本發(fā)明涉及量子點應(yīng)用領(lǐng)域和生物熒光標記領(lǐng)域，具體涉及一種納米量子點對動物細胞的熒光標記方法。

背景技術(shù)：

探索和發(fā)現(xiàn)生物體內(nèi)及生命過程中蛋白質(zhì)、核酸、多肽等重要生物分子的高靈敏分析檢測方法，是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點和難點。生物標記技術(shù)是該領(lǐng)域不可或缺的研究手段。通用的生物標記方法可以分為放射性標記、顯色標記、酶標記和熒光標記等。其中，熒光標記備受科研人員關(guān)注，而其檢測靈敏度很大程度上取決于熒光標記探針的發(fā)光強度和光化學(xué)穩(wěn)定性。

熒光半導(dǎo)體納米材料量子點具有發(fā)光效率高、光化學(xué)穩(wěn)定性好、發(fā)射光顏色與粒徑大小關(guān)聯(lián)等優(yōu)點，作為一種新型熒光標記物可廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)及dna檢測、細胞標記成像、活細胞生命動態(tài)過程示蹤、活體動物體內(nèi)腫瘤細胞靶向示蹤等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

現(xiàn)有的生物標記技術(shù)主要基于生物素與親和素之間的非共價相互作用，雖然具有簡便、快捷的優(yōu)點，但是標記產(chǎn)物不穩(wěn)定。另一種采用基于羧基與氨基的縮合反應(yīng)的標記方法往往需要添加催化劑，并且由于生物體本身存在大量氨基與羧基，因此反應(yīng)效率不高，特異性也不好。

目前點擊化學(xué)應(yīng)用最為廣泛的是銅離子催化的端基炔和疊氮化物huisgen偶極環(huán)加成反應(yīng)。而新型的基于環(huán)炔基-疊氮連接的不含銅的新型點擊化學(xué)方法更為其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)，將點擊化學(xué)與熒光納米量子點結(jié)合起來可以構(gòu)建一種穩(wěn)定的納米標記探針。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種納米量子點對動物細胞的熒光標記方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中采用生物標記方法，無論是熒光半導(dǎo)體標記還是基于羧基與氨基的縮合反應(yīng)標記都普遍存在標記不穩(wěn)定、標記效率低、影響被標記物的活性，或者標記成本高的問題。

為解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種納米量子點對動物細胞的熒光標記方法，包括以下步驟：

步驟一，制備細胞-點擊化學(xué)修飾連接劑復(fù)合培養(yǎng)液：通過在細胞的培養(yǎng)液中，以1:1的比例添加帶有環(huán)炔基的點擊化學(xué)修飾連接劑，在室溫下反應(yīng)30-60分鐘得到細胞-點擊化學(xué)修飾連接劑復(fù)合培養(yǎng)液，其中點擊化學(xué)修飾連接劑的量為細胞摩爾量的10-100倍；

步驟二，使用疊氮-熒光量子點復(fù)合物對細胞進行熒光標記：將疊氮-熒光量子點復(fù)合物以1:1的比例加入制備完成的細胞-點擊化學(xué)修飾連接劑復(fù)合培養(yǎng)液中，室溫孵育30-60分鐘，得到熒光量子點標記的生物體培養(yǎng)液，其中疊氮-熒光量子點復(fù)合物的量為細胞摩爾量的10-100倍。

進一步的，所述疊氮-熒光量子點復(fù)合物為cdse、cdte、cds、zns、cuinse、cuins、inp、cdse/zns、cdte/cds、cdte/cdse中的一種或多種。

進一步的，所述細胞-點擊化學(xué)修飾連接劑復(fù)合培養(yǎng)液制備完成后，加入ph為7.2-7.6的緩沖液對其洗滌，將多余的點擊化學(xué)修飾連接劑去除。

