本發(fā)明涉及害蟲生物防治技術領域，特別是一種榕母管薊馬防治高效蠟蚧輪枝菌菌株的快速初篩方法。

背景技術：

榕母管薊馬Gynaikothrips ficorum(Marchal)隸屬于纓翅目Thysanoptera薊馬科(Thripidae)，是出口盆栽榕樹上的主要害蟲。目前，該蟲的防控偏重于使用化學農(nóng)藥，易造成“3R”和藥害問題。生物防治是一種安全、有效、持久的控害方法，且蟲生真菌挖掘利用已是害蟲生防的重要發(fā)展方向之一。蠟蚧輪枝菌Lecanicillium lecanii(Zimmermann)Zare&Gams是一種地理分布和寄主范圍均比較廣泛的昆蟲病原真菌，在國內(nèi)外已有一些高效菌株被篩選用于西花薊馬Frankliniella occidentalis(Pergande)、棕櫚薊馬Thrips palmi Karn和煙薊馬T.tabaci Lindeman等的生物防治，但尚未見對榕母管薊馬高效防控菌株的篩選報道。傳統(tǒng)的生防菌株篩選方法是對目標害蟲進行毒力測定，但鑒于蠟蚧輪枝菌的來源多樣性及其對目標害蟲的毒力大小不同，若將每種不同來源的菌株一一對榕母管薊馬進行毒力測定，不僅篩選工作量大，而且受供試蟲源飼養(yǎng)時間的制約；因此，有必要尋找一種用于榕母管薊馬防治高效蠟蚧輪枝菌菌株的快速初篩方法，以提高篩選效率。

菌株生物學特性是影響蟲生真菌毒力的主要因素之一，目前有研究人員通過建立菌株生物學特性與毒力的回歸方程，分析他們之間的相關性，以求證蟲生真菌的某些生物學特性是否可作為評判菌株對目標害蟲毒力大小的初篩指標；如雷妍圓等(2010)發(fā)現(xiàn)，球孢白僵菌Beauveria bassiana(Balsamo)Vuillemin對小菜蛾Plutella xylostella(L.)的致病力與菌株產(chǎn)孢量呈極顯著相關(中國生物防治，CN：11-5973/S)，玫煙色棒束孢Isariafumosorosea(Wize)Brown et Smith對小菜蛾的致病力與菌株生長速率、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率呈極顯著相關(植物保護學報，CN：11-1983/S)；黃大慶等(2004)和王成樹等(1998)分別發(fā)現(xiàn)，球孢白僵菌菌株對馬尾松毛蟲Dendrolimus punctatus Walker的LT50與菌株產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)中時呈極顯著相關(宿州師專學報，CN：CN34-1289/Z和森林病蟲通訊，CN：21-1161/S)；Altre等(1999)發(fā)現(xiàn)，玫煙色擬青霉Paecilomyces fumosoroseus(Wize)Brown et Smith對小菜蛾的致病力與菌株孢子的萌發(fā)中時呈顯著正相關(Journal of Invertebrate Pathology，ISSN：0022-2011)。這些研究均表明，蟲生真菌生長速度快慢、產(chǎn)孢量大小、孢子萌發(fā)率高低和萌發(fā)速度快慢與菌株毒力存在一定的相關性，可作為評判菌株對目標害蟲毒力大小的初篩指標。據(jù)此，本發(fā)明通過建立類似的回歸方程，分析蠟蚧輪枝菌生物學特性與菌株對榕母管薊馬毒力的相關性，從中篩選出某些生物學指標用于榕母管薊馬防治高效蠟蚧輪枝菌菌株的快速初篩，為利用蟲生真菌防控榕母管薊馬等害蟲提供更多的技術支持。

技術實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的是提出一種榕母管薊馬防治高效蠟蚧輪枝菌菌株的快速初篩方法，能快速篩選出對榕母管薊馬具有控制和應用潛能的優(yōu)質(zhì)高效菌株，減輕篩選工作量，節(jié)省篩選工作時間，提高篩選效率，對利用蟲生真菌防控榕母管薊馬等害蟲具有重要意義。

本發(fā)明采用以下方案實現(xiàn)：一種榕母管薊馬防治高效蠟蚧輪枝菌菌株的快速初篩方法，具體包括以下步驟：

步驟S1：選擇供試菌株，觀察所述供試菌株的生物學特性指標，所述生物學特性指標包括生長速度、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率和孢子萌發(fā)中時GT₅₀等；

