對相關(guān)申請的援引本申請要求2014年9月12日提交的臨時美國申請no.62/050,022的優(yōu)先權(quán)，通過援引將其完整收入本文。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及用反應(yīng)性半胱氨酸殘基改造的抗體，且更具體地說，本發(fā)明涉及具有治療或診斷應(yīng)用的抗體?？梢允拱腚装彼岣脑炜贵w與化療藥；毒素；親和配體，諸如生物素和檢測標記，諸如熒光團綴合。本發(fā)明還涉及使用抗體和抗體-藥物綴合物化合物在體外，原位和體內(nèi)診斷或治療哺乳動物細胞或相關(guān)病理性情況的方法。發(fā)明背景抗體-藥物綴合物(adc)是有吸引力的靶向化療分子，因為它們組合抗體和細胞毒性藥物二者的理想特性，即通過將有力的細胞毒性藥物靶向表達抗原的腫瘤細胞，由此增強它們的抗腫瘤活性。針對給定靶抗原的成功adc開發(fā)取決于抗體選擇，接頭穩(wěn)定性，細胞毒性藥物效力和接頭-藥物綴合抗體的方式的優(yōu)化。常規(guī)附著方式，即通過共價鍵連接，藥物模塊與抗體一般產(chǎn)生不均一的(heterogeneous)分子混合物，其中藥物模塊結(jié)合在抗體上的許多位點上。例如，細胞毒性藥物一般與抗體通過抗體的通常大量的賴氨酸殘基綴合，從而產(chǎn)生不均一的抗體-藥物綴合物混合物。根據(jù)反應(yīng)條件的不同，所述的不均一混合物一般含有抗體和0-約8或8以上附著的藥物模塊的分布。此外，在具有特定整數(shù)比的藥物模塊與抗體的綴合物各亞組內(nèi)可能是不均一的混合物，其中藥物模塊結(jié)合在抗體上的不同位點上。分析和制備方法不足以分離和表征由綴合反應(yīng)產(chǎn)生的不均一混合物中的抗體-藥物綴合物類分子?？贵w為較大的復(fù)雜的并且結(jié)構(gòu)多樣的生物分子，通常帶有許多反應(yīng)性官能基。其與接頭試劑和藥物-接頭中間體的反應(yīng)性取決于如下因素：諸如ph，濃度，鹽濃度和共溶劑。此外，多步驟綴合過程因控制反應(yīng)條件和表征反應(yīng)劑和中間體方面的困難而可能不可再現(xiàn)。半胱氨酸硫醇在中性ph具有反應(yīng)性，這與在接近ph7時質(zhì)子化和親核性降低的大部分胺類不同。由于游離硫醇(rsh,硫氫基)基團具有相對的反應(yīng)性，所以帶有半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)通常以其作為二硫化物-連接的寡聚體的氧化形式存在或具有內(nèi)部橋連的二硫化物基團?？贵w半胱氨酸硫醇一般對親電子綴合反應(yīng)劑比對抗體胺或羥基更具反應(yīng)性，即更具親核性。通過使蛋白質(zhì)的不同氨基酸殘基突變成半胱氨酸氨基酸的在半胱氨酸硫醇上的設(shè)計可能存在問題，特別是就未配對的(游離cys)殘基或那些相對易于進行反應(yīng)或氧化的殘基而言。在蛋白質(zhì)的濃溶液中，無論是在大腸桿菌(e.coli)的周質(zhì)中，還是在培養(yǎng)物上清液或部分或完全純化的蛋白質(zhì)中，蛋白質(zhì)表面上的未配對的cys殘基可以配對并且氧化成分子內(nèi)二硫化物和由此的蛋白質(zhì)二聚體或多聚體。二硫化物二聚體的形成使得新的cys無法與藥物，配體或其它標記發(fā)生綴合反應(yīng)。此外，如果蛋白質(zhì)以氧化方式在新改造的cys和已存在的cys殘基之間形成分子內(nèi)二硫鍵，那么兩種cys基團對活性位點的參與和相互作用而言均無法利用。此外，可以通過錯誤折疊或喪失三級結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)失活或賦予其非特異性(zhang等(2002)anal.biochem.311:1-9)。在改造的半胱氨酸可供綴合但不擾亂免疫球蛋白折疊和裝配或改變抗原結(jié)合和效應(yīng)器功能的位點處具有半胱氨酸替代的抗體(thiomabtm抗體)(junutula,etal.,2008bnaturebiotech.,26(8):925-932；dornanetal(2009)blood114(13):2721-2729；us7521541；us7723485；wo2009/052249)。然后，這些thiomabtm抗體可以經(jīng)由改造的半胱氨酸硫醇基綴合細胞毒性藥物以獲得具有統(tǒng)一化學(xué)計量(例如在具有一個改造的半胱氨酸位點的抗體中多至2個藥物每個抗體)的thiomabtm抗體-藥物綴合物(tdc)。針對不同抗原的多種抗體的研究顯示了tdc在異種移植物模型中像常規(guī)adc一樣有效，而且在有關(guān)臨床前模型中在更高的劑量得到耐受。thiomabtm抗體改造用于在抗體的不同位置(例如輕鏈-fab，重鏈-fab和重鏈-fc內(nèi)的特定氨基酸位置(即位點))附著藥物。由于它們的同質(zhì)性和位點特異性綴合細胞毒性藥物，thiomabtm抗體的體外和體內(nèi)穩(wěn)定性，功效和pk特性提供勝過常規(guī)adc的獨特優(yōu)勢。發(fā)明概述本申請包括新穎的，分離的半胱氨酸改造抗體(thiomabtm抗體)的公開，其在重鏈或輕鏈中包含游離半胱氨酸氨基酸。本發(fā)明的一個方面為一種制備該分離的半胱氨酸改造抗體(thiomabtm抗體)的工藝，即通過將一個或多個氨基酸殘基用半胱氨酸替換來誘變親本抗體的核酸序列以編碼該半胱氨酸改造抗體；表達該半胱氨酸改造抗體；并分離該半胱氨酸改造抗體。本發(fā)明的另一個方面為分離的半胱氨酸改造抗體(thiomabtm抗體)的綴合物，其中該抗體是共價附著至捕捉標記物，檢測標記物，藥物模塊，或固體支持物的。在某些實施方案中，本發(fā)明為一種半胱氨酸改造抗體，其包含選自表1-4任一，優(yōu)選表1或2任一中鑒定的半胱氨酸突變的半胱氨酸突變。在具體的實施方案中，該半胱氨酸突變?yōu)橛坞x半胱氨酸氨基酸。在某些實施方案中，重鏈中的半胱氨酸突變選自表2或3中鑒定的半胱氨酸突變。在某些實施方案中，輕鏈中的半胱氨酸突變選自表1或4中鑒定的半胱氨酸突變。在某些實施方案中，該半胱氨酸突變選自由hc-i195c，hc-s420c，hc-y432c，和lc-g64c(依照kabat編號方式)組成的組。在某些實施方案中，該半胱氨酸突變選自由hc-y432c和lc-g64c(依照kabat編號方式)組成的組。在某些實施方案中，該半胱氨酸突變?yōu)橹劓溚蛔兦疫x自由y33c，g162c，v184c，i195c，s420c，y432c，和q434c(依照kabat編號方式)組成的組。在某些實施方案中，該半胱氨酸突變?yōu)橹劓溚蛔兦疫x自由r19c，e46c，t57c，y59c，a60c，m100cc，w103c，g162c，i195c，v258c，s420c，h425c，和n430c(依照kabat編號方式)組成的組。在某些實施方案中，該半胱氨酸突變?yōu)橹劓溚蛔兦疫x自由y33c，g162c，v184c，和i195c(依照kabat編號方式)組成的組。在某些實施方案中，該半胱氨酸突變?yōu)橹劓溚蛔兦疫x自由r19c，e46c，y59c，a60c，m100cc，w103c，v258c，h425c，和n430c(依照kabat編號方式)組成的組。在某些實施方案中，該半胱氨酸突變?yōu)檩p鏈突變且選自由y55c，g64c，t85c，和t180c，和n430c(依照kabat編號方式)組成的組。在某些實施方案中，該半胱氨酸突變?yōu)檩p鏈突變且選自由t31c，s52c，g64c，r66c，a193c，和n430c(依照kabat編號方式)組成的組。在某些實施方案中，該半胱氨酸突變?yōu)檩p鏈突變且選自由g64c，t85c，和t180c，和n430c(依照kabat編號方式)組成的組。在某些實施方案中，該半胱氨酸突變?yōu)檩p鏈突變且選自由s52c，g64c，r66c，和a193cn430c(依照kabat編號方式)組成的組。在具體的實施方案中，輕鏈中的半胱氨酸突變選自包含依照kabat編號方式的lc-i106c，lc-r108c，lc-r142c，和lc-k149c的半胱氨酸突變的組(見圖1a；表1)。在一個優(yōu)選的實施方案中，輕鏈中的半胱氨酸突變?yōu)橐勒誯abat編號方式的lc-k149c(見圖1a)。表1：例示性輕鏈半胱氨酸突變。殘基序列(+/-5個殘基)seqidno.eu編號方式kabat編號方式igtkveckrtva1106106rkveikctvaap2108108rnnfypceakvq3142142kakvqwcvdnal4149149在優(yōu)選的實施方案中，重鏈的半胱氨酸突變選自包含依照eu編號方式的hc-t114c，hc-a140c，hc-l174c，hc-l179c，hc-t187c，hc-t209c，hc-v262c，hc-g371c，hc-y373c，hc-e382c，hc-s424c，hc-n434c，和hc-q438c的半胱氨酸突變的組(見圖1b；表2)。在一個優(yōu)選的實施方案中，重鏈中的半胱氨酸突變?yōu)橐勒誯abat編號方式的hc-a143c(即依照eu編號方式的hc-a140c)(見圖1b和21；表2)。在一個優(yōu)選的實施方案中，重鏈中的半胱氨酸突變?yōu)橐勒誩u編號方式的hc-a174c(見圖1b和21；表2)。表2：例示性重鏈半胱氨酸突變。在某些實施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗體是通過包含下述步驟的工藝制備的：(i)通過將一個或多個氨基酸殘基用半胱氨酸替換來誘變親本抗體的核酸序列以編碼該半胱氨酸改造抗體；(ii)表達該半胱氨酸改造抗體；并(iii)分離該半胱氨酸改造抗體。在某些實施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗體為包含清蛋白結(jié)合肽(abp)的融合蛋白。在具體的實施方案中，該abp包含選自下述的序列：a)cdkthtgggsqrlmediclprwgclweddf(seqidno:144)，b)qrlmediclprwgclweddf(seqidno:145)，c)qrliediclprwgclweddf(seqidno:146)，d)rliediclprwgclwedd(seqidno:147)，或e)diclprwgclw(seqidno:148)。在某些實施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗體選自單克隆抗體，抗體片段，雙特異性抗體，嵌合抗體，人抗體，和人源化抗體。在具體的實施方案中，該抗體片段為fab片段。在某些實施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗體為抗her2抗體。在某些實施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗體為抗muc16抗體。在某些實施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗體為抗steap1抗體.在某些實施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗體為抗cd79b抗體。在某些實施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗體為抗cd22抗體。在某些實施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗體為抗b7h4抗體。在某些實施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗體為抗ly6e抗體。在某些實施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗體為抗napi2b抗體。在某些實施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗體結(jié)合受體(1)-(53)中的一項或多項：(1)bmpr1b(骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體-ib型)；(2)e16(lat1,slc7a5)；(3)steap1(前列腺的六次跨膜上皮抗原)；(4)0772p(ca125,muc16)；(5)mpf(mpf,msln,smr,巨核細胞強化因子,間皮素)；(6)napi3b(napi2b,napi-3b,nptiib,slc34a2,溶質(zhì)載體家族34(磷酸鈉),成員2,ii型鈉依賴性磷酸轉(zhuǎn)運蛋白3b)；(7)sema5b(flj10372,kiaa1445,mm.42015,sema5b,semag,腦信號蛋白5bhlog,sema結(jié)構(gòu)域,七次血小板反應(yīng)蛋白重復(fù)(1型和類1型),跨膜域(tm)和短胞質(zhì)域,(腦信號蛋白)5b)；(8)pscahlg(2700050c12rik,c530008o16rik,rikencdna2700050c12,rikencdna2700050c12基因)；(9)etbr(內(nèi)皮縮血管肽b型受體)；(10)msg783(rnf124,假定蛋白flj20315)；(11)steap2(hgnc_8639,ipca-1,pcanap1,stamp1,steap2,stmp,前列腺癌相關(guān)基因1,前列腺癌相關(guān)蛋白1,前列腺的六次跨膜上皮抗原2,六次跨膜前列腺蛋白)；(12)trpm4(br22450,flj20041,trpm4,trpm4b,瞬時型受體電位陽離子通道,亞家族m,成員4)；(13)cripto(cr,cr1,crgf,cripto,tdgf1,畸胎瘤衍生的生長因子)；(14)cd21(cr2(補體受體2)或c3dr(c3d/eb病毒受體)或hs.73792)；(15)cd79b(cd79b,cd79β,igb(免疫球蛋白相關(guān)β),b29)；(16)fcrh2(ifgp4,irta4,spap1a(含sh2域的磷酸酶錨定蛋白1a),spap1b,spap1c)；(17)her2；(18)nca；(19)mdp；(20)il20rα；(21)brevican；(22)ephb2r；(23)aslg659；(24)psca；(25)geda；(26)baff-r(b細胞活化因子受體,blys受體3,br3)；(27)cd22(b細胞受體cd22-b同種型)；(28)cd79a(cd79a,cd79α,免疫球蛋白相關(guān)α,b細胞特異性蛋白)；(29)cxcr5(伯基特氏淋巴瘤受體1,g蛋白偶聯(lián)受體)；(30)hla-dob(mhcii類分子的β亞基(ia抗原))；(31)p2x5(嘌呤能受體p2x配體門控性離子通道5)；(32)cd72(b細胞分化抗原cd72,lyb-2)；(33)ly64(淋巴細胞抗原64(rp105),富亮氨酸重復(fù)(lrr)家族的i型膜蛋白)；(34)fcrh1(fc受體樣蛋白1)；(35)irta2(免疫球蛋白超家族受體易位相關(guān)2)；(36)tenb2(推定的跨膜蛋白聚糖)；(37)pmel17(銀同系物；silv；d12s53e；pmel17；si；sil)；(38)tmeff1(具有egf樣和兩個卵泡抑素樣域的跨膜蛋白1；tomoregulin-1)；(39)gdnf-ra1(gdnf家族受體α1；gfra1；gdnfr；gdnfra；retl1；trnr1；ret1l；gdnfr-α1；gfr-α-1)；(40)ly6e(淋巴細胞抗原6復(fù)合物,基因座e；ly67,rig-e,sca-2,tsa-1)；(41)tmem46(shisa同系物2)；(42)ly6g6d(淋巴細胞抗原6復(fù)合物,基因座g6d；ly6-d,megt1)；(43)lgr5(含富亮氨酸重復(fù)的g蛋白偶聯(lián)受體5；gpr49,gpr67)；(44)ret(ret原癌基因；men2a；hscr1；men2b；mtc1；ptc；cdhf12；hs.168114；ret51；ret-ele1)；(45)ly6k(淋巴細胞抗原6復(fù)合物,基因座k；ly6k；hsj001348；flj35226)；(46)gpr19(g蛋白偶聯(lián)受體19；mm.4787)；(47)gpr54(kiss1受體；kiss1r；gpr54；hot7t175；axor12)；(48)asphd1(含天冬氨酸β-羥化酶域的1；loc253982)；(49)酪氨酸酶(tyr；ocaia；oca1a；酪氨酸酶；shep3)；(50)tmem118(環(huán)指蛋白,跨膜2；rnft2；flj14627)；(51)gpr172a(g蛋白偶聯(lián)受體172a；gpcr41；flj11856；d15ertd747e)；(52)cd33；和(53)cll-1(clec12a,micl,和dcal2)。在某些實施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗體是共價附著至捕捉標記物，檢測標記物，藥物模塊，或固體支持物的。在具體的實施方案中，該抗體是共價附著至生物素捕捉標記物的。在具體的實施方案中，該抗體是共價附著至熒光染料檢測標記物的。在具體的實施方案中，該熒光染料選自熒光素型，若丹明型，丹酰，麗絲胺，花菁，藻紅蛋白，德克薩斯紅，及其類似物。在具體的實施方案中，該抗體是共價附著至選自3h，11c，14c，18f，32p，35s，64cu，68ga，86y，89zr，99tc，111in，123i，124i，125i，131i，133xe，177lu，211at，和213bi的放射性核素檢測標記物的。在具體的實施方案中，該抗體是通過螯合配體共價附著至檢測標記物的。在具體的實施方案中，該螯合配體選自dota，dotp，dotma，dtpa和teta。在某些實施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗體共價附著至選自美登木素生物堿，奧瑞司他汀，多拉司他汀，單端孢菌素，cc1065，加利車霉素，烯二炔類抗生素，紫杉烷，和蒽環(huán)類抗生素的藥物模塊以形成具有式i(即ab-(l-d)p)的抗體-藥物綴合物，其中ab為該抗體，l為接頭，d為該藥物模塊，且p為1，2，3，或4。在具體的實施方案中，該抗體-藥物綴合物具有結(jié)構(gòu)：在具體的實施方案中，綴合至本文所述半胱氨酸改造抗體的式i的藥物(d)為美登木素生物堿，其具有結(jié)構(gòu)：其中波狀線表示d的硫原子與接頭的共價附著；r獨立選自h，甲基，乙基，1-丙基，2-丙基，1-丁基，2-甲基-1-丙基，2-丁基，2-甲基-2-丙基，1-戊基，2-戊基，3-戊基，2-甲基-2-丁基，3-甲基-2-丁基，3-甲基-1-丁基，2-甲基-1-丁基，1-己基，2-己基，3-己基，2-甲基-2-戊基，3-甲基-2-戊基，4-甲基-2-戊基，3-甲基-3-戊基，2-甲基-3-戊基，2,3-二甲基-2-丁基，和3,3-二甲基-2-丁基；且m為1，2，或3。在具體的實施方案中，綴合至本文所述半胱氨酸改造抗體的式i的藥物(d)選自結(jié)構(gòu)：在具體的實施方案中，綴合至本文所述半胱氨酸改造抗體的式i的藥物(d)具有下述結(jié)構(gòu)：其中n為0，1，或2。在具體的實施方案中，綴合至本文所述半胱氨酸改造抗體的式i的藥物(d)為單甲基奧瑞司他汀藥物模塊mmae或mmaf，其具有結(jié)構(gòu)：在本發(fā)明的某些實施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗體具有下述結(jié)構(gòu)之一：其中val為纈氨酸；cit為瓜氨酸；且p為1，2，3，或4。在本發(fā)明的某些實施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗體具有下述結(jié)構(gòu)：在某些實施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗體綴合至落入本說明書后續(xù)部分進一步詳細描述的下述類別之一的藥物：奧瑞司他汀(auristatin)，多拉司他汀(dolastatin)，單端孢菌素(trichothecene)，cc1065，加利車霉素(calicheamicin)，烯二炔類抗生素，紫杉烷，吡咯并苯并二氮雜卓(pyrrolobenzodiazepine)(pbd)，1-(氯甲基)-2,3-二氫-1h-苯并[e]吲哚(cbi)二聚體，cbi-pbd異二聚體，和蒽環(huán)類抗生素(anthracycline)。在某些實施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗體的接頭(l)包含硫醇反應(yīng)性試劑。在具體的實施方案中，該接頭(l)選自由馬來酰亞胺，碘乙酰胺，和吡啶基二硫化物組成的組。在具體的實施方案中，該接頭(l)為吡啶基二硫化物。在具體的實施方案中，該接頭(l)為吡啶基二硫化物且該藥物(d)為mmae。在某些實施方案中，本發(fā)明包含一種制備抗體-藥物綴合物的方法，其包含使半胱氨酸改造抗體(ab)的至少一個游離半胱氨酸與接頭-藥物(l-d)試劑反應(yīng)以形成具有式(即ab-(l-d)p)的抗體-藥物綴合物，其中ab為該半胱氨酸改造抗體，l為接頭，d為藥物模塊，且p為1，2，3，或4；且其中該半胱氨酸改造抗體包含一個或多個游離半胱氨酸氨基酸，其中至少一個游離半胱氨酸氨基酸選自表1或2任一中鑒定的半胱氨酸突變或者選自表3或4中鑒定的備選的穩(wěn)定的半胱氨酸突變。在某些實施方案中，本發(fā)明包含一種制備抗體-藥物綴合物的方法，其包含使半胱氨酸改造抗體(ab)的至少一個游離半胱氨酸與接頭-藥物(l-d)試劑反應(yīng)以形成具有式(即ab-(l-d)p)的抗體-藥物綴合物，其中ab為該半胱氨酸改造抗體，l為接頭，d為藥物模塊，且p為1，2，3，或4；且其中該半胱氨酸改造抗體包含一個或多個游離半胱氨酸氨基酸，其中至少一個游離半胱氨酸氨基酸優(yōu)選選自表1和2中鑒定的半胱氨酸突變或者選自表3或4中鑒定的備選的穩(wěn)定的半胱氨酸突變。在具體的實施方案中，該方法可用于生成半胱氨酸改造抗體，其中該半胱氨酸突變在重鏈中且選自表2或3中鑒定的半胱氨酸突變。在具體的實施方案中，該方法可用于生成半胱氨酸改造抗體，其中該半胱氨酸突變在輕鏈中且選自表1和4中鑒定的半胱氨酸突變。在一個優(yōu)選的實施方案中，該方法可用于生成半胱氨酸改造抗體，其中該半胱氨酸突變選自圖21中鑒定的半胱氨酸突變。在其它實施方案中，該方法可用于生成半胱氨酸改造抗體，其中該半胱氨酸突變選自表5中鑒定的半胱氨酸突變。在某些實施方案中，該方法可用于生成半胱氨酸改造抗體，其中該半胱氨酸突變選自由hc-i195c，hc-s420c，hc-y432c，和lc-g64c(依照kabat編號方式)組成的組。在某些實施方案中，該方法可用于生成半胱氨酸改造抗體，其中該半胱氨酸突變選自由hc-y432c和lc-g64c(依照kabat編號方式)組成的組。在某些實施方案中，該方法可用于生成半胱氨酸改造抗體，其中該半胱氨酸突變?yōu)橹劓溚蛔兦疫x自由y33c，g162c，v184c，i195c，s420c，y432c，和q434c(依照kabat編號方式)組成的組。在某些實施方案中，該方法可用于生成半胱氨酸改造抗體，其中該半胱氨酸突變?yōu)橹劓溚蛔兦疫x自由r19c，e46c，t57c，y59c，a60c，m100cc，w103c，g162c，i195c，v258c，s420c，h425c，和n430c(依照kabat編號方式)組成的組。在某些實施方案中，該方法可用于生成半胱氨酸改造抗體，其中該半胱氨酸突變?yōu)橹劓溚蛔兦疫x自由y33c，g162c，v184c，和i195c(依照kabat編號方式)組成的組。在某些實施方案中，該方法可用于生成半胱氨酸改造抗體，其中該半胱氨酸突變?yōu)橹劓溚蛔兦疫x自由r19c，e46c，y59c，a60c，m100cc，w103c，v258c，h425c，和n430c(依照kabat編號方式)組成的組。在某些實施方案中，該方法可用于生成半胱氨酸改造抗體，其中該半胱氨酸突變在輕鏈中且選自由y55c，g64c，t85c，和t180c(依照kabat編號方式)組成的組。在某些實施方案中，該方法可用于生成半胱氨酸改造抗體，其中該半胱氨酸突變在輕鏈中且選自由t31c，s52c，g64c，r66c，a193c(依照kabat編號方式)組成的組。