本發(fā)明屬于生物處理技術(shù)領(lǐng)域，涉及一株芳氧苯氧丙酸類除草劑降解菌株及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

芳氧苯氧丙酸類（AOPP）除草劑主要用于防除禾本科雜草，因其高效、低毒而在我國及世界作物田被廣泛應(yīng)用。精噁唑禾草靈是該類除草劑中使用量最大的品種，2003年和2009年的銷售額分別為2.5億美元和2.8億美元，占該類除草劑總銷售量的31.2%，位于全球除草劑銷量榜第七位。AOPP除草劑在應(yīng)用過程中僅有小部分藥劑可以附著于植物上發(fā)揮作用，其余大部分殘留在大氣、土壤和水等生態(tài)環(huán)境中。盡管AOPP除草劑的毒性相對(duì)較低，但大量研究表明AOPP除草劑對(duì)水生生物表現(xiàn)為高毒性，過量殘留已經(jīng)對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、土壤生態(tài)、人類健康以及進(jìn)出口貿(mào)易帶來巨大威脅。

生物降解是農(nóng)藥在環(huán)境中的一類重要轉(zhuǎn)化過程。微生物由于大量存在于自然界、并且具有種類繁多、繁殖迅速和對(duì)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，在農(nóng)藥的生物降解過程中起到了重要作用。當(dāng)前研究者已分離到一些能降解AOPP除草劑的微生物，主要以降解精噁唑禾草靈為主且降解能力普遍較低：Gennari等首次報(bào)道了一組微生物菌群在60天內(nèi)將30 mg·L^-1精噁唑禾草靈完全降解；Hoagland等分離了四株熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescensBD4-13，RA-2和UA5-40和P. putida M-17在 7天內(nèi)最高僅能降解5 mg·L^-1精噁唑禾草靈；宋立巖等從精噁唑禾草靈生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng)中富集篩選到具有較高降解能力的菌株Alca1igenes sp. H，該菌株10天可將初始濃度為100 mg·L^-1的精噁唑禾草靈分別降解45.8%；侯穎等從被精噁唑禾草靈污染的土壤中分離到一株紅球菌Rhodococcus sp. T1，該菌株在5d內(nèi)將100 mg·L^-1的精噁唑禾草靈降解80%。因此，篩選到能夠高效廣譜降解AOPP除草劑的菌株，對(duì)降解基因資源的開發(fā)利用和環(huán)境污染修復(fù)非常具有現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)AOPP除草劑殘留帶來生態(tài)污染，而現(xiàn)有微生物對(duì)AOPP除草劑降解能力弱、降解譜窄的問題，提供一種高效廣譜降解AOPP除草劑的微生物。

為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一株芳氧苯氧丙酸類除草劑降解菌株，所述微生物為不動(dòng)桿菌屬，其分類命名為Acinetobacter sp.VL-2，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（簡稱CCTCC），保藏編號(hào)為：CCTCC NO：M 2016374，保藏日期為：2017年7月4日，保藏地址為：中國. 武漢. 武漢大學(xué)。

本發(fā)明所述的菌株Acinetobacter sp.VL-2，其16S rDNA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

本發(fā)明所述的Acinetobacter sp.VL-2篩選方法為：用無機(jī)鹽培養(yǎng)基，以精噁唑禾草靈為唯一碳源，對(duì)農(nóng)藥廠污水排放口處污泥中具有其降解能力的微生物進(jìn)行分離純化。

具體地，以農(nóng)藥廠污水排放口處污泥作為分離材料，利用含有100 mg·L^-1精噁唑禾草靈的無機(jī)鹽培養(yǎng)基作為介質(zhì)，連續(xù)富集馴化能利用精噁唑禾草靈生長的菌株，將富集培養(yǎng)基稀釋涂布至含有100 mg·L^-1精噁唑禾草靈的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基，30℃靜止培養(yǎng)，挑去能在該平板上形成透明圈的微生物進(jìn)行純化獲得純培養(yǎng)，即為本發(fā)明所獲取的菌株Acinetobacter sp.VL-2。利用紫外掃描驗(yàn)證該純培養(yǎng)對(duì)精噁唑禾草靈的降解能力。

