggcttatct tctgcataca aatatacacc aacacttgtg gaatatgtgs gatigagcac 480 ctatcactat ^tta^atutt ttattatccu aactttatgc agat^ttg^c ngtac^aaat 540 cgcaatttaa caactgtcaa cartcgacgc ttraatrctt cttgagatgg tatgatatgg 600 tctttaggta atctaatttg tttttctt.gc aaaagataat. caaagatctt atcacacttg 660 gccacatcaa aactatactt aacctcactt tgcggatttt tacgaggagt ctgcattaaa 720 ttagagcaag cagaaggctt atttttgtta gtccatgacc acicagcaac atacatatca 780 IgaLcacccL caccUcaci aicactagcc Lcagaglatit ctitULgaa丨 L aacaL laggc 84Q trcttctcat atagtcaggt ttcgartttt ctggttxttt gagttttttt ctggcacttc 900 cgttgtttgc cgcgtggctt gttttttatg ttntaattta tittttctag tgtgaccggc 960 tggttcccag cttaattttt gtatccggta tatgactttg atagcc^aag ttttcagc^t 1020 ggs t Lagiac gta tacgtgc ctgtca tagt actt tttclc tctccgtttg aUctggcag 1080 acggttcgtt ct-tatcctgt tttctagctg ttcacattag ctatttgtgc atgctttgtg 1140 cttgcaagcg tactgcgcat gctgccatgc ggccacaaac tgtagtccac gcgctagctg 1200 ctggctttgc ttgtgcctac atgtgctgtg cacgtgctgc ccccatgcca tttatattat 1260 a11g1111ca cllgalatiLL accalalala caallaalll galgctacal gcclacalac 1320
[0002] gatataatta taattatgga ggggagggca ccatattgtt cataatggtt catttatgcc 1380 aaccatttca ctttttttcc ttggtttctc attttttgca actatttaag cttgaccctc 1440 ccattggctc tttatagttg caaattacat ctcctacacc aatttttttt cctgtatgtt 1500 cttccgcatg tgctagctag cttagtagct tgagctccat cggttttggt tggtgttttt 1560 tgtttctaga tttcctttgt ggcttgctct gctaattctt catggctgaa actgatggtt 1620 actttgtccg ttgcaggttg agctcctgct tcagcltgcc tcatgccagc atgcgcatgg 1680 tgcggtctgc tgctcatgtg ttctcttctt tccaacattt atcctactcg ttgctcctta 1740 agtacgtctg gtctttttcc tctcgcttta ttggcttttt tttttgctat tcaagcctaa 1800 ccctctcgtt gttttcccat atatccttca catcaatata tcttcttcct taatttcttc 1860 agtgctatgt attaactggc tactcgagtt ctttcctatg ttgccgccgc catatttctt 1920 gtttggttgc attggtgtct tatgttttgt tgtgctcaac gtgagaaatg cgatggcagg 1980 gtacgtactg gggcagcgtg 2000
【權(quán)利要求】
1. 一種水稻缺鐵誘導(dǎo)啟動(dòng)子，其特征在于：?jiǎn)?dòng)子DNA片段的DNA核苷酸序列如SEQ ID NO: 1 所示。
2. -種表達(dá)載體，其特征在于：含有權(quán)利要求1的DNA核苷酸序列。
3. -種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，其特征在于：含有權(quán)利要求1的DNA核苷酸序列。
4. 一種工程菌，其特征在于：含有權(quán)利要求1的DNA核苷酸序列。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻缺鐵誘導(dǎo)啟動(dòng)子在啟動(dòng)目的基因表達(dá)中的應(yīng)用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的水稻缺鐵誘導(dǎo)啟動(dòng)子在啟動(dòng)目的基因表達(dá)中的應(yīng)用，其特征 在于：在目的植物中用所述DNA片段啟動(dòng)目的基因的表達(dá)，得到目的基因表達(dá)受到缺鐵誘 導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因植物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的水稻缺鐵誘導(dǎo)啟動(dòng)子在啟動(dòng)目的基因表達(dá)中的應(yīng)用，其特征 在于：所述目的植物為水稻；所述目的基因?yàn)镚US基因；所述缺鐵條件為不供鐵的水稻培養(yǎng) 液；方法為將重組載體導(dǎo)入所述目的植物，從而在所述目的植物中用所述DNA片段啟動(dòng)GUS 基因的表達(dá)。
【文檔編號(hào)】C12N1/15GK104059912SQ201410249644
【公開(kāi)日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2014年6月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月6日
【發(fā)明者】王芳, 鄧敏娟, 徐磊, 趙紅玉, 魏溪娟, 易可可 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院