在某些實施方案中，該方法可用于生成半胱氨酸改造抗體，其中該半胱氨酸突變在輕鏈中且選自由g64c，t85c，和t180c(依照kabat編號方式)組成的組。在某些實施方案中，該方法可用于生成半胱氨酸改造抗體，其中該半胱氨酸突變在輕鏈中且選自由s52c，g64c，r66c，和a193c(依照kabat編號方式)組成的組。在優(yōu)選的實施方案中，該方法可用于生成半胱氨酸改造抗體，其中輕鏈中的半胱氨酸突變選自包含依照kabat編號方式的lc-i106c，lc-r108c，lc-r142c，和lc-k149c的半胱氨酸突變的組(見圖1a和21)。在優(yōu)選的實施方案中，該方法可用于生成半胱氨酸改造抗體，其中輕鏈中的半胱氨酸突變?yōu)橐勒誯abat編號方式的lc-k149c(見圖1a和21和表1)。在優(yōu)選的實施方案中，該方法可用于生成半胱氨酸改造抗體，其中重鏈中的半胱氨酸突變選自包含依照eu編號方式的hc-t114c，hc-a140c，hc-l174c，hc-l179c，hc-t187c，hc-t209c，hc-v262c，hc-g371c，hc-y373c，hc-e382c，hc-s424c，hc-n434c，和hc-q438c的半胱氨酸突變的組(見圖1b和21和表2)。在優(yōu)選的實施方案中，該方法可用于生成半胱氨酸改造抗體，其中重鏈中的半胱氨酸突變?yōu)橐勒誩u編號方式的hc-a140c(即依照kabat編號方式的hc-a136c)(見圖1b和21和表2)。在優(yōu)選的實施方案中，該方法可用于生成半胱氨酸改造抗體，其中重鏈中的半胱氨酸突變?yōu)橐勒誩u編號方式的hc-l174c(見圖1b和21和表2)。在某些實施方案中，該方法可用于生成本文所述半胱氨酸改造抗體，其中該半胱氨酸改造抗體是通過包含下述步驟的工藝制備的：(i)通過將一個或多個氨基酸殘基用半胱氨酸替換來誘變親本抗體的核酸序列以編碼該半胱氨酸改造抗體；(ii)表達該半胱氨酸改造抗體；并(iii)分離該半胱氨酸改造抗體。在某些實施方案中，該方法可用于生成半胱氨酸改造抗體，其中該半胱氨酸改造抗體為包含清蛋白結(jié)合肽(abp)的融合蛋白。在具體的實施方案中，該abp包含選自下述的序列：a)cdkthtgggsqrlmediclprwgclweddf(seqidno:144)，b)qrlmediclprwgclweddf(seqidno:145)，c)qrliediclprwgclweddf(seqidno:146)，d)rliediclprwgclwedd(seqidno:147)，或e)diclprwgclw(seqidno:148)。在某些實施方案中，該方法可用于生成半胱氨酸改造抗體，其中該半胱氨酸改造抗體選自單克隆抗體，抗體片段，雙特異性抗體，嵌合抗體，人抗體，和人源化抗體。在具體的實施方案中，該抗體片段為fab片段。在某些實施方案中，該方法可用于生成半胱氨酸改造抗體，其中該半胱氨酸改造抗體為抗her2抗體。在某些實施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗體為抗muc16抗體。在某些實施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗體為抗steap1抗體。在某些實施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗體為抗cd79b抗體。在某些實施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗體為抗cd22抗體。在某些實施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗體為抗b7h4抗體。在某些實施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗體為抗ly6e抗體。在某些實施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗體為抗napi2b抗體。在某些實施方案中，該方法可用于生成半胱氨酸改造抗體，其中該半胱氨酸改造抗體結(jié)合受體(1)-(53)中的一項或多項：(1)bmpr1b(骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體-ib型)；(2)e16(lat1,slc7a5)；(3)steap1(前列腺的六次跨膜上皮抗原)；(4)0772p(ca125,muc16)；(5)mpf(mpf,msln,smr,巨核細胞強化因子,間皮素)；(6)napi3b(napi2b,napi-3b,nptiib,slc34a2,溶質(zhì)載體家族34(磷酸鈉),成員2,ii型鈉依賴性磷酸轉(zhuǎn)運蛋白3b)；(7)sema5b(flj10372,kiaa1445,mm.42015,sema5b,semag,腦信號蛋白5bhlog,sema結(jié)構(gòu)域,七次血小板反應(yīng)蛋白重復(fù)(1型和類1型),跨膜域(tm)和短胞質(zhì)域,(腦信號蛋白)5b)；(8)pscahlg(2700050c12rik,c530008o16rik,rikencdna2700050c12,rikencdna2700050c12基因)；(9)etbr(內(nèi)皮縮血管肽b型受體)；(10)msg783(rnf124,假定蛋白flj20315)；(11)steap2(hgnc_8639,ipca-1,pcanap1,stamp1,steap2,stmp,前列腺癌相關(guān)基因1,前列腺癌相關(guān)蛋白1,前列腺的六次跨膜上皮抗原2,六次跨膜前列腺蛋白)；(12)trpm4(br22450,flj20041,trpm4,trpm4b,瞬時型受體電位陽離子通道,亞家族m,成員4)；(13)cripto(cr,cr1,crgf,cripto,tdgf1,畸胎瘤衍生的生長因子)；(14)cd21(cr2(補體受體2)或c3dr(c3d/eb病毒受體)或hs.73792)；(15)cd79b(cd79b,cd79β,igb(免疫球蛋白相關(guān)β),b29)；(16)fcrh2(ifgp4,irta4,spap1a(含sh2域的磷酸酶錨定蛋白1a),spap1b,spap1c)；(17)her2；(18)nca；(19)mdp；(20)il20rα；(21)brevican；(22)ephb2r；(23)aslg659；(24)psca；(25)geda；(26)baff-r(b細胞活化因子受體,blys受體3,br3)；(27)cd22(b細胞受體cd22-b同種型)；(28)cd79a(cd79a,cd79α,免疫球蛋白相關(guān)α,b細胞特異性蛋白)；(29)cxcr5(伯基特氏淋巴瘤受體1,g蛋白偶聯(lián)受體)；(30)hla-dob(mhcii類分子的β亞基(ia抗原))；(31)p2x5(嘌呤能受體p2x配體門控性離子通道5)；(32)cd72(b細胞分化抗原cd72,lyb-2)；(33)ly64(淋巴細胞抗原64(rp105),富亮氨酸重復(fù)(lrr)家族的i型膜蛋白)；(34)fcrh1(fc受體樣蛋白1)；(35)irta2(免疫球蛋白超家族受體易位相關(guān)2)；(36)tenb2(推定的跨膜蛋白聚糖)；(37)pmel17(銀同系物；silv；d12s53e；pmel17；si；sil)；(38)tmeff1(具有egf樣和兩個卵泡抑素樣域的跨膜蛋白1；tomoregulin-1)；(39)gdnf-ra1(gdnf家族受體α1；gfra1；gdnfr；gdnfra；retl1；trnr1；ret1l；gdnfr-α1；gfr-α-1)；(40)ly6e(淋巴細胞抗原6復(fù)合物,基因座e；ly67,rig-e,sca-2,tsa-1)；(41)tmem46(shisa同系物2)；(42)ly6g6d(淋巴細胞抗原6復(fù)合物,基因座g6d；ly6-d,megt1)；(43)lgr5(含富亮氨酸重復(fù)的g蛋白偶聯(lián)受體5；gpr49,gpr67)；(44)ret(ret原癌基因；men2a；hscr1；men2b；mtc1；ptc；cdhf12；hs.168114；ret51；ret-ele1)；(45)ly6k(淋巴細胞抗原6復(fù)合物,基因座k；ly6k；hsj001348；flj35226)；(46)gpr19(g蛋白偶聯(lián)受體19；mm.4787)；(47)gpr54(kiss1受體；kiss1r；gpr54；hot7t175；axor12)；(48)asphd1(含天冬氨酸β-羥化酶域的1；loc253982)；(49)酪氨酸酶(tyr；ocaia；oca1a；酪氨酸酶；shep3)；(50)tmem118(環(huán)指蛋白,跨膜2；rnft2；flj14627)；(51)gpr172a(g蛋白偶聯(lián)受體172a；gpcr41；flj11856；d15ertd747e)；(52)cd33；和(53)cll-1(clec12a,micl,和dcal2)。在某些實施方案中，該方法可用于生成半胱氨酸改造抗體，其中該半胱氨酸改造抗體是共價附著至捕捉標記物，檢測標記物，藥物模塊，或固體支持物的。在具體的實施方案中，該抗體是共價附著至生物素捕捉標記物的。在某些實施方案中，該抗體是共價附著至熒光染料檢測標記物的。在某些實施方案中，該熒光染料選自熒光素型，若丹明型，丹酰，麗絲胺，花菁，藻紅蛋白，德克薩斯紅，及其類似物。在某些實施方案中，該抗體是共價附著至選自3h，11c，14c，18f，32p，35s，64cu，68ga，86y，89zr，99tc，111in，123i，124i，125i，131i，133xe，177lu，211at，和213bi的放射性核素檢測標記物的。在具體的實施方案中，該抗體是通過螯合配體共價附著至檢測標記物的。在具體的實施方案中，該螯合配體選自dota，dotp，dotma，dtpa和teta。在某些實施方案中，該方法可用于生成半胱氨酸改造抗體，其中該半胱氨酸改造抗體共價附著至選自美登木素生物堿，奧瑞司他汀，多拉司他汀，單端孢菌素，cc1065，加利車霉素，烯二炔類抗生素，紫杉烷，和蒽環(huán)類抗生素的藥物模塊以形成具有式i(即ab-(l-d)p)的抗體-藥物綴合物，其中ab為該抗體，l為接頭，d為該藥物模塊，且p為1，2，3，或4。在具體的實施方案中，該方法可用于生成半胱氨酸改造抗體，其中該半胱氨酸改造抗體具有結(jié)構(gòu)：在具體的實施方案中，該方法可用于生成半胱氨酸改造抗體，其中該半胱氨酸改造抗體的藥物(d)為美登木素生物堿，其具有結(jié)構(gòu)：其中波狀線表示d的硫原子與接頭的共價附著；r獨立選自h，甲基，乙基，1-丙基，2-丙基，1-丁基，2-甲基-1-丙基，2-丁基，2-甲基-2-丙基，1-戊基，2-戊基，3-戊基，2-甲基-2-丁基，3-甲基-2-丁基，3-甲基-1-丁基，2-甲基-1-丁基，1-己基，2-己基，3-己基，2-甲基-2-戊基，3-甲基-2-戊基，4-甲基-2-戊基，3-甲基-3-戊基，2-甲基-3-戊基，2,3-二甲基-2-丁基，和3,3-二甲基-2-丁基；且m為1，2，或3。在具體的實施方案中，該方法可用于生成半胱氨酸改造抗體，其中該藥物(d)選自結(jié)構(gòu)：在具體的實施方案中，該方法可用于生成具有下述結(jié)構(gòu)的半胱氨酸改造抗體：其中n為0，1，或2或在具體的實施方案中，該方法可用于生成半胱氨酸改造抗體，其中d為單甲基奧瑞司他汀藥物模塊mmae或mmaf，其具有結(jié)構(gòu)：在具體的實施方案中，該方法可用于生成具有選自下述結(jié)構(gòu)的半胱氨酸改造抗體：其中val為纈氨酸；cit為瓜氨酸；且p為1，2，3，或4。在具體的實施方案中，該方法可用于生成綴合至落入本說明書后續(xù)部分進一步詳細描述的下述類別之一的藥物的半胱氨酸改造抗體：奧瑞司他汀，多拉司他汀，單端孢菌素，cc1065，加利車霉素，烯二炔類抗生素，紫杉烷，吡咯并苯并二氮雜卓(pbd)，1-(氯甲基)-2,3-二氫-1h-苯并[e]吲哚(cbi)二聚體，cbi-pbd異二聚體，和蒽環(huán)類抗生素。在具體的實施方案中，該方法可用于生成半胱氨酸改造抗體，其中該接頭(l)包含硫醇反應(yīng)性試劑。在具體的實施方案中，該接頭(l)選自由馬來酰亞胺，碘乙酰胺，和吡啶基二硫化物組成的組。在具體的實施方案中，該接頭(l)為吡啶基二硫化物。在具體的實施方案中，該接頭(l)為吡啶基二硫化物且該藥物(d)為mmae。在某些實施方案中，該方法可用于生成半胱氨酸改造抗體，其中該半胱氨酸改造抗體為分離的半胱氨酸改造抗體。在某些實施方案中，該方法可用于生成分離的半胱氨酸改造抗體，其中分離的輕鏈中的半胱氨酸突變選自包含依照kabat編號方式的lc-i106c，lc-r108c，lc-r142c，和lc-k149c的半胱氨酸突變的組(見圖1a和圖21)。在某些實施方案中，該方法可用于生成分離半胱氨酸改造抗體，其中分離的輕鏈中的半胱氨酸突變?yōu)橐勒誯abat編號方式的lc-k149c(見圖1a和21和表1)。在某些實施方案中，該方法可用于生成分離的半胱氨酸改造抗體，其中分離的重鏈中的半胱氨酸突變選自包含依照eu編號方式的hc-t114c，hc-a140c，hc-l174c，hc-l179c，hc-t187c，hc-t209c，hc-v262c，hc-g371c，hc-y373c，hc-e382c，hc-s424c，hc-n434c，和hc-q438c的半胱氨酸突變的組(見圖1b和21和表2)。在某些實施方案中，該方法可用于生成分離的半胱氨酸改造抗體，其中分離的重鏈中的半胱氨酸突變?yōu)橐勒誩u編號方式的hc-a140c(即依照kabat編號方式的hc-a136c)(見圖1b和21和表2)。在一個優(yōu)選的實施方案中，本文所述任何半胱氨酸改造抗體具有下述半胱氨酸突變之一：依照kabat編號方式的lc-k149c和依照eu編號方式的hc-a140c(見表1和2和圖1a和1b)。在本發(fā)明的某些實施方案中，本文所述任何半胱氨酸改造抗體具有0.8-1.0的硫醇反應(yīng)性值。在本發(fā)明的某些實施方案中，本文所述任何半胱氨酸改造抗體具有0.9-1.0的硫醇反應(yīng)性值。在本發(fā)明的某些實施方案中，本文所述任何半胱氨酸改造抗體具有0.6-0.9的硫醇反應(yīng)性值。在本發(fā)明的某些實施方案中，本文所述任何半胱氨酸改造抗體具有0.5-0.7的硫醇反應(yīng)性值。在本發(fā)明的某些實施方案中，本文所述任何半胱氨酸改造抗體具有0.4-0.6的硫醇反應(yīng)性值。在本發(fā)明的某些實施方案中，本文所述任何半胱氨酸改造抗體具有0.3-0.5的硫醇反應(yīng)性值。在本發(fā)明的某些實施方案中，本文所述任何半胱氨酸改造抗體具有0.2-0.4的硫醇反應(yīng)性值。在某些實施方案中，本發(fā)明為一種藥物組合物，其包含本文所述任何半胱氨酸改造抗體。附圖簡述圖1a顯示4d5輕鏈的kabat編號方案。圖1b顯示4d5抗體的順序編號方案(左列)，以n端開始，與kabat編號方案(中列)和eu編號方式(右列)比較。圖2顯示抗體中用于半胱氨酸誘變和藥物綴合的例示性位點。粗體和下劃線殘基是用于半胱氨酸誘變的例示性位點。下劃線殘基是用于半胱氨酸誘變的另外的例示性位點。圖2a顯示重鏈中用于半胱氨酸誘變的例示性和另外的例示性殘基。圖2b顯示輕鏈中用于半胱氨酸誘變的例示性和另外的例示性殘基。用于半胱氨酸誘變的優(yōu)選位點以灰色陰影標示且包括依照eu編號方式的hc-t114c，hc-a140c，hc-l174c，hc-l179c，hc-t187c，hc-t209c，hc-v262c，hc-g371c，hc-y373c，hc-e382c，hc-s424c，hc-n434c，和hc-q438c(圖2a)和依照kabat編號方式的lc-i106c，lc-r108c，lc-r142c，和lc-k149c(圖2b)。優(yōu)選的依照eu編號方式的hc-a140c(依照kabat編號方式的hc-a136c)和依照kabat編號方式的lc-k149c以框標示且以大號字體突顯。圖3顯示用于聚集分析和計算的聚集體和單體峰的代表性圖。8和10分鐘之間的大峰為單體峰而8分鐘處的小峰為聚集體峰。圖4顯示thiomabtm抗體的uv280lc/ms層析圖。圖4a顯示通過uv280lc/ms檢測的綴合峰。圖4b顯示dar0(裸抗體)，dar1，和dar2綴合峰。圖5顯示用于實施全抗體半胱氨酸篩選的方案。對pds-mmae和mc-vc-mmae綴合物實施全抗體篩選。相應(yīng)地，生成并測試648pds-mmae和648mc-vc-mmae(總共1296)thiomabtm抗體。圖6顯示mc-vc-mmae和pds-mmae綴合物的代表性穩(wěn)定性圖。圖6a顯示0小時，48小時，和96小時時使用lc/ms分析獲得的pds-mmaelc-r142cthiomabtm抗體的代表性穩(wěn)定性圖。圖6b顯示0小時，48小時，和96小時時使用lc/ms分析獲得的mc-vc-mmaelc-r142cthiomabtm抗體的代表性穩(wěn)定性圖。圖7顯示通過百分比藥物載荷評估的不同pds-mmaethiomabtm抗體的穩(wěn)定性的圖。圖8顯示通過百分比藥物載荷評估的不同mc-vc-mmaethiomabtm抗體的穩(wěn)定性的圖。圖9顯示lc-k149c，lc-v205c，和hc-a114cthiomabtm抗her2和抗cd33抗體隨時間的平均dar的圖。圖10顯示例示性thiomabtm抗體結(jié)構(gòu)。圖10a顯示thio-her2-hu7c2-hc-a118c-二硫化物-pbd和thio-her2-hu7c2-lc-k149c-二硫化物-pbdthiomabtm抗體的結(jié)構(gòu)。圖10b顯示thio-her2-hu7c2-lc-k149c-cbi二聚體的結(jié)構(gòu)。圖10c顯示thio-her2-hu7c2-lc-k149c-二硫化物-cbi-pbd的結(jié)構(gòu)。圖10d顯示thio-her2-hu7c2-lc-k149c-二硫化物-pnu的結(jié)構(gòu)。圖10e顯示thio-her2-hu7c2-hc-a118c-馬來酰亞胺-pnu和thio-her2-hu7c2-lc-k149c-馬來酰亞胺-pnu的結(jié)構(gòu)。圖11顯示mc-vc-mmaethiomabtm抗體的繪圖(不按比例)。圖12顯示pds-mmaethiomabtm抗體的繪圖(不按比例)。圖13顯示某些藥物綴合至lc-k149c半胱氨酸改造抗體的酶促修飾的圖解。該修飾如下：cryptophycin發(fā)生酰胺切割，tubulysin發(fā)生乙?；鶕p失(即脫乙酰基化)，cbi-pbd異二聚體接頭-藥物中間體發(fā)生氨基甲酸根損失，而類紫杉烷是不穩(wěn)定的且顯示多重酶促切割。圖14a顯示與lc-k149c相比，hc-a140c對tubulysin的乙?；鶊F提供保護。具體而言，使用lcms顯示了溫育24小時后使用hc-a140c作為附著位點時的藥物降解比lc-k149c更少。圖14b和14c使用一種新穎的全血測定法顯示溫育24小時后hc-a140c比lc-k149c更加穩(wěn)定。圖15使用多輪wb測定法顯示hc-a140c處的乙?；鶕p失與lc-k149c相比劇烈降低。確認了hc-a140c挽救乙酰基損失修飾。圖16a顯示hc-a140c對cbi-pbd異二聚體接頭-藥物中間體的氨基甲酸酯基團提供保護。具體而言，使用lcms顯示了溫育24小時后使用hc-a140c作為附著位點時的藥物降解比lc-k149c更少(圖16a)。圖16b和16c使用一種新穎的全血測定法顯示溫育24小時后hc-a140c比lc-k149c更加穩(wěn)定。圖17使用本文所述新穎的全血測定法顯示hc-a140c比lc-k149c更加穩(wěn)定。圖18a顯示hc-a140c提供保護免于類紫杉烷的修飾。具體而言，使用lcms顯示了溫育24小時后使用hc-a140c作為附著位點時的藥物降解比lc-k149c更少。圖18b和18c使用一種新穎的全血測定法顯示溫育24小時后hc-a140c比lc-k149c更加穩(wěn)定。圖19使用新穎的全血測定法顯示hc-a140c比lc-k149c更加穩(wěn)定(例如就保護類紫杉烷藥物損失而言)。圖20顯示與lc-k149c相比，hc-a140c保護cryptophycin免于酰胺和酯切割。圖21顯示對于pds和-vc接頭優(yōu)選的hc和lc半胱氨酸突變，定位于抗體的圖解。典型實施方案的詳細描述詳細內(nèi)容參照本發(fā)明的某些實施方案，其實施例在附帶的結(jié)構(gòu)和通式中例示。盡管結(jié)合列舉的實施方案描述了本發(fā)明，但是應(yīng)理解它們并非指定用于將本發(fā)明限定到那些實施方案。相反，本發(fā)明覆蓋所有的備選，變型和等同技術(shù)方案，它們均包括在如權(quán)利要求定義的本發(fā)明范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道可以用于實施本發(fā)明的與本文所述的那些相似或等同的許多方法和物質(zhì)。本發(fā)明決不限于所述的方法和物質(zhì)。除非另做陳述，否則，本文所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義并且與如下文獻中所述一致：singleton等(1994)dictionaryofmicrobiologyandmolecularbiology,2nded.,j.wiley&sons,newyork,ny；和janeway,c.,travers,p.,walport,m.,shlomchik(2001)immonobiology,5thed.,garlandpublishing,newyork。定義除非另做陳述，否則，本文所用的下列術(shù)語和措詞具有如下含義：當(dāng)本文中使用商品名時，申請人意欲獨立地包括商品名產(chǎn)品制劑，仿制藥和商品名產(chǎn)品的活性藥物組分。本文的術(shù)語“抗體”以其最廣泛的含義使用并且特別覆蓋單克隆抗體，多克隆抗體，二聚體，多聚體，多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們表現(xiàn)出所需的生物學(xué)活性(miller等(2003)jour.ofimmunology170:4854-4861)?？贵w可以為鼠，人，人源化，嵌合的抗體或來源于其它物種?？贵w為由能夠識別和結(jié)合特異性抗原的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)(janeway,c.,travers,p.,walport,m.,shlomchik(2001)immunobiology,5thed.,garlandpublishing,newyork).靶抗原一般具有由多種抗體的cdrs識別的大量結(jié)合位點，也稱作表位。特異性結(jié)合不同表位的各抗體具有不同的結(jié)構(gòu)。因此，一種抗原可以具有一種以上相應(yīng)的抗體?？贵w包括全-長免疫球蛋白分子或全-長免疫球蛋白分子的免疫活性模塊，即含有免疫特異性結(jié)合所關(guān)注靶標的抗原或其部分的抗原結(jié)合位點的分子，這類靶標包括，但不限于癌細胞或產(chǎn)生與自身免疫性疾病相關(guān)的自身免疫抗體的細胞。本文披露的免疫球蛋白可以具有免疫球蛋白分子的任意類型(例如igg，ige，igm，igd和iga)，類別(例如igg1，igg2，igg3，igg4，iga1和iga2)或亞類。免疫球蛋白可以來源于任意的物種。然而，在一個方面中，免疫球蛋白來源于人，鼠或兔?！翱贵w片段”包含全長抗體的一部分，一般為其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的實例包括：fab，fab′，f(ab′)2和fv片段；雙抗體；線性抗體；微抗體(minibody)(olafsen等(2004)proteineng.design&sel.17(4):315-323)；fab表達文庫制備的片段；抗獨特型(抗-id)抗體；cdr(互補決定區(qū))；和以免疫特異性方式結(jié)合癌細胞抗原，病毒抗原或微生物抗原的上述任意的表位-結(jié)合片段；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體。在某些實施方案中，本文中提供的抗體是多特異性抗體，例如雙特異性抗體。如本文中使用的，術(shù)語“多特異性抗體”指包含具有多表位特異性(即能夠結(jié)合一種分子上的兩種或更多種不同表位或能夠結(jié)合兩種或更多種不同分子上的表位)的抗原結(jié)合域的抗體。