具體地，所述的無機(jī)鹽培養(yǎng)基配方為：NH₄NO₃ 1.0 g·L^-1，KH₂PO₄ 0.5 g·L^-1，K₂HPO₄ 1.5 g·L^-1，NaCl 1.0 g·L^-1，MgSO₄·7H₂O 0.1 g·L^-1，pH 7.0，固體培養(yǎng)基需加入瓊脂20.0 g·L^-1，121℃滅菌20 min，使用前添加終濃度100 mg·L^-1過濾除菌的精噁唑禾草靈作為碳源。

本發(fā)明所述的芳氧苯氧丙酸類除草劑降解菌株的生理生化鑒定和16S rDNA序列鑒定結(jié)果如下：

生理生化鑒定：革蘭氏陰性菌，細(xì)胞呈短桿狀，無鞭毛，無莢膜，無芽孢；菌落呈乳白色到微黃色，菌落突起呈圓形，有光澤，不透明，容易挑??；接觸酶、V-P試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用、明膠水解、乳糖發(fā)酵、果糖發(fā)酵、阿拉伯糖發(fā)酵等均為陽性；對(duì)氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、慶大霉素、壯觀霉素、鏈霉素、四環(huán)素均不敏感。其生理生化鑒定的結(jié)果與伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)中不動(dòng)桿菌屬的特征最為接近。

16S rDNA序列鑒定：利用引物27F：5`-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3和1492R：5`-GGTTACCTTGTTACGACTT-3`擴(kuò)增該菌株的16S rDNA，通過T/A克隆的方式連接至克隆載體pMD19T，構(gòu)建重組克隆載體pMD19T-16S，將其轉(zhuǎn)化到克隆宿主菌Escherich coli DH5α獲得重組微生物E. coli DH5α （pMD19T-16S），將所獲得的重組微生物外源片段進(jìn)行測序，在分子水平上將其鑒定至不動(dòng)桿菌屬，命名為Acinetobacter sp.VL-2。

本發(fā)明的另一目的是提供該菌株的最適生長條件，為該菌株的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

將Acinetobacter sp. VL-2菌落接種至液體LB培養(yǎng)基，分別于20，25，30，37，42℃；pH 4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0；鹽濃度 0 g·L^-1，2 g·L^-1，4 g·L^-1，6 g·L^-1，8 g·L^-1，10 g·L^-1，12 g·L^-1，16 g·L^-1，20 g·L^-1；培養(yǎng)基裝液量10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%條件下振蕩培養(yǎng)12h后測定OD600值，確定最適發(fā)酵條件，制備高效降解AOPP微生物菌劑。

具體地，所述的LB培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10.0 g·L^-1，酵母粉5.0 g·L^-1， NaCl 10.0 g·L^-1， pH 7.0，121℃滅菌20 min。

所述的芳氧苯氧丙酸類除草劑降解菌株的最適生長條件，該菌株在LB培養(yǎng)基中最適生長溫度在25-42℃之間，最適生長pH為7.0，最適生長鹽濃度為4 g·L^-1，好氧發(fā)酵。

本發(fā)明的又一目的是提供該菌株的應(yīng)用。該菌株可用于AOPP除草劑造成環(huán)境污染的生物修復(fù)。

本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

（1）菌株VL-2種子液培養(yǎng)：從LB平板上挑取菌株VL-2單菌落，分別接種于3 mL 液體LB培養(yǎng)基中于30℃，搖床180 r·min^-1培養(yǎng)12 h。然后將該菌株的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到20 mL新鮮的液體LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。6000 r·min^-1離心3 min，收集菌體，用滅菌的無機(jī)鹽培養(yǎng)基洗滌一次后，制成OD_600nm=1.0的菌懸液，即種子液。

