水稻啟動(dòng)子p-G9及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一個(gè)水稻啟動(dòng)子p-G9及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的DNA片段，為如下1）或2）或3）的DNA分子：1）序列表中序列1所示的DNA分子；2）在嚴(yán)格條件下與1）限定的DNA序列雜交且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子；3）與1）限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的啟動(dòng)子，含有ABRE逆境響應(yīng)元件，在水稻葉片、莖、莖節(jié)、小穗、穎殼和枝梗中特異表達(dá)，該啟動(dòng)子為組織特異性啟動(dòng)子；本發(fā)明在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V闊的應(yīng)用和市場前景。
【專利說明】水稻啟動(dòng)子P-G9及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種水稻啟動(dòng)子P-G9及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]水資源短缺正成為制約我國乃至世界農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要因素。我國現(xiàn)人均水資源占有量僅為世界人均水平的1/4，缺水已經(jīng)成為我國工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人民生活面臨的主要問題之一。培育耐旱品種是當(dāng)前多種農(nóng)作物育種工作中的重要課題。以水稻為例，水稻是我國最重要的糧食作物之一，總產(chǎn)量占糧食總產(chǎn)量40%左右，但同時(shí)又是一種需水量很大的作物，日益嚴(yán)峻的水資源短缺已經(jīng)成為稻作生產(chǎn)面臨的重要問題之一。在有限的水資源條件下實(shí)現(xiàn)水稻高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)，必須培育耐旱水稻品種。研究水稻耐旱遺傳學(xué)基礎(chǔ)，加強(qiáng)稻屬耐旱基因資源的發(fā)掘、創(chuàng)新和利用具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0003]普通野生稻(0.rufipogon Griff.)作為栽培稻(0.sativa L.)的祖先，是栽培稻遺傳改良的重要基因庫。野生稻在進(jìn)化成栽培稻的過程中，不僅很多農(nóng)藝性狀發(fā)生了很大的變化，而且遺傳多樣性降低，等位基因數(shù)減少，Sun等研究表明栽培稻中的等位基因僅為野生稻的60%。
[0004]被譽(yù)為“植物大熊貓”的江西東鄉(xiāng)野生稻(0.rufipogon Griff.)是目前世界上生境最北(28° 14' N)的野生稻，與栽培稻隔離條件好，沒有栽培稻基因滲入，具有耐低溫、耐干旱的特性。從野生稻中發(fā)掘、定位、克隆耐旱相關(guān)基因，將對(duì)水稻生產(chǎn)具有重要意義。
[0005]我國野生稻資源豐富，從野生稻中發(fā)掘、定位、克隆耐旱相關(guān)基因及其旱誘導(dǎo)啟動(dòng)子，將對(duì)水稻生產(chǎn)具有 重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種DNA片段。
[0007]本發(fā)明提供的DNA片段，為如下I)或2)或3)的DNA分子:
[0008]I)序列表中序列I所示的DNA分子；
[0009]2)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA序列雜交且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子；
[0010]3)與I)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子。
[0011]上述嚴(yán)格條件可為在0.1 XSSPE (或0.1XSSC)、0.1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。
[0012]序列表中序列I的DNA序列由1962個(gè)核苷酸組成，含有ABRE作用元件。
[0013]含有上述DNA片段的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0014]上述重組載體為將上述DNA片段插入表達(dá)載體中，得到重組載體；具體為將序列表中的序列I所示的DNA片段插入pCambial381的EcoRI和PstI酶切識(shí)別位點(diǎn)間得到的
重組質(zhì)粒。
[0015]擴(kuò)增上述DNA片段的全長或其任意片段的引物對(duì)也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。[0016]上述引物對(duì)中由序列表中序列2所示的單鏈DNA分子和序列表中序列3所示的單鏈DNA分子組成。
[0017]上述DNA片段在啟動(dòng)目的基因表達(dá)中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0018]上述應(yīng)用中，所述目的基因表達(dá)為組織特異表達(dá)。
[0019]上述應(yīng)用中，所述組織為植物的枝梗、莖、莖節(jié)、葉片、小穗和穎殼中的至少一種。
