本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地講是一株高產(chǎn)苯乙醇的釀酒酵母及其在干紅葡萄酒釀造中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
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葡萄酒香氣成分受多種因素影響，如葡萄品種、原料成熟度、釀造工藝、陳釀條件等。葡萄酒的獨(dú)特風(fēng)味是體現(xiàn)葡萄酒個(gè)性的關(guān)鍵，其釀造是多種微生物的應(yīng)用過程，直接影響香氣物質(zhì)的種類和數(shù)量，也影響到香氣物質(zhì)的變化過程。因此微生物是形成葡萄酒質(zhì)量和風(fēng)格的重要因素，而釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是葡萄酒釀造的主要微生物，是控制葡萄酒質(zhì)量的靈魂，不同的釀酒酵母可以賦予葡萄酒不同的感官風(fēng)味。到目前為止，已鑒定出的葡萄酒香氣成分超過1000種，被證實(shí)的由酵母發(fā)酵產(chǎn)生的香氣物質(zhì)成分超過400種。
優(yōu)良的葡萄酒酵母可以從自然界中分離篩選獲得，如葡萄園的土壤、成熟的葡萄漿果、葡萄酒廠區(qū)的土壤、發(fā)酵醪、葡萄皮渣、酒腳和沉淀物等，相對(duì)上述酵母篩選來源而言，葡萄酒廠未添加培養(yǎng)酵母的自然發(fā)酵過程更易獲得高品質(zhì)的釀酒酵母，因環(huán)境條件已對(duì)酵母群進(jìn)行了初篩，目的性強(qiáng)，從中可以分離獲得比其他材料更多的有用菌株。但目前我國(guó)葡萄酒生產(chǎn)絕大多數(shù)采用國(guó)外進(jìn)口的活性干酵母進(jìn)行發(fā)酵，導(dǎo)致各產(chǎn)區(qū)葡萄酒的產(chǎn)地特征不能有效發(fā)揮，造成國(guó)產(chǎn)葡萄酒質(zhì)量的趨同化日益嚴(yán)重；除此之外，國(guó)內(nèi)外葡萄酒釀造所用酵母發(fā)酵生產(chǎn)的葡萄酒中苯乙醇含量普遍偏低，導(dǎo)致玫瑰香特征香氣不明顯的問題。苯乙醇具有清甜的玫瑰樣花香，在蘋果、杏仁、香蕉、桃子、梨子、草莓、可可、蜂蜜等天然植物中發(fā)現(xiàn)，它是葡萄酒等酒精飲料中的重要風(fēng)味化合物。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是克服上述已有技術(shù)的不足，而提供一株高產(chǎn)苯乙醇的釀酒酵母。
本發(fā)明的另一目的提供高產(chǎn)苯乙醇的釀酒酵母在干紅葡萄酒中的應(yīng)用。
本發(fā)明主要解決現(xiàn)有葡萄酒中苯乙醇含量低而影響產(chǎn)品香氣、口感和質(zhì)量的問題。
本發(fā)明的技術(shù)方案是：一株高產(chǎn)苯乙醇的釀酒酵母，其特殊之處在于，采摘新疆地區(qū)的成熟霞多麗葡萄，破碎后分汁分裝無菌容器中進(jìn)行自然發(fā)酵3-5d；將發(fā)酵葡萄汁經(jīng)逐級(jí)稀釋后涂布篩選培養(yǎng)基上，經(jīng)28-32℃下培養(yǎng)5 d后，挑取呈奶油色且稍帶綠色、表面光滑且不透明的菌株即為所得酵母，經(jīng)5.8S ITS 序列鑒定，確定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。
所用的篩選培養(yǎng)基為WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂(Wallerstein laboratory nutrient agar)培養(yǎng)基，其配制方法為：稱取酵母粉4 g，蛋白胨 5 g，葡萄糖 50 g，加儲(chǔ)液A 40 mL，加儲(chǔ)液B 1 mL，瓊脂粉 20 g，加熱融化后冷卻室溫調(diào)pH至5.5，將上述培養(yǎng)基組分在121℃下滅菌15 min后，冷卻至60℃左右，趁熱在超凈工作臺(tái)中加入1ml儲(chǔ)液C；儲(chǔ)液A：磷酸二氫鉀 5.5 g，氯化鉀 4.25 g，氯化鈣 1.25 g，硫酸鎂 1.25 g，定容至400 mL，在4℃冰箱保存；儲(chǔ)液B：氯化鐵 0.25 g，硫酸錳 0.25 g，定容至100 mL，在4℃冰箱保存；儲(chǔ)液C：溴甲酚綠0.44 g溶于10mL水和10mL無水乙醇中，其中10 mL水（帶瓶）要提前滅菌。
