本發(fā)明涉及一種與活性型gip特異性地反應(yīng)的抗體其利用。

背景技術(shù)：

gip(腸抑胃肽(gastricinhibitorypolypeptide)或葡萄糖依賴性促胰島素多肽(glucose-dependentinsulinotropicpolypeptide))為屬于胰高血糖素(glucagon)-胰泌素(secretin)家族的消化道激素之一。gip與glp-1(胰高血糖素樣肽1)一起稱為腸促胰島素(incretin)，在脂質(zhì)或糖質(zhì)的攝食時(shí)由存在于小腸的k細(xì)胞分泌。

已知gip會(huì)促進(jìn)胰島β細(xì)胞的胰島素分泌，并激發(fā)胰島素存在下的脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝入。因此，也認(rèn)為gip的作用成為肥胖的一個(gè)主要原因，實(shí)際上，有抑制gip的功能與抑制肥胖的報(bào)告(非專利文獻(xiàn)1)。

進(jìn)一步，報(bào)告有g(shù)ip成為胰島素抵抗性的原因之一(非專利文獻(xiàn)1)。在胰島素抵抗發(fā)病時(shí)，由胰島素導(dǎo)致的糖的吸收作用降低，其結(jié)果，引起高胰島素血癥。高胰島素血癥也據(jù)說是與以肥胖為首的各種的生活習(xí)慣病的發(fā)病有關(guān)的根本原因，從生活習(xí)慣病的風(fēng)險(xiǎn)減輕的方面出發(fā)，胰島素抵抗性的預(yù)防和改善也很重要。

另外，已知gip具有胃酸分泌抑制作用或胃運(yùn)動(dòng)抑制作(專利文獻(xiàn)1～3)，認(rèn)為gip的上升抑制對(duì)飯后的消化促進(jìn)或胃積食的改善有效。

因此，測(cè)定血液中的gip的濃度在這樣的疾病或其治療藥的評(píng)價(jià)方面很重要。

但是，已知在gip中存在具有生理活性的活性型和不具有生理活性的非活性型。即，在人方面，前原gip(prepro-gip)由分布于胃、十二指腸、小腸上部的k細(xì)胞受到處理而成為活性型gip(也記為“gip(1-42)”)，其后，通過由dpp-4將n末端的2個(gè)氨基酸切斷而成為非活性型的gip(也記為“gip(3-42)”)。因此，生物體內(nèi)gip的定量通過測(cè)定活性型和非活性型的總量，不能準(zhǔn)確地得知治療藥的效果或生活習(xí)慣病的風(fēng)險(xiǎn)等。

一直以來，作為測(cè)定活性型gip的手段，市售有活性型gip定量試劑盒(ibl公司)，但存在以下問題：1)飯后的血中活性型gip濃度高于該試劑盒的定量界限；2)稀釋率不同的情況下的變動(dòng)系數(shù)超過10％；3)稀釋率越高，測(cè)定值越升高。另外，最近，報(bào)道有將由gip(1-42)的n末端側(cè)6個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的肽作為免疫原制作的抗活性型gip單克隆抗體利用elisa法可以定量5～4000pg/ml濃度的活性型gip(非專利文獻(xiàn)2)。另外，報(bào)道有將由gip(1-42)的n末端側(cè)7個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的肽作為免疫原制作的抗活性型gip單克隆抗體利用elisa法定量7～500pg/ml濃度的活性型gip(專利文獻(xiàn)4)。

(專利文獻(xiàn)1)國際公開第01/87341號(hào)

(專利文獻(xiàn)2)日本特表2006-213598號(hào)公報(bào)

(專利文獻(xiàn)3)日本特開平5-95767號(hào)公報(bào)

(專利文獻(xiàn)4)日本特開2013-138638號(hào)公報(bào)

(非專利文獻(xiàn)1)miyawakik等，natmed.8(7)：738-42，2002

(非專利文獻(xiàn)2)：jasons.troutt等，clinicalchemistry，57(6)：849-855(2011)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及以下的1)～3)。

1)一種抗體，其為結(jié)合于活性型gip且與非活性型gip實(shí)質(zhì)上不結(jié)合的抗活性型gip抗體，其中，至少識(shí)別選自序列號(hào)5表示的氨基酸序列的第8～10號(hào)的氨基酸中的1個(gè)以上，且在h鏈上含有由下述(1)表示的氨基酸序列或其保守序列突變構(gòu)成的區(qū)域。

emnpsdgrthfne(1)

2)一種活性型gip的檢測(cè)或測(cè)定方法，其使用上述1)的抗體。

3)一種活性型gip的檢測(cè)或測(cè)定試劑，其含有上述1)的抗體。

附圖說明

圖1是使用了本發(fā)明的抗活性型gip抗體的夾心elisa的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖2是使用了本發(fā)明的抗活性型gip抗體的健康人人血中活性型gip的定量。對(duì)照食及試驗(yàn)食攝取后的(a)血中g(shù)ip(1-42)、(b)血中總gip值(n＝5，同以被驗(yàn)者的交叉試驗(yàn))。(c)飯后gip(1-42)相對(duì)于總gip的比例(％)

圖3本發(fā)明抗活性型gip抗體的表位分析。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明涉及提供一種能夠高精度地檢測(cè)活性型gip的抗活性型gip抗體。

本發(fā)明人等對(duì)特異性地識(shí)別活性型gip的抗體的獲取進(jìn)行了各種研究，其結(jié)果識(shí)別了與迄今為止的抗體不同的表位，并成功取得具有高特異性的新型的抗活性型gip抗體。

通過使用本發(fā)明的抗體，可以以高精度將活性型gip與非活性型gip區(qū)別從而進(jìn)行檢測(cè)。因此，根據(jù)本發(fā)明，可以進(jìn)行生物體試樣中的活性型gip的測(cè)定、活性型gip值的異常的檢測(cè)、進(jìn)而以活性型gip作為指標(biāo)的治療藥的奏效性評(píng)價(jià)等。另外，通過計(jì)算活性型gip相對(duì)于總gip的比例，可以估計(jì)dpp-4活性。