在一些實施方案中，多特異性抗體是對至少兩個不同抗原結(jié)合位點具有結(jié)合特異性的單克隆抗體(諸如雙特異性抗體)。在一些實施方案中，多特異性抗體的第一抗原結(jié)合域和第二抗原結(jié)合域可結(jié)合一種和相同分子內(nèi)的兩種表位(分子內(nèi)結(jié)合)。例如，多特異性抗體的第一抗原結(jié)合域和第二抗原結(jié)合域可結(jié)合相同分子上的兩種不同表位。在某些實施方案中，多特異性抗體結(jié)合的兩種不同表位是正常情況下不受一個單特異性抗體，諸如例如常規(guī)抗體或一個免疫球蛋白單一可變域同一時間結(jié)合的表位。在一些實施方案中，多特異性抗體的第一抗原結(jié)合域和第二抗原結(jié)合域可結(jié)合位于兩種截然不同分子內(nèi)的表位(分子間結(jié)合)。例如，多特異性抗體的第一抗原結(jié)合域可結(jié)合一種分子上的一種表位，而多特異性抗體的第二抗原結(jié)合域可結(jié)合一種不同分子上的另一種表位，由此交聯(lián)該兩種分子。在一些實施方案中，多特異性抗體(諸如雙特異性抗體)的抗原結(jié)合域包含兩個vh/vl單元，其中第一vh/vl單元結(jié)合第一表位而第二vh/vl單元結(jié)合第二表位，其中每個vh/vl單元包含重鏈可變域(vh)和輕鏈可變域(vl)。此類多特異性抗體包括但不限于全長抗體，具有兩個或更多個vl和vh域的抗體，和抗體片段(諸如fab，fv，dsfv，scfv，雙抗體，雙特異性雙抗體和三抗體，已經(jīng)共價或非共價連接的抗體片段)。進一步包含至少部分重鏈可變區(qū)和/或至少部分輕鏈可變區(qū)的vh/vl單元也可稱作“臂”或“半體”或“半抗體”。在一些實施方案中，半體包含的部分重鏈可變區(qū)的足以容許與第二半體形成分子內(nèi)二硫鍵。在一些實施方案中，半體包含節(jié)突變或穴突變，例如為了容許與包含互補穴突變或節(jié)突變的第二半體或半抗體異二聚化。下文進一步討論節(jié)突變和穴突變。在某些實施方案中，本文中提供的多特異性抗體可以是雙特異性抗體。如本文中使用的，術(shù)語“雙特異性抗體”指包含能夠結(jié)合一種分子上的兩種不同表位或能夠結(jié)合兩種不同分子上的表位的抗原結(jié)合域的多特異性抗體。雙特異性抗體在本文中也可稱作具有“雙重特異性”或是“雙重特異性的”。例示性的雙特異性抗體可結(jié)合該分子和任何其它抗原二者。在某些實施方案中，結(jié)合特異性之一針對該分子且另一針對cd3。參見例如美國專利no.5,821,337。在某些實施方案中，雙特異性抗體可結(jié)合相同分子的兩種不同表位。在某些實施方案中，雙特異性抗體可結(jié)合兩種不同分子上的兩種不同表位。也可以使用雙特異性抗體來將細胞毒劑定位于表達感興趣分子的細胞。雙特異性抗體可以以全長抗體或抗體片段制備。用于生成多特異性抗體的技術(shù)包括但不限于具有不同特異性的兩對免疫球蛋白重鏈-輕鏈的重組共表達(見milstein和cuello，nature305：537(1983)，wo93/08829，和traunecker等，emboj.10：3655(1991))，和“節(jié)-入-穴”工程化(見例如美國專利no.5,731,168，wo2009/089004，us2009/0182127，us2011/0287009，marvin和zhu，actapharmacol.sin.(2005)26(6)：649-658，和kontermann(2005)actapharmacol.sin.，26：1-9)。如本文中使用的，術(shù)語“節(jié)-入-穴”或“knh”技術(shù)指通過在兩條多肽相互作用的界面處將隆起(節(jié))引入一條多肽并將空腔(穴)引入另一條多肽中，在體外或在體內(nèi)將兩條多肽配對在一起的技術(shù)。例如，已經(jīng)在抗體的fc:fc結(jié)合界面，cl:ch1界面或vh/vl界面中引入knh(見例如us2011/0287009，us2007/0178552，wo96/027011，wo98/050431，zhu等(1997)proteinscience6：781-788，和wo2012/106587)。在一些實施方案中，knh在制造多特異性抗體期間驅(qū)動兩條不同重鏈配對在一起。例如，在它們的fc區(qū)中具有knh的多特異性抗體可進一步包含連接至每個fc區(qū)的單一可變域，或進一步包含與相似或不同輕鏈可變域配對的不同重鏈可變域。knh技術(shù)還可用于將兩個不同受體胞外域或包含不同靶物識別序列的任何其它多肽序列(例如包括親和抗體(affibody)，肽體(peptibody)和其它fc融合物)配對在一起。如本文中使用的，術(shù)語“節(jié)突變”指在多肽與另一多肽相互作用的界面處向該多肽中引入隆起(節(jié))的突變。在一些實施方案中，另一多肽具有穴突變。如本文中使用的，術(shù)語“穴突變”指在多肽與另一多肽相互作用的界面處向該多肽中引入空腔(穴)的突變。在一些實施方案中，另一多肽具有節(jié)突變。下文提供簡要的非限制性討論?！奥∑稹敝钢辽僖粋€氨基酸側(cè)鏈自第一多肽的界面凸出并因此可放置在鄰近界面(即第二多肽的界面)的補償空腔中，從而穩(wěn)定異多聚體，并由此例如有利于異多聚體形成，超過同多聚體形成。隆起可存在于初始界面中或可通過合成而引入(例如通過改變編碼界面的核酸)。在一些實施方案中，改變編碼第一多肽的界面的核酸以編碼隆起。為了實現(xiàn)這一點，將編碼第一多肽的界面中的至少一個“初始”氨基酸殘基的核酸用編碼至少一個側(cè)鏈體積比初始氨基酸殘基要大的“輸入”氨基酸殘基的核酸替換。會領(lǐng)會可以有超過一個初始和對應(yīng)輸入殘基。各種氨基酸殘基的側(cè)鏈體積顯示于例如us2011/0287009的表1。引入“隆起”的突變可稱作“節(jié)突變”。在一些實施方案中，用于形成隆起的輸入殘基是選自精氨酸(r)，苯丙氨酸(f)，酪氨酸(y)和色氨酸(w)的天然發(fā)生氨基酸殘基。在一些實施方案中，輸入殘基是色氨酸或酪氨酸。在一些實施方案中，用于形成隆起的初始殘基具有較小側(cè)鏈體積，諸如丙氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸或纈氨酸。“空腔”指至少一個氨基酸側(cè)鏈自第二多肽的界面凹進并因此容納第一多肽的鄰近界面上的對應(yīng)隆起。空腔可存在于初始界面中或可通過合成而引入(例如通過改變編碼界面的核酸)。在一些實施方案中，改變編碼第二多肽的界面的核酸以編碼空腔。為了實現(xiàn)這一點，將編碼第二多肽的界面中的至少一個“初始”氨基酸殘基的核酸用編碼至少一個側(cè)鏈體積比初始氨基酸殘基要小的“輸入”氨基酸殘基的dna替換。會領(lǐng)會可以有超過一個初始和對應(yīng)輸入殘基。在一些實施方案中，用于形成空腔的輸入殘基是選自丙氨酸(a)，絲氨酸(s)，蘇氨酸(t)和纈氨酸(v)的天然發(fā)生氨基酸殘基。在一些實施方案中，輸入殘基是絲氨酸，丙氨酸或蘇氨酸。在一些實施方案中，用于形成空腔的初始殘基具有較大的側(cè)鏈體積，諸如酪氨酸，精氨酸，苯丙氨酸或色氨酸。引入“空腔”的突變可稱作“穴突變”。隆起“可放置”在空腔中，這意味著隆起和空腔分別在第一多肽和第二多肽的界面上的空間位置及隆起和空腔的大小使得隆起能定位在空腔中，而對第一和第二多肽在界面處的正常聯(lián)合沒有顯著擾亂。因為隆起諸如tyr，phe和trp通常不與界面的軸垂直延伸且具有優(yōu)選構(gòu)象，所以隆起與對應(yīng)空腔的排列在一些情況中可能依賴于隆起/空腔對基于三維結(jié)構(gòu)(諸如通過x射線晶體學(xué)或核磁共振(nmr)獲得的)的建模。這可以使用本領(lǐng)域廣泛接受的技術(shù)來實現(xiàn)。在一些實施方案中，igg1恒定區(qū)中的節(jié)突變?yōu)閠366w(eu編號方式)。在一些實施方案中，igg1恒定區(qū)中的穴突變包含一處或多處選自t366s，l368a和y407v(eu編號方式)的突變。在一些實施方案中，igg1恒定區(qū)中的穴突變包含t366s，l368a和y407v(eu編號方式)。在一些實施方案中，igg4恒定區(qū)中的節(jié)突變?yōu)閠366w(eu編號方式)。在一些實施方案中，igg4恒定區(qū)中的穴突變包含一處或多處選自t366s，l368a，和y407v(eu編號方式)的突變。在一些實施方案中，igg4恒定區(qū)中的穴突變包含t366s，l368a，和y407v(eu編號方式)。也可以通過用于生成抗體fc-異二聚體分子的工程化靜電操縱效應(yīng)(wo2009/089004a1)；交聯(lián)兩個或更多個抗體或片段(見例如美國專利no.4,676,980，及brennan等，science，229：81(1985))；使用亮氨酸拉鏈來生成雙特異性抗體(見例如kostelny等，j.immunol.，148(5):1547-1553(1992))；使用用于生成雙特異性抗體片段的“雙抗體”技術(shù)(見例如hollinger等，proc.natl.acad.sci.usa，90:6444-6448(1993))；及使用單鏈fv(sfv)二聚體(見例如gruber等，j.immunol.，152:5368(1994))；及如例如tutt等，j.immunol.147：60(1991)中所描述的，制備三特異性抗體來生成多特異性抗體。本文中還包括具有三個或更多個功能性抗原結(jié)合位點的工程化改造抗體，包括“章魚抗體”或“雙重可變域免疫球蛋白”(dvd)(見例如us2006/0025576a1，和wu等，naturebiotechnology(2007))。本文中的抗體或片段還包括包含結(jié)合該分子及另一種不同抗原的抗原結(jié)合位點的“雙重作用fab”或“daf”(見例如us2008/0069820)。本文的術(shù)語“單克隆抗體”指從基本上同質(zhì)的抗體群中獲得的抗體，即除可能少量存在的天然發(fā)生的可能突變之外，包含在該群體中的各抗體是相同的。單克隆抗體是高度特異的靶向單個抗原位點的抗體。而且，與包括靶向不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制品相反，每種單克隆抗體只靶向抗原上的單一決定簇。除其特異性外，單克隆抗體的優(yōu)點還在于它們可以以不被其它抗體污染的方式合成。修飾語“單克隆”表示獲自基本上同質(zhì)的抗體群的抗體特性，并非解釋為需要由任何特定方法生產(chǎn)抗體。例如，可以通過首先由kohler等(1975)nature256:495描述的雜交瘤方法制備用于本發(fā)明的單克隆抗體或可以通過重組dna方法制備(例如，參見:us4816567；us5807715)。例如，還可以使用clackson等(1991)nature,352:624-628；marks等(1991)j.mol.biol.,222:581-597所述的技術(shù)從噬菌體抗體文庫分離單克隆抗體。本文的單克隆抗體特別包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類型或亞型的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而所述鏈的剩余部分與來源于另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類型或亞型的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，本文還包括嵌合抗體的片段，只要它們展示期望的生物學(xué)活性(us4816567；和morrison等(1984)proc.natl.acad.sci.usa,81:6851-6855)。本文關(guān)注的嵌合抗體包括“靈長化(primatized)”抗體，其包含來源于非人的靈長類(例如舊世界猴，猿等)的可變域抗原結(jié)合序列和人恒定區(qū)序列。本文的“完整抗體”為包含vl和vh結(jié)構(gòu)域以及輕鏈恒定域(cl)和重鏈恒定域ch1，ch2和ch3的抗體。恒定域可以為天然序列恒定域(例如人天然序列恒定域)或其氨基酸序列變體。完整抗體可以具有一種或多種“效應(yīng)子功能”，意旨歸因于抗體的fc恒定區(qū)(天然序列fc區(qū)或氨基酸序列變體fc區(qū))的那些生物學(xué)活性?？贵w效應(yīng)子功能的實例包括c1q結(jié)合；補體依賴的細胞毒性；fc受體結(jié)合；抗體-依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒作用(adcc)；胞吞作用；和細胞表面受體，諸如b細胞受體和bcr的減量調(diào)節(jié)。在某些實施方案中，可以將一處或多處氨基酸修飾引入本文中提供的抗體的fc區(qū)中，由此生成fc區(qū)變體。fc區(qū)變體可以包含在一個或多個氨基酸位置包含氨基酸修飾(例如替代)的人fc區(qū)序列(例如，人igg1，igg2，igg3或igg4fc區(qū))。在某些實施方案中，本發(fā)明涵蓋擁有一些但不是所有效應(yīng)器功能的抗體變體，這使其成為如下應(yīng)用的期望候選物，其中抗體的體內(nèi)半衰期是重要的，而某些效應(yīng)器功能(諸如補體和adcc)是不必要的或有害的。可以進行體外和/或體內(nèi)細胞毒性測定法以確認cdc和/或adcc活性的降低/消減。例如，可以進行fc受體(fcr)結(jié)合測定法以確?？贵w缺乏fcγr結(jié)合(因此有可能缺乏adcc活性)，但是保留fcrn結(jié)合能力。介導(dǎo)adcc的主要細胞nk細胞僅表達fcγriii，而單核細胞表達fcγri，fcγrii和fcγriii。在ravetch和kinet，annu.rev.immunol.9:457-492(1991)的第464頁上的表3中匯總了造血細胞上的fcr表達。評估感興趣分子的adcc活性的體外測定法的非限制性例子記載于美國專利no.5,500,362(見例如hellstrom，i.等，proc.nat’lacad.sci.usa83:7059-7063(1986))和hellstrom，i等，proc.nat’lacad.sci.usa82:1499-1502(1985)；5,821,337(見bruggemann，m.等，j.exp.med.166:1351-1361(1987))?；蛘撸梢圆捎梅欠派湫詼y定方法(見例如用于流式細胞術(shù)的actitm非放射性細胞毒性測定法(celltechnology，inc.mountainview，ca；和cytotox非放射性細胞毒性測定法(promega，madison，wi))。對于此類測定法有用的效應(yīng)細胞包括外周血單個核細胞(pbmc)和天然殺傷(nk)細胞?；蛘?另外，可以在體內(nèi)評估感興趣分子的adcc活性，例如在動物模型中，諸如披露于clynes等，proc.nat’lacad.sci.usa95:652-656(1998)的。也可以實施c1q結(jié)合測定法以確認抗體不能結(jié)合c1q，并且因此缺乏cdc活性。見例如wo2006/029879和wo2005/100402中的c1q和c3c結(jié)合elisa。為了評估補體激活，可以實施cdc測定法(見例如gazzano-santoro等，j.immunol.methods202:163(1996)；cragg，m.s.等，blood101:1045-1052(2003)；及cragg，m.s.和m.j.glennie，blood103:2738-2743(2004))。也可以使用本領(lǐng)域中已知的方法來實施fcrn結(jié)合和體內(nèi)清除/半衰期測定(見例如petkova，s.b.等，int’l.immunol.18(12):1759-1769(2006))。在一些實施方案中，可以在本文中提供的抗體的fc部分中引入一處或多處氨基酸修飾以提高對新生兒fc受體的igg結(jié)合。在某些實施方案中，抗體包含下述三處依照eu編號方式的突變：m252y，s254t，和t256e(“yte突變”)(美國專利no.8,697,650；還見dall’acqua等，journalofbiologicalchemistry281(33):23514-23524(2006)。在某些實施方案中，yte突變不影響抗體結(jié)合其關(guān)聯(lián)抗原的能力。在某些實施方案中，yte突變與天然(即非yte突變)抗體相比延長抗體的血清半衰期。在一些實施方案中，yte突變與天然(即非yte突變)抗體相比將抗體的血清半衰期延長3倍。在一些實施方案中，yte突變將抗體的血清半衰期與天然(即非yte突變)抗體相比延長2倍。在一些實施方案中，yte突變將抗體的血清半衰期與天然(即非yte突變)抗體相比延長4倍。在一些實施方案中，yte突變將抗體的血清半衰期與天然(即非yte突變)抗體相比延長至少5倍。在一些實施方案中，yte突變將抗體的血清半衰期與天然(即非yte突變)抗體相比延長至少10倍。見例如美國專利no.8,697,650；還見dall’acqua等，journalofbiologicalchemistry281(33):23514-23524(2006)。在某些實施方案中，yte突變體提供調(diào)控抗體的抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性(adcc)活性的一種手段。在某些實施方案中，yteo突變體提供調(diào)控針對人抗原的人源化igg抗體的adcc活性的一種手段。見例如美國專利no.8,697,650；還見dall’acqua等，journalofbiologicalchemistry281(33):23514-23524(2006)。在某些實施方案中，yte突變體容許同時調(diào)控血清半衰期，組織分布，和抗體活性(例如igg抗體的adcc活性)。見例如美國專利no.8,697,650；還見dall’acqua等，journalofbiologicalchemistry281(33):23514-23524(2006)。具有降低的效應(yīng)器功能的抗體包括那些具有依照eu編號方式的fc區(qū)殘基238，265，269，270，297，327和329中的一個或多個的替代的(美國專利no.6,737,056)。此類fc突變體包括在依照eu編號方式的氨基酸位置265，269，270，297和327中的兩處或更多處具有替代的fc突變體，包括依照eu編號方式的殘基265和297替代成丙氨酸(即依照eu編號方式的d265a和n297a)的所謂的“dana”fc突變體(美國專利no.7,332,581)。在某些實施方案中，fc突變體包含下述兩處氨基酸替代：d265a和n297a。在某些實施方案中，fc突變體由下述兩處氨基酸替代組成：d265a和n297a。在某些實施方案中，野生型人fc區(qū)的位置329(eu編號方式)處的脯氨酸(p329)是用甘氨酸或精氨酸或大得足以破壞fc/fcγ受體界面內(nèi)fc的p329和fcgriii的色氨酸殘基w87和w110之間形成的脯氨酸三明治的氨基酸殘基(sondermann等：nature406，267-273(20july2000))替代的。在又一個實施方案中，fc變體中的至少一處進一步的氨基酸替代為s228p，e233p，l234a，l235a，l235e，n297a，n297d，或p331s，而且在仍有另一個實施方案中，所述至少一處進一步的氨基酸替代為人igg1fc區(qū)的l234a和l235a或人igg4fc區(qū)的s228p和l235e，均依照eu編號方式(美國專利no.8,969,526，通過援引將其完整收錄)。在某些實施方案中，多肽包含野生型人iggfc區(qū)的fc變體，其中該多肽所具有的人iggfc區(qū)的p329是用甘氨酸替代的，且其中該fc變體包含至少兩處進一步的氨基酸替代，人igg1fc區(qū)的l234a和l235a或人igg4fc區(qū)的s228p和l235e，且其中殘基是依照該eu編號方式編號的(美國專利no.8,969,526，通過援引將其完整收錄)。在某些實施方案中，包含p329g，l234a和l235a(eu編號方式)替代的多肽展現(xiàn)降低對人fcγriiia和fcγriia的親和力，用于將adcc下調(diào)至由包含野生型人iggfc區(qū)的多肽誘導(dǎo)的adcc的至少20％，和/或用于下調(diào)adcp(美國專利no.8,969,526，通過援引將其完整收錄)。在一個具體的實施方案中，包含野生型人fc多肽的fc變體的多肽包含三重突變：依照eu編號方式的位置pro329處的氨基酸替代，l234a和l235a突變(p329/lala)(美國專利no.8,969,526，通過援引將其完整收錄)。在具體的實施方案中，該多肽包含下述氨基酸替代：依照eu編號方式的p329g，l234a，和l235a。描述了具有改善的或降低的對fcr的結(jié)合的某些抗體變體(見例如美國專利no.6,737,056；wo2004/056312，及shields等，j.biol.chem.9(2)：6591-6604(2001))。在某些實施方案中，抗體變體包含具有改善adcc的一處或多處氨基酸替代，例如fc區(qū)的位置298，333，和/或334(eu編號方式)的替代的fc區(qū)。在一些實施方案中，對fc區(qū)做出改變，其導(dǎo)致改變的(即，改善的或降低的)c1q結(jié)合和/或補體依賴性細胞毒性(cdc)，例如，如記載于美國專利no.6,194,551，wo99/51642，及idusogie等，j.immunol.164：4178-4184(2000)的。具有延長的半衰期和改善的對新生兒fc受體(fcrn)的結(jié)合的抗體記載于us2005/0014934a1(hinton等)，新生兒fc受體(fcrn)負責(zé)將母體igg轉(zhuǎn)移至胎兒(guyer等，j.immunol.117:587(1976)及kim等，j.immunol.24:249(1994))。那些抗體包含其中具有改善fc區(qū)對fcrn結(jié)合的一處或多處替代的fc區(qū)。此類fc變體包括那些在依照eu編號方式的fc區(qū)殘基238，256，265，272，286，303，305，307，311，312，317，340，356，360，362，376，378，380，382，413，424或434中的一處或多處具有替代，例如，fc區(qū)殘基434的替代的(美國專利no.7,371,826)。還可見duncan和winter，nature322:738-40(1988)；美國專利no.5,648,260；美國專利no.5,624,821；及wo94/29351，其關(guān)注fc區(qū)變體的其它例子。根據(jù)其重鏈恒定域的氨基酸序列的不同，可以將完整抗體指定為不同“類”。存在五大類的完整免疫球蛋白抗體:iga，igd，ige，igg和igm，且可以將其中的幾種進一步分成“亞類”(同種型)，例如igg1,igg2,igg3,igg4,iga1,和iga2。對應(yīng)于不同抗體類別的重鏈恒定域分別稱作α，δ，ε，γ和μ。不同類別免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)造為眾所周知的。ig型包括鉸鏈-修飾型或無鉸鏈型(roux等(1998)j.immunol.161:4083-4090；lund等(2000)eur.j.biochem.267:7246-7256；us2005/0048572；us2004/0229310)。“半胱氨酸改造抗體”或“半胱氨酸改造抗體變體”是如下的抗體，該抗體的一個或多個殘基是用半胱氨酸殘基替代的。半胱氨酸改造抗體的硫醇基團可以綴合至藥物模塊(例如經(jīng)由接頭)以形成thiomabtm抗體(即thiomabtm抗體-藥物綴合物(tdc))。在特定的實施方案中，替代殘基存在于抗體的可及位點。通過用半胱氨酸替代那些殘基，反應(yīng)性硫醇基團由此位于抗體的可及位點且可用于將抗體綴合至其它模塊，諸如藥物模塊或接頭-藥物模塊，以創(chuàng)建免疫綴合物，如本文中進一步描述的。