[0020]上述應(yīng)用中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物具體為水稻。
[0021]上述應(yīng)用中，所述目的基因?yàn)棰荢基因。
[0022]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)一種啟動(dòng)子，將導(dǎo)入水稻，含有ABRE逆境響應(yīng)元件，在水稻中驅(qū)動(dòng)GUS基因的表達(dá)，結(jié)果表明，在水稻小穗、穎殼和枝梗中特異表達(dá)，該啟動(dòng)子為組織特異性啟動(dòng)子；本發(fā)明在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V闊的應(yīng)用和市場前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為基因在30%PEG處理前(O)和處理2、4、8、16、24、36、48和72小時(shí)后的表達(dá) 譜
[0024]圖2為以IL23基因組DNA為模板，在引物⑶S9引導(dǎo)下的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物
[0025]圖3為p-G9轉(zhuǎn)基因水稻的⑶S組織染色及基因G9在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量分析
【具體實(shí)施方式】
[0026]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0027]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0028]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。所用引物合成及測序工作均由北京奧科生物科技有限責(zé)任公司完成。
[0029]耐旱系IL23水稻:(公眾可以從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得；參考文獻(xiàn):ZhangX, Zhou SX, Fu Y C，et al.1dentification of a drought tolerant introgressionlinederived from Dongxiang common wild rice(0.rufipogon Griff.).Plant MolBiol,2006, 62:247-259)。
[0030]桂朝2號(hào)水稻:(中國作物種質(zhì)資源信息網(wǎng)，http://icgr.caas.net.cn/ ;庫編號(hào):I1A49054)。
[0031]pCambial381 即 NCBI 中的 Binary vector pCAMBIA-1381,為環(huán)形質(zhì)粒,其核苷酸序列見 NCBI 中的如下序列:GenBank:AF234302.1 ;VERSION:AF234302.1 ;G1: 7638091。植物表達(dá)載體pCambial381的核苷酸序列中，第9810至10590位核苷酸為CaMV35S啟動(dòng)子(組成型啟動(dòng)子)，用來啟動(dòng)潮霉素基因；第2-1855位核苷酸為GUS基因；第7214-8008位核苷酸為aadA基因(卡那霉素抗性基因)；第8749-9774位核苷酸為hptll基因(潮霉素抗性基因)。
[0032]日本晴水稻:(中國作物種質(zhì)資源信息網(wǎng)，http://icgr.caas.net.cn/ ;庫編號(hào):I1A13071)。[0033]實(shí)施例1、水稻旱誘導(dǎo)啟動(dòng)子p-G9的獲得
[0034]一、旱誘導(dǎo)基因的發(fā)現(xiàn)
[0035]首先以耐旱系IL23水稻及對(duì)照親本桂朝2號(hào)(GC2)水稻為材料進(jìn)行芯片(芯片為Affimetrix 公司的水稻全基因組芯片(GunuChi p'S: Rice Genome Array),貨號(hào):900599)雜交，并在芯片數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)上，結(jié)合比較基因組學(xué)分析，篩選耐旱相關(guān)基因，經(jīng)過基因組比較、耐旱相關(guān)性分析，最后獲得耐旱基因G9，30%PEG處理?xiàng)l件下，基因的表達(dá)量明顯增加(圖1)，是旱誘導(dǎo)基因。
[0036]二、旱誘導(dǎo)啟動(dòng)子P-G9的獲得
[0037]利用primerf引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，并在引物兩端分別引入限制性內(nèi)切酶EcoRI 和 PstI 識(shí)別位點(diǎn)及保護(hù)堿基。⑶S9F: 5’ -GCGAATTC CTGATGCGTGTTGTTGATG-3’ ；GUS9R:5，-AACTGCAG CATGATCGCAGTCGTCGCAA-3’。⑶S9F中，帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶EcoRI識(shí)別位點(diǎn)及保護(hù)堿基；GUS9R中，帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶PstI的識(shí)別位點(diǎn)及保護(hù)堿基。