本發(fā)明中“活性型gip”是指哺乳類的活性型gip，優(yōu)選為人的活性型gip。人活性型gip為由42個(gè)的氨基酸構(gòu)成的肽(“gip(1-42)”)(序列號(hào)5)。另一方面，“非活性型gip”是指活性型gip的n末端的2個(gè)氨基酸(ya)被切斷后的肽(“gip(3-42)”)。

本發(fā)明中的抗活性型gip抗體為結(jié)合于活性型gip且與非活性型gip實(shí)質(zhì)上不結(jié)合的抗體。

與非活性型gip實(shí)質(zhì)上不結(jié)合可以通過使用蛋白質(zhì)印跡(westernblotting)、免疫沉淀、免疫組織化學(xué)染色、及elisa等方法測(cè)定被驗(yàn)抗體和非活性型gip的結(jié)合來進(jìn)行判斷。具體而言，如果在將被驗(yàn)抗體相對(duì)于活性型gip的結(jié)合量設(shè)為100％的情況下，被驗(yàn)抗體相對(duì)于的非活性型gip的結(jié)合量至多為10％以下，優(yōu)選5％以下，進(jìn)一步優(yōu)選1％以下，進(jìn)一步更優(yōu)選0.1％時(shí)，則可以認(rèn)為其“與非活性型gip實(shí)質(zhì)上不結(jié)合”。

另外，利用夾心elisa(sandwichelisa)的測(cè)定中，相對(duì)于非活性型gip溶液，可以使用例如抗總gip抗體作為捕捉抗體、生物素標(biāo)記抗活性型gip單克隆抗體作為檢測(cè)抗體來進(jìn)行。

另外，本發(fā)明的抗體為識(shí)別活性型gip(序列號(hào)5)的n末端至第8號(hào)以后的氨基酸的抗體，為至少識(shí)別選自第8～10號(hào)(sdy)中的1個(gè)以上的氨基酸的抗體。

進(jìn)一步，本發(fā)明的抗體在h鏈上含有由下述(1)表示的氨基酸序列或其保守序列突變構(gòu)成的區(qū)域。

emnpsdgrthfne(1)

(1)中的字母文字是指氨基酸的一種文字標(biāo)記，序列以從n末端至c末端方向的順序記載。在此，i表示異亮氨酸，l表示亮氨酸，f表示苯基丙氨酸，v表示纈氨酸，a表示丙氨酸，t表示蘇氨酸，d表示天門冬氨酸，q表示谷酰胺，e表示谷氨酸，m表示蛋氨酸，n表示天門冬酰胺，p表示脯氨酸，s表示絲氨酸，g表示甘氨酸，r表示精氨酸，h表示組氨酸。

在本發(fā)明中，“保守序列突變”是指對(duì)由突變前的氨基酸序列構(gòu)成的抗體的反應(yīng)性不產(chǎn)生顯著的影響或不使其改變的氨基酸突變。這樣的保守序列突變中包含1～多個(gè)，優(yōu)選為1～3個(gè)，更優(yōu)選1個(gè)的氨基酸的取代、加成及缺失。作為進(jìn)行了該保守序列突變的氨基酸序列，可列舉與突變前的氨基酸序列具有90％以上，優(yōu)選為95％以上，進(jìn)一步優(yōu)選為98％以上的序列同一性的氨基酸序列。該突變可以利用部位特異的變異誘發(fā)及pcr介導(dǎo)變異誘發(fā)那樣的本技術(shù)領(lǐng)域中公知的標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)而導(dǎo)入到本發(fā)明的抗體中。作為保守氨基酸取代，可舉出將氨基酸殘基取代為具有類似的側(cè)鏈的氨基酸殘基(氨基酸殘基的家族)。該氨基酸殘基的家族在本技術(shù)領(lǐng)域中被定義，包含具有堿基性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天門冬氨酸、谷氨酸)、非荷電極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天門冬酰胺、谷酰氨、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、蛋氨酸)、β-分支側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)、及芳香族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。

上述(1)表示的氨基酸序列編碼由表示h鏈可變區(qū)的序列號(hào)2所示的氨基酸序列的第50～62號(hào)的13氨基酸殘基構(gòu)成的區(qū)域。

本發(fā)明的抗體只要具有上述反應(yīng)性，也可以為被該抗體的片段、例如f(ab')2、f(ab')、單鏈fv(scfv)、vh及vl中的半胱氨酸殘基取代的氨基酸殘基經(jīng)由二硫鍵而結(jié)合的二硫鍵fv(dsfv)或它們的聚合物、或scfv進(jìn)行了二聚化后的二聚化v區(qū)域(雙鏈抗體，diabody)。進(jìn)而，只要具有上述反應(yīng)性，則含有抗活性型gip抗體的一部分(即，具備構(gòu)成抗體的氨基酸序列的一部分)且具有上述反應(yīng)性的肽也包含于該抗體的碎片中。

另外，本發(fā)明抗體的免疫球蛋白類別沒有特別限定，可以為igg、igm、iga、ige、igd、igy的任一種免疫球蛋白類別，優(yōu)選為igg。另外，本發(fā)明的抗體也包含任一種同種型的抗體。

另外，本發(fā)明的抗體可以為非人動(dòng)物的抗體、人型嵌合抗體、人源化抗體及人源抗體的任一種。作為非人動(dòng)物的抗體，可以列舉例如小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠等的抗體，優(yōu)選為小鼠的抗體。

在此，“人型嵌合抗體”為以將源自非人動(dòng)物且與活性型gip特異性結(jié)合的抗體的恒定區(qū)域以具有與人的抗體相同的恒定區(qū)域的方式進(jìn)行基因工程地突變的抗體，優(yōu)選為人/小鼠嵌合抗體。另外，“人源化抗體”為將源自非人動(dòng)物且與活性型gip特異性地結(jié)合的抗體的h鏈和l鏈的互補(bǔ)識(shí)別區(qū)域(cdr)以外的一級(jí)結(jié)構(gòu)通過基因工程突變?yōu)閷?duì)應(yīng)于人的抗體的一級(jí)結(jié)構(gòu)的抗體。另外，“人源抗體”是指作為完全源自人的抗體基因的表達(dá)產(chǎn)物的人源抗體。