進一步的，所述熒光量子點標記的生物體培養(yǎng)液制備完成后，加入ph為7.2-7.6的緩沖液對其洗滌，將多余的疊氮-熒光量子點復(fù)合物去除，并采用離心的方式收集熒光量子點標記的細胞。

進一步的，所述緩沖液為pbs緩沖液或者hepes緩沖液。

進一步的，所述培養(yǎng)液為dmem培養(yǎng)液。

進一步的，所述疊氮-熒光量子點復(fù)合物中，量子點內(nèi)核為cdse/zns核殼型量子點，外面包裹修飾有疊氮基團聚馬來酸酐聚合物n3-pmah。

進一步的，所述疊氮-量子點復(fù)合物溶液的制備方法是：

將cdse/zns核殼量子點溶解于氯仿中，然后將聚合物n3-pmah溶解于二甲基亞砜，緩慢加入cdse/zns核殼量子點的氯仿溶液，形成透明溶液；

50℃加熱2h，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿，再在90℃加熱4h；

降溫后，加入氯仿/正己烷=1：1沉淀，6000g離心10min。丙酮洗3次；

重新溶解于ph為7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液，即得到疊氮-量子點復(fù)合物溶液。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：將熒光量子點以共價的方式結(jié)合到細胞上，熒光標記穩(wěn)定、高效，并且能夠保持被標記物的活性；并且本發(fā)明的方法操作簡便，快速易行，為細胞等生物體的長時間觀察研究提供了適宜的實驗方法。

基于活體細胞的熒光標記，或活體熒光成像技術(shù)不需要殺死動物，可以對同一個動物進行長時間反復(fù)跟蹤成像，既可以提高數(shù)據(jù)的可比性，避免個體差異對試驗結(jié)果的影響。更重要的是，該技術(shù)可以得到直觀的成像圖片，了解標記物在動物體內(nèi)的分布和代謝情況，避免了傳統(tǒng)的體外實驗方法的諸多缺點，特別是在在癌癥細胞轉(zhuǎn)移及干細胞相關(guān)研究、藥物制劑學(xué)、藥物臨床前研究中有不可估量的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為根據(jù)本發(fā)明對細胞進行熒光量子點標記的原理示意圖。

圖2為本發(fā)明實施例中所用疊氮-量子點復(fù)合物的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖3為用于修飾量子點的疊氮聚合物n3-pmah的1hnmr圖譜。

圖4示出本發(fā)明實施例中所用疊氮-量子點復(fù)合物的吸收和發(fā)射光譜。

圖5示出本發(fā)明實施例中所用疊氮-量子點復(fù)合物的透射電鏡圖像。

圖6a和6b分別為根據(jù)本發(fā)明對a549細胞和ramos淋巴瘤細胞進行熒光量子點標記后的熒光成像圖。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

圖1示出了本發(fā)明一種納米量子點對動物細胞的熒光標記方法的一個實施例：一種納米量子點對動物細胞的熒光標記方法，包括以下步驟：

步驟一，制備細胞-點擊化學(xué)修飾連接劑復(fù)合培養(yǎng)液：通過在細胞的培養(yǎng)液中，以1:1的比例添加帶有環(huán)炔基的點擊化學(xué)修飾連接劑，在室溫下反應(yīng)30-60分鐘得到細胞-點擊化學(xué)修飾連接劑復(fù)合培養(yǎng)液，其中點擊化學(xué)修飾連接劑的量為細胞摩爾量的10-100倍；

步驟二，使用疊氮-熒光量子點復(fù)合物對細胞進行熒光標記：將疊氮-熒光量子點復(fù)合物以1:1的比例加入制備完成的細胞-點擊化學(xué)修飾連接劑復(fù)合培養(yǎng)液中，室溫孵育30-60分鐘，得到熒光量子點標記的生物體培養(yǎng)液，其中疊氮-熒光量子點復(fù)合物的量為細胞摩爾量的10-100倍。。