例如，thiomabtm抗體可以是具有輕鏈中(例如依照kabat編號方式的g64c，i106c，r108c，k149c或r142c)或重鏈中(例如依照kabat編號方式的hc-d101c，hc-v184c，或hc-t205c，或依照eu編號方式的hc-t114c，hc-a140c，hc-l174c，hc-l179c，hc-t187c，hc-t209c，hc-v262c，hc-g371c，hc-y373c，hc-e382c，hc-s424c，hc-n434c，和hc-q438c(即依照kabat編號方式的hc-a136c為依照eu編號方式的hc-a140c)非半胱氨酸天然殘基變成半胱氨酸的單一突變的抗體(見圖1b))。在具體的例子中，thiomabtm抗體具有重或輕鏈任一中的單一半胱氨酸突變，使得每個全長抗體(即具有兩條重鏈和兩條輕鏈的抗體)具有兩個改造的半胱氨酸殘基?！癳rbb受體”為屬于受體erbb受體家族的蛋白酪氨酸激酶，其成員為細胞生長，分化和存活的重要介導(dǎo)物。erbb受體家族包括4種不同的成員，包括表皮生長因子受體(egfr，erbb1，her1)，her2(erbb2或p185neu)，her3(erbb3)和her4(erbb4或tyro2)。已經(jīng)使用人乳腺腫瘤細胞系skbr3表征了一組抗-erbb2抗體(hudziak等(1989)mol.cell.biol.9(3):1165-1172。使用稱作4d5的抑制細胞增殖達56％的抗體獲得最大抑制作用。在本試驗的一組抗體中的其它抗體降低細胞增殖的程度較弱。進一步發(fā)現(xiàn)抗體4d5可以使過表達erbb2的乳腺腫瘤細胞系對tnf-α的細胞毒性效應(yīng)敏感(us5677171)。hudziak等討論的抗-erbb2抗體進一步在下列文獻中得到表征：fendly等(1990)cancerresearch50:1550-1558；kotts等(1990)invitro26(3):59a；sarup等(1991)growthregulation1:72-82；shepard等(1991)j.clin.immunol.11(3):117-127；kumar等(1991)mol.cell.biol.11(2):979-986；lewis等(1993)cancerimmunol.immunother.37:255-263；pietras等(1994)oncogene9:1829-1838；vitetta等(1994)cancerresearch54:5301-5309；sliwkowski等(1994)j.biol.chem.269(20):14661-14665；scott等(1991)j.biol.chem.266:14300-5；d′souza等，proc.natl.acad.sci.(1994)91:7202-7206；lewis等，(1996)cancerresearch56:1457-1465；和schaefer等(1997)oncogene15:1385-1394。erbb受體通常包含胞外結(jié)構(gòu)域，其可以結(jié)合erbb配體；親脂性跨膜結(jié)構(gòu)域；保守的胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域；和包含幾個可以被磷酸化的酪氨酸殘基的羧基-末端信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。erbb受體可以為“天然序列”erbb受體或其“氨基酸序列變體”。優(yōu)選erbb受體為天然序列人erbb受體。因此，“erbb受體家族的成員”包括egfr(erbb1)，erbb2，erbb3，erbb4。術(shù)語“氨基酸序列變體”意旨在一定程度上具有不同于天然序列多肽的氨基酸序列的多肽。氨基酸序列變體在天然氨基酸序列的氨基酸序列內(nèi)的某些位置上具有替代，缺失和/或插入。按照常規(guī)的名稱，即一字母密碼和三字母密碼命名氨基酸。例如，在某些實施方案中，氨基酸序列變體會與天然erbb配體的至少一種受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或與天然erbb受體的至少一種配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有至少約70％的序列同一性，并且優(yōu)選它的序列會與這類受體或配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域至少約80％，更優(yōu)選至少約90％同源。將“序列同一性”定義為對序列進行序列對比排列并在必要時引入缺口以獲取最大百分比序列同一性后氨基酸序列變體中相同的殘基的百分率。用于進行序列對比的方法和計算機程序為本領(lǐng)域眾所周知的。一種這類計算機程序為genentech,inc.創(chuàng)建的“align2”，其中歸檔為1991年12月10日在unitedstatescopyrightoffice,washington,dc20559的用戶文件。“天然抗體”通常為由兩種相同的輕(l)鏈和兩種相同的重(h)鏈組成的約150,000道爾頓的異四聚化糖蛋白。每一輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈連接，而二硫鍵的數(shù)量在不同免疫球蛋白同種型的重鏈中可變。每一重鏈和輕鏈還具有有規(guī)則間隔的鏈間二硫橋。每一重鏈在一端上帶有可變域(vh)，隨后是大量恒定域。每一輕鏈在一端上帶有可變域(vl)，而在另一端上帶有恒定域。將輕鏈的恒定域與重鏈的第一恒定域進行序列對比并且將輕鏈的可變域與重鏈的可變域進行序列對比。認為特定的氨基酸殘基在輕鏈域重鏈可變域之間形成界面。術(shù)語“可變的”指可變域中的某些部分在抗體序列中差異廣泛且用于每種特定抗體針對其特定抗原的結(jié)合和特異性的實情。然而，變異性并非均勻分布于抗體的整個可變域。它集中于輕鏈和重鏈可變域中稱作高變區(qū)的三個區(qū)段?？勺冇蛑懈痈叨缺Ｊ氐牟糠址Q作框架區(qū)(fr)。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含四個fr，它們大多采取β-折疊構(gòu)象，通過形成環(huán)狀連接且在有些情況中形成β-折疊結(jié)構(gòu)一部分的三個高變區(qū)連接。每條鏈中的高變區(qū)通過fr非常接近的保持在一起，并與另一條鏈的高變區(qū)一起促成抗體的抗原結(jié)合位點的形成(參見kabat等人，1991，《sequencesofproteinsofimmunologicalinterest》，第5版，publichealthservice，nationalinstitutesofhealth，bethesda，md)。恒定域不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但展現(xiàn)出多種效應(yīng)物功能，諸如抗體依賴性細胞的細胞毒性(adcc)中抗體的參與。術(shù)語“高變區(qū)”在用于本文時指抗體中負責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)通常包含來自“互補決定區(qū)”或“cdr”的氨基酸殘基(例如輕鏈可變域中的殘基24-34(l1)，50-56(l2)和89-97(l3)及重鏈可變域中的殘基31-35(h1)，50-65(h2)和95-102(h3)；kabat等人，見上文)和/或那些來自“高變環(huán)”的殘基(例如輕鏈可變域中的殘基26-32(l1)，50-52(l2)和91-96(l3)及重鏈可變域中的殘基26-32(h1)，53-55(h2)和96-101(h3)；chothiaandlesk(1987)j.mol.biol.196:901-917)。“框架區(qū)”或“fr”殘基指可變域中除了本文中所定義的高變區(qū)殘基以外的那些殘基。用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個相同的抗原結(jié)合片段，稱作“fab”片段，各自具有一個抗原結(jié)合位點，和一個殘余“fc”片段，其名稱反映了它易于結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個f(ab′)2片段，它具有兩個抗原結(jié)合位點且仍能夠交聯(lián)抗原?！癴v”是包含完整抗原識別和抗原結(jié)合位點的最小抗體片段。此區(qū)由緊密，非共價結(jié)合的一個重鏈可變區(qū)和一個輕鏈可變域的二聚體組成。正是在這種構(gòu)造中，各個可變域的三個高變區(qū)相互作用而在vh-vl二聚體表面確定了一個抗原結(jié)合位點。六個高變區(qū)共同賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個可變域(或只包含對抗原特異的三個高變區(qū)的半個fv)也具有識別和結(jié)合抗原的能力，盡管親和力低于完整結(jié)合位點。fab片段還包含輕鏈的恒定域和重鏈的第一恒定域(ch1)。fab’片段因在重鏈ch1結(jié)構(gòu)域的羧基末端增加了少數(shù)殘基而與fab片段有所不同，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸。fab’-sh是本文中對其中恒定區(qū)半胱氨酸殘基攜帶至少一個游離硫醇基的fab’的稱謂。f(ab′)2抗體片段最初是作為成對fab’片段生成的，在fab’片段之間具有鉸鏈半胱氨酸。還知道抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)。根據(jù)其恒定域氨基酸序列，來自任何脊椎動物物種的抗體的“輕鏈”可歸入兩種截然不同類型中的一種，稱作卡帕(κ)和拉姆達(λ)?！皢捂渇v”或“scfv”抗體片段包含抗體的vh和vl結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于一條多肽鏈上。優(yōu)選的是，該fv多肽在vh和vl結(jié)構(gòu)域之間還包含多肽接頭，使得scfv能夠形成抗原結(jié)合期望的結(jié)構(gòu)。關(guān)于scfv的綜述參見plückthun，《thepharmacologyofmonoclonalantibodies》，vol.113，rosenburg和moore編，springer-verlag，newyork，pp.269-315，1994?？筫rbb2抗體scfv片段描述于wo93/16185；美國專利5,571,894；和5,587,458。非人(例如嚙齒類)抗體的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。人源化是將鼠抗原結(jié)合信息轉(zhuǎn)移至非免疫原性人抗體受體的方法，并且已經(jīng)產(chǎn)生了許多治療上有用的藥物。人源化方法一般通過將所有6個鼠互補決定區(qū)(cdr)轉(zhuǎn)移至人抗體框架開始(jones等,(1986)nature321:522-525)。這些cdr移植的抗體一般不會保持其對抗原結(jié)合的最初親和力，并且事實上，親和力通常嚴重受損。除cdr外，還必須引入選定的非人抗體框架殘基以便維持正確的cdr構(gòu)象(chothia等(1989)nature342:877)。已經(jīng)證實，將關(guān)鍵的小鼠框架殘基轉(zhuǎn)移至人受體以便支持所移植cdr的結(jié)構(gòu)構(gòu)象恢復(fù)抗原結(jié)合和親和力(riechmann等(1992)j.mol.biol.224,487-499；foote和winter,(1992)j.mol.biol.224:487-499；presta等(1993)j.immunol.151,2623-2632；werther等(1996)j.immunol.methods157:4986-4995；和presta等(2001)thromb.haemost.85:379-389)。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區(qū)殘基用具有期望特異性，親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠，大鼠，兔或非人靈長類的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的框架區(qū)(fr)殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒有發(fā)現(xiàn)的殘基。進行這些修飾是為了進一步改進抗體的性能。通常，人源化抗體包含至少一個，通常兩個基本上整個如下可變域，其中整個或基本上整個高變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且整個或基本上整個fr是人免疫球蛋白序列的fr。人源化抗體任選還包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細節(jié)參見us6,407,213；jonesetal.(1986)nature321:522-525；riechmannetal.(1988)nature332:323-329；presta(1992)curr.op.struct.biol.2:593-596。“游離半胱氨酸氨基酸”指已經(jīng)改造到親本抗體中，帶有硫醇官能基(-sh)，并且未作為分子內(nèi)或分子間二硫鍵配對的半胱氨酸氨基酸殘基。術(shù)語“硫醇反應(yīng)性值”為游離半胱氨酸氨基酸的反應(yīng)性的定量表征。硫醇反應(yīng)性值為半胱氨酸改造抗體中與硫醇反應(yīng)性試劑起反應(yīng)的游離半胱氨酸氨基酸的百分比，并且換算成最大值1。例如，半胱氨酸改造抗體上以100％產(chǎn)率與硫醇反應(yīng)性試劑諸如生物素-馬來酰亞胺試劑起反應(yīng)而形成生物素標記的抗體的游離半胱氨酸氨基酸具有1.0的硫醇反應(yīng)性值。改造到相同或不同親本抗體中的以90％產(chǎn)率與硫醇反應(yīng)性試劑起反應(yīng)的另一個半胱氨酸氨基酸具有約0.9的硫醇反應(yīng)性值。改造到相同或不同親本抗體中的以80％產(chǎn)率與硫醇反應(yīng)性試劑起反應(yīng)的另一個半胱氨酸氨基酸具有約0.8的硫醇反應(yīng)性值。改造到相同或不同親本抗體中的以70％產(chǎn)率與硫醇反應(yīng)性試劑起反應(yīng)的另一個半胱氨酸氨基酸具有約0.7的硫醇反應(yīng)性值。改造到相同或不同親本抗體中的以60％產(chǎn)率與硫醇反應(yīng)性試劑起反應(yīng)的另一個半胱氨酸氨基酸具有約0.6的硫醇反應(yīng)性值。改造到相同或不同親本抗體中的以50％產(chǎn)率與硫醇反應(yīng)性試劑起反應(yīng)的另一個半胱氨酸氨基酸具有約0.5的硫醇反應(yīng)性值。改造到相同或不同親本抗體中的以40％產(chǎn)率與硫醇反應(yīng)性試劑起反應(yīng)的另一個半胱氨酸氨基酸具有約0.4的硫醇反應(yīng)性值。改造到相同或不同親本抗體中的以30％產(chǎn)率與硫醇反應(yīng)性試劑起反應(yīng)的另一個半胱氨酸氨基酸具有約0.3的硫醇反應(yīng)性值。改造到相同或不同親本抗體中的以20％產(chǎn)率與硫醇反應(yīng)性試劑起反應(yīng)的另一個半胱氨酸氨基酸具有約0.2的硫醇反應(yīng)性值。改造到相同或不同親本抗體中的以10％產(chǎn)率與硫醇反應(yīng)性試劑起反應(yīng)的另一個半胱氨酸氨基酸具有約0.1的硫醇反應(yīng)性值。改造到相同或不同親本抗體中的完全無法與硫醇反應(yīng)性試劑起反應(yīng)的另一個半胱氨酸氨基酸具有0的硫醇反應(yīng)性值?？梢酝ㄟ^elisa測定法，質(zhì)譜法，液相層析法，放射自顯影法或其它定量分析試驗測定特定半胱氨酸的硫醇反應(yīng)性值。“親本抗體”為所含氨基酸序列中的一個或多個氨基酸殘基將用一個或多個半胱氨酸殘基替代的抗體。親本抗體可以包含天然或野生型序列。親本抗體可以具有相對于其它天然，野生型或修飾形式的抗體而言預(yù)先存在的氨基酸序列修飾(諸如添加，缺失和/或替代)。親本抗體可以針對所關(guān)注的靶抗原，例如生物學(xué)上重要的多肽。還關(guān)注針對非多肽抗原(諸如腫瘤相關(guān)糖脂抗原；參見us5,091,178)的抗體。例示性親本抗體包括對細胞表面和跨膜受體和腫瘤相關(guān)抗原(taa)具有親和力和選擇性的抗體。“分離的”抗體指已經(jīng)鑒定且與/由其天然環(huán)境的一種成分分開和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染性成分指會干擾該抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶，激素，和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實施方案中，將抗體純化至(1)根據(jù)lowry方法的測定，抗體重量超過95％，最優(yōu)選重量超過99％，(2)足以通過使用轉(zhuǎn)杯式測序儀獲得至少15個殘基的n-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)根據(jù)使用考馬斯藍或優(yōu)選銀染色的還原性或非還原性條件下的sds-page，達到同質(zhì)。既然抗體天然環(huán)境的至少一種成分不會存在，那么分離的抗體包括重組細胞內(nèi)的原位抗體。然而，分離的抗體通常通過至少一個純化步驟來制備?！敖Y(jié)合”分子靶標或所關(guān)注抗原例如erbb2抗原的抗體為能夠以足夠親和力結(jié)合抗原，使得該抗體可用于靶向表達該抗原的細胞的抗體。如果抗體為結(jié)合erbb2的抗體，那么它通常優(yōu)先結(jié)合erbb2勝過其它erbb受體，并且可以為不會與其它蛋白質(zhì)，諸如egfr，erbb3或erbb4發(fā)生顯著交叉反應(yīng)的抗體。在這類實施方案中，抗體與這些非erbb2蛋白質(zhì)結(jié)合(例如對內(nèi)源受體的細胞表面結(jié)合)的程度將低于10％，正如通過熒光激活細胞分選術(shù)(facs)分析或放射性免疫沉淀(ria)測定的。有時，抗erbb2抗體不會與大鼠neu蛋白發(fā)生顯著的交叉反應(yīng)，例如如schecter等(1984)nature312:513和drebin等(1984)nature312:545-548中所述。本發(fā)明所涵蓋的抗體的分子靶標包括cd蛋白及其配體，諸如，但不限于：(i)cd3，cd4，cd8，cd19，cd20，cd22，cd34，cd40，cd79α(cd79a)和cd79β(cd79b)；(ii)erbb受體家族的成員，諸如egf受體，her2，her3或her4受體；(iii)細胞粘附分子，諸如lfa-1，mac1，p150,95，vla-4，icam-1，vcam和αv/β3整聯(lián)蛋白，包括其α或β亞基(例如抗cd11a，抗cd18或抗cd11b抗體)；(iv)生長因子，諸如vegf；ige；血型抗原；flk2/flt3受體；肥胖(ob)受體；mpl受體；ctla-4；蛋白c，br3，c-met，組織因子，等；和(v)細胞表面和跨膜腫瘤相關(guān)抗原(taa)。術(shù)語“抗ly6e抗體”和“結(jié)合ly6e的抗體”指能夠以足夠親和力結(jié)合ly6e，使得該抗體可作為診斷劑和/或治療劑用于靶向ly6e的抗體。在一個實施方案中，根據(jù)例如通過放射免疫測定法(ria)的測量，抗ly6e抗體結(jié)合無關(guān)的，非ly6e的蛋白質(zhì)的程度小于該抗體對ly6e的結(jié)合的約10％。在某些實施方案中，結(jié)合ly6e的抗體具有≤1μm，≤100nm，≤10nm，≤5nm，≤4nm，≤3nm，≤2nm，≤1nm，≤0.1nm，≤0.01nm，或≤0.001nm(例如10-8m或更少，例如10-8m到10-13m，例如10-9m到10-13m)的解離常數(shù)(kd)。在某些實施方案中，抗ly6e抗體結(jié)合在來自不同物種的ly6e中保守的ly6e表位。術(shù)語“抗steap1抗體”和“結(jié)合steap1的抗體”指能夠以足夠親和力結(jié)合steap1，使得該抗體可作為診斷劑和/或治療劑用于靶向steap1的抗體。在一個實施方案中，根據(jù)例如通過放射免疫測定法(ria)的測量，抗steap1抗體結(jié)合無關(guān)的，非steap1的蛋白質(zhì)的程度小于該抗體對steap1的結(jié)合的約10％。在某些實施方案中，結(jié)合steap1的抗體具有≤1μm，≤100nm，≤10nm，≤5nm，≤4nm，≤3nm，≤2nm，≤1nm，≤0.1nm，≤0.01nm，或≤0.001nm(例如10-8m或更少，例如10-8m到10-13m，例如10-9m到10-13m)的解離常數(shù)(kd)。在某些實施方案中，抗steap1抗體結(jié)合在來自不同物種的steap1中保守的steap1表位。術(shù)語“抗cd79b抗體”和“結(jié)合cd79b的抗體”指能夠以足夠親和力結(jié)合cd79b，使得該抗體可作為診斷劑和/或治療劑用于靶向cd79b的抗體。在一個實施方案中，根據(jù)例如通過放射免疫測定法(ria)的測量，抗cd79b抗體結(jié)合無關(guān)的，非cd79b的蛋白質(zhì)的程度小于該抗體對cd79b的結(jié)合的約10％。在某些實施方案中，結(jié)合cd79b的抗體具有≤1μm，≤100nm，≤10nm，≤5nm，≤4nm，≤3nm，≤2nm，≤1nm，≤0.1nm，≤0.01nm，或≤0.001nm(例如10-8m或更少，例如10-8m到10-13m，例如10-9m到10-13m)的解離常數(shù)(kd)。在某些實施方案中，抗cd79b抗體結(jié)合在來自不同物種的cd79b中保守的cd79b表位。術(shù)語“抗muc16抗體”和“結(jié)合muc16的抗體”指能夠以足夠親和力結(jié)合muc16，使得該抗體可作為診斷劑和/或治療劑用于靶向muc16的抗體。在一個實施方案中，根據(jù)例如通過放射免疫測定法(ria)的測量，抗muc16抗體結(jié)合無關(guān)的，非muc16的蛋白質(zhì)的程度小于該抗體對muc16的結(jié)合的約10％。在某些實施方案中，結(jié)合muc16的抗體具有≤1μm，≤100nm，≤10nm，≤5nm，≤4nm，≤3nm，≤2nm，≤1nm，≤0.1nm，≤0.01nm，或≤0.001nm(例如10-8m或更少，例如10-8m到10-13m，例如10-9m到10-13m)的解離常數(shù)(kd)。在某些實施方案中，抗muc16抗體結(jié)合在來自不同物種的muc16中保守的muc16表位。術(shù)語“抗her2抗體”和“結(jié)合her2的抗體”指能夠以足夠親和力結(jié)合her2，使得該抗體可作為診斷劑和/或治療劑用于靶向her2的抗體。在一個實施方案中，根據(jù)例如通過放射免疫測定法(ria)的測量，抗her2抗體結(jié)合無關(guān)的，非her2的蛋白質(zhì)的程度小于該抗體對her2的結(jié)合的約10％。在某些實施方案中，結(jié)合her2的抗體具有≤1μm，≤100nm，≤10nm，≤5nm，≤4nm，≤3nm，≤2nm，≤1nm，≤0.1nm，≤0.01nm，或≤0.001nm(例如10-8m或更少，例如10-8m到10-13m，例如10-9m到10-13m)的解離常數(shù)(kd)。在某些實施方案中，抗her2抗體結(jié)合在來自不同物種的her2中保守的her2表位。術(shù)語“抗cd22抗體”和“結(jié)合cd22的抗體”指能夠以足夠親和力結(jié)合cd22，使得該抗體可作為診斷劑和/或治療劑用于靶向cd22的抗體。在一個實施方案中，根據(jù)例如通過放射免疫測定法(ria)的測量，抗cd22抗體結(jié)合無關(guān)的，非cd22的蛋白質(zhì)的程度小于該抗體對cd22的結(jié)合的約10％。在某些實施方案中，結(jié)合cd22的抗體具有≤1μm，≤100nm，≤10nm，≤5nm，≤4nm，≤3nm，≤2nm，≤1nm，≤0.1nm，≤0.01nm，或≤0.001nm(例如10-8m或更少，例如10-8m到10-13m，例如10-9m到10-13m)的解離常數(shù)(kd)。在某些實施方案中，抗cd22抗體結(jié)合在來自不同物種的cd22中保守的cd22表位。