作為本發(fā)明的抗體，進(jìn)一步優(yōu)選包含由序列號(hào)2表示的氨基酸序列或其保守序列突變構(gòu)成的區(qū)域作為h鏈可變區(qū)。

而且，進(jìn)一步優(yōu)選包含由序列號(hào)2表示的氨基酸序列或其保守序列突變構(gòu)成的區(qū)域作為h鏈可變區(qū)，且包含由序列號(hào)4表示的氨基酸序列或其保守序列突變構(gòu)成的區(qū)域作為l鏈可變區(qū)。

在本發(fā)明中，作為另外一種方式，提供以下的1)及2)表示的抗體構(gòu)成成分及其基因。特別是由序列號(hào)2表示的氨基酸序列或其保守序列突變構(gòu)成的多肽(h鏈可變區(qū))包含上述(1)表示的氨基酸序列，因此，優(yōu)選作為擔(dān)負(fù)本發(fā)明的抗體的功能的抗體片段。

1)以下的多肽及編碼其的基因

(a)為由序列號(hào)2表示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽、或與該氨基酸序列具有90％以上，更優(yōu)選為95％以上，進(jìn)一步優(yōu)選為98％以上的同一性的氨基酸序列的多肽，且該多肽擔(dān)負(fù)作為結(jié)合于活性型gip且與非活性型gip實(shí)質(zhì)上不結(jié)合的抗體的功能。

(b)為由序列號(hào)1表示的堿基序列構(gòu)成的dna、或由與該堿基序列具有90％以上，更優(yōu)選為95％以上，進(jìn)一步優(yōu)選為98％以上的同一性的堿基序列構(gòu)成的dna，且該dna編碼擔(dān)負(fù)作為結(jié)合于活性型gip且與非活性型gip實(shí)質(zhì)上不結(jié)合的抗體的功能的多肽。

2)以下的多肽及編碼其的基因

(c)為由序列號(hào)4表示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽、或與該氨基酸序列具有90％以上，更優(yōu)選95％以上，進(jìn)一步優(yōu)選98％以上的同一性的氨基酸序列的多肽，且該多肽擔(dān)負(fù)作為結(jié)合于活性型gip且與非活性型gip實(shí)質(zhì)上不結(jié)合的抗體的功能。

(d)為由序列號(hào)3表示的堿基序列構(gòu)成的dna、或由與該堿基序列具有90％以上，更優(yōu)選95％以上，進(jìn)一步優(yōu)選98％以上的同一性的堿基序列構(gòu)成的dna，且該dna編碼擔(dān)負(fù)作為結(jié)合于活性型gip且與非活性型gip實(shí)質(zhì)上不結(jié)合的抗體的功能的多肽。

作為由與上述的序列號(hào)1或3表示的堿基序列具有90％以上的同一性的堿基序列構(gòu)成的dna，例如可舉出在嚴(yán)格的條件下與序列號(hào)1或3表示的堿基序列進(jìn)行雜交的dna。此時(shí)的雜交的條件可舉出例如在6×ssc(0.9mnacl，0.09m檸檬酸三鈉)或6×sspe(3mnacl，0，2mnah2po4，20mmedta·2na，ph7.4)中在42℃下進(jìn)行雜交，之后在42℃下用0.5×ssc進(jìn)行清洗的條件。

另外，在本發(fā)明中，氨基酸序列或堿基序列間的同一性是指在比對(duì)2個(gè)氨基酸序列或堿基序列時(shí)在兩個(gè)序列中同樣氨基酸殘基或堿基存在的位置的數(shù)目相對(duì)于全長氨基酸殘基數(shù)或堿基數(shù)的比例(％)。具體而言，例如可以通過利用李普曼-皮爾遜法(lipman-pearson法；science，227，1435，(1985))進(jìn)行計(jì)算，并使用遺傳信息處理軟件genetyx-win(ver.5.1.1；軟件開發(fā))的同源性分析(searchhomology)程序，將比較的單位大小(unitsizetocompare)(ktup)設(shè)為2進(jìn)行分析而算出。

作為包含由序列號(hào)2表示的氨基酸序列構(gòu)成的區(qū)域作為h鏈可變區(qū)、且包含由序列號(hào)4表示的氨基酸序列構(gòu)成的區(qū)域作為l鏈可變區(qū)的抗活性型gip抗體，可舉出由后述實(shí)施例1所示的雜交瘤9b9h5-b9株產(chǎn)生的單克隆抗體。

本發(fā)明的抗活性型gip抗體可以使用公知的手段作為單克隆抗體得到。作為源自哺乳動(dòng)物的單克隆抗體，包含由雜交瘤產(chǎn)生的抗體、以及設(shè)計(jì)抗體基因或抗體片段基因并使用公知的基因工程的方法生產(chǎn)的抗體。

作為基因工程的方法，可舉出：通過制成將編碼h鏈可變區(qū)的dna(例如由序列號(hào)1表示的堿基序列構(gòu)成的dna)和編碼l鏈可變區(qū)的dna(例如由序列號(hào)3表示的堿基序列構(gòu)成的dna)分別插入于適當(dāng)?shù)妮d體的啟動(dòng)子下游后的重組體載體，由將其導(dǎo)入于宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化體制造h鏈及l(fā)鏈，將它們用具有可能性的肽連結(jié)；或通過將編碼h鏈可變區(qū)的dna(由例如序列號(hào)1表示的堿基序列構(gòu)成的dna)和編碼l鏈可變區(qū)的dna(例如由序列號(hào)3表示的堿基序列構(gòu)成的dna)用公知的編碼接頭的dna連接而制成插入于適當(dāng)?shù)妮d體的啟動(dòng)子下游的重組體載體，并將其在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)等，從而生產(chǎn)具有抗原結(jié)合能力的單鏈的重組抗體蛋白質(zhì)(scfv)。(參照maccfferty，j.etal.，nature，348，552-554，1990；timclacksonetal，nature，352，642-628，1991等)。另外，進(jìn)一步，可以為生產(chǎn)將編碼可變區(qū)的dna和編碼恒定區(qū)域的dna結(jié)合而表達(dá)的蛋白質(zhì)的方法。此時(shí)，恒定區(qū)域可以為與源自可變區(qū)的抗體同樣的抗體，或可以為源自不同的抗體的抗體。