本發(fā)明的高產(chǎn)苯乙醇的釀酒酵母，菌株代號(hào)為XXF8，該菌株已于2015年11月11日保藏于“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為：CGMCC No. 11646；建議分類命名為：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。
本發(fā)明的高產(chǎn)苯乙醇的釀酒酵母在干紅葡萄酒釀制中的應(yīng)用，以高產(chǎn)苯乙醇的釀酒酵母XXF8為發(fā)酵酵母，按常規(guī)法釀造干紅葡萄酒，具有高苯乙醇含量、香氣濃郁的特點(diǎn)；具體方法為：以適合干紅葡萄酒釀造的葡萄品種為原料，機(jī)械破碎后的帶皮葡萄汁，加入釀酒酵母XXF8為發(fā)酵劑，發(fā)酵過程中檢測(cè)酒精度和還原糖量，待含糖量低于4 g/L時(shí)終止發(fā)酵。
本發(fā)明所述的一株高產(chǎn)苯乙醇的釀酒酵母及其在干紅葡萄酒釀造中的應(yīng)用與已有技術(shù)相比具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著進(jìn)步，通過選擇性篩選方法，分離出一株高產(chǎn)苯乙醇的釀酒酵母，從而能夠在葡萄酒的發(fā)酵生產(chǎn)中依靠酵母菌自身高產(chǎn)苯乙醇，生產(chǎn)的干紅葡萄酒中的苯乙醇含量高達(dá)169.38mg/L，比常規(guī)釀酒酵母菌株釀造的干紅葡萄酒提高2.8倍，釀造的葡萄酒香氣濃郁，對(duì)于提升干紅葡萄酒的產(chǎn)品質(zhì)量具有積極作用。
具體實(shí)施方式：
為了更好地理解與實(shí)施，下面結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明；所舉實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明，并非用于限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1，釀酒酵母XXF8的篩選、菌屬鑒定與發(fā)酵特性：
采摘中國(guó)新疆地區(qū)的成熟霞多麗葡萄，破碎后分汁分裝無菌容器中進(jìn)行自然發(fā)酵3-5d；取1ml發(fā)酵葡萄汁經(jīng)逐級(jí)稀釋后涂布篩選培養(yǎng)基上，經(jīng)28-32℃下培養(yǎng)5d，選取呈奶油色且稍帶綠色、表面光滑且不透明的菌株，即有典型釀酒酵母菌落特征的單菌落，重復(fù)劃線分離多次，獲得純培養(yǎng)并甘油管保藏（-20℃），即得酵母XXF8；所用的篩選培養(yǎng)基為WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂(Wallerstein laboratory nutrient agar)培養(yǎng)基，其配制方法為：稱取酵母粉4 g，蛋白胨 5 g，葡萄糖 50 g，加儲(chǔ)液A 40 mL，加儲(chǔ)液B 1 mL，瓊脂粉 20 g，加熱融化后冷卻室溫調(diào)pH至5.5，將上述培養(yǎng)基組分在121℃下滅菌15 min后，冷卻至60℃左右，趁熱在超凈工作臺(tái)中加入1ml儲(chǔ)液C；儲(chǔ)液A：磷酸二氫鉀 5.5 g，氯化鉀 4.25 g，氯化鈣 1.25 g，硫酸鎂 1.25 g，定容至400 mL，在4℃冰箱保存；儲(chǔ)液B：氯化鐵 0.25 g，硫酸錳 0.25 g，定容至100 mL，在4℃冰箱保存；儲(chǔ)液C：溴甲酚綠0.44 g溶于10mL水和10mL無水乙醇中，其中10 mL水（帶瓶）要提前滅菌。
提取菌株DNA，進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物電泳條帶，切割所需 DNA 目的條帶，純化測(cè)序。以ITS1-TCCGTAGGTGAACCTGCGG和ITS4-TCCTCCGCTTATTGATATGC通用引物，PCR循環(huán)條件：94℃預(yù)變性4min，94℃45秒，55℃45秒，72℃1min循環(huán)30次，72℃10 min修復(fù)延伸，4℃終止反應(yīng)；將測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的已有序列進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)菌株XXF8為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。