根據(jù)本發(fā)明一種納米量子點對動物細胞的熒光標記方法的一個實施例，所述疊氮-熒光量子點復(fù)合物為cdse、cdte、cds、zns、cuinse、cuins、inp、cdse/zns、cdte/cds、cdte/cdse中的一種或多種。由于本發(fā)明的方法是在量子點表面修飾疊氮基，并利用疊氮基與環(huán)炔基發(fā)生點擊化學(xué)反應(yīng)，而點擊化學(xué)反應(yīng)與量子點本身并無直接關(guān)系。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明的方法理論上適用于所有熒光量子點，其中核殼型的量子點具有更加穩(wěn)定的光學(xué)性質(zhì)。

根據(jù)本發(fā)明一種納米量子點對動物細胞的熒光標記方法的一個實施例，所述細胞-點擊化學(xué)修飾連接劑復(fù)合培養(yǎng)液制備完成后，加入ph為7.2-7.6的緩沖液對其洗滌，將多余的點擊化學(xué)修飾連接劑去除。

根據(jù)本發(fā)明一種納米量子點對動物細胞的熒光標記方法的一個實施例，所述熒光量子點標記的生物體培養(yǎng)液制備完成后，加入ph為7.2-7.6的緩沖液對其洗滌，將多余的疊氮-熒光量子點復(fù)合物去除，并采用離心的方式收集熒光量子點標記的細胞。

根據(jù)本發(fā)明一種納米量子點對動物細胞的熒光標記方法的一個實施例，所述緩沖液為pbs緩沖液或者hepes緩沖液。

根據(jù)本發(fā)明一種納米量子點對動物細胞的熒光標記方法的一個實施例，所述培養(yǎng)液為dmem培養(yǎng)液。

圖2為本發(fā)明的疊氮-量子點復(fù)合物結(jié)構(gòu)示意圖。從圖中可見，本發(fā)明所用的量子點內(nèi)核為cdse/zns核殼型量子點，經(jīng)疊氮基修飾后，量子點表面包覆一層帶疊氮基的聚合物，疊氮基暴露于外，可以與環(huán)炔基化合物發(fā)生點擊化學(xué)反應(yīng)。

實際操作中，細胞可以經(jīng)一段時間的培養(yǎng)。例如，使用含10%小牛血清的dmem培養(yǎng)基，在37℃、5%co2/95%空氣、飽和濕度的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。隔天更換培養(yǎng)液，每4~6天傳代一次。使用前，首先用緩沖液將細胞洗3次，并換新鮮的不含小牛血清的dmem培養(yǎng)基。

細胞表面雖然有多個氨基，但是通過與點擊化學(xué)修飾連接劑分子連接后，轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)炔基，轉(zhuǎn)變的數(shù)量和加入的修飾試劑分子有關(guān)系，環(huán)炔基可以與量子點表面的疊氮基團發(fā)生連接反應(yīng)。每個量子點表面有多個疊氮基，原理上每個疊氮基團都可以連接一個點擊化學(xué)修飾連接劑分子，由于量子點只有10nm左右大小，可以通過控制點擊化學(xué)修飾連接劑分子與細胞的比例，來保證細胞表面量子點能接觸到的范圍內(nèi)，僅有一個環(huán)炔基能夠與量子點表面的疊氮基反應(yīng)。生物體系中通常不含有環(huán)炔基和疊氮基，如此，整個反應(yīng)體系只有含有環(huán)炔基的細胞能和帶有疊氮基的量子點反應(yīng)，從而，本發(fā)明的標記方法具有明顯的特異性。

對于相對復(fù)雜的生物體系如血液、人體組織等體系中，采用這種標記方法可以大大避免傳統(tǒng)基于氨基和羧基反應(yīng)的非特異性標記帶來的偽信號。同時相對生物素-親和素方法由于是化學(xué)鍵合，因此標記產(chǎn)物更加穩(wěn)定。