如上所述，用于制備功能上同等的多肽的氨基酸變異的導(dǎo)入例如可以使用部位特異的變異誘發(fā)法等來進(jìn)行。

抗活性型gip抗體產(chǎn)生雜交瘤基本上可以使用公知技術(shù)如下地制作。

例如，可以根據(jù)需要通過將具有活性型gip或其n末端的氨基酸序列的肽(由序列號(hào)5的第1～15號(hào)的氨基酸序列構(gòu)成的肽)與適當(dāng)?shù)妮d體蛋白質(zhì)、例如鑰孔血藍(lán)蛋白(klh)或牛血清白蛋白等結(jié)合，通過進(jìn)一步提高免疫原性，對(duì)非人哺乳動(dòng)物進(jìn)行免疫而制作。另外，用作致敏抗原(免疫源)的活性型gip或上述肽可以通過基因工程的方法或化學(xué)合成來制作。

作為用致敏抗原進(jìn)行免疫的哺乳動(dòng)物，沒有特別地限定，優(yōu)選考慮作為細(xì)胞融合中使用的母細(xì)胞的哺乳動(dòng)物的骨髓瘤細(xì)胞的相容性而來選擇，一般而言，可使用嚙歯類的動(dòng)物，例如小鼠、大鼠、倉鼠等。

在將致敏抗原對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫中，可按照公知的方法進(jìn)行。例如，可通過將致敏抗原注射于哺乳動(dòng)物的腹腔內(nèi)、或皮下來進(jìn)行。具體而言，將致敏抗原用pbs(磷酸鹽緩沖鹽水，phosphate-bufferedsaline)或生理鹽水等稀釋為適當(dāng)量，將懸浮的物質(zhì)根據(jù)所期望適量混合通常的佐劑(例如費(fèi)氏完全佐劑)，乳化后，給藥于動(dòng)物的皮下、皮內(nèi)、腹腔等而暫時(shí)刺激后，根據(jù)需要重復(fù)進(jìn)行同樣的操作?？乖慕o藥量根據(jù)給藥途徑、動(dòng)物種類來適當(dāng)決定，但優(yōu)選通常的給藥量為每次10μg～1mg左右。這樣進(jìn)行免疫，并確認(rèn)到血清中所期望的抗體水平上升之后，從抗體水平上升后的哺乳動(dòng)物中取出免疫細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞融合。作為進(jìn)行細(xì)胞融合時(shí)的優(yōu)選免疫細(xì)胞，特別地列舉脾細(xì)胞。

作為與上述免疫細(xì)胞融合的另一個(gè)母細(xì)胞的哺乳動(dòng)物的骨髓瘤細(xì)胞可以適當(dāng)使用已經(jīng)公知的各種細(xì)胞株、例如p3x63、ns-1、mpc-11、sp2/0等。

上述免疫細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞融合可以按照公知的方法，例如科勒等的方法(kohleretal.，nature，vol，256，p495-497(1975))等來進(jìn)行。即，通過在聚乙二醇(平均分子量1000～6000的peg，30～60％濃度)、仙臺(tái)病毒(hvj)等的細(xì)胞融合促進(jìn)劑的存在下，根據(jù)期望添加二甲基亞砜等輔助劑，在rpmi1640培養(yǎng)液、mem培養(yǎng)液等營養(yǎng)培養(yǎng)液中將免疫細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行混合，從而形成融合細(xì)胞(雜交瘤)。

將通過融合而形成的雜交瘤在含有次黃嘌呤、胸甙及氨基蝶呤的培養(yǎng)基(hat培養(yǎng)基)等選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)1天～7天，與未融合細(xì)胞進(jìn)行分離。將得到的雜交瘤進(jìn)一步從其產(chǎn)生的抗體(結(jié)合于活性型gip、且與非活性型gip實(shí)質(zhì)上不結(jié)合的抗體)中選擇出來。

按照公知的有限稀釋法將選擇的雜交瘤進(jìn)行單一克隆化，確立作為單一克隆性抗體產(chǎn)生雜交瘤。

檢測(cè)雜交瘤所產(chǎn)生的抗體的活性的方法可以使用公知的方法。例如可舉出elisa法、凝集反應(yīng)法、放射免疫分析法。

為了從得到的雜交瘤取得單克隆抗體，可采用：按照通常的方法培養(yǎng)該雜交瘤，作為其培養(yǎng)上清液而得到的方法；或?qū)㈦s交瘤給藥于與其具有相容性的哺乳動(dòng)物而使其增殖，作為其腹水而得到的方法等。

抗體的精制可以使用鹽析法、凝膠過濾法、離子交換色譜法或親和色譜法等公知的精制手段來進(jìn)行。

通過將本發(fā)明的抗活性型gip抗體用于任意的免疫學(xué)的測(cè)定方法，可以特異性地檢測(cè)或測(cè)定檢測(cè)體中的活性型gip。即，使本發(fā)明的抗活性型gip抗體與檢測(cè)體接觸，并檢測(cè)對(duì)該抗體的結(jié)合從而在免疫學(xué)上測(cè)定活性型gip的水平，由此可以檢測(cè)或測(cè)定生物體試樣或生物體內(nèi)的活性型gip。