步驟S2：測定所述供試菌株對榕母管薊馬成蟲毒力指標；所述毒力指標包括所述供試菌株對榕母管薊馬成蟲的致死中時LT₅₀以及榕母管薊馬成蟲的累計校正死亡率；

步驟S3：構建得2個代表供試菌株生物學特性與毒力關系的最優(yōu)回歸方程，篩選出2個作為評判蠟蚧輪枝菌對榕母管薊馬毒力大小的快速初篩指標；

其中，所述2個代表供試菌株生物學特性與毒力關系的最優(yōu)回歸方程為：

y₁＝-1434.0017+217.9375x₁+75.6041x₂；

y₂＝175.8298-23.8111x₁-9.0535x₂；

其中，所述x₁為供試菌株的生長速度，x₂為孢子萌發(fā)中時GT₅₀，y₁為榕母管薊馬成蟲的累計校正死亡率，y₂為供試菌株的致死中時LT₅₀；

其中，所述2個作為評判蠟蚧輪枝菌對榕母管薊馬毒力大小的快速初篩指標為x₁與x₂。

進一步地，所述供試菌株包括蠟蚧輪枝菌V07、蠟蚧輪枝菌V16063、蠟蚧輪枝菌V3450和蠟蚧輪枝菌Vp28。

進一步地，所述2個代表供試菌株生物學特性與毒力關系的最優(yōu)回歸方程的相關系數(shù)分別為0.9993和0.9962，所述2個代表供試菌株生物學特性與毒力關系的最優(yōu)回歸方程的顯著性檢驗分別為0.0222和0.0406，均小于0.05，達顯著水平。

進一步地，x₁與y₁呈極顯著正相關，其偏相關系數(shù)為0.9960，顯著性檢驗為0.0079，小于0.01；x₂與y₁呈顯著正相關，其偏相關系數(shù)為0.9928，顯著性檢驗為0.0142，小于0.05；x₁、x₂均與y₂呈顯著負相關，其偏相關系數(shù)分別－0.9886和－0.9828，顯著性檢驗分別為0.0224和0.0335，均小于0.05。

較佳的，所述2個最優(yōu)回歸方程和2個快速初篩指標，在供試菌株高產(chǎn)孢量和高孢子萌發(fā)率，且相互之間差異不顯著的情況下，可用于榕母管薊馬防治高效蠟蚧輪枝菌菌株的快速初篩；而對于低產(chǎn)孢量和低孢子萌發(fā)率的菌株，無需經(jīng)過方程評判，可直接淘汰。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明有以下有益效果：本發(fā)明可使不同來源的蠟蚧輪枝菌菌株，無需一一對榕母管薊馬進行毒力測定，即可淘汰大部分低效或無效的菌株，快速篩選出對榕母管薊馬具有控制和應用潛能的優(yōu)質(zhì)高效菌株，減輕菌株篩選工作量和節(jié)約篩選工作時間一半以上，且不受供試蟲源飼養(yǎng)時間的制約，有效地提高了榕母管薊馬防治高效蠟蚧輪枝菌菌株的篩選效率，可為榕母管薊馬其他優(yōu)質(zhì)高效生防菌株的快速初篩提供參考。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例中榕母管薊馬成蟲受蠟蚧輪枝菌菌株V07侵染后的死亡趨勢示意圖。

圖2為本發(fā)明實施例中榕母管薊馬成蟲受蠟蚧輪枝菌菌株V16063侵染后的死亡趨勢示意圖。

圖3為本發(fā)明實施例中榕母管薊馬成蟲受蠟蚧輪枝菌菌株V3450侵染后的死亡趨勢示意圖。

圖4為本發(fā)明實施例中榕母管薊馬成蟲受蠟蚧輪枝菌菌株Vp28侵染后的死亡趨勢示意圖。

具體實施方式

下面結合附圖及實施例對本發(fā)明做進一步說明。

本實施例提供了一種榕母管薊馬防治高效蠟蚧輪枝菌菌株的快速初篩方法，具體包括以下步驟：

步驟S1：選擇供試菌株，觀察所述供試菌株的生物學特性指標，所述生物學特性指標包括生長速度、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率和孢子萌發(fā)中時GT₅₀等；