由于本發(fā)明的生物體熒光標記是基于對細胞進行的熒光標記，因此，本發(fā)明的方法可以對細胞、干細胞、病毒、細菌等生物體進行熒光量子點標記。

下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。

原料與試劑

n3-pmah聚合物修飾劑：參照文獻

journaloftheamericanchemicalsociety2012134(20),8388-8391中所公開的方法合成。具體地，將聚馬來酸酐（分子量1000，購自polysciences,inc）、組胺（購自西格瑪奧德里奇公司）、疊氮基團末端的氨基化聚乙二醇n3-peg8-ch2ch2nh2（購自嘉興博美生物技術(shù)有限公司）在二甲基亞砜（購自西格瑪奧德里奇公司）中反應(yīng)12小時得到。其1hnmr圖譜示于圖3。

cdse/zns核殼量子點：購自武漢珈源量子點技術(shù)開發(fā)有限責(zé)任公司。

a549肺癌細胞、ramos淋巴瘤細胞：均從中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫/中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心獲得。

疊氮-量子點復(fù)合物

本發(fā)明所用的量子點內(nèi)核為cdse/zns核殼型量子點，外面包裹修飾有疊氮基團聚馬來酸酐聚合物n3-pmah。其制備方法如下：

將cdse/zns核殼量子點溶解于氯仿中，然后將聚合物n3-pmah溶解于二甲基亞砜，緩慢加入cdse/zns核殼量子點的氯仿溶液。形成透明溶液。50℃加熱2h，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿，再在90℃加熱4h。降溫后，加入氯仿/正己烷=1：1沉淀，6000g離心10min。丙酮洗3次。重新溶解于ph為7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液，即得到疊氮-量子點復(fù)合物溶液。

圖4為本發(fā)明所用疊氮-量子點復(fù)合物的吸收和發(fā)射光譜。從圖中可見，本發(fā)明的疊氮-量子點復(fù)合物在300nm到590nm有連續(xù)的吸收光譜，而發(fā)射波長在600nm附近。也就是說用300nm到590nm之間任何波長的光源激發(fā)都可以將其激發(fā)而發(fā)射出600nm的紅色熒光。這對于細胞的熒光標記而言，為熒光成像激發(fā)光的選擇帶來極大的方便。

圖5示出本發(fā)明實施例中所用疊氮-量子點復(fù)合物的透射電鏡圖像。從圖中可見，本發(fā)明的量子點粒徑小于5nm，和一般的生物分子如蛋白質(zhì)大小基本差異不大，不會影響細胞的自身功能。同時也能確保細胞表面只有1個環(huán)炔基能與量子點結(jié)合。

盡管本發(fā)明并未窮舉，而僅使用了cdse/zns量子點作為疊氮-量子點復(fù)合物的內(nèi)核，應(yīng)理解，本發(fā)明的方法適用于所有的熒光量子點，包括cdse、cdte、cds、zns、cuinse、cuins、inp等量子點，或是cdse/zns、cdte/cds、cdte/cdse等的核殼型量子點，以及它們的任意組合。

實驗1：a549肺癌細胞標記

a549肺癌細胞培養(yǎng)：培養(yǎng)液為含10%小牛血清的dmem培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件：37℃，5%co2/95%空氣，飽和濕度，隔天更換培養(yǎng)液，每4~6天傳代一次。

a549肺癌細胞培養(yǎng)：培養(yǎng)液為含10%小牛血清的dmem培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件：37℃，5%co2/95%空氣，飽和濕度，隔天更換培養(yǎng)液，每4~6天傳代一次。

a549肺癌細胞與點擊化學(xué)修飾連接劑的結(jié)合：首先用pbs緩沖液將細胞洗3次，換新鮮的不含小牛血清的dmem培養(yǎng)基，然后將摩爾量為細胞摩爾量10倍的點擊化學(xué)修飾連接劑dbco-peg4-nhsester加入細胞培養(yǎng)液，在室溫下振蕩反應(yīng)30分鐘，然后用pbs緩沖液洗去多余的修飾試劑，加入新鮮的培養(yǎng)基，備用。