[0038]以耐旱系IL23水稻的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為:先940C 5min ;然后 94°C 30sec, 58°C 45sec, 72°C 2min,共 30 個(gè)循環(huán)；最后 72°C IOmin,獲得目的產(chǎn)物。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖2所示，I為Marker IIK所用Marker為天根生化科技有限公司的Marker III，貨號(hào):MD103_01)，2為PCR產(chǎn)物。
[0039]將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明，PCR產(chǎn)物具有序列表的序列I自5’末端第I至1962位核苷酸所示的DNA片段，將序列表的序列I自5’末端第I至1962位核苷酸所示的DNA片段命名為p-G9 (旱誘導(dǎo)啟動(dòng)子)。
[0040]用分析軟件(http://www.dna.affrc.g0.jp/PLACE)對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)在其區(qū)域內(nèi)含有與逆境脅迫相關(guān)的順式作用元件ABRE。
[0041]實(shí)施例2、p-G9轉(zhuǎn)基因水稻的獲得及其鑒定
[0042]—、p_G9植物表達(dá)載體的構(gòu)建
[0043]1、以耐旱系IL23水稻的基因組DNA為模板，用特異性引物對(duì)⑶S9(⑶S9F/⑶S9R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化1962bp的DNA片段(p_G9)(所用回收試劑盒為天根生化科技有限公司的DNA產(chǎn)物純化試劑盒，貨號(hào):DP204-02)。
[0044]2、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和PstI酶切步驟I回收的PCR產(chǎn)物。
[0045]3、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和PstI酶切植物表達(dá)載體pCambial381，回收載體骨架(約 10650bp)o
[0046]4、將步驟2的酶切產(chǎn)物與步驟3的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒。
[0047]5、將重組質(zhì)粒進(jìn)行測序,測序結(jié)果表明，得到了重組質(zhì)粒pCambial381_pG9,該載體為將序列表的序列I自5’末端第I至1962位核苷酸所不的DNA片段插入pCambial381的EcoRI和PstI酶切位點(diǎn)之間得到(pCambial381載體中的⑶S無自帶啟動(dòng)子，其中NCBI中描述的35S是啟動(dòng)潮霉素的啟動(dòng)子)。
[0048]二、p-G9轉(zhuǎn)基因水稻的獲得
[0049]將pCambial381_pG9用基因槍法轉(zhuǎn)化日本晴的成熟胚愈傷組織,用含50mg/L潮霉素的NB培養(yǎng)基進(jìn)行2輪篩選，每輪篩選20-30天，經(jīng)預(yù)分化、分化得到植株。
[0050]1、將水稻品種“日本晴”的成熟胚愈傷組織作為基因槍轟擊的受體，用基因槍將重組質(zhì)粒pCambial381-pG9轟擊到愈傷組織,具體步驟如下:
[0051](I)將水稻品種“日本晴”的成熟胚愈傷組織在高滲透培養(yǎng)基(NB培養(yǎng)基+91.2g/L甘露醇)上進(jìn)行滲透處理6h (28°C，暗培養(yǎng))。
[0052](2)用重組質(zhì)粒pCambial381-pG9包裹直徑110 μ m金粉，采用PDS-1000/He基因槍Bio-Red公司生產(chǎn))，選擇IlOOPsi的可裂膜,載樣距祀材料6cm進(jìn)行轟擊。
[0053](3)轟擊后的愈傷組織繼續(xù)在原培養(yǎng)基上培養(yǎng)16h (28°C，暗培養(yǎng))。
[0054]2、將完成步驟I的愈傷組織轉(zhuǎn)移到恢復(fù)培養(yǎng)基(NB培養(yǎng)基+2mg/L 2，4_D)上，恢復(fù)培養(yǎng)I周(28°C，暗培養(yǎng))。[0055]3、將完成步驟2的愈傷組織轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基(NB培養(yǎng)基+50mg/L潮霉素)上，28°C暗培養(yǎng)30天，篩兩輪。
[0056]4、將步驟3得到的愈傷組織轉(zhuǎn)移到預(yù)分化培養(yǎng)基上(NB培養(yǎng)基+5mg/L ABA+50mg/L 潮霉素 +2mg/L NAA+lmg/L 6-BA)暗培養(yǎng) 15 天，28°C。
[0057]5、將步驟4得到的抗性愈傷轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上(NB培養(yǎng)基+2mg/L6_BA+ Img/LNAA+lmg/L KT+50mg/L潮霉素)28°C光照培養(yǎng)約15天。
[0058]6、將步驟5中幼苗移到生根培養(yǎng)基上(1/2MS+0.5mg/L NAA+0.09g/L肌醇+30g/L蔗糖)28 °C光照培養(yǎng)約30天。
[0059]7、將步驟6中苗高7-8cm且根系發(fā)達(dá)的植株移栽到花盆，放置于溫室中培養(yǎng)3周，成活的植株即為Ttl代植株。
[0060]將植株進(jìn)行PCR鑒定(引物為潮霉素引物1F5’ -tacttctaca cagccatc-3’和IR，5’-cgtctgtcga gaagtttc-3’得到約1000bp的為陽性植株),結(jié)果表明，得到的陽性植株為Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻。