由此，可以進(jìn)行生物體試樣中的活性型gip的測(cè)定、活性型gip值的異常的檢測(cè)、進(jìn)而進(jìn)行以活性型gip作為指標(biāo)的治療藥的奏效性評(píng)價(jià)等。

在此，作為免疫學(xué)的測(cè)定法，沒有特別地限制，作為定性的分析，可以列舉免疫組織染色法、熒光抗體法、吸附法、以及中和法，作為定量分析，可以列舉elisa法、放射免疫分析法、及蛋白質(zhì)印跡法等。其中，從簡(jiǎn)便性的觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選使用elisa法。在elisa法、放射免疫分析法中，有競(jìng)爭(zhēng)法、夾心法、直接吸附法。

競(jìng)爭(zhēng)法為使抗活性型gip抗體與分析用板結(jié)合，向其中與小牛腸堿性磷酸酶(ciap)、辣根過氧化物酶等酶或用放射性同位素等標(biāo)記了的一定濃度的活性型gip一起添加試樣。試樣中的活性型gip和標(biāo)記了的活性型gip圍繞對(duì)抗活性型gip抗體的結(jié)合而競(jìng)爭(zhēng)，根據(jù)試樣中的活性型gip的濃度，標(biāo)記活性型gip與抗活性型gip抗體結(jié)合，因此，可以根據(jù)對(duì)該標(biāo)記活性型gip的抗體的結(jié)合量推定試樣中的活性型gip的濃度。

夾心法為使用抗gip抗體和標(biāo)記抗活性型gip抗體的方法，作為抗gip抗體，優(yōu)選與抗活性型gip抗體表位不同的抗體，作為這樣的抗體，可舉出抗總gip抗體。另外，優(yōu)選使用固定化抗gip抗體和標(biāo)記抗活性型gip抗體的方法。

作為固定化抗gip抗體，優(yōu)選將抗體固定化于聚苯乙烯板、膠乳顆粒、磁性顆粒、玻璃纖維膜、尼龍膜、硝基纖維素膜、醋酸纖維素膜等不溶性支撐體上的抗體。

另外，作為標(biāo)記抗活性型gip抗體的標(biāo)記，例如可以使用放射性同位體(例如³²p、³⁵s、³h)、酶(例如過氧化物酶、堿性磷酸酶、熒光素酶)、蛋白(例如抗生物素蛋白)、低分子化合物(例如生物素)、熒光物質(zhì)(例如fitc)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)(例如阿地尼亞(aclidinium))、膠乳顆粒(例如著色膠乳顆粒、熒光膠乳顆粒)、金屬(例如金、銀、鉑等貴金屬)膠體顆粒、碳原子等。

另外，直接吸附法(直接法)為使抗原吸附于固相，從而使之與標(biāo)記抗活性型gip抗體反應(yīng)的方法。

檢測(cè)體(生物體試樣)中的活性型gip的檢測(cè)通過使試樣中的活性型gip與固定化抗gip抗體反應(yīng)來進(jìn)行，例如在利用夾心法的情況下，可以通過使試樣含有液和固定化抗gip抗體反應(yīng)然后使上述標(biāo)記抗體反應(yīng)、或者使固定化抗gip抗體和標(biāo)記抗體同時(shí)反應(yīng)來進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后，如果測(cè)定由試樣中的活性型gip、固定化抗gip抗體以標(biāo)記抗體形成的復(fù)合體中的標(biāo)記量，則可以測(cè)定試樣中的活性型gip量。標(biāo)記量的測(cè)定可以用對(duì)應(yīng)于標(biāo)記體的種類的方法來進(jìn)行。例如，在使用酶作為標(biāo)記的情況下，反應(yīng)后，加入基質(zhì)，并測(cè)定酶活性。另外，在使用熒光(包括熒光膠乳顆粒)或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)作為標(biāo)記的情況下，在不引起消光的條件下測(cè)定信號(hào)。著色膠乳顆粒、金屬膠體顆粒、以及碳顆粒等通過目視或反射光等來測(cè)定信號(hào)。

含有本發(fā)明的抗活性型gip抗體的檢測(cè)或測(cè)定試劑(試劑盒)是在使用本發(fā)明的抗活性型gip抗體測(cè)定或檢測(cè)檢測(cè)體中的活性型gip的方法中使用，是用于定性、定量或半定量地檢測(cè)或測(cè)定從被驗(yàn)者采集的生物體試樣(例如組織、血液、血漿、血清、淋巴液等)或生物體內(nèi)的活性型gip的試劑。

含有該抗活性型gip抗體的檢測(cè)或測(cè)定試劑，優(yōu)選為在被標(biāo)記化的本發(fā)明的抗活性型gip抗體之外，還含有例如檢體用稀釋液、固定化抗gip抗體、反應(yīng)基質(zhì)、根據(jù)需要的顯色試劑、反應(yīng)停止用試劑、標(biāo)準(zhǔn)抗原試劑、樣品前處理用試劑、阻斷試劑等而構(gòu)成。另外，抗活性型gip抗體可以包含或固定于樹脂、膜、薄膜、容器等中，或溶解于溶劑中。

關(guān)于上述的實(shí)施方式，在本發(fā)明中，公開有以下的方式。

＜1＞一種抗體，其為結(jié)合于活性型gip且與非活性型gip實(shí)質(zhì)上不結(jié)合的抗活性型gip抗體，其中，至少識(shí)別選自序列號(hào)5表示的氨基酸序列的第8～10號(hào)氨基酸中的1個(gè)以上，且在h鏈上含有由下述(1)表示的氨基酸序列或其保守序列突變構(gòu)成的區(qū)域。

emnpsdgrthfne(1)

＜2＞根據(jù)＜1＞的抗體，其包含由序列號(hào)2表示的氨基酸序列或其保守序列突變構(gòu)成的區(qū)域作為h鏈可變區(qū)。

＜3＞根據(jù)＜2＞的抗體，其中，保守序列突變后的氨基酸序列與序列號(hào)2表示的氨基酸序列具有90％以上的同一性。

＜4＞根據(jù)＜1＞或＜2＞的抗體，其包含由序列號(hào)2表示的氨基酸序列或其保守序列突變構(gòu)成的區(qū)域作為h鏈可變區(qū)，且包含由序列號(hào)4表示的氨基酸序列或其保守序列突變構(gòu)成的區(qū)域作為l鏈可變區(qū)。