采用改進(jìn)的YEPD培養(yǎng)基（葡萄糖220 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉 5g/L）作為初始培養(yǎng)基，杜氏管法考察發(fā)酵特性；其中酒精耐受力測(cè)定中乙醇終濃度分別為10%、13%、16%、19%，酸度耐受力測(cè)定中檸檬酸終濃度分別為5g/L、8 g/L、11 g/L、14 g/L，SO2耐受力測(cè)定中終濃度分別為60mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L，耐受高糖能力測(cè)定中葡萄糖終濃度分別為220g/L、300g/L、400g/L、500g/L，并與商品化釀酒酵母D254和RC212（D254和RC212為國(guó)內(nèi)干紅葡萄酒發(fā)酵常用的進(jìn)口商品釀酒酵母）做對(duì)照。
結(jié)果表明，本發(fā)明的菌株XXF8與商品化釀酒酵母相比具有優(yōu)良的發(fā)酵特性，所有測(cè)試條件下均能夠正常啟動(dòng)發(fā)酵，故釀酒酵母XXF8具備釀造高品質(zhì)葡萄酒潛力。
實(shí)施例2，釀酒酵母XXF8釀造生產(chǎn)赤霞珠干紅葡萄酒：
所用菌種：高產(chǎn)苯乙醇的釀酒酵母XXF8、商品化進(jìn)口活性釀酒酵母D254和RC212。
釀酒酵母菌種制備：挑取斜面保藏菌種一環(huán)，接入裝有200ml菌種制備培養(yǎng)基的500ml三角燒瓶中，置于28℃下培養(yǎng)48h；菌種制備培養(yǎng)基：葡萄糖100 g，蛋白胨20 g，酵母粉 10g，加水至1000ml，pH自然，115℃下滅菌20min；活化種子液采用冷凍離心機(jī)在10000 r/min和6℃下離心4min收集菌體，離心完畢后菌體用無菌水重懸浮，洗滌離心2次，收集菌體備用。
釀造赤霞珠干紅葡萄酒：成熟的赤霞珠釀酒葡萄榨汁破碎，裝入10L玻璃容器中，裝液量為容器體積的3/4，添加SO2至最終濃度為60mg/L；按照種子培養(yǎng)液體積的10%接入離心洗滌后的菌體，20℃下發(fā)酵5天，定期測(cè)定CO2失重、殘?zhí)橇亢途凭?，發(fā)酵完畢后（還原糖量小于4g/L）采用氣相色譜法測(cè)定苯乙醇等香氣物質(zhì)的含量，其中釀酒酵母XXF8發(fā)酵樣苯乙醇含量高達(dá)169.38 mg/L，而D254和RC212的發(fā)酵樣苯乙醇含量分別為72.71mg/L和60.56 mg/L。
發(fā)酵新酒專家感官品評(píng)：評(píng)酒專家由9名從事葡萄酒研究多年的專家組成，其中5名來自企業(yè)的釀酒工程師組成，具有較高的權(quán)威性和合理性。由專家品評(píng)結(jié)果可知，專家組一致認(rèn)為本發(fā)明的釀酒酵母XXF8發(fā)酵酒樣評(píng)價(jià)比較高，其主要突出點(diǎn)在于XXF8釀造的干紅葡萄酒香氣濃郁、口感略復(fù)雜，結(jié)構(gòu)感好于D254和RC212的發(fā)酵酒樣。
實(shí)施例3，釀酒酵母XXF8釀造生產(chǎn)蛇龍珠干紅葡萄酒：
所用菌種：高產(chǎn)苯乙醇的釀酒酵母XXF8、商品化進(jìn)口活性釀酒酵母D254和RC212。
釀酒酵母菌種制備：挑取斜面保藏菌種一環(huán)，接入裝有200ml菌種制備培養(yǎng)基的500ml三角燒瓶中，置于28℃下培養(yǎng)48h。菌種制備培養(yǎng)基：葡萄糖100 g，蛋白胨20 g，酵母粉 10g，加水至1000ml，pH自然，115℃下滅菌20min?；罨N子液采用冷凍離心機(jī)在10000 r/min和6℃下離心4min收集菌體，離心完畢后菌體用無菌水重懸浮，洗滌離心2次，收集菌體備用。
釀造蛇龍珠干紅葡萄酒：成熟的蛇龍珠釀酒葡萄榨汁破碎，裝入10L玻璃容器中，裝液量為容器體積的3/4，添加SO2至最終濃度為60mg/L。按照種子培養(yǎng)液體積的6%接入離心洗滌后的菌體，20℃下發(fā)酵5天，定期測(cè)定CO2失重、殘?zhí)橇亢途凭龋l(fā)酵完畢后（還原糖量小于4g/L）采用氣相色譜法測(cè)定苯乙醇等香氣物質(zhì)的含量，其中釀酒酵母XXF8發(fā)酵樣苯乙醇含量高達(dá)142.15 mg/L，而D254和RC212的發(fā)酵樣苯乙醇含量分別為65.39.71mg/L和56.82 mg/L。
發(fā)酵新酒專家感官品評(píng)：評(píng)酒專家由9名從事葡萄酒研究多年的專家組成，其中5名來自企業(yè)的釀酒工程師組成，具有較高的權(quán)威性和合理性。由專家品評(píng)結(jié)果可知，專家組一致認(rèn)為本發(fā)明的釀酒酵母XXF8發(fā)酵酒樣評(píng)價(jià)比較高，其主要突出點(diǎn)在于XXF8釀造的干紅葡萄酒香氣濃郁、口感復(fù)雜，略偏酸，結(jié)構(gòu)感好于D254和RC212的發(fā)酵酒樣。
本發(fā)明的釀酒酵母XXF8還適用于梅樂、西拉、黑比諾等品種的干紅葡萄酒生產(chǎn)。