[0061]將空載pCambial381用基因槍法轉(zhuǎn)化日本晴的成熟胚愈傷組織，用上述方法得到Ttl代轉(zhuǎn)空載體對(duì)照水稻(引物為潮霉素引物1F5’ -tacttctaca cagccatc-3’和IR，5’ -cgtctgtcga gaagtttc-3’ 得到約 1000bp 的為陽性植株)。
[0062]三、轉(zhuǎn)基因水稻的組織表達(dá)特異性分析
[0063]1、⑶S組織染色
[0064]對(duì)Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻、Ttl代轉(zhuǎn)空載體對(duì)照水稻的根、葉片、葉鞘、莖、莖節(jié)、葉節(jié)、枝梗、穎殼和小穗進(jìn)行⑶S組織染色。
[0065]結(jié)果如圖3A所示，3A為p_G9轉(zhuǎn)基因水稻的⑶S組織染色結(jié)果；結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻的GUS基因在枝梗、莖、莖節(jié)、葉片、小穗和穎殼中具有較高的表達(dá)活性(藍(lán)色)，而在其他組織如、根、莖和葉鞘中的表達(dá)量極低，甚至不表達(dá)(沒有顏色)，而Ttl代轉(zhuǎn)空載體對(duì)照水稻任何組織均不表達(dá)GUS (空載中沒有啟動(dòng)子啟動(dòng)GUS表達(dá)，而載體中的35S啟動(dòng)子只是啟動(dòng)潮霉素基因的表達(dá))。
[0066]上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，T0代轉(zhuǎn)基因水稻中的⑶S基因得到表達(dá)，證明P-G9為啟動(dòng)子，可以啟動(dòng)GUS的表達(dá)，且為組織特異性啟動(dòng)子。
[0067]2、G9基因在IL23和GC2各組織中的相對(duì)表達(dá)量
[0068]分別提取IL23和桂朝2號(hào)水稻的根、葉片、葉鞘、莖、莖節(jié)、穎殼、枝梗和小穗的 RNA，反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA 作為模板，以 G7F:5’ -AGCAGAGTTGGGCTAAGCTG-3’，G7R:5’ -GAAAACCCTAGCACCCCAAA-3’ ；為引物，進(jìn)行RT-PCR，以18S為內(nèi)參，內(nèi)參的引物為18S-F5' -GCTTTGGTGACTCTAGATAAC-3'，18S-R 5' -GTCGGGAGTGGGTAATTTGC-3'。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。結(jié)果如圖3B所示，基因G9僅在滲入系IL23的枝梗、莖、莖節(jié)、葉片、小穗和穎殼中具有較高的表達(dá)量，而在其他組織中及桂朝2號(hào)的各組織中表達(dá)量極低，甚至不表達(dá)。`
【權(quán)利要求】
1.一種DNA片段，為如下I)或2)或3)的DNA分子: 1)序列表中序列I所不的DNA分子； 2)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA序列雜交且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子； 3)與I)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子。
2.含有權(quán)利要求1所述DNA片段的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
3.如權(quán)利要求2所述的重組載體，其特征在于:所述重組載體為將權(quán)利要求1所述DNA片段插入表達(dá)載體中，得到重組載體。
4.擴(kuò)增權(quán)利要求1所述DNA片段的全長或其任意片段的引物對(duì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的引物對(duì)，其特征在于:所述引物對(duì)由序列表中序列2所示的單鏈DNA分子和序列表中序列3所不的單鏈DNA分子組成。
6.權(quán)利要求1所述DNA片段在啟動(dòng)目的基因表達(dá)中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:所述目的基因表達(dá)為組織特異表達(dá)。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于:所述組織為植物的葉片、莖、莖節(jié)、小穗、穎殼和枝梗中的至少一種。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于: 所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物具體為水稻。
10.如權(quán)利要求6-9中任一所述的應(yīng)用，其特征在于: 所述目的基因?yàn)镚US基因。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103834650SQ201210477891
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年11月22日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月22日
【發(fā)明者】孫傳清, 劉鳳霞, 張俠, 周少霞, 王娜, 譚祿賓, 朱作峰, 付永彩, 才宏偉, 顧憑, 彭文, 謝道昕 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)