＜5＞根據(jù)＜4＞的抗體，其中，相對(duì)于序列號(hào)2表示的氨基酸序列進(jìn)行了保守序列突變的氨基酸序列與序列號(hào)2表示的氨基酸序列具有90％以上的同一性，相對(duì)于序列號(hào)4表示的氨基酸序列進(jìn)行了保守序列突變的氨基酸序列與序列號(hào)4表示的氨基酸序列具有90％以上的同一性。

＜6＞一種活性型gip的檢測(cè)或測(cè)定方法，其使用＜1＞～＜5＞中任一項(xiàng)的抗體。

＜7＞一種試樣中的活性型gip的檢測(cè)或測(cè)定方法，其包含以下的1)～2)的工序。

1)使固定化抗gip抗體和被標(biāo)記了的＜1＞～＜5＞中任一項(xiàng)的抗體一起或分別與試樣含有液接觸的工序；

2)測(cè)定由試樣中的活性型gip、上述固定化抗gip抗體以及標(biāo)記抗體形成的復(fù)合體中的標(biāo)記量的工序。

＜8＞一種活性型gip的檢測(cè)或測(cè)定試劑，其包含＜1＞～＜5＞中任一項(xiàng)的抗體。

＜9＞以下的多肽及編碼其的基因

(a)為由序列號(hào)2表示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽、或與該氨基酸序列具有90％以上，更優(yōu)選為95％以上，進(jìn)一步優(yōu)選為98％以上的同一性的氨基酸序列的多肽，且該多肽擔(dān)負(fù)作為結(jié)合于活性型gip且與非活性型gip實(shí)質(zhì)上不結(jié)合的抗體的功能。

(b)為由序列號(hào)1表示的堿基序列構(gòu)成的dna、或由與該堿基序列具有90％以上，更優(yōu)選為95％以上，進(jìn)一步優(yōu)選為98％以上的同一性的堿基序列構(gòu)成的dna，且該dna編碼擔(dān)負(fù)作為結(jié)合于活性型gip且與非活性型gip實(shí)質(zhì)上不結(jié)合的抗體的功能的多肽。

＜10＞以下的多肽及編碼其的基因

(c)為由序列號(hào)4表示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽、或與該氨基酸序列具有90％以上，更優(yōu)選為95％以上，進(jìn)一步優(yōu)選為98％以上的同一性的氨基酸序列的多肽，且該多肽擔(dān)負(fù)作為結(jié)合于活性型gip且與非活性型gip實(shí)質(zhì)上不結(jié)合的抗體的功能。

(d)由序列號(hào)3表示的堿基序列構(gòu)成的dna、或由與該堿基序列具有90％以上，更優(yōu)選為95％以上，進(jìn)一步優(yōu)選為98％以上的同一性的堿基序列構(gòu)成的dna，且該dna編碼擔(dān)負(fù)作為結(jié)合于活性型gip且與非活性型gip實(shí)質(zhì)上不結(jié)合的抗體的功能的多肽。

實(shí)施例

實(shí)施例1抗體的制作

1)免疫用肽的合成

將活性型gip的n末端15氨基酸(gip(1-15))peg化后，使klh化學(xué)性地結(jié)合，制作klh結(jié)合peg化gip(1-15)，作為免疫抗原。將對(duì)活性型gip的n末端15氨基酸(gip(1-15))進(jìn)行了peg化后的物質(zhì)作為測(cè)定用抗原(1)，將對(duì)非活性型gip的n末端13氨基酸(gip(3-15))進(jìn)行了peg化后的物質(zhì)作為測(cè)定用抗原(2)。

2)免疫

使用balb/c小鼠3只，在背部皮下進(jìn)行了免疫。在初次的免疫中，給藥將上述中制作的抗原和完全費(fèi)氏佐劑進(jìn)行了混合后的乳膠。從初次免疫開始每2周使用將抗原和不完全費(fèi)氏佐劑進(jìn)行了混合后的乳劑實(shí)施追加免疫。一次性免疫的抗原量在0.1～0.2mg的范圍內(nèi)進(jìn)行。實(shí)施初次免疫7周后，使用從小鼠采集的血清實(shí)施抗體值測(cè)定，確認(rèn)了抗體值的上升。

3)細(xì)胞融合

從抗體值上升了的小鼠中摘除脾臟，得到了脾細(xì)胞。將得到的脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞株p3u1利用peg法融合。其后，播種于20張96孔板(1×10⁵cells/孔)。

4)篩選

將測(cè)定用抗原(1)及(2)以成為1μg/ml的方式用pbs(-)稀釋從而在板上固相化，通過使用了進(jìn)行了hrp標(biāo)記后的抗小鼠ig抗體作為二級(jí)抗體的elisa法評(píng)價(jià)雜交瘤培養(yǎng)上清液和抗原(1)及(2)的反應(yīng)，選擇在抗原(1)中顯示陽性且在抗原(2)中顯示陰性的雜交瘤作為抗活性型gip單克隆抗體產(chǎn)生雜交瘤。

5)克隆

利用有限稀釋法將上述得到的雜交瘤以可得到單一的菌落的方式進(jìn)行培養(yǎng)，由此進(jìn)行抗體產(chǎn)生雜交瘤的克隆，再次elisa測(cè)定單一菌落形成孔，確立產(chǎn)生對(duì)抗原(1)顯示陽性且對(duì)抗原(2)顯示陰性的抗體的9b9h5-b9株。