用疊氮-量子點復(fù)合物對a549肺癌細胞進行熒光標記：將摩爾量為細胞摩爾量10倍的疊氮-量子點復(fù)合物加入以上步驟得到的細胞培養(yǎng)液中，孵育30分鐘，用pbs緩沖液洗去多余的疊氮-量子點，得到量子點標記的細胞溶液。

這樣的用量是為了保證修飾試劑和量子點在一定范圍內(nèi)過量，以提高標記效率。

用熒光顯微鏡可以觀察到細胞上有明顯的熒光信號，如圖6a所示。細胞采用明場模式觀察，得到的細胞圖象為黑白；而量子點發(fā)出的熒光信號采用488nm的激光激發(fā)，收集590nm到630nm波長范圍的紅色熒光信號。可以看到量子點的紅色熒光信號和細胞得到很好的重疊。說明細胞已經(jīng)成功得到標記。

實驗2：ramos淋巴瘤細胞標記

ramos淋巴瘤細胞培養(yǎng)：培養(yǎng)液為含12%胎牛血清的dmem培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件：37℃，5%co2/95%空氣，飽和濕度，隔天更換培養(yǎng)液，每4~6天傳代一次。

ramos淋巴瘤細胞與點擊化學(xué)修飾連接劑的結(jié)合：首先用pbs緩沖液將細胞洗3次，離心收集細胞，換新鮮的不含小牛血清的dmem培養(yǎng)基，然后將摩爾量為細胞摩爾量30倍的點擊化學(xué)修飾連接劑加入細胞培養(yǎng)液，反應(yīng)30分鐘，然后用pbs緩沖液洗去多余的修飾試劑，加入新鮮的培養(yǎng)基，備用。

用疊氮-量子點復(fù)合物對ramos淋巴瘤細胞進行熒光標記：將摩爾量為細胞摩爾量30倍的疊氮-量子點復(fù)合物加入第二步得到的細胞培養(yǎng)液中，孵育30分鐘，用pbs洗去多余的疊氮-量子點，離心收集得到量子點標記的細胞溶液。

這樣的用量是為了保證修飾試劑和量子點在一定范圍內(nèi)過量，以提高起標記效率。由于ramos淋巴瘤細胞是懸浮細胞，為保證其標記效率，修飾劑和量子點的用量會比前面的細胞用量多。

應(yīng)理解，根據(jù)本發(fā)明的方法，針對不同的細胞，或為適應(yīng)不同的情況，點擊化學(xué)修飾連接劑及疊氮-量子點復(fù)合物的用量可以在細胞摩爾量10-100倍范圍內(nèi)變化，并可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)實際情況進行選擇和調(diào)整。

用熒光顯微鏡可以觀察到細胞上有明顯的熒光信號，如圖6b所示。細胞采用明場模式觀察，得到的細胞圖象為黑白；而量子點發(fā)出的熒光信號采用488nm的激光激發(fā)，收集590nm到630nm波長范圍的紅色熒光信號?？梢钥吹搅孔狱c的紅色熒光信號和細胞得到很好的重疊。說明細胞已經(jīng)成功得到標記。

盡管這里參照本發(fā)明的多個解釋性實施例對本發(fā)明進行了描述，但是，應(yīng)該理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)計出很多其他的修改和實施方式，這些修改和實施方式將落在本申請公開的原則范圍和精神之內(nèi)。更具體地說，在本申請公開、附圖和權(quán)利要求的范圍內(nèi)，可以對主題組合布局的組成部件和/或布局進行多種變型和改進。除了對組成部件和/或布局進行的變形和改進外，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，其他的用途也將是明顯的。