步驟S2：測定所述供試菌株對榕母管薊馬成蟲毒力指標；所述毒力指標包括所述供試菌株對榕母管薊馬成蟲的致死中時LT₅₀以及榕母管薊馬成蟲的累計校正死亡率；

步驟S3：構建得2個代表供試菌株生物學特性與毒力關系的最優(yōu)回歸方程，篩選出2個作為評判蠟蚧輪枝菌對榕母管薊馬毒力大小的快速初篩指標；

其中，所述2個代表供試菌株生物學特性與毒力關系的最優(yōu)回歸方程為：

y₁＝-1434.0017+217.9375x₁+75.6041x₂；

y₂＝175.8298-23.8111x₁-9.0535x₂；

其中，所述x₁為供試菌株的生長速度，x₂為孢子萌發(fā)中時GT₅₀，y₁為榕母管薊馬成蟲的累計校正死亡率，y₂為供試菌株的致死中時LT₅₀；

其中，所述2個作為評判蠟蚧輪枝菌對榕母管薊馬毒力大小的快速初篩指標為x₁與x₂。

在本實施例中，所述供試菌株包括蠟蚧輪枝菌V07、蠟蚧輪枝菌V16063、蠟蚧輪枝菌V3450和蠟蚧輪枝菌Vp28。

在本實施例中，所述2個代表供試菌株生物學特性與毒力關系的最優(yōu)回歸方程的相關系數(shù)分別為0.9993和0.9962，所述2個代表供試菌株生物學特性與毒力關系的最優(yōu)回歸方程的顯著性檢驗分別為0.0222和0.0406，均小于0.05，達顯著水平。

在本實施例中，x₁與y₁呈極顯著正相關，其偏相關系數(shù)為0.9960，顯著性檢驗為0.0079，小于0.01；x₂與y₁呈顯著正相關，其偏相關系數(shù)為0.9928，顯著性檢驗為0.0142，小于0.05；x₁、x₂均與y₂呈顯著負相關，其偏相關系數(shù)分別－0.9886和－0.9828，顯著性檢驗分別為0.0224和0.0335，均小于0.05。

較佳的，在本實施例中，所述2個最優(yōu)回歸方程和2個快速初篩指標，在供試菌株高產(chǎn)孢量和高孢子萌發(fā)率，且相互之間差異不顯著的情況下，可用于榕母管薊馬防治高效蠟蚧輪枝菌菌株的快速初篩；而對于低產(chǎn)孢量和低孢子萌發(fā)率的菌株，無需經(jīng)過方程評判，可直接淘汰。

下面通過室內(nèi)試驗對本實施例作進一步的描述和說明，以解決本實施例中2個代表供試菌株生物學特性與毒力關系的最優(yōu)回歸方程的構建及2個可作為評判蠟蚧輪枝菌對榕母管薊馬毒力大小的快速初篩指標的獲得問題。

1、材料與方法

(1)供試菌株和蟲源選取

供試菌株為蠟蚧輪枝菌V07、V16063、V3450和Vp28菌株由福建農(nóng)林大學植物保護學院提供，菌種保存與活化均采用察氏培養(yǎng)基，在光照培養(yǎng)箱內(nèi)的活化和培養(yǎng)條件為溫度(25±1)℃、相對濕度90％±5％、光周期L︰D＝14︰10、光照強度(2000±50)Lx；供試榕母管薊馬為成蟲，采集于福建省漳州市漳浦縣的盆栽榕樹種植基地，在溫度(26±2)℃、相對濕度60％±5％、光周期L︰D＝8︰16、光照強度(10000±50)Lx條件下，用特制養(yǎng)蟲瓶(專利號：ZL 2012 1 0018430.7)和當年新抽垂葉榕嫩枝條(枝條上有3張以上嫩葉)飼養(yǎng)13～15代，建立穩(wěn)定種群后備用。

(2)供試菌株生物學特性觀察

取保存的4株蠟蚧輪枝菌菌株接種到9cm的察氏培養(yǎng)基平板上，活化培養(yǎng)10d后用無菌打孔器分別在4株活化菌株的培養(yǎng)皿內(nèi)打取直徑5mm的菌苔，菌絲面朝下接種于直徑9cm的察氏培養(yǎng)基平板上，每株菌株各接5個培養(yǎng)皿，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天下午15︰00采用十字交叉法測量每株菌株菌落直徑的增長量，連續(xù)測量10d，計算每株供試菌株的生長速度；然后往每個培養(yǎng)皿中加入10mL的0.05％吐溫-80無菌水作為潤濕劑洗脫并收集分生孢子，經(jīng)3層脫脂紗布過濾除去菌絲和雜質(zhì)得孢子原液，用紐鮑爾血細胞計數(shù)在400倍的倒置生物顯微鏡下，統(tǒng)計每個培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量；再將每株菌株的5份孢子原液均稀釋300倍，各取1mL孢子懸浮液均勻涂布于5份2％水瓊脂平板培養(yǎng)基上，后置于相同條件的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每3h用400倍的倒置生物顯微鏡隨機觀察每個培養(yǎng)基3個視野，每個視野至少20個孢子，以孢子的芽管長度大于或等于孢子短軸直徑為標準，統(tǒng)計孢子萌發(fā)數(shù)，15h后計算4株菌株的孢子萌發(fā)率并估測孢子萌發(fā)中時(GT₅₀)。