對(duì)于所得到的抗體產(chǎn)生雜交瘤的保存，培養(yǎng)該雜交瘤并在對(duì)數(shù)增殖期回收之后，用含fbs的細(xì)胞凍結(jié)液調(diào)制成細(xì)胞濃度成為1×10⁶cells/ml之后，以成為1×10⁶cells/管的方式分注于凍存管，在冷凍杯(bicell)中在-80℃下保存。

6)抗體生產(chǎn)

將得到的產(chǎn)生抗體雜交瘤的凍結(jié)冷凍杯解凍，對(duì)hybridoma-sfm進(jìn)行無血清馴化。擴(kuò)大培養(yǎng)后，在2個(gè)滾瓶(500ml×2個(gè)，1l)中進(jìn)行培養(yǎng)，回收培養(yǎng)上清液。使用回收的培養(yǎng)上清液進(jìn)行proteina精制，精制了單克隆抗體。

實(shí)施例2與利用elisa法的活性型gip的反應(yīng)性

利用elisa法確認(rèn)了實(shí)施例1中得到的單克隆抗體與活性型gip的反應(yīng)性。在nh2基生物素標(biāo)記試劑盒(dojindo公司制)中進(jìn)行抗活性型gip單克隆抗體的氨基的生物素標(biāo)記。在人(總)胃抑素(gip)elisa測(cè)定試劑盒(millipore公司制)中作為附屬的檢測(cè)抗體“gipdetectionantibody”(生物素標(biāo)記抗總gip單克隆抗體)的替代，使用1μg/ml制作的生物素標(biāo)記抗活性型gip單克隆抗體進(jìn)行elisa。制作將gip(1-42)或gip(3-42)的2000pg/ml溶液至6個(gè)階段做成最高濃度的4倍稀釋系列(8.2～2000pg/ml)，通過利用抗總gip單克隆抗體(附屬于millipore公司制的人(總)胃抑素(gip)elisa測(cè)定試劑盒)作為捕捉抗體；用生物素標(biāo)記抗活性型gip單克隆抗體作為檢測(cè)抗體；并在檢測(cè)中使用了過氧化物酶-鏈霉親和素結(jié)合物的夾心elisa體系，制作了將gip濃度作為x軸，將吸光度450nm～590nm作為y軸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。

如圖1所示，在gip(3-42)中，在高濃度域中吸光度也不上升，僅在gip(1-42)中吸光度依賴于濃度地上升，因此確認(rèn)了本elisa體系在gip(3-42)中沒有交叉性，能夠特異性地檢測(cè)gip(1-42)。

實(shí)施例3人活性型gip的測(cè)定

為了評(píng)價(jià)是否可以將實(shí)施例2中構(gòu)建的gip(1-42)elisa法在實(shí)際上用于人血中g(shù)ip(1-42)測(cè)定，使用了人血漿樣品進(jìn)行了探討。

相對(duì)于健康人，將攝取了對(duì)照食(標(biāo)準(zhǔn)食)、或試驗(yàn)食(gip減少食)之后的各時(shí)間的血中g(shù)ip(1-42)值示于圖2a，將作為比較測(cè)定的血中總gip值示于圖2b。血中g(shù)ip(1-42)值在飯后30分鐘值處觀察到峰值(圖2a)，但與至飯后120分鐘值都維持高值的總gip(圖2b)相比，顯示在早期血中濃度減少。在對(duì)照食和試驗(yàn)食的比較中，在飯后30分鐘值及60分鐘值處，試驗(yàn)食相對(duì)于對(duì)照食可看到顯著的血中g(shù)ip(1-42)值的減少(圖2a)，并可看到與總gip值(圖2b)同樣的傾向。另外，求出gip(1-42)相對(duì)于飯后的總gip的比例(圖2c)。在飯后30、60、120及180分鐘時(shí)，各時(shí)間的平均值為43％、28％、27％、及19％，顯示在飯后早期活性型gip的比例高，其后經(jīng)時(shí)地減少。

實(shí)施例4活性型gip單克隆抗體的表位分析

為了特定實(shí)施例1中制作的單克隆抗體的表位，制作下述的合成肽。

(1)gip(1-10)：nh2-yaegtfisdy-cooh

(2)gip(1-9)：nh2-yaegtfisd-cooh

(3)gip(1-8)：nh2-yaegtfis-cooh

(4)gip(1-7)：nh2-yaegtfi-cooh

(5)gip(1-6)：nh2-yaegtf-cooh

(6)gip(1-6)+gip非特異的4aa(隨機(jī)4aa)：nh2-yaegtfvnlv-cooh

將合成的6種肽以成為1μg/ml的方式用pbs(-)進(jìn)行稀釋并在96孔板上固相化，使用生物素標(biāo)記抗活性型gip單克隆抗體，并在檢測(cè)中使用過氧化物酶-鏈霉親和素結(jié)合物進(jìn)行elisa。將結(jié)果示于圖3。

由圖3可知：必須以gip(1-8)以上、即從n末端8個(gè)氨基酸以上的長度的活性型gip肽作為抗活性型gip單克隆抗體的識(shí)別部位。

實(shí)施例5h鏈及l(fā)鏈可變區(qū)的氨基酸序列的分析

(1)序列決定

按照常規(guī)方法，進(jìn)行從9b9h5-b9雜交瘤的總rna的提取，將其作為模板制備cdna。使用表1所示的引物，在表2所示的條件下進(jìn)行pcr，將含有h鏈及l(fā)鏈的可變區(qū)的pcr產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增。

即，將得到的cdna(利用h鏈特異的引物合成)作為模板，將小鼠抗體(igg)h鏈特異的引物作為反向引物(reverseprimer)、將表1所示的通用引物(universalprimer)作為正向引物(forwardprimer)進(jìn)行racepcr反應(yīng)。同樣地，以cdna(利用l鏈特異的引物合成)為模板，使用l鏈特異的引物進(jìn)行racepcr反應(yīng)。在pcr酶中使用primestargxl。將得到的pcr產(chǎn)物在cloningplasmidpmd20-t中進(jìn)行連接，通過常規(guī)方法的轉(zhuǎn)化，從而每pcr產(chǎn)物取得48個(gè)克隆。