（2）菌株VL-2降解精噁唑禾草靈的動(dòng)力學(xué)：在精噁唑禾草靈終濃度為100 mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，按5%接種量接入OD_600nm=1.0菌株VL-2種子液，于30℃，180 r·min^-1 振蕩培養(yǎng)，每隔24 h 取樣一次，測定OD_600nm和精噁唑禾草靈的殘留濃度。

（3）溫度和pH對(duì)菌株VL-2降解精噁唑禾草靈的影響：在精噁唑禾草靈終濃度為100 mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，按5%接種量接入種子液，分別于20℃，25℃，30℃，37℃，42℃，pH 7，180 r·min^-1振蕩培養(yǎng)；分別于初始pH 4、5、6、7、8、9、10、11，30℃、180 r·min^-1 振蕩培養(yǎng)，測定溫度和pH對(duì)菌株VL-2降解精噁唑禾草靈的影響。

（4）底物初始濃度和接種量對(duì)菌株VL-2降解精噁唑禾草靈的影響：在精噁唑禾草靈終濃度為100 mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，分別按1%、5%、10%、20%的接種量接入種子液于30℃，180 r·min^-1 振蕩培養(yǎng)；分別在精噁唑禾草靈終濃度為25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，按5%接種量接入種子液，于30℃，180 r·min^-1 振蕩培養(yǎng)，測定底物初始濃度和接種量對(duì)菌株VL-2降解精噁唑禾草靈的影響。

（5）菌株VL-2對(duì)其他AOPP除草劑的降解能力測定：分別在終濃度為100 mg/L的含氰氟草酯，炔草酯，精喹禾靈，高效氟吡甲禾靈的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，按5%接種量接入種子液，于30℃，180 r·min^-1 振蕩培養(yǎng)120 h，測定菌株VL-2對(duì)其他AOPP除草劑的降解能力。

本發(fā)明以農(nóng)藥廠污水排放口污泥為分離材料，分離純化到一株可以高效廣譜的降解AOPP類除草劑的菌株，對(duì)降解基因資源的開發(fā)利用和農(nóng)藥污染土壤修復(fù)非常具有現(xiàn)實(shí)意義。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，該菌株對(duì)AOPP除草劑的降解是高效廣譜的，對(duì)100 mg/L的精噁唑禾草靈在120 h降解率達(dá)到98%以上，降解性能明顯優(yōu)于國內(nèi)外的精噁唑禾草靈降解菌株。此外，該菌株還可以降解其他AOPP除草劑，對(duì)氰氟草酯，炔草酯，精喹禾靈，高效氟吡甲禾靈的降解率均可達(dá)到90%以上，降解譜有豐富的多樣性，適合應(yīng)用在AOPP除草劑污染土壤的生物治理上。

附圖說明

圖1是菌株VL-2降解精噁唑禾草靈效果圖。

圖2是菌株VL-2降解精噁唑禾草靈的產(chǎn)物鑒定質(zhì)譜圖。

圖3是菌株VL-2降解精噁唑禾草靈的機(jī)制示意圖。

圖4是菌株VL-2的電鏡圖片。

圖5是菌株VL-2的系統(tǒng)發(fā)育樹。

圖6是精噁唑禾草靈降解曲線及菌株VL-2生長曲線。

圖7a是溫度對(duì)菌株VL-2降解精噁唑禾草靈的影響示意圖。

圖7b是pH值對(duì)菌株VL-2降解精噁唑禾草靈的影響示意圖。

圖7c是底物初始濃度對(duì)菌株VL-2降解精噁唑禾草靈的影響示意圖。

圖7d是接種量對(duì)菌株VL-2降解精噁唑禾草靈的影響示意圖。

圖8是菌株VL-2降解其他AOPP除草劑的示意圖。

本發(fā)明所述的生物材料，其分類命名為Acinetobacter sp. VL-2，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（簡稱CCTCC），保藏編號(hào)為：CCTCC NO：M 2016374，保藏日期為：2016年7月4日，保藏地址為：中國. 武漢. 武漢大學(xué)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖說明和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步描述，但不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。下述的實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法無特殊說明均為常規(guī)方法。下述的實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)試劑耗材等無特殊說明均可從商業(yè)用途購買。