(3)供試菌株對榕母管薊馬的毒力測定

取活化后的4株供試菌株，然后往每個活化培養(yǎng)皿中加入10mL的0.05％吐溫-80無菌水作為潤濕劑洗脫并收集分生孢子，計算孢子原液的濃度，再用無菌水將每份孢子原液分別稀釋成1.00×10⁴，1.00×10⁵，1.00×10⁶，1.00×10⁷和1.00×10⁸mL^-1等5個處理濃度，以0.05％吐溫-80無菌水為對照，共6個處理，每個處理3次重復。取直徑9cm的培養(yǎng)皿，依次鋪入1片相同直徑的花泥和濾紙，花泥厚0.5cm、吸水8mL，在濾紙上再放1片帶葉柄的垂葉榕嫩葉，葉柄用濕棉花包裹并與濾紙緊貼，共72個培養(yǎng)皿，每株菌株分得18個培養(yǎng)皿，均勻分成6組。用軟毛筆刷挑取同一日齡的榕母管薊馬成蟲，每株菌株每個處理均挑90頭，在各自處理液中浸泡10s，待蟲體略干時再挑到葉片上，每皿挑30頭后用保鮮膜封口，并用0.27mm的昆蟲針在保鮮膜上密扎細孔通氣；將培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天下午15︰00觀察、記錄死亡數(shù)，連續(xù)觀察10d，并將死亡蟲體挑入察氏培養(yǎng)基平板上，再置于相同條件的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、觀察，以死亡蟲體長出菌絲計為有效感染，統(tǒng)計榕母管薊馬成蟲的死亡數(shù)，計算累計校正死亡率，估測每株菌株的致死中時(LT₅₀)。

(4)數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用DPS 7.05數(shù)據(jù)處理軟件，采用Tukey檢驗法對4株蠟蚧輪枝菌菌株生長速度、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率進行多重比較；采用機率值分析法，估測比較4株供試菌株孢子的GT₅₀及菌株對榕母管薊馬成蟲的LT₅₀；采用逐步回歸分析法，分析供試菌株生物學特性與毒力(1.00×10⁸mL^-1處理)的相關性，構建最優(yōu)回歸方程。

2、結果與分析

(1)4株供試菌株的生物學特性

由表1可知，V16063、V3450和Vp28菌株生長較快，菌株生長速度在4.68～4.94mm/d間，相互間差異不顯著；V07菌株生長最慢，與其他3株菌株的差異顯著。4株菌株產(chǎn)孢量均很多，每皿達4.25×10⁹～6.04×10⁹，其中V3450菌株最多，依次為V16063、Vp28和V07菌株，菌株間略存差異但差異不顯著。4株菌株孢子萌發(fā)率均很高，高達95.91％～97.07％，其中Vp28菌株最高，依次為V3450、V07和V16063菌株，菌株間存差不顯著。V3450菌株孢子GT₅₀最短，為5.86h，顯著短于其他3株菌株；V07菌株孢子GT₅₀最長，與其他3株菌株差異顯著。

表1 4株蠟蚧輪枝菌菌株的生物學特性

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P＜0.05)。

(2)4株供試菌株對榕母管薊馬成蟲的毒力

①榕母管薊馬成蟲受供試菌株侵染后的死亡趨勢

由圖1至圖4可知，榕母管薊馬成蟲受4株蠟蚧輪枝菌菌株侵染后的死亡趨勢均隨菌劑濃度升高和侵染時間延長而上升，但不同菌劑中榕母管薊馬成蟲累計校正死亡率大小及死亡趨勢的變幅則明顯不同。Vp28、V3450和V16063菌株，榕母管薊馬成蟲的累計校正死亡率均在接菌3～4d后呈現(xiàn)快速遞增，7～8d后趨于平緩；10d后1.00×10⁷和1.00×10⁸mL^-1處理的累計校正死亡率，以V3450最高(77.11％～85.54％)，V16063位居其次(75.90％～78.31％)，Vp28位居第3(66.26％～74.70％)。而V07菌株，榕母管薊馬成蟲的累計校正死亡率雖在接菌3～4d后也開始遞增，但遞增速度較緩，6～7d后就趨于平緩，10d后1.00×10⁷和1.00×10⁸mL^-1處理的累計校正死亡率分別為43.37％和54.22％，僅是其他3株菌株的56.24％～65.45％和63.39％～72.58％。