術(shù)語“抗cd79b抗體”和“結(jié)合cd79b的抗體”指能夠以足夠親和力結(jié)合cd79b，使得該抗體可作為診斷劑和/或治療劑用于靶向cd79b的抗體。在一個實施方案中，根據(jù)例如通過放射免疫測定法(ria)的測量，抗cd79b抗體結(jié)合無關(guān)的，非cd79b的蛋白質(zhì)的程度小于該抗體對cd79b的結(jié)合的約10％。在某些實施方案中，結(jié)合cd79b的抗體具有≤1μm，≤100nm，≤10nm，≤5nm，≤4nm，≤3nm，≤2nm，≤1nm，≤0.1nm，≤0.01nm，或≤0.001nm(例如10-8m或更少，例如10-8m到10-13m，例如10-9m到10-13m)的解離常數(shù)(kd)。在某些實施方案中，抗cd79b抗體結(jié)合在來自不同物種的cd79b中保守的cd79b表位。術(shù)語“抗napi2b抗體”和“結(jié)合napi2b的抗體”指能夠以足夠親和力結(jié)合napi2b，使得該抗體可作為診斷劑和/或治療劑用于靶向napi2b的抗體。在一個實施方案中，根據(jù)例如通過放射免疫測定法(ria)的測量，抗napi2b抗體結(jié)合無關(guān)的，非napi2b的蛋白質(zhì)的程度小于該抗體對napi2b的結(jié)合的約10％。在某些實施方案中，結(jié)合napi2b的抗體具有≤1μm，≤100nm，≤10nm，≤5nm，≤4nm，≤3nm，≤2nm，≤1nm，≤0.1nm，≤0.01nm，或≤0.001nm(例如10-8m或更少，例如10-8m到10-13m，例如10-9m到10-13m)的解離常數(shù)(kd)。在某些實施方案中，抗napi2b抗體結(jié)合在來自不同物種的napi2b中保守的napi2b表位。除非另做陳述，術(shù)語“單克隆抗體4d5”指具有或衍生自鼠4d5抗體(atcccrl10463)的抗原結(jié)合殘基的抗體。例如，單克隆抗體4d5可以為鼠單克隆抗體4d5或其變體，諸如人源化4d5。例示性人源化4d5抗體包括如美國專利no.5,821,337中所述的humab4d5-1，humab4d5-2，humab4d5-3，humab4d5-4，humab4d5-5，humab4d5-6，humab4d5-7和humab4d5-8(曲妥珠單抗(trastuzumab),)。除非另外指明，術(shù)語“單克隆抗體7c2”或“7c2”指具有7c2.v2.2.la抗體的或自其衍生的抗原結(jié)合殘基的抗體。7c2抗體是抗her2抗體。“hu7c2.v.2.2.la抗體-藥物綴合物”(hu7c2adc)指綴合至藥物的人源化7c2抗體。在具體的實施方案中，人源化7c2抗體經(jīng)由改造的半胱氨酸和接頭綴合至藥物。在具體的實施方案中，人源化7c2adc與一種或多種選自曲妥珠單抗t-dm1和帕妥珠單抗的另外的治療劑共施用。在一些實施方案中，hu7c2adc與曲妥珠單抗共施用。在一些實施方案中，hu7c2adc與t-dm1共施用。在一些實施方案中，hu7c2adc與帕妥珠單抗共施用。在一些實施方案中，hu7c2adc與曲妥珠單抗和帕妥珠單抗共施用。在一些實施方案中，hu7c2adc與t-dm1和帕妥珠單抗共施用。術(shù)語“治療”和“處理”指治療性處理及預(yù)防性或防范性措施二者，其中目標是預(yù)防或減緩(減輕)不想要的生理學(xué)變化或紊亂，諸如癌癥的形成或傳播。為了本發(fā)明，有利或期望的臨床結(jié)果包括但不限于：緩解癥狀，削弱疾病的程度，疾病狀態(tài)穩(wěn)定(即不惡化)，延遲或減緩疾病進展，改善或減輕疾病狀態(tài)，及康復(fù)(無論是部分的還是完全的)，無論是可檢測的還是不可檢測的?！爸委煛被颉疤幚怼边€可以指與不接受治療的預(yù)期存活相比延長存活。需要治療的受試者包括早就患有狀況或紊亂的受試者以及傾向于患上狀況或紊亂的受試者或者要預(yù)防狀況或紊亂的受試者。術(shù)語“治療有效量”指在哺乳動物中有效治療疾病或紊亂的藥物量。在癌癥的情況中，藥物的治療有效量可減少癌細胞的數(shù)目；縮小腫瘤的尺寸；抑制(即在一定程度上減緩和優(yōu)選阻止)癌細胞浸潤到周圍器官中；抑制(即在一定程度上減緩和優(yōu)選阻止)腫瘤轉(zhuǎn)移；在一定程度上抑制腫瘤生長；和/或在一定程度上減輕一種或多種與癌癥有關(guān)的癥狀。在藥物可阻止生長和/或殺死現(xiàn)有癌細胞的程度上，它可以是抑制細胞的和/或細胞毒性的。對于癌癥療法，可通過例如評估疾病進展時間(ttp)和/或測定響應(yīng)速率(rr)來測量功效。術(shù)語“癌癥”和“癌性”指或描述哺乳動物中特征通常為細胞生長不受調(diào)節(jié)的生理狀況?！澳[瘤”包含一個或多個癌性細胞。癌癥的例子包括但不限于癌，淋巴瘤，母細胞瘤，肉瘤，及白血病或淋巴樣惡性腫瘤。此類癌癥的更具體例子包括鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)，肺癌包括小細胞肺癌，非小細胞肺癌(“nsclc”)，肺的腺癌和肺的鱗狀癌，腹膜癌，肝細胞癌，胃癌包括胃腸癌，胰腺癌，成膠質(zhì)細胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝瘤(hepatoma)，乳癌，結(jié)腸癌，直腸癌，結(jié)腸直腸癌，子宮內(nèi)膜或子宮癌，唾液腺癌，腎癌，前列腺癌，外陰癌，甲狀腺癌，肝癌，肛門癌，陰莖癌，以及頭和頸癌。“表達erbb的癌”指包含在其細胞表面上存在erbb蛋白質(zhì)的細胞的癌。“表達erbb2的癌”指在其細胞表面上生成足夠水平的erbb2，使得抗erbb2抗體可與其結(jié)合并對癌產(chǎn)生治療效果的癌?！斑^表達”抗原性受體的癌指與同一組織類型的非癌性細胞相比，在其細胞表面上具有顯著更高水平的受體諸如erbb2的癌。此類過表達可以是由基因擴增或者是由轉(zhuǎn)錄或翻譯提高引起的?？稍谠\斷或預(yù)后測定法中通過評估細胞表面上存在的受體蛋白質(zhì)水平的升高(例如通過免疫組織化學(xué)測定法；ihc)來確定受體過表達。或者/另外，可測量細胞中受體編碼核酸的水平，例如通過熒光原位雜交(fish；參見wo98/45479)，southern印跡，或聚合酶鏈式反應(yīng)(pcr)技術(shù)，諸如實時定量pcr(rt-pcr)。“化學(xué)療法”是可用于治療癌癥的化學(xué)治療劑的使用?！盎焺敝缚捎糜谥委煱┌Y的化學(xué)化合物，不管作用機制。如本文中使用的，術(shù)語“藥物”或“藥物模塊”是化療劑的例子。因而，在本文所述thiomabtm抗體包含半胱氨酸改造抗體，接頭，和藥物的情況中，該藥物可以是本文所述任何化療劑?；焺┑念悇e包括但不限于：烷化劑類(alkyatingagents)，抗代謝物類(antimetabolites)，紡錘體毒植物生物堿類(spindlepoisonplantalkaloids)，細胞毒性/抗腫瘤抗生素類(cytoxic/antitumorantibiotics)，拓撲異構(gòu)酶抑制劑類(topoisomeraseinhibitors)，抗體類(antibodies)，光敏劑類(photosensitizers)，和激酶抑制劑類(kinaseinhibitors)?；焺┑睦影ǎ篹rlotinib(genentech/osipharm.)，多西他塞(docetaxel)(sanofi-aventis)，5-fu(氟尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，casno.51-21-8)，吉西他濱(gemcitabine)(lilly)，pd-0325901(casno.391210-10-9,pfizer)，順鉑(cisplatin)(順式-二胺,二氯鉑(ii)，casno.15663-27-1)，卡鉑(carboplatin)(casno.41575-94-4)，帕利他塞(paclitaxel)(bristol-myerssquibboncology,princeton,n.j.)，替莫唑胺(temozolomide)(4-甲基-5-氧-2,3,4,6,8-五氮雙環(huán)[4.3.0]九-2,7,9-三烯-9-羧酰胺，casno.85622-93-1,scheringplough)，他莫昔芬(tamoxifen)((z)-2-[4-(1,2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基]-n,n-二甲基-乙胺，)，和多柔比星(doxorubicin)akti-1/2，hppd，和雷帕霉素(rapamycin)?；焺┑母嗬影ǎ簥W沙利鉑(oxaliplatin)(sanofi)，bortezomib(millenniumpharm.)，sutent(su11248,pfizer)，來曲唑(letrozole)(novartis)，甲磺酸伊馬替尼(imatinibmesylate)(novartis)，xl-518(mek抑制劑,exelixis,wo2007/044515)，arry-886(mek抑制劑,azd6244,arraybiopharma,astrazeneca)，sf-1126(pi3k抑制劑,semaforepharmaceuticals)，bez-235(pi3k抑制劑,novartis)，xl-147(pi3k抑制劑,exelixis)，ptk787/zk222584(novartis)，氟維司群(fulvestrant)(astrazeneca)，亞葉酸(leucovorin,folinicacid)，雷帕霉素(rapamycin)(西羅莫司(sirolimus),wyeth)，lapatinib(gsk572016,glaxosmithkline)，lonafarnib(sarasartm,sch66336,scheringplough)，sorafenib(bay43-9006,bayerlabs)，gefitinib(astrazeneca)，伊立替康(irinotecan)(cpt-11,pfizer)，tipifarnib(zarnestratm,johnson&johnson)，abraxanetm不含克列莫佛(cremophor)，清蛋白改造納米顆粒劑型帕利他塞(paclitaxel)(americanpharmaceuticalpartners,schaumberg,il)，vandetanib(rinn,zd6474,astrazeneca)，chloranmbucil，ag1478，ag1571(su5271；sugen)，temsirolimus(wyeth)，pazopanib(glaxosmithkline)，canfosfamide(telik)，塞替派(thiotepa)和環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)磺酸烷基酯類(alkylsulfonates)，諸如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶類(aziridines)，諸如苯佐替派(benzodopa)，卡波醌(carboquone)，美妥替派(meturedopa)和烏瑞替派(uredopa)；乙撐亞胺類(ethylenimines)和甲基蜜胺類(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)，三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)，三乙撐磷酰胺(triethylenephosphoramide)，三乙撐硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羥甲蜜胺(trimethylomelamine)；番荔枝內(nèi)酯類(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜樹堿(camptothecin)(包括合成類似物托泊替康(topotecan))；苔蘚抑素(bryostatin)；callystatin；cc-1065(包括其阿多來新(adozelesin)，卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；隱藻素類(cryptophycins)(特別是隱藻素1和隱藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成類似物，kw-2189和cb1-tm1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海綿抑素(spongistatin)；氮芥類(nitrogenmustards)，諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)，萘氮芥(chlornaphazine)，膽磷酰胺(chlorophosphamide)，雌莫司汀(estramustine)，異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)，雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)，鹽酸氧氮芥(mechlorethamineoxidehydrochloride)，美法侖(melphalan)，新氮芥(novembichin)，苯芥膽甾醇(phenesterine)，潑尼莫司汀(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥(uracilmustard)；亞硝脲類(nitrosoureas)，諸如卡莫司汀(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素類，諸如烯二炔類抗生素(enediyne)(例如加利車霉素(calicheamicin)，加利車霉素γ1i，加利車霉素ωi1(angewchem.intl.ed.engl.,(1994)33:183-186)；蒽環(huán)類抗生素(dynemicin)，dynemicina；二膦酸鹽類(bisphosphonates)，諸如氯膦酸鹽(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)發(fā)色團和相關(guān)色蛋白烯二炔類抗生素發(fā)色團)，阿克拉霉素(aclacinomysin)，放線菌素(actinomycin)，氨茴霉素(authramycin)，偶氮絲氨酸(azaserine)，博來霉素(bleomycin)，放線菌素c(cactinomycin)，carabicin，洋紅霉素(carminomycin)，嗜癌霉素(carzinophilin)，色霉素(chromomycinis)，放線菌素d(dactinomycin)，柔紅霉素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-二氮-5-氧-l-正亮氨酸，嗎啉代多柔比星，氰基嗎啉代多柔比星，2-吡咯代多柔比星和脫氧多柔比星)，表柔比星(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，伊達比星(idarubicin)，麻西羅霉素(marcellomycin)，絲裂霉素類(mitomycins)諸如絲裂霉素c，霉酚酸(mycophenolicacid)，諾拉霉素(nogalamycin)，橄欖霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin)，泊非霉素(porfiromycin)，嘌呤霉素(puromycin)，三鐵阿霉素(quelamycin)，羅多比星(rodorubicin)，鏈黑菌素(streptonigrin)，鏈佐星(streptozocin)，殺結(jié)核菌素(tubercidin)，烏苯美司(ubenimex)，凈司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物類，諸如甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-fu)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)，甲氨蝶呤(methotrexate)，蝶羅呤(pteropterin)，三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)，6-巰基嘌呤(mercaptopurine)，硫咪嘌呤(thiamiprine)，硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷(azauridine)，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷(cytarabine)，雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)，去氧氟尿苷(doxifluridine)，依諾他濱(enocitabine)，氟尿苷(floxuridine)；雄激素類，諸如卡魯睪酮(calusterone)，丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)，表硫雄醇(epitiostanol)，美雄烷(mepitiostane)，睪內(nèi)酯(testolactone)；抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)，米托坦(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸(frolinicacid)；醋葡醛內(nèi)酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinicacid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋銨(elliptiniumacetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼達明(lonidainine)；美登木素生物堿類(maytansinoids)，諸如美登素(maytansine)和安絲菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；噴司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖復(fù)合物(jhsnaturalproducts,eugene,or)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋鍺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2′,2”-三氯三乙胺；單端孢菌素類(trichothecenes)(t-2毒素，疣孢菌素(verrucurin)a，桿孢菌素(roridin)a和蛇行菌素(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(ara-c)；環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)；塞替派(thiotepa)；6-硫鳥嘌呤(thioguanine)；巰基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；鉑類似物，諸如順鉑(cisplatin)和卡鉑(carboplatin)；長春堿(vinblastine)；依托泊苷(etoposide)(vp-16)；異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新堿(vincristine)；長春瑞濱(vinorelbine)能滅瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依達曲沙(edatrexate)；道諾霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；卡培他濱(capecitabine)(roche)；伊本膦酸鹽(ibandronate)；cpt-11；拓撲異構(gòu)酶抑制劑rfs2000；二氟甲基鳥氨酸(dmfo)；類視黃酸類(retinoids)，諸如視黃酸(retinoicacid)；及任何上述物質(zhì)的制藥學(xué)可接受的鹽，酸和衍生物。術(shù)語“細胞毒劑”在用于本文時指抑制或防止細胞的功能和/或引起細胞破壞的物質(zhì)?；焺?即“藥物”或“藥物模塊”)可以是細胞毒劑。因而，在本文所述thiomabtm抗體包含半胱氨酸改造抗體，接頭，和藥物的情況中，該藥物可以是本文所述任何細胞毒劑。該術(shù)語意圖包括：放射性同位素，例如211at，131i，125i，90y，186re，188re，s153m，212bi，32p，60c和lu的放射性同位素；化療劑；和毒素，諸如小分子毒素或者細菌，真菌，植物或動物起源的酶活毒素，包括其合成類似物和衍生物?！笆删w展示”是將變異多肽作為與外殼蛋白的融合蛋白展示在噬菌體例如絲狀噬菌體顆粒的表面上的技術(shù)。噬菌體展示的一種效用在于可對隨機化蛋白質(zhì)變體的大型文庫快速且有效的分選那些以高親和力結(jié)合靶分子的序列的事實。在噬菌體上展示肽和蛋白質(zhì)文庫已經(jīng)用于對數(shù)以百萬計的多肽篩選具有特定結(jié)合特性的多肽。多價噬菌體展示方法已經(jīng)用于展示小隨機肽和小蛋白質(zhì)，通常通過與絲狀噬菌體的piii或pviii融合(wellsandlowman,(1992)curr.opin.struct.biol.3:355-362及其引用的參考文獻)。在單價噬菌體展示中，將蛋白質(zhì)或肽文庫與噬菌體外殼蛋白或其部分融合，且在存在野生型蛋白質(zhì)時以低水平表達。親合力效果與多價噬菌體相比降低，使得分選基于內(nèi)在配體親和力，并使用簡化dna操作的噬菌粒載體。lowmanandwells,(1991)methods:acompaniontomethodsinenzymology3:205-0216。噬菌體展示包括用于生成抗體樣分子的技術(shù)(janeway,c.,travers,p.,walport,m.,shlomchik,(2001)immunobiology,5thed.,garlandpublishing,newyork,p627-628；leeetal.)?！笆删！笔蔷哂屑毦鷱?fù)制起點例如co1e1和一個拷貝的噬菌體基因區(qū)間的質(zhì)粒載體。噬菌?？捎糜谌魏我阎删w，包括絲狀噬菌體和λ形噬菌體。質(zhì)粒通常還將包含抗生素抗性的選擇標志?？寺〉竭@些載體中的dna區(qū)段可以像質(zhì)粒一樣增殖。當(dāng)包含這些載體的細胞中配有生成噬菌體顆粒所必需的所有基因時，質(zhì)粒的復(fù)制方式改變成滾環(huán)復(fù)制以生成質(zhì)粒dna的一條鏈的拷貝并包裝噬菌體顆粒。噬菌粒可形成感染性或非感染性噬菌體顆粒。該術(shù)語包括包含噬菌體外殼蛋白基因或其片段且其與異源多肽基因連接成基因融合物，使得異源多肽展示在噬菌體顆粒表面上的噬菌粒?！敖宇^”，“接頭單元”或“連接物”指包含使抗體與藥物模塊共價連接的共價鍵或原子鏈的化學(xué)模塊。在各個實施方案中，將接頭指定為l。接頭包括：二價基，諸如亞烴基(alkyldiyl)，亞芳基，亞雜芳基，諸如-(cr2)no(cr2)n-，烴氧基重復(fù)單元(例如聚亞乙基氧基(polyethylenoxy)，peg，聚亞甲基氧基(polymethyleneoxy))和烴氨基(例如聚乙烯氨基，jeffaminetm)等模塊；及二酸酯和酰胺類，包括琥珀酸酯，琥珀酰胺，二乙醇酸酯，丙二酸酯和己酰胺。術(shù)語“標記”指可以共價附著于抗體并發(fā)揮如下功能的任何模塊：(i)提供可檢測信號；(ii)與第二標記相互作用以改變由第一或第二標記提供的可檢測信號，例如fret(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)；(iii)穩(wěn)定與抗原或配體的相互作用或提高與之結(jié)合的親和力；(iv)通過電荷，疏水性，形狀或其它物理參數(shù)影響遷移率例如電泳遷移率或細胞通透性；或(v)提供捕捉模塊，以調(diào)節(jié)配體親和力，抗體/抗原結(jié)合，或離子絡(luò)合。