實(shí)施例1

芳氧苯氧丙酸類除草劑降解菌株Acinetobacter sp.VL-2的分離篩選：

取2 g農(nóng)藥廠污水排放口處淤泥樣品置于100 mL 含20 mg/L精噁唑禾草靈的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于30℃、180 r·min^-1 培養(yǎng)5 d。用紫外掃描儀測定富集液對(duì)精噁唑禾草靈的降解情況，確定精噁唑禾草靈被降解后，將無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的培養(yǎng)液以10%的接種量接入到含50 mg/L精噁唑禾草靈的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，繼續(xù)富集并測定降解情況，按此方法直至精噁唑禾草靈濃度提高至100 mg/L，并傳代3 次。

將具有精噁唑禾草靈降解性能的富集液經(jīng)梯度稀釋后涂布在以100 mg/L精噁唑禾草靈為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基平板上，于30℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)5 d。將平板上長出的菌落形態(tài)不同的單菌落分別劃線于LB平板純化，并接種于以100 mg/L精噁唑禾草靈為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于30℃、180 r·min^-1搖床培養(yǎng)5 d 后，利用高效液相色譜（HPLC）確定菌株對(duì)精噁唑禾草靈的降解能力。如圖1所示，通過HPLC發(fā)現(xiàn)，編號(hào)為VL-2的菌株可以將精噁唑禾草靈完全轉(zhuǎn)化為一種未知產(chǎn)物。

前述無機(jī)鹽培養(yǎng)基配方為：NH₄NO₃ 1.0 g·L^-1，KH₂PO₄ 0.5 g·L^-1，K₂HPO₄ 1.5 g·L^-1，NaCl 1.0 g·L^-1，MgSO₄·7H₂O 0.1 g·L^-1，pH 7.0，固體培養(yǎng)基需加入瓊脂20.0 g·L^-1，121℃滅菌20 min，使用前添加過濾除菌的精噁唑禾草靈作為碳源。

將菌株VL-2降解精噁唑禾草靈后的培養(yǎng)液冷凍干燥后用2 mL的甲醇溶解，過0.22 um有機(jī)濾膜，利用質(zhì)譜分析（MS）鑒定該未知產(chǎn)物。如圖2所示，通過MS分析發(fā)現(xiàn)，該未知產(chǎn)物的m^-/z=332，具有一個(gè)m^-/z=334的同位素峰，且兩個(gè)峰之間的豐度比值為3:1，這說明該未知產(chǎn)物中含有一個(gè)鹵素原子。根據(jù)精噁唑禾草靈的化學(xué)結(jié)構(gòu)，將該未知產(chǎn)物鑒定為精噁唑禾草靈酸，即菌株VL-2對(duì)精噁唑禾草靈的降解是通過水解其酯鍵實(shí)現(xiàn)的（圖3）。

實(shí)施例2

芳氧苯氧丙酸類除草劑降解菌株Acinetobacter sp.VL-2的鑒定及其生長特性：

對(duì)菌株VL-2進(jìn)行16S rDNA鑒定：

利用引物27F：5`-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3`和1492R：5`-TACCTTGTTACGACTT -3`擴(kuò)增菌株VL-2的16S rDNA，通過T/A克隆的方式連接至克隆載體pMD19T，構(gòu)建重組克隆載體pMD19T-16S，將其轉(zhuǎn)化到克隆宿主菌Escherich coli DH5α獲得重組微生物Escherich coli DH5α （pMD19T-16S），將所獲得的重組微生物外源片段進(jìn)行測序，NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)該16S rDNA序列，在分子水平上將菌株VL-2鑒定至不動(dòng)桿菌屬。