②供試菌株對榕母管薊馬成蟲的LT₅₀

由表2可知，1.00×10⁴mL^-1處理濃度，4株供試菌株的LT₅₀均較長(9.38～13.30d)，其中以V3450菌株最短，其他依次為Vp28、V07和V16063菌株，相互間差異不顯著。1.00×10⁵和1.00×10⁶mL^-1處理濃度，4株供試菌株的LT₅₀略有變短(8.50～11.69d和7.23～10.09d)，但仍以V3450菌株最短，其他則依次為Vp28、V16063和V07菌株，且相互間存在差異但不顯著。1.00×10⁷和1.00×10⁸mL^﹣1處理，4株供試菌株的LT₅₀均明顯變短，但還是以V3450菌株最短(5.72d和5.17d)，V16063菌株位居其次(5.77d和5.54d)，Vp28菌株位居第3(6.38d和5.86d)；V07菌株最長，且與其他3株菌株差異顯著。

表2 4株供試菌株對榕母管薊馬成蟲的LT₅₀

注：同行不同小寫字母表示差異顯著(P＜0.05)。

③供試菌株生物學特性與毒力相關性的逐步回歸分析

由表3可知，在逐步回歸分析過程中，蠟蚧輪枝菌4個生物學指標對菌株毒力的作用水平不同。產(chǎn)孢量(x₃)和孢子萌發(fā)率(x₄)對累計校正死亡率(y₁)和LT₅₀(y₂)的作用不顯著(F＝0.00)，而被剔除；菌株生長速度(x₁)和孢子GT₅₀(x₂)對累計校正死亡率(y₁)和LT₅₀(y₂)的作用則達顯著水平(F≥28.34)，被引入后得2個最優(yōu)回歸方程y₁＝－1434.0017+217.9375x₁+75.6041x₂和y₂＝175.8298－23.8111x₁－9.0535x₂，相關系數(shù)分別高達0.9993和0.9962，且顯著性檢驗均達顯著水平(P＜0.05)。同時，由方程變量的偏相關分析可知，累計校正死亡率與菌株生長速度呈極顯著正相關(P＜0.01)，與孢子GT₅₀呈顯著正相關(P＜0.05)；LT₅₀與菌株生長速度和孢子GT₅₀均呈顯著負相關(P＜0.05)。

表3蠟蚧輪枝菌生物學特性與毒力相關性的逐步回歸分析

注：x₁、x₂、x₃和x₄分別表示菌株生長速度、孢子GT₅₀、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率，y₁和y₂分別表示累計校正死亡率和LT₅₀。

3、結論

4株蠟蚧輪枝菌菌株的生物學特性存在異同，產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率均很高，但V3450菌株生長速度最快、孢子GT₅₀最短，V16063和Vp28菌株生長速度較快、孢子GT₅₀較短，V07菌株生長速度最慢、孢子GT₅₀最長；榕母管薊馬成蟲受供試菌株侵染后的死亡趨勢均隨菌劑濃度升高和侵染時間延長而上升，但不同菌劑中的變幅則明顯不同，侵染致死效果次序為V3450＞V16063＞Vp28＞V07，LT50次序為V3450＜V16063＜Vp28＜V07。通過逐步回歸分析探討菌株生物學特性與毒力的相關性發(fā)現(xiàn)，菌株毒力與其生長速度和孢子GT₅₀顯著相關，菌株生長越快、孢子萌發(fā)越快，毒力越高；而菌株毒力與產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率未呈顯著相關，這可能是由于供試菌株的產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率均很高且差異不顯著的緣故?？梢姡诠┰嚲戤a(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率均很高且相互間差異不顯著時，菌株生長速度和孢子GT₅₀可作為評判蠟蚧輪枝菌對榕母管薊馬毒力大小的初篩指標，所構建的2個最優(yōu)回歸方程可用于榕母管薊馬防治高效蠟蚧輪枝菌菌株的快速初篩；而對于低產(chǎn)孢量和低孢子萌發(fā)率的菌株，無需經(jīng)過方程評判，可直接淘汰。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。