本文中使用的立體化學(xué)的定義和規(guī)則一般遵循s.p.parker,ed.,mcgraw-hilldictionaryofchemicalterms(1984)mcgraw-hillbookcompany,newyork；eliel,e.andwilen,s.,stereochemistryoforganiccompunds(1994)johnwiley&sons,inc.,newyork。許多有機化合物以旋光形式存在，即它們有能力旋轉(zhuǎn)平面偏振光的平面。在描述旋光化合物時，前綴d和l或r和s用于表示分子關(guān)于其手性中心的絕對構(gòu)型。前綴d和l或(+)和(-)用于表示化合物對平面偏振光的旋轉(zhuǎn)的跡象，其中(-)或1指化合物是左旋的。以(+)或d為前綴的化合物是右旋的。對于指定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，這些立體異構(gòu)體是相同的，只是它們互為鏡像。特定的立體異構(gòu)體還可稱作對映體，此類異構(gòu)體的混合物通常稱作對映混合物。對映體的50:50混合物稱作外消旋混合物或外消旋物，它們可以在沒有立體選擇性或立體特異性的化學(xué)反應(yīng)或方法中存在。術(shù)語“外消旋混合物”和“外消旋物”指兩種對映體等摩爾混合從而喪失旋光性的混合物。短語“藥學(xué)可接受鹽”在用于本文時指adc的藥學(xué)可接受的有機或無機鹽。例示性的鹽包括但不限于硫酸鹽，檸檬酸鹽，乙酸鹽，草酸鹽，氯化物，溴化物，碘化物，硝酸鹽，硫酸氫鹽，磷酸鹽，酸式磷酸鹽，異煙酸鹽，乳酸鹽，水楊酸鹽，酸式檸檬酸鹽，酒石酸鹽，油酸鹽，丹寧酸鹽，泛酸鹽，酒石酸氫鹽，抗壞血酸鹽，琥珀酸鹽，馬來酸鹽，龍膽酸鹽，富馬酸鹽，葡糖酸鹽，葡糖醛酸鹽，糖酸鹽，甲酸鹽，苯甲酸鹽，谷氨酸鹽，甲磺酸鹽，乙磺酸鹽，苯磺酸鹽，對甲苯磺酸鹽和撲酸鹽(即1,1’-亞甲基-雙-(2-羥基-3-萘甲酸鹽))。藥學(xué)可接受鹽可能牽涉包含另一種分子，諸如乙酸鹽離子，琥珀酸鹽離子或其它抗衡離子。抗衡離子可以是穩(wěn)定母體化合物電荷的任何有機或無機模塊。另外，藥學(xué)可接受鹽可以在其結(jié)構(gòu)中具有超過一種帶電荷原子。在多種帶電荷原子作為藥學(xué)可接受鹽的組成部分的情況中可以具有多種抗衡離子。因此，藥學(xué)可接受鹽可具有一種或多種帶電荷原子和/或一種或多種抗衡離子?！八帉W(xué)可接受溶劑化物”指一個或多個溶劑分子和adc的結(jié)合。形成藥學(xué)可接受溶劑化物的溶劑的例子包括但不限于水，異丙醇，乙醇，甲醇，dmso，乙酸乙酯，乙酸和乙醇胺。半胱氨酸改造抗體本發(fā)明的化合物包括半胱氨酸改造抗體，其中野生型或親本抗體中的一個或多個氨基酸被半胱氨酸氨基酸(即“改造的半胱氨酸”)替換(即“替代”或“突變”)。由此可以改造任意形式的抗體，即使其突變。例如，可以改造親代單克隆抗體以形成“thiomabtm抗體”?！皌hiomabtm抗體的一個例子是具有改造的半胱氨酸的抗體片段(即fab)。這種fab“thiomabtm抗體可以稱作“thiofab”。應(yīng)注意單一位點突變在thiofab中產(chǎn)生單一改造的半胱氨酸殘基(singleengineeredcysteineresidue)，而單一位點突變在thiomabtm抗體中產(chǎn)生兩個改造的半胱氨酸殘基，這是因igg抗體的二聚化特性所致。對具有改造的半胱氨酸(cys)殘基的突變體評價新引入的改造的半胱氨酸硫醇基團的反應(yīng)性。硫醇反應(yīng)性值為0至1.0范圍中的相對數(shù)值范圍并且可以測量任意半胱氨酸改造抗體的該值。本發(fā)明的半胱氨酸改造抗體的硫醇反應(yīng)性值在0.0至1.0的范圍中。具體而言，本發(fā)明的半胱氨酸改造抗體的硫醇反應(yīng)性值在0.1至1.0的范圍中。在某些實施方案中，本發(fā)明的半胱氨酸改造抗體的硫醇反應(yīng)性值在0.0至0.1，0.1至0.5，0.1至0.6，0.1至0.7，0.1至0.8，0.1至0.9，或0.1至1.0的范圍中。在某些實施方案中，本發(fā)明的半胱氨酸改造抗體的硫醇反應(yīng)性值在0.2至1.0，0.3至1.0，0.4至1.0，0.5至1.0，0.6至1.0，0.7至1.0，或0.8至1.0的范圍中。在某些實施方案中，本發(fā)明的半胱氨酸改造抗體的硫醇反應(yīng)性值在0.6至1.0的范圍中。在某些實施方案中，本發(fā)明的半胱氨酸改造抗體的硫醇反應(yīng)性值在0.7至1.0的范圍中。在某些實施方案中，本發(fā)明的半胱氨酸改造抗體的硫醇反應(yīng)性值在0.8至1.0的范圍中。在某些實施方案中，本發(fā)明的半胱氨酸改造抗體的硫醇反應(yīng)性值在0.5至0.8的范圍中。在某些實施方案中，本發(fā)明的半胱氨酸改造抗體的硫醇反應(yīng)性值在0.5至0.9的范圍中。在某些實施方案中，本發(fā)明的半胱氨酸改造抗體的硫醇反應(yīng)性值在0.5至0.7的范圍中。在某些實施方案中，本發(fā)明的半胱氨酸改造抗體的硫醇反應(yīng)性值在0.5至1.0的范圍中。本發(fā)明的設(shè)計，選擇和制備方法能夠使半胱氨酸改造抗體能夠與親電子官能基(functionability)反應(yīng)。這些方法進一步能夠形成抗體綴合物化合物，諸如抗體-藥物綴合物(adc)化合物，在指定，設(shè)計，選擇的位點上具有藥物分子?？贵w表面上的反應(yīng)性半胱氨酸殘基能夠通過硫醇反應(yīng)基，諸如馬來酰亞胺或鹵代乙?；禺愋缘鼐Y合藥物模塊。cys殘基的硫醇官能基與馬來酰亞胺基的親核反應(yīng)性約高于蛋白質(zhì)中任意其它氨基酸官能基，諸如賴氨酸殘基的氨基或n-末端氨基約1000倍。碘乙酰試劑和馬來酰亞胺試劑中的硫醇特異性官能基可以與胺基反應(yīng)，但需要更高的ph(>9.0)和更長的反應(yīng)時間(garman,1997,non-radioactivelabelling:apracticalapproach,academicpress,london)。本發(fā)明半胱氨酸改造抗體優(yōu)選保持其野生型親本抗體對應(yīng)物的抗原結(jié)合能力。因此，半胱氨酸改造抗體能夠結(jié)合，優(yōu)選特異性結(jié)合抗原。這類抗原包括：例如腫瘤相關(guān)抗原(taa)，細胞表面受體蛋白和其它細胞表面分子，跨膜蛋白，信號傳導(dǎo)蛋白，細胞存活調(diào)節(jié)因子，細胞增殖調(diào)節(jié)因子，與組織發(fā)育或分化相關(guān)(例如，已知或懷疑在功能上相關(guān))的分子，淋巴因子，細胞因子，涉及細胞周期調(diào)節(jié)的分子，涉及血管發(fā)生的分子和與血管發(fā)生相關(guān)(例如，已知或懷疑在功能上相關(guān))的分子。腫瘤相關(guān)抗原可以為分化簇因子(即cd蛋白)。能夠結(jié)合半胱氨酸改造抗體的抗原可以為上述類型之一的亞組中的成員，其中所述類型中另一亞組包含具有不同特性的其它分子/抗原(就所關(guān)注的抗原而言)。親本抗體還可以為選自如上所述的us5821337的表3中所述的humab4d5-1，humab4d5-2，humab4d5-3，humab4d5-4，humab4d5-5，humab4d5-6，humab4d5-7和humab4d5-8(曲妥珠單抗,)的人源化抗體，特別將該文獻引入本文作為參考；人源化520c9(wo93/21319)和如本文所述的人源化2c4抗體。本發(fā)明的半胱氨酸改造抗體可以位點-特異性和有效地與硫醇-反應(yīng)試劑偶聯(lián)。硫醇-反應(yīng)試劑可以為多官能接頭試劑(multifunctionallinkerreagent)；捕捉物，即親和，標記試劑(例如生物素-接頭試劑)；檢測標記物(例如熒光團試劑)；固相固定化試劑(例如sepharosetm，聚苯乙烯或玻璃)或藥物-接頭中間體(drug-linkerintermediate)。硫醇-反應(yīng)試劑的一個實例為n-乙基馬來酰亞胺(nem)。在一個典型的實施方案中，thiomabtm抗體與生物素-接頭試劑反應(yīng)得到生物素化的thiomabtm抗體，通過這種方式可以檢測和測定改造的半胱氨酸殘基的存在和反應(yīng)性。thiomabtm抗體與多官能接頭試劑反應(yīng)得到帶有可以與藥物模塊試劑或其它標記進一步反應(yīng)的官能化接頭的thiomabtm抗體。thiomabtm抗體與藥物-接頭中間體反應(yīng)得到thiomabtm抗體-藥物綴合物。在某些實施方案中，thiomabtm抗體為thiofab。本文所述的典型方法一般可以應(yīng)用于鑒定和生產(chǎn)抗體，并且更一般地通過使用本文所述的設(shè)計和篩選步驟用于其它蛋白質(zhì)。這類手段可以應(yīng)用于綴合其它硫醇反應(yīng)試劑，其中反應(yīng)基為例如馬來酰亞胺，碘乙酰胺，吡啶基二硫化物或其它硫醇反應(yīng)綴合配偶體(haugland,2003,molecularprobeshandbookoffluorescentprobesandresearchchemicals,molecularprobes,inc.；brinkley,1992,bioconjugatechem.3:2；garman,1997,non-radioactivelabelling:apracticalapproach,academicpress,london；means(1990)bioconjugatechem.1:2；hermanson,g.inbioconjugatetechniques(1996)academicpress,sandiego,pp.40-55,643-671)。所述的配偶體可以為細胞毒性劑(例如毒素，諸如多柔比星(doxorubicin)或百日咳毒素)；熒光團，諸如熒光染料類熒光素或若丹明；用于成像的螯合劑或放射性治療金屬；肽基或非-肽基標記或檢測標記；或清除-改進劑(clearance-modifyingagent)，諸如聚乙二醇的不同異構(gòu)體；結(jié)合第三種成分的肽或另一種碳水化合物或親脂性試劑。在本文典型抗體hu4d5上鑒定的位點主要位于抗體的恒定域中，其在所有抗體種類之間為充分保守的。這些位點可廣泛適用于其它抗體，而無需進一步進行結(jié)構(gòu)設(shè)計或有關(guān)特異性抗體結(jié)構(gòu)的知識，并且不會干擾對抗體可變域而言固有的抗原結(jié)合特性?？梢杂糜谥委煱┌Y的半胱氨酸改造抗體包括，但不限于針對細胞表面受體和腫瘤相關(guān)抗原(taa)的抗體。這類抗體可以用作裸抗體(未與藥物或標記模塊綴合)或用作式i抗體-藥物綴合物(adc)。腫瘤相關(guān)抗原為本領(lǐng)域中公知的并且可以制備它們以便用于使用本領(lǐng)域眾所周知的方法和信息生產(chǎn)抗體。在發(fā)現(xiàn)用于癌癥診斷和療法的有效細胞靶標的嘗試中，研究人員尋求鑒定與一種或多種正常非癌細胞相比在一種或多種特定類型的癌細胞表面上特異性表達的跨膜多肽，或腫瘤相關(guān)多肽。與非癌細胞表面上相比，通常這類腫瘤相關(guān)多肽更大量地在癌細胞表面上表達。對這類腫瘤相關(guān)細胞表面抗原多肽的鑒定已經(jīng)使人們能夠特異性靶向癌細胞，通過基于抗體的療法對其進行破壞。taa的實例包括，但不限于下述taa(1)-(53)。為方便起見，均為本領(lǐng)域公知的有關(guān)這些抗原的信息如下所列，并且按照nationalcenterforbiotechnologyinformation(ncbi)的核酸和蛋白質(zhì)序列鑒定規(guī)定，包括名稱，可選擇的名稱，genbank登記號和主要參考文獻。相當(dāng)于taa(1)-(53)的核酸和蛋白質(zhì)序列可以在公共數(shù)據(jù)庫，諸如genbank中獲得。由抗體靶向的腫瘤相關(guān)抗原包括所有氨基酸序列變體和同種型，它們與引述的參考文獻中鑒定的序列相比具有至少約70％，80％，85％，90％或95％序列同一性，或表現(xiàn)出基本上與具有引述參考文獻中發(fā)現(xiàn)的序列的taa相同的生物特性或特征。例如，具有變體序列的taa一般能夠特異性結(jié)合與文獻中所示相應(yīng)序列taa特異性結(jié)合的抗體。特別將本文特別引述的參考文獻中的序列和披露內(nèi)容引入作為參考。腫瘤相關(guān)抗原(1)-(53)：(1)bmpr1b(骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體-ib型(bonemorphogeneticreceptor-typeib),genbank登記號nm_001203)tendijke,p.,等science264(5155):101-104(1994),oncogene14(11):1377-1382(1997))；wo2004063362(權(quán)利要求2)；wo2003042661(權(quán)利要求12)；us2003134790-a1(38-39頁)；wo2002102235(權(quán)利要求13；頁296)；wo2003055443(91-92頁)；wo200299122(實施例2；528-530頁)；wo2003029421(權(quán)利要求6)；wo2003024392(權(quán)利要求2；附圖112)；wo200298358(權(quán)利要求1；183頁)；wo200254940(100-101頁)；wo200259377(349-350頁)；wo200230268(權(quán)利要求27；376頁)；wo200148204(實施例；附圖4)；np_001194骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體,ib型/pid＝np_001194.1.交叉參考:mim:603248；np_001194.1；ay065994(2)e16(lat1,slc7a5,genbank登記號nm_003486)biochem.biophys.res.commun.255(2),283-288(1999),nature395(6699):288-291(1998),gaugitsch,h.w.,等(1992)j.biol.chem.267(16):11267-11273)；wo2004048938(實施例2)；wo2004032842(實施例iv)；wo2003042661(權(quán)利要求12)；wo2003016475(權(quán)利要求1)；wo200278524(實施例2)；wo200299074(權(quán)利要求19；頁127-129)；wo200286443(權(quán)利要求27；222,393頁)；wo2003003906(權(quán)利要求10；293頁)；wo200264798(權(quán)利要求33；頁93-95)；wo200014228(權(quán)利要求5；133-136頁)；us2003224454(附圖3)；wo2003025138(權(quán)利要求12；150頁)；np_003477溶質(zhì)載體家族7(solutecarrierfamily7)(陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白(cationicaminoacidtransporter),y+系統(tǒng)),成員5/pid＝np_003477.3-人類；交叉參考:mim:600182；np_003477.3；nm_015923；nm_003486_1(3)steap1(前列腺的六次跨膜上皮抗原(sixtransmembraneepithelialantigenofprostate),genbank登記號nm_012449)；cancerres.61(15),5857-5860(2001),hubert,r.s.,等(1999)proc.natl.acad.sci.u.s.a.96(25):14523-14528)；wo2004065577(權(quán)利要求6)；wo2004027049(附圖1l)；ep1394274(實施例11)；wo2004016225(權(quán)利要求2)；wo2003042661(權(quán)利要求12)；us2003157089(實施例5)；us2003185830(實施例5)；us2003064397(附圖2)；wo200289747(實施例5；頁618-619)；wo2003022995(實施例9；附圖13a,實施例53；173頁,實施例2；附圖2a)；np_036581前列腺的六次跨膜上皮抗原；交叉參考:mim:604415；np_036581.1；nm_012449_1(4)0772p(ca125,muc16,genbank登記號af361486)；j.biol.chem.276(29):27371-27375(2001))；wo2004045553(權(quán)利要求14)；wo200292836(權(quán)利要求6；附圖12)；wo200283866(權(quán)利要求15；116-121頁)；us2003124140(實施例16)；交叉參考：gi:34501467；aak74120.3；af361486_1(5)mpf(mpf,msln,smr,巨核細胞強化因子(megakaryocytepotentiatingfactor),mesothelin,genbank登記號nm_005823)yamaguchi,n.,等biol.chem.269(2),805-808(1994),proc.natl.acad.sci.u.s.a.96(20):11531-11536(1999),proc.natl.acad.sci.u.s.a.93(1):136-140(1996),j.biol.chem.270(37):21984-21990(1995))；wo2003101283(權(quán)利要求14)；(wo2002102235(權(quán)利要求13；287-288頁)；wo2002101075(權(quán)利要求4；頁308-309)；wo200271928(320-321頁)；wo9410312(52-57頁)；交叉參考:mim:601051；np_005814.2；nm_005823_1(6)napi3b(也稱作napi2b)(napi-3b,nptiib,slc34a2,溶質(zhì)載體家族(solutecarrierfamily)34(磷酸鈉),成員2,ii型鈉依賴性磷酸轉(zhuǎn)運蛋白3b,genbank登記號nm_006424)j.biol.chem.277(22):19665-19672(2002),genomics62(2):281-284(1999),feild,j.a.,等(1999)biochem.biophys.res.commun.258(3):578-582)；wo2004022778(權(quán)利要求2)；ep1394274(實施例11)；wo2002102235(權(quán)利要求13；326頁)；ep875569(權(quán)利要求1；17-19頁)；wo200157188(權(quán)利要求20；329頁)；wo2004032842(實施例iv)；wo200175177(權(quán)利要求24；139-140頁)；交叉參考:mim:604217；np_006415.1；nm_006424_1(7)sema5b(flj10372,kiaa1445,mm.42015,sema5b,semag,腦信號蛋白(semaphorin)5bhlog,sema結(jié)構(gòu)域,七次血小板反應(yīng)蛋白重復(fù)(seventhrombospondinrepeats)(1型(type1)和類1型(type1-like)),跨膜域(tm)和短胞質(zhì)域,(腦信號蛋白)5b,genbank登記號ab040878)；nagaset.,等(2000)dnares.7(2):143-150)；wo2004000997(權(quán)利要求1)；wo2003003984(權(quán)利要求1)；wo200206339(權(quán)利要求1；50頁)；wo200188133(權(quán)利要求1；頁41-43,48-58)；wo2003054152(權(quán)利要求20)；wo2003101400(權(quán)利要求11)；登記號:q9p283；embl；ab040878；baa95969.1.genew；hgnc:10737(8)pscahlg(2700050c12rik,c530008o16rik,rikencdna2700050c12,rikencdna2700050c12基因,genbank登記號ay358628)；ross等(2002)cancerres.62:2546-2553；us2003129192(權(quán)利要求2)；us2004044180(權(quán)利要求12)；us2004044179(權(quán)利要求11)；us2003096961(權(quán)利要求11)；us2003232056(實施例5)；wo2003105758(權(quán)利要求12)；us2003206918(實施例5)；ep1347046(權(quán)利要求1)；wo2003025148(權(quán)利要求20)；交叉參考:gi:37182378；aaq88991.1；ay358628_1(9)etbr(內(nèi)皮縮血管肽b型受體(endothelintypebreceptor),genbank登記號ay275463)；nakamutam.,等biochem.biophys.res.commun.177,34-39,1991；ogaway.,等biochem.biophys.res.commun.178,248-255,1991；araih.,等jpn.circ.j.56,1303-1307,1992；araih.,等j.biol.chem.268,3463-3470,1993；sakamotoa.,yanagisawam.,等biochem.biophys.res.commun.178,656-663,1991；elshourbagyn.a.,等j.biol.chem.268,3873-3879,1993；haendlerb.,等j.cardiovasc.pharmacol.20,s1-s4,1992；tsutsumim.,等gene228,43-49,1999；strausbergr.l.,等proc.natl.acad.sci.u.s.a.99,16899-16903,2002；bourgeoisc.,等j.clin.endocrinol.metab.82,3116-3123,1997；okamotoy.,等biol.chem.272,21589-21596,1997；verheijj.b.,等am.j.med.genet.108,223-225,2002；hofstrar.m.w.,等eur.j.hum.genet.5,180-185,1997；puffenbergere.g.,等cell79,1257-1266,1994；attiet.,etal,hum.mol.genet.4,2407-2409,1995；auricchioa.,等hum.mol.genet.5:351-354,1996；amielj.,等hum.mol.genet.5,355-357,1996；hofstrar.m.w.,等nat.genet.12,445-447,1996；svenssonp.j.,等hum.genet.103,145-148,1998；fuchss.,等mol.med.7,115-124,2001；pingaultv.,等(2002)hum.genet.111,198-206；wo2004045516(權(quán)利要求1)；wo2004048938(實施例2)；wo2004040000(權(quán)利要求151)；wo2003087768(權(quán)利要求1)；wo2003016475(權(quán)利要求1)；wo2003016475(權(quán)利要求1)；wo200261087(附圖1)；wo2003016494(附圖6)；wo2003025138(權(quán)利要求12；144頁)；wo200198351(權(quán)利要求1；頁124-125)；ep522868(權(quán)利要求8；附圖2)；wo200177172(權(quán)利要求1；頁297-299)；us2003109676；us6518404(附圖