菌株VL-2的生長特性：

Acinetobacter sp.VL-2為革蘭氏陰性菌，在LB平板上生長很快，30℃，12 h可形成直徑為3 mm的微黃色菌落，菌落邊緣整齊，有光澤，突出，濕潤，光滑，不透明；接觸酶、V-P試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用、明膠水解、乳糖發(fā)酵、果糖發(fā)酵、阿拉伯糖發(fā)酵等均為陽性；對(duì)氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、慶大霉素、壯觀霉素、鏈霉素、四環(huán)素均不敏感；如圖4所示，其電鏡圖片中菌體呈短桿狀，無鞭毛，無莢膜，無芽孢，大小為0.8×1.5μm，基于其16S rDNA序列以及生理生化特征，菌株VL-2被鑒定為Acinetobacter屬（圖5）。

實(shí)施例3

本實(shí)施例說明菌株VL-2的最適生長條件。

將Acinetobacter sp.VL-2菌落接種至液體LB培養(yǎng)基，分別于20，25，30，37，42℃；pH 4，5，6，7，8，9，10，11；鹽濃度 0 g·L^-1，2 g·L^-1，4 g·L^-1，6 g·L^-1，8 g·L^-1，10 g·L^-1，12 g·L^-1，16 g·L^-1，20 g·L^-1；培養(yǎng)基裝液量10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%條件下振蕩培養(yǎng)12h后測定OD600值，確定最適發(fā)酵條件。

其中，所述的LB培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10.0 g·L^-1，酵母粉5.0 g·L^-1， NaCl 10.0 g·L^-1， pH 7.0，121℃滅菌20 min。

菌株VL-2的最適生長溫度為30℃，在25-42℃之間均可以很好的生長，但在較低溫度（20℃和25℃）時(shí)，其生長則受到輕微抑制。菌株VL-2在pH為5-11之間時(shí)，生長良好，其最適生長pH為7；當(dāng)pH低于4時(shí)，其生長就受到明顯抑制，菌株VL-2生長時(shí)隨著搖瓶裝液量的增加其生長量下降，表明菌株VL-2也是好氧型微生物。菌株VL-2在NaCl濃度為0.4%時(shí)生長良好；當(dāng)NaCl濃度為1.2%時(shí)其生長即受到明顯的抑制。

實(shí)施例4

本實(shí)施例說明芳氧苯氧丙酸類除草劑降解菌株Acinetobacter sp.VL-2的降解特性：

從LB平板上挑取菌株VL-2單菌落，分別接種于3 mL 液體LB培養(yǎng)基中于30℃，搖床180 r·min^-1培養(yǎng)12 h。然后將該菌株的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到20 mL新鮮的液體LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。6000 r·min^-1離心3 min，收集菌體，用滅菌的無機(jī)鹽培養(yǎng)基洗滌一次后，制成OD_600nm=1.0的菌懸液，即種子液。

在精噁唑禾草靈終濃度為100 mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，按5%接種量接入OD_600nm=1.0菌株VL-2種子液，于30℃、180 r·min^-1 振蕩培養(yǎng)，每隔24 h 取樣一次，測定OD_600nm和精噁唑禾草靈的濃度。

由圖6可以看出，菌株VL-2接種到培養(yǎng)基中24 h，就開始降解精噁唑禾草靈，而沒有明顯的延滯現(xiàn)象；之后降解速率逐漸增加，到120 h就已將100 mg/L的精噁唑禾草靈基本降解完全。另外，從圖中還可以看出，隨著精噁唑禾草靈的降解，菌株VL-2的生長量逐漸增加；當(dāng)精噁唑禾草靈被降解完全后，菌株VL-2的生長量開始下降。該結(jié)果表明菌株VL-2可以利用精噁唑禾草靈作為唯一碳源進(jìn)行生長。