[表1]

※h-pcr中將標(biāo)記的兩個(gè)序列每個(gè)等摩爾地混合使用

[表2]

取得的克隆使用引物m13-47(cgccagggttttcccagtcacgac；序列號(hào)10)，從plasmid區(qū)域的一側(cè)進(jìn)行分析。使用bigdyeterminatorsv3.1cyclesequencingkit(abi公司)，按照附屬的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃進(jìn)行測(cè)序，并決定序列。決定了的序列中，對(duì)由源自實(shí)驗(yàn)試樣的堿基序列推定的氨基酸序列，利用blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)進(jìn)行相似性檢索，確定推定為編碼h鏈及l(fā)鏈的可變區(qū)的堿基序列(起始密碼子以后)、及氨基酸序列(序列號(hào)1～4)。在此，序列號(hào)1及2表示編碼單克隆抗體的h鏈可變區(qū)的堿基序列及氨基酸序列，序列號(hào)3及4表示編碼單克隆抗體的l鏈可變區(qū)的堿基序列及氨基酸序列。

另外，對(duì)于h鏈可變區(qū)的氨基酸序列，用blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)進(jìn)行相似性的檢索，結(jié)果，關(guān)于距離其n末端第50～62號(hào)的氨基酸殘基“emnpsdgrthfne”，沒有發(fā)現(xiàn)具有與其具有90％以上的同一性的氨基酸序列的多肽。

序列表

<110>花王株式會(huì)社

<120>抗活性型gip抗體

<130>ks1415

<150>jp2014-258849

<151>2014-12-22

<160>10

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>339

<212>dna

<213>小鼠

<220>

<221>cds

<222>(1)..(339)

<400>1

caggtccaactgcagcagcctggggctgaactggtgaagcctggggcc48

glnvalglnleuglnglnproglyalagluleuvallysproglyala

151015

tcagtgaagctgtcctgcaaggcttctggctacaccttcaccagcttc96

servallysleusercyslysalaserglytyrthrphethrserphe

202530

tggatgcactgggtgattcagaggcctggacaaggccttgagtggatt144

trpmethistrpvalileglnargproglyglnglyleuglutrpile

354045

ggagagatgaatcctagcgacggtcgtactcacttcaatgaaaagttc192

glyglumetasnproseraspglyargthrhispheasnglulysphe

505560

aagaccaaggccacactgactatagacacatcctccaacacagcctac240

lysthrlysalathrleuthrileaspthrserserasnthralatyr

65707580

atggaactcaacagcctgacatctgaggactctgcggtctattactgt288

metgluleuasnserleuthrsergluaspseralavaltyrtyrcys

859095

gcaagaaggatggaggactggggccaagggactctggtcactgtttct336

alaargargmetgluasptrpglyglnglythrleuvalthrvalser

100105110

gca339

ala

<210>2

<211>113

<212>prt

<213>小鼠

<400>2

glnvalglnleuglnglnproglyalagluleuvallysproglyala

151015

servallysleusercyslysalaserglytyrthrphethrserphe

202530

trpmethistrpvalileglnargproglyglnglyleuglutrpile

354045

glyglumetasnproseraspglyargthrhispheasnglulysphe

505560

lysthrlysalathrleuthrileaspthrserserasnthralatyr

65707580

metgluleuasnserleuthrsergluaspseralavaltyrtyrcys

859095

alaargargmetgluasptrpglyglnglythrleuvalthrvalser

100105110

ala

<210>3

<211>324

<212>dna

<213>小鼠

<220>

<221>cds

<222>(1)..(324)

<400>3

gacatcaagatgacccagtctccatcttccatgtatgcatctctagga48

aspilelysmetthrglnserprosersermettyralaserleugly

151015

gagagagtcactatcacttgcaaggcgagtcaggacattaatagctat96

gluargvalthrilethrcyslysalaserglnaspileasnsertyr

202530

ttaggctggttccagcagaaaccagggaaatctcctaagaccctgata144

leuglytrppheglnglnlysproglylysserprolysthrleuile

354045

tatggtgcaaacagattggtagatggggtcccatcaaggttcagtggc192

tyrglyalaasnargleuvalaspglyvalproserargphesergly

505560

agtggatctgggcaagattactctctcaccatcagcagcctggagtat240

serglyserglyglnasptyrserleuthrileserserleuglutyr

65707580

gacgatatgggaatatattattgtctacagtatgatgagtttccgctc288

aspaspmetglyiletyrtyrcysleuglntyraspglupheproleu

859095

accttcggtgctgggaccaagctggagctgaaacgg324

thrpheglyalaglythrlysleugluleulysarg

100105

<210>4

<211>108

<212>prt

<213>小鼠

<400>4

aspilelysmetthrglnserprosersermettyralaserleugly

151015

gluargvalthrilethrcyslysalaserglnaspileasnsertyr

202530

leuglytrppheglnglnlysproglylysserprolysthrleuile

354045

tyrglyalaasnargleuvalaspglyvalproserargphesergly

505560

serglyserglyglnasptyrserleuthrileserserleuglutyr

65707580

aspaspmetglyiletyrtyrcysleuglntyraspglupheproleu

859095

thrpheglyalaglythrlysleugluleulysarg

100105

<210>5

<211>42

<212>prt

<213>智人

<400>5

tyralagluglythrpheileserasptyrserilealametasplys

151015

ilehisglnglnaspphevalasntrpleuleualaglnlysglylys

202530

lysasnasptrplyshisasnilethrgln

3540

<210>6

<211>67

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核甘酸

<400>6

ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagtctaatacgactcact60

atagggc67

<210>7

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核甘酸

<400>7

gggaartarcccttgaccaggca23

<210>8

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核甘酸

<400>8

gggaartagcctttgacaaggca23

<210>9

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核甘酸

<400>9

cactgccatcaatcttccacttgaca26

<210>10

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核甘酸

<400>10

cgccagggttttcccagtcacgac24