3)；us5773223(權(quán)利要求1a；col31-34)；wo2004001004(10)msg783(rnf124,推定蛋白(hypotheticalprotein)flj20315,genbank登記號nm_017763)；wo2003104275(權(quán)利要求1)；wo2004046342(實施例2)；wo2003042661(權(quán)利要求12)；wo2003083074(權(quán)利要求14；頁61)；wo2003018621(權(quán)利要求1)；wo2003024392(權(quán)利要求2；附圖93)；wo200166689(實施例6)；交叉參考:locusid:54894；np_060233.2；nm_017763_1(11)steap2(hgnc_8639,ipca-1,pcanap1,stamp1,steap2,stmp,前列腺癌相關(guān)基因1,前列腺癌相關(guān)蛋白1,前列腺的六次跨膜上皮抗原2,六次跨膜前列腺蛋白,genbank登記號af455138)；lab.invest.82(11):1573-1582(2002))；wo2003087306；us2003064397(權(quán)利要求1；附圖1)；wo200272596(權(quán)利要求13；頁54-55)；wo200172962(權(quán)利要求1；附圖4b)；wo2003104270(權(quán)利要求11)；wo2003104270(權(quán)利要求16)；us2004005598(權(quán)利要求22)；wo2003042661(權(quán)利要求12)；us2003060612(權(quán)利要求12；附圖10)；wo200226822(權(quán)利要求23；附圖2)；wo200216429(權(quán)利要求12；附圖10)；交叉參考:gi:22655488；aan04080.1；af455138_1(12)trpm4(br22450,flj20041,trpm4,trpm4b,瞬時型受體電位陽離子通道(transientreceptorpotentialcationchannel),亞族m,成員4,genbank登記號nm_017636)；xu,x.z.,等proc.natl.acad.sci.u.s.a.98(19):10692-10697(2001),cell109(3):397-407(2002),j.biol.chem.278(33):30813-30820(2003))；us2003143557(權(quán)利要求4)；wo200040614(權(quán)利要求14；頁100-103)；wo200210382(權(quán)利要求1；附圖9a)；wo2003042661(權(quán)利要求12)；wo200230268(權(quán)利要求27；391頁)；us2003219806(權(quán)利要求4)；wo200162794(權(quán)利要求14；附圖1a-d)；交叉參考:mim:606936；np_060106.2；nm_017636_1(13)cripto(cr,cr1,crgf,cripto,tdgf1,畸胎瘤-衍生的生長因子(teratocarcinoma-derivedgrowthfactor),genbank登記號np_003203或nm_003212)；ciccodicola,a.,等emboj.8(7):1987-1991(1989),am.j.hum.genet.49(3):555-565(1991))；us2003224411(權(quán)利要求1)；wo2003083041(實施例1)；wo2003034984(權(quán)利要求12)；wo200288170(權(quán)利要求2；頁52-53)；wo2003024392(權(quán)利要求2；附圖58)；wo200216413(權(quán)利要求1；頁94-95,105)；wo200222808(權(quán)利要求2；附圖1)；us5854399(實施例2；col17-18)；us5792616(附圖2)；交叉參考:mim:187395；np_003203.1；nm_003212_1(14)cd21(cr2(補體受體2)或c3dr(c3d/eb病毒受體(epsteinbarrvirusreceptor))或hs.73792genbank登記號m26004)；fujisaku等(1989)j.biol.chem.264(4):2118-2125)；weisj.j.,等j.exp.med.167,1047-1066,1988；moorem.,等proc.natl.acad.sci.u.s.a.84,9194-9198,1987；barelm.,等mol.immunol.35,1025-1031,1998；weisj.j.,等proc.natl.acad.sci.u.s.a.83,5639-5643,1986；sinhas.k.,等(1993)j.immunol.150,5311-5320；wo2004045520(實施例4)；us2004005538(實施例1)；wo2003062401(權(quán)利要求9)；wo2004045520(實施例4)；wo9102536(附圖9.1-9.9)；wo2004020595(權(quán)利要求1)；登記號:p20023；q13866；q14212；embl；m26004；aaa35786.1(15)cd79b(cd79b,cd79β,igb(免疫球蛋白相關(guān)β,b29,genbank登記號nm_000626或11038674)；proc.natl.acad.sci.u.s.a.(2003)100(7):4126-4131,blood(2002)100(9):3068-3076,muller等(1992)eur.j.immunol.22(6):1621-1625)；wo2004016225(權(quán)利要求2,附圖140)；wo2003087768,us2004101874(權(quán)利要求1,頁102)；wo2003062401(權(quán)利要求9)；wo200278524(實施例2)；us2002150573(權(quán)利要求5,頁15)；us5644033；wo2003048202(權(quán)利要求1,306和309頁)；wo99/558658,us6534482(權(quán)利要求13,附圖17a/b)；wo200055351(權(quán)利要求11,1145-1146頁)；交叉參考:mim:147245；np_000617.1；nm_000626_1(16)fcrh2(ifgp4,irta4,spap1a(含有sh2結(jié)構(gòu)域的磷酸酶錨定蛋白1a(sh2domaincontainingphosphataseanchorprotein1a),spap1b,spap1c,genbank登記號nm_030764,ay358130)；genomeres.13(10):2265-2270(2003),immunogenetics54(2):87-95(2002),blood99(8):2662-2669(2002),proc.natl.acad.sci.u.s.a.98(17):9772-9777(2001),xu,m.j.,等(2001)biochem.biophys.res.commun.280(3):768-775；wo2004016225(權(quán)利要求2)；wo2003077836；wo200138490(權(quán)利要求5；附圖18d-1-18d-2)；wo2003097803(權(quán)利要求12)；wo2003089624(權(quán)利要求25)；交叉參考:mim:606509；np_110391.2；nm_030764_1(17)her2(erbb2,genbank登記號m11730)；coussensl.,等science(1985)230(4730):1132-1139)；yamamotot.,等nature319,230-234,1986；sembak.,等proc.natl.acad.sci.u.s.a.82,6497-6501,1985；swierczj.m.,等j.cellbiol.165,869-880,2004；kuhnsj.j.,等j.biol.chem.274,36422-36427,1999；choh.-s.,等nature421,756-760,2003；ehsania.,等(1993)genomics15,426-429；wo2004048938(實施例2)；wo2004027049(附圖1i)；wo2004009622；wo2003081210；wo2003089904(權(quán)利要求9)；wo2003016475(權(quán)利要求1)；us2003118592；wo2003008537(權(quán)利要求1)；wo2003055439(權(quán)利要求29；附圖1a-b)；wo2003025228(權(quán)利要求37；附圖5c)；wo200222636(實施例13；95-107頁)；wo200212341(權(quán)利要求68；附圖7)；wo200213847(71-74頁)；wo200214503(頁114-117)；wo200153463(權(quán)利要求2；41-46頁)；wo200141787(15頁)；wo200044899(權(quán)利要求52；附圖7)；wo200020579(權(quán)利要求3；附圖2)；us5869445(權(quán)利要求3；col31-38)；wo9630514(權(quán)利要求2；頁56-61)；ep1439393(權(quán)利要求7)；wo2004043361(權(quán)利要求7)；wo2004022709；wo200100244(實施例3；附圖4)；登記號:p04626；embl；m11767；aaa35808.1.embl；m11761；aaa35808.1(18)nca(ceacam6,genbank登記號m18728)；barnettt.,等genomics3,59-66,1988；tawaragiy.,等biochem.biophys.res.commun.150,89-96,1988；strausbergr.l.,等proc.natl.acad.sci.u.s.a.99:16899-16903,2002；wo2004063709；ep1439393(權(quán)利要求7)；wo2004044178(實施例4)；wo2004031238；wo2003042661(權(quán)利要求12)；wo200278524(實施例2)；wo200286443(權(quán)利要求27；頁427)；wo200260317(權(quán)利要求2)；登記號:p40199；q14920；embl；m29541；aaa59915.1.embl；m18728(19)mdp(dpep1,genbank登記號bc017023)；proc.natl.acad.sci.u.s.a.99(26):16899-16903(2002))；wo2003016475(權(quán)利要求1)；wo200264798(權(quán)利要求33；85-87頁)；jp05003790(附圖6-8)；wo9946284(附圖9)；交叉參考:mim:179780；aah17023.1；bc017023_1(20)il20rα(il20ra,zcytor7,genbank登記號af184971)；clarkh.f.,等genomeres.13,2265-2270,2003；mungalla.j.,等nature425,805-811,2003；blumbergh.,等cell104,9-19,2001；dumoutierl.,等j.immunol.167,3545-3549,2001；parrish-novakj.,等j.biol.chem.277,47517-47523,2002；pletnevs.,等(2003)biochemistry42:12617-12624；sheikhf.,等(2004)j.immunol.172,2006-2010；ep1394274(實施例11)；us2004005320(實施例5)；wo2003029262(74-75頁)；wo2003002717(權(quán)利要求2；63頁)；wo200222153(45-47頁)；us2002042366(20-21頁)；wo200146261(57-59頁)；wo200146232(63-65頁)；wo9837193(權(quán)利要求1；55-59頁)；登記號：q9uhf4；q6uwa9；q96sh8；embl；af184971；aaf01320.1(21)brevican(bcan,behab,genbank登記號af229053)；garys.c.,等gene256,139-147,2000；clarkh.f.,等genomeres.13,2265-2270,2003；strausbergr.l.,等proc.natl.acad.sci.u.s.a.99,16899-16903,2002；us2003186372(權(quán)利要求11)；us2003186373(權(quán)利要求11)；us2003119131(權(quán)利要求1；附圖52)；us2003119122(權(quán)利要求1；附圖52)；us2003119126(權(quán)利要求1)；us2003119121(權(quán)利要求1；附圖52)；us2003119129(權(quán)利要求1)；us2003119130(權(quán)利要求1)；us2003119128(權(quán)利要求1；附圖52)；us2003119125(權(quán)利要求1)；wo2003016475(權(quán)利要求1)；wo200202634(權(quán)利要求1)(22)ephb2r(drt,erk,hek5,epht3,tyro5,genbank登記號nm_004442)；chan,j.和watt,v.m.,oncogene6(6),1057-1061(1991)oncogene10(5):897-905(1995),annu.rev.neurosci.21:309-345(1998),int.rev.cytol.196:177-244(2000))；wo2003042661(權(quán)利要求12)；wo200053216(權(quán)利要求1；頁41)；wo2004065576(權(quán)利要求1)；wo2004020583(權(quán)利要求9)；wo2003004529(128-132頁)；wo200053216(權(quán)利要求1；42頁)；交叉參考:mim:600997；np_004433.2；nm_004442_1(23)aslg659(b7h,genbank登記號ax092328)；us20040101899(權(quán)利要求2)；wo2003104399(權(quán)利要求11)；wo2004000221(附圖3)；us2003165504(權(quán)利要求1)；us2003124140(實施例2)；us2003065143(附圖60)；wo2002102235(權(quán)利要求13；299頁)；us2003091580(實施例2)；wo200210187(權(quán)利要求6；附圖10)；wo200194641(權(quán)利要求12；附圖7b)；wo200202624(權(quán)利要求13；附圖1a-1b)；us2002034749(權(quán)利要求54；45-46頁)；wo200206317(實施例2；320-321頁,權(quán)利要求34；321-322頁)；wo200271928(468-469頁)；wo200202587(實施例1；附圖1)；wo200140269(實施例3；頁190-192)；wo200036107(實施例2；205-207頁)；wo2004053079(權(quán)利要求12)；wo2003004989(權(quán)利要求1)；wo200271928(233-234,452-453頁)；wo0116318(24)psca(前列腺干細胞抗原前體(prostatestemcellprecursor),genbank登記號aj297436)；reiterr.e.,等proc.natl.acad.sci.u.s.a.95,1735-1740,1998；guz.,等oncogene19,1288-1296,2000；biochem.biophys.res.commun.(2000)275(3):783-788；wo2004022709；ep1394274(實施例11)；us2004018553(權(quán)利要求17)；wo2003008537(權(quán)利要求1)；wo200281646(權(quán)利要求1；頁164)；wo2003003906(權(quán)利要求10；頁288)；wo200140309(實施例1；附圖17)；us2001055751(實施例1；附圖1b)；wo200032752(權(quán)利要求18；附圖1)；wo9851805(權(quán)利要求17；頁97)；wo9851824(權(quán)利要求10；94頁)；wo9840403(權(quán)利要求2；附圖1b)；登記號:o43653；embl；af043498；aac39607.1(25)geda(genbank登記號ay260763)；aap14954脂肪瘤hmgic融合-配偶體-類蛋白(lipomahmgicfusion-partner-likeprotein)/pid＝aap14954.1-人類(人)；wo2003054152(權(quán)利要求20)；wo2003000842(權(quán)利要求1)；wo2003023013(實施例3,權(quán)利要求20)；us2003194704(權(quán)利要求45)；交叉參考:gi:30102449；aap14954.1；ay260763_1(26)baff-r(b細胞活化因子受體,blys受體3,br3,genbank登記號af116456)；baff受體/pid＝np_443177.1-人類：thompson,j.s.,等science293(5537),2108-2111(2001)；wo2004058309；wo2004011611；wo2003045422(實施例；32-33頁)；wo2003014294(權(quán)利要求35；附圖6b)；wo2003035846(權(quán)利要求70；615-616頁)；wo200294852(col136-137)；wo200238766(權(quán)利要求3；133頁)；wo200224909(實施例3；附圖3)；交叉參考:mim:606269；np_443177.1；nm_052945_1；af132600(27)cd22(b細胞受體cd22-b同種型,bl-cam,lyb-8,lyb8,siglec-2,flj22814,genbank登記號ak026467)；wilson等(1991)j.exp.med.173:137-146；wo2003072036(權(quán)利要求1；附圖1)；交叉參考:mim:107266；np_001762.1；nm_001771_1(28)cd79a(cd79a，cd79α，免疫球蛋白相關(guān)α，一種b細胞特異性蛋白，其與igβ(cd79b)共價相互作用并且在表面上與igm分子形成復(fù)合物，轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及b細胞分化的信號),pi:4.84,mw:25028tm:2[p]genechromosome:19q13.2,genbank登記號np_001774.10)；wo2003088808,us20030228319；wo2003062401(權(quán)利要求9)；us2002150573(權(quán)利要求4,13-14頁)；wo9958658(權(quán)利要求13,附圖16)；wo9207574(附圖1)；us5644033；ha等(1992)j.immunol.148(5):1526-1531；mueller等(1992)eur.j.biochem.22:1621-1625；hashimoto等(1994)immunogenetics40(4):287-295；preud’homme等(1992)clin.exp.immunol.90(1):141-146；yu等(1992)j.immunol.148(2)633-637；sakaguchi等(1988)emboj.7(11):3457-3464(29)cxcr5(伯基特氏淋巴瘤受體1(burkitt’slymphomareceptor1)，一種g蛋白偶聯(lián)受體，由cxcl13趨化因子活化，在淋巴細胞遷移和體液防御中起作用，在hiv-2感染中起作用和可能在aids，淋巴瘤，黑素瘤和白血病發(fā)生中起作用)；372aa,pi:8.54mw:41959tm:7[p]genechromosome:11q23.3,genbank登記號np_001707.1)；wo2004040000；wo2004015426；us2003105292(實施例2)；us6555339(實施例2)；wo200261087(附圖1)；wo200157188(權(quán)利要求20,頁269)；wo200172830(12-13頁)；wo200022129(實施例1,152-153頁,實施例2,254-256頁)；wo9928468(權(quán)利要求1,頁38)；us5440021(實施例2,col49-52)；wo9428931(56-58頁)；wo9217497(權(quán)利要求7,附圖5)；dobner等(1992)eur.j.immunol.22:2795-2799；barella等(1995)biochem.j.309:773-779(30)hla-dob(mhcii類分子的β亞基(ia抗原)，其與肽結(jié)合并且將其呈遞給cd4+t淋巴細胞)；273aa,pi:6.56,mw:30820.tm:1[p]genechromosome:6p21.3,genbank登記號np_002111.1)；tonnelle等(1985)emboj.4(11):2839-2847；jonsson等(1989)immunogenetics29(6):411-413；beck等(1992)j.mol.biol.228:433-441；strausberg等(2002)proc.natl.acad.sciusa99:16899-16903；servenius等(1987)j.biol.chem.262:8759-8766；beck等(1996)j.mol.biol.255:1-13；naruse等(2002)tissueantigens59:512-519；wo9958658(權(quán)利要求13,附圖15)；us6153408(col35-38)；us5976551(col168-170)；us6011146(col145-146)；kasahara等(1989)immunogenetics30(1):66-68；larhammar等(1985)j.biol.chem.260(26):14111-14119(31)p2x5(嘌呤能受體p2x配體門控離子通道5(purinergicreceptorp2xligand-gatedionchannel5)，即由胞外atp門控的離子通道，可能涉及突觸傳遞和神經(jīng)發(fā)生，其缺陷可以促使特發(fā)性逼尿肌不穩(wěn)定病理生理學(xué)情況)；422aa),pi:7.63,mw:47206tm:1[p]genechromosome:17p13.3,genbank登記號np_002552.2)；le等(1997)febslett.418(1-2):195-199；wo2004047749；wo2003072035(權(quán)利要求10)；touchman等(2000)genomeres.10:165-173；wo200222660(權(quán)利要求20)；wo2003093444(權(quán)利要求1)；wo2003087768(權(quán)利要求1)；wo2003029277(82頁)；(32)cd72(b細胞分化抗原cd72,lyb-2)；359aa,pi:8.66,mw:40225tm:1[p]genechromosome:9p13.3,genbank登記號np_001773.1)；wo2004042346(權(quán)利要求65)；wo2003026493(51-52,57-58頁)；wo200075655(105-106頁)；vonhoegen等(1990)j.immunol.144