菌株VL-2在37℃時(shí)，對(duì)精噁唑禾草靈的降解能力最強(qiáng)；而在溫度高于或低于37℃時(shí)，精噁唑禾草靈的降解率就受到明顯抑制；隨著溫度不斷降低，菌株對(duì)精噁唑禾草靈的降解能力逐漸減弱，如圖7a所示。菌株VL-2在降解精噁唑禾草靈時(shí)對(duì)pH的適應(yīng)范圍很寬，在pH 6-10之間均具有很好的效果；即使在pH為4時(shí)，精噁唑禾草靈的降解率也可以達(dá)到52%，如圖7b所示。菌株VL-2對(duì)精噁唑禾草靈的降解速率隨著底物濃度的增加而降低。當(dāng)精噁唑禾草靈初始濃度為20 mg/L時(shí)，其在72 h的降解率為98.5%；而當(dāng)精噁唑禾草靈初始濃度為100 mg/L時(shí)，其在120 h的降解率仍然可以達(dá)到95.3%，說明該菌株對(duì)精噁唑禾草靈具有高效的降解效率，如圖7c所示。隨著接種量的增大，精噁唑禾草靈的降解速率明顯增加。當(dāng)接種量為1%時(shí)，精噁唑禾草靈在72 h的降解率為20.1%；而當(dāng)接種量為10%和20%時(shí)，精噁唑禾草靈在96 h時(shí)即基本降解完全，如圖7d所示。

菌株Acinetobacter sp.VL-2也可以降解氰氟草酯，炔草酯，精喹禾靈，高效氟吡甲禾靈等AOPP除草劑。如圖8所示，其對(duì)多種AOPP除草劑在120 h內(nèi)降解率均達(dá)到90%以上，特別對(duì)炔草酯的降解率極高，在72 h內(nèi)降解效率即達(dá)到80%以上。表明菌株VL-2降解譜有豐富的多樣性，適合應(yīng)用在AOPP除草劑污染土壤的生物治理上。

序列表

<110> 南京工業(yè)大學(xué)

<120> 一株芳氧苯氧丙酸類除草劑降解菌株及其應(yīng)用

<130> xb16101201

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1407

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial

<400> 1

cacatgcaag tcgagcgggg gaaggtagct tgctactgga cctagcggcg gacgggtgag 60

taatgcttag gaatctgcct attagtgggg gacaacatct cgaatgggat gctaataccg 120

catacgtcct acgggagaaa gcaggggatc ttcggacctt gcgctaatag atgagcctaa 180

gtcggattag ctagttggtg gggtaaaggc ctaccaaggc gacgatctgt agcgggtctg 240

agaggatgat ccgccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag 300

tggggaatat tggacaatgg agggaaccct gatccagcca tgccgcgtgt gtgaagaagg 360

ccttatggtt gtaaagcact ttaagcgagg aggaggctac tttagttaat acctagagat 420

agtagacgtt actcgcagaa taagcaccgg ctaactctgt gccagcagcc gcggtaatac 480

agagggtgcg agcgttaatc ggatttactg ggcgtaaagc gtgcgtaggc ggcttattaa 540

gtcggatgtg aaatccccga gcttaacttg ggaattgcat tcgatactgg tgagctagag 600

tatgcgagag gatggtagaa ttccaggtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tctggaggaa 660

taccgatggc gaaggcagcc atctggccta atactgacgc tgaggtacga aagcatgggg 720

agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc atgccgtaaa cgatgtctac tagccgttgg 780

ggcctttgag gctttagtgg cgcagctaac gcgataagta gaccgcctgg ggagtacggt 840

cgcaagacta aaactcaaat gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt 900

taattcgatg caacgcgaag aaccttacct ggccttgaca tactagaaac tatccagaga 960

tggattggtg ccttcgggaa tctagataca ggtgctgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc 1020

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