(12):4870-4877；strausberg等(2002)proc.natl.acad.sciusa99:16899-16903(33)ly64(淋巴細胞抗原64(rp105)，即富含亮氨酸重復(fù)(lrr)家族i型膜蛋白(typeimemberaneproteinoftheleucinerichrepeatfamily)，調(diào)節(jié)b細胞細胞活化和程序性細胞死亡，其功能缺失與患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡的患者的疾病活動增加有關(guān))；661aa,pi:6.20,mw:74147tm:1[p]genechromosome:5q12,genbank登記號np_005573.1)；us2002193567；wo9707198(權(quán)利要求11,39-42頁)；miura等(1996)genomics38(3):299-304；miura等(1998)blood92:2815-2822；wo2003083047；wo9744452(權(quán)利要求8,57-61頁)；wo200012130(24-26頁)(34)fcrh1(fc受體-樣蛋白1(fcreceptor-likeprotein1)，即含有c2型ig-樣結(jié)構(gòu)域和itam結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白fc結(jié)構(gòu)域的推定受體，可能在b-淋巴細胞分化中起作用)；429aa,pi:5.28,mw:46925tm:1[p]genechromosome:1q21-1q22,genbank登記號np_443170.1)；wo2003077836；wo200138490(權(quán)利要求6,附圖18e-1-18-e-2)；davis等(2001)proc.natl.acad.sciusa98(17):9772-9777；wo2003089624(權(quán)利要求8)；ep1347046(權(quán)利要求1)；wo2003089624(權(quán)利要求7)(35)irta2(免疫球蛋白超家族受體易位相關(guān)2，即在b細胞發(fā)育和淋巴瘤的生成中具有可能的作用的推定的免疫受體；由于易位所導(dǎo)致的基因失調(diào)在某些b細胞惡性腫瘤中發(fā)生)；977aa,pi:6.88,mw:106468,tm:1[p]genechromosome:1q21,genbank登記號人:af343662,af343663,af343664,af343665,af369794,af397453,ak090423,ak090475,al834187,ay358085；小鼠:ak089756,ay158090,ay506558；np_112571.1；wo2003024392(權(quán)利要求2,附圖97)；nakayama等(2000)biochem.biophys.res.commun.277(1):124-127；wo2003077836；wo200138490(權(quán)利要求3,附圖18b-1-18b-2)(36)tenb2(tmeff2,tomoregulin,tpef,hpp1,tr,與egf/調(diào)蛋白(heregulin)家族生長因子和卵泡抑素(follistatin)有關(guān)的推定的跨膜蛋白聚糖)；374aa,ncbi登記號:aad55776,aaf91397,aag49451,ncbirefseq:np_057276；ncbi基因:23671；omim:605734；swissprotq9uik5；genbank登記號af179274；ay358907,caf85723,cq782436；wo2004074320；jp2004113151；wo2003042661；wo2003009814；ep1295944(69-70頁)；wo200230268(329頁)；wo200190304；us2004249130；us2004022727；wo2004063355；us2004197325；us2003232350；us2004005563；us2003124579；horie等(2000)genomics67:146-152；uchida等(1999)biochem.biophys.res.commun.266:593-602；liang等(2000)cancerres.60:4907-12；glynne-jones等(2001)intjcancer.oct15；94(2):178-84(37)pmel17(銀同系物；silv；d12s53e；pmel17；si；sil)；me20；gp100)bc001414；bt007202；m32295；m77348；nm_006928；mcglinchey，r.p.等(2009)proc.natl.acad.sci.u.s.a.106(33)，13731-13736；kummer，m.p.等(2009)j.biol.chem.284(4)，2296-2306；(38)tmeff1(具有egf樣和兩個卵泡抑素樣域的跨膜蛋白1；tomoregulin-1)；h7365；c9orf2；c9orf2；u19878；x83961；nm_080655；nm_003692；harms，p.w.(2003)genesdev.17(21)，2624-2629；gery，s.etal(2003)oncogene22(18):2723-2727；(39)gdnf-ra1(gdnf家族受體α1；gfra1；gdnfr；gdnfra；retl1；trnr1；ret1l；gdnfr-α1；gfr-α-1)；u95847；bc014962；nm_145793nm_005264；kim，m.h.等(2009)mol.cell.biol.29(8)，2264-2277；treanor，j.j.等(1996)nature382(6586):80-83；(40)ly6e(淋巴細胞抗原6復(fù)合物，基因座e；ly67,rig-e,sca-2,tsa-1)；np_002337.1；nm_002346.2；denooij-vandalen，a.g.等(2003)int.j.cancer103(6)，768-774；zammit，d.j.等(2002)mol.cell.biol.22(3):946-952；(41)tmem46(shisa同系物2(xenopuslaevis)；shisa2)；np_001007539.1；nm_001007538.1；furushima，k.等(2007)dev.biol.306(2)，480-492；clark，h.f.等(2003)genomeres.13(10):2265-2270；(42)ly6g6d(淋巴細胞抗原6復(fù)合物，基因座g6d；ly6-d，megt1)；np_067079.2；nm_021246.2；mallya，m.等(2002)genomics80(1):113-123；ribas，g.等(1999)j.immunol.163(1):278-287；(43)lgr5(含富亮氨酸重復(fù)的g蛋白偶聯(lián)受體5；gpr49，gpr67)；np_003658.1；nm_003667.2；salanti，g.等(2009)am.j.epidemiol.170(5):537-545；yamamoto，y.等(2003)hepatology37(3):528-533；(44)ret(ret原癌基因；men2a；hscr1；men2b；mtc1；ptc；cdhf12；hs.168114；ret51；ret-ele1)；np_066124.1；nm_020975.4；tsukamoto，h.等(2009)cancersci.100(10):1895-1901；narita，n.等(2009)oncogene28(34):3058-3068；(45)ly6k(淋巴細胞抗原6復(fù)合物，基因座k；ly6k；hsj001348；flj35226)；np_059997.3；nm_017527.3；ishikawa，n.等(2007)cancerres.67(24):11601-11611；denooij-vandalen，a.g.等(2003)int.j.cancer103(6):768-774；(46)gpr19(g蛋白偶聯(lián)受體受體19；mm.4787)；np_006134.1；nm_006143.2；montpetit，a.和sinnett，d.(1999)hum.genet.105(1-2):162-164；o′dowd，b.f.等(1996)febslett.394(3):325-329；(47)gpr54(kiss1受體；kiss1r；gpr54；hot7t175；axor12)；np_115940.2；nm_032551.4；navenot，j.m.等(2009)mol.pharmacol.75(6):1300-1306；hata，k.等(2009)anticancerres.29(2):617-623；(48)asphd1(含天冬氨酸β-羥化酶域的1；loc253982)；np_859069.2；nm_181718.3；gerhard，d.s.等(2004)genomeres.14(10b):2121-2127；(49)酪氨酸酶(tyr；ocaia；oca1a；酪氨酸酶；shep3)；np_000363.1；nm_000372.4；bishop，d.t.等(2009)nat.genet.41(8):920-925；nan，h.等(2009)int.j.cancer125(4):909-917；(50)tmem118(環(huán)指蛋白，跨膜2；rnft2；flj14627)；np_001103373.1；nm_001109903.1；clark，h.f.等(2003)genomeres.13(10):2265-2270；scherer，s.e.等(2006)nature440(7082):346-351(51)gpr172a(g蛋白偶聯(lián)受體172a；gpcr41；flj11856；d15ertd747e)；np_078807.1；nm_024531.3；ericsson，t.a.等(2003)proc.natl.acad.sci.u.s.a.100(11):6759-6764；takeda，s.等(2002)febslett.520(1-3):97-101。(52)cd33，唾液酸結(jié)合性免疫球蛋白樣凝集素家族的成員，是一種67-kda糖基化跨膜蛋白。在定型骨髓單核細胞和紅細胞祖細胞以外，cd33在大多數(shù)髓樣和單核細胞白血病細胞上表達。在最早的多能干細胞，成熟粒細胞，淋巴樣細胞，或非造血細胞上沒有看到它(sabbath等(1985)j.clin.invest.75:756-56；andrews等(1986)blood68:1030-5)。cd33在其胞質(zhì)尾上含有兩個酪氨酸殘基，其中每一個跟著是疏水性殘基，類似于在許多抑制性受體中看到的免疫受體基于酪氨酸的抑制性基序(itim)。(53)cll-1(clec12a，micl，和dcal2)編碼c型凝集素/c型凝集素樣域(ctl/ctld)超家族的一個成員。這個家族的成員共享共同的蛋白質(zhì)折疊且具有各式各樣的功能，諸如細胞粘附，細胞-細胞信號傳導(dǎo)，糖蛋白周轉(zhuǎn)，和在炎癥和免疫應(yīng)答中的作用。由此基因編碼的蛋白質(zhì)是粒細胞和單核細胞功能的負調(diào)節(jié)物。已經(jīng)描述了此基因的數(shù)種可變剪接轉(zhuǎn)錄物變體，但是還沒有測定這些變體中的一些的全長性質(zhì)。此基因與染色體12p13上的天然殺傷基因復(fù)合物區(qū)域中的其它ctl/ctld超家族成員緊密連鎖(drickamerk(1999)curr.opin.struct.biol.9(5):585-90；vanrhenena等(2007)blood110(7):2659-66；chench等(2006)blood107(4):1459-67；marshallas等(2006)eur.j.immunol.36(8):2159-69；bakkerab等(2005)cancerres.64(22):8443-50；marshallas等(2004)j.biol.chem.279(15):14792-802)。已經(jīng)顯示cll-1是ii型跨膜受體，其包含單個c型凝集素樣域(其預(yù)測不結(jié)合鈣或糖)，莖區(qū)，跨膜域和短的含有itim基序的胞質(zhì)尾。親本抗體還可以為包含清蛋白結(jié)合肽(abp)序列的融合蛋白(dennis等(2002)“albuminbindingasageneralstrategyforimprovingthepharmacokineticsofproteins”jbiolchem.277:35035-35043；wo01/45746)。本發(fā)明的抗體包括具有下列文獻中教導(dǎo)的abp序列的融合蛋白:(i)dennis等(2002)jbiolchem.277:35035-35043，表iii和iv,35038頁；(ii)us20040001827，在[0076]；和(iii)wo01/45746，在12-13頁，并且將所有這些文獻引入本文作為參考。誘變可通過本領(lǐng)域中公知的多種方法制備編碼起始多肽的氨基酸序列變體的dna。這些方法包括，但不限于通過定點(或寡核苷酸介導(dǎo)的)誘變，pcr誘變和對編碼所述多肽的較早制備的dna的盒式誘變制備。還可以通過限制片段操作或通過使用合成寡核苷酸的重疊延伸pcr構(gòu)建重組抗體的變體。誘變引物編碼半胱氨酸密碼子替代物。標準誘變技術(shù)可以用于產(chǎn)生編碼這類突變的半胱氨酸改造抗體的dna。一般指導(dǎo)原則可以在下列文獻中找到：sambrook等molecularcloning,alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,1989；和ausubel等currentprotocolsinmolecularbiology,greenepublishing和wiley-interscience,newyork,n.y.,1993。定點誘變?yōu)橐环N制備替代變體，即突變蛋白的方法。這項技術(shù)為本領(lǐng)域眾所周知(例如，參見,carter(1985)等nucleicacidsres.13:4431-4443；ho等(1989)基因(amst.)77:51-59；和kunkel等(1987)proc.natl.acad.sci.usa82:488)。簡言之，在進行dna定點誘變過程中，通過首先使編碼所需突變的寡核苷酸與這類起始dna的單鏈雜交來改變起始dna。在雜交后，將dna聚合酶用于使用雜交的寡核苷酸作為引物并且使用起始dna單鏈作為模板合成完整的第二鏈。因此，將編碼所需突變的寡核苷酸摻入所得雙鏈dna。定點誘變可以在表達質(zhì)粒中表達預(yù)進行誘變的蛋白質(zhì)的基因中進行，并且可以對所得質(zhì)粒測序以便證實引入了所需的半胱氨酸替代突變(liu等(1998)j.biol.chem.273:20252-20260)。定點方案和方式，包括那些商購的方案和方式，例如multisite-directedmutagenesiskit(stratagene,lajolla,ca)。pcr誘變還適合于制備起始多肽的氨基酸序列變體。參見higuchi,(1990)：pcrprotocols,pp.177-183,academicpress；ito等(1991)gene102:67-70；bernhard等(1994)bioconjugatechem.5:126-132；和vallette等(1989)nuc.acidsres.17:723-733。簡言之，當(dāng)將少量模板dna用作pcr中的起始物時，在序列方面稍不同于模板dna中相應(yīng)區(qū)的引物可以用于產(chǎn)生相對大量的特異性dna片段，這些片段僅在引物不同于模板的位置上不同于模板序列。用于制備變體的另一種方法，即盒式誘變基于wells等(1985)基因34:315-323所述的技術(shù)。起始物為包含要突變的起始多肽dna的質(zhì)粒(或其它載體)。鑒定要突變的起始dna中的密碼子。在鑒定的突變位點的每側(cè)上必須存在獨特的限制性內(nèi)切核酸酶位點。如果不存在這類限制位點，那么可以使用上述寡核苷酸介導(dǎo)的誘變方法產(chǎn)生它們，以便將其引入起始多肽dna的適當(dāng)位置上。在這些位點上切割質(zhì)粒dna以使其線性化。使用標準操作步驟合成編碼在限制位點之間但含有所需突變的dna序列的雙鏈寡核苷酸。其中分別合成寡核苷酸的兩條鏈然后使用標準技術(shù)彼此雜交。通過亞磷酰胺合成法(phosphoramiditesynthesismethod)制備寡核苷酸(us4415732；us4458066；beaucage,s.和iyer,r.(1992)"advancesinthesynthesisofoligonucleotidesbythephosphoramiditeapproach",tetrahedron48:2223-2311).這種雙鏈寡核苷酸稱作盒(cassette)。將這種盒設(shè)計成具有與線性化質(zhì)粒末端相容的5′和3′末端，使得它可以直接連接質(zhì)粒。這種質(zhì)粒目前含有突變的dna序列?？梢酝ㄟ^dna測序證實含有編碼的半胱氨酸替代物的突變dna。還通過寡核苷酸定向誘變，使用經(jīng)pcr的誘變的雙鏈質(zhì)粒dna作為模板產(chǎn)生單突變(sambrook和russel,(2001)molecularcloning:alaboratorymanual,3rdedition；zoller等(1983)methodsenzymol.100:468-500；zoller,m.j.和smith,m.(1982)nucl.acidsres.10:6487-6500)。在本發(fā)明中，在m13噬菌體上展示的hu4d5(gerstner等(2002)“sequenceplasticityintheantigen-bindingsiteofatherapeuticanti-her2antibody”,jmolbiol.321:851-62)作為模型系統(tǒng)用于實驗。將半胱氨酸突變引入hu4d5-噬菌體，hu4d5和abp-hu4d5構(gòu)建體。如上所述使用聚乙二醇(peg)沉淀法進行hu4d5-thiomabtm抗體-噬菌體制備(lowman,henryb.(1998)methodsinmolecularbiology(totowa,newjersey)87(combinatorialpeptidelibraryprotocols)249-264)。pheselector測定pheselector(用于選擇反應(yīng)性硫醇的噬菌體elisa)測定法能夠以elisa噬菌體方式檢測抗體中反應(yīng)性半胱氨酸基團。參見美國專利no.7,521,541和美國專利公開文本no.20110301334，通過援引將它們完整收錄。具體而言，pheseslector測定包括在孔表面上包被所關(guān)注的蛋白質(zhì)(例如抗體)，隨后與噬菌粒一起溫育且然后使用吸光度檢測hrp標記的二抗的過程?？梢砸钥焖?，有力和高流通量方式篩選噬菌體上展示的突變蛋白?？梢允褂脧目贵w或其它蛋白質(zhì)的隨機蛋白質(zhì)-噬菌體文庫鑒定游離cys摻入的適當(dāng)反應(yīng)位點相同的手段生產(chǎn)半胱氨酸改造抗體的文庫并且進行結(jié)合選擇。這項技術(shù)包括使噬菌體上展示的半胱氨酸突變體蛋白質(zhì)與也為硫醇反應(yīng)性的親和試劑或報告基團反應(yīng)。在某些實施方案中，pheselector測定法包括下述步驟：1)在maxisorp96孔板上分開包被牛血清清蛋白(bsa)，部分或整個靶蛋白(例如erbb2胞外域(her2))，和鏈霉親合素(100μl，2μg/ml)；2)用0.5％tween-20(在pbs中)封閉后，將生物素化的和非生物素化的thiomabtm抗體-噬菌體(2x1010個噬菌體顆粒)于室溫溫育1小時(例如如果靶蛋白為erbb2胞外域(her2)，那么是hu4d5-thiomabtm抗體-噬菌體)；3)與噬菌體一起溫育后是與辣根過氧化物酶(hrp)標記的二抗(抗m13噬菌體衣殼蛋白，pviii蛋白抗體)一起溫育；4)進行標準hrp反應(yīng)并于450nm測量吸光度；5)通過計算鏈霉親合素的od450/靶蛋白(例如her2)的od450之間的比來測量硫醇反應(yīng)性，使得1的硫醇反應(yīng)性值指示半胱氨酸硫醇的完全生物素化。蛋白質(zhì)表達和純化易于使用常規(guī)操作步驟(例如通過使用能夠特異性結(jié)合編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)分離編碼半胱氨酸改造抗體的dna并且對其進行測序。雜交瘤細胞用作這類dna的來源。一旦分離，就可以將dna放入表達載體，然后將其轉(zhuǎn)染入宿主細胞，諸如大腸桿菌細胞，猿猴cos細胞，中國倉鼠卵巢(cho)細胞，hek293t細胞，或其它不額外產(chǎn)生抗體蛋白的哺乳動物宿主細胞，諸如骨髓瘤細胞(us5807715；us2005/0048572；us2004/0229310)，以便獲得重組宿主細胞中合成的單克隆抗體。在大多數(shù)情況中，半胱氨酸改造抗體的產(chǎn)率與野生型抗體相似。有關(guān)細菌中編碼抗體的dna的重組表達的綜述文章包括skerra等(1993)curr.opinioninimmunol.5:256-262和plückthun(1992)immumol.revs.130:151-188。在設(shè)計和選擇后，可以通過下列方式生產(chǎn)具有高度反應(yīng)性的未配對的cys殘基的半胱氨酸改造抗體，例如thiomabtm抗體：(i)在細菌，例如大腸桿菌系統(tǒng)或哺乳動物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中表達(wo01/00245)，例如中國倉鼠卵巢細胞(cho)或hek293細胞(例如hek293t細胞)；和(ii)使用常用的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化(lowman等(1991)j.biol.chem.266(17):10982-10988)。在本發(fā)明的具體實施方案中，在哺乳動物細胞表達系統(tǒng)中表達thiomabtm抗體。在具體的實施方案中，哺乳動物細胞表達系統(tǒng)為hek293t細胞。thiomabtm抗體是全長抗體，其包括天然半胱氨酸殘基，在抗體內(nèi)形成二硫鍵。因而，這些天然半胱氨酸殘基不具有任何與藥物-馬來酰亞胺綴合的反應(yīng)性硫醇基團(reactive-thiolgroup)(除非用還原劑處理)。因此，新改造的cys殘基可以保持不配對并且能夠與親電子接頭試劑或藥物-接頭中間體(drug-linkerintermediate)，諸如藥物-馬來酰亞胺反應(yīng)，即與之綴合。依照順序編號系統(tǒng)給重鏈和輕鏈的改造的cys殘基的結(jié)構(gòu)位置編號。這種順序編號系統(tǒng)(sequentialnumberingsystem)與kabat編號系統(tǒng)相關(guān)(kabat等(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md)，而kabat編號系統(tǒng)用于4d5抗體。使用kabat編號系統(tǒng)，實際的線性氨基酸序列可以含有相當(dāng)于可變域的fr或cdr的縮短或插入的較少或額外的氨基酸。通過圖1a和1b中的順序編號和kabat編號方案鑒定半胱氨酸改造的重鏈變體位點和輕鏈變體位點。硫醇反應(yīng)性可以廣泛化至抗體的某些結(jié)構(gòu)域，諸如輕鏈恒定域(cl)和重鏈恒定域ch1，ch2和ch3。產(chǎn)生約0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，和0.95和更高硫醇反應(yīng)性值的半胱氨酸替代可以在如下完整抗體的重鏈恒定域α，δ，ε，γ和μ中進行：分別為iga，igd，ige，igg和igm，包括igg亞類：igg1，igg2，igg3，igg4，iga1和iga2。標記的半胱氨酸改造抗體本發(fā)明的半胱氨酸改造抗體可以與任意標記模塊(labelmoiety)綴合，所述的標記模塊可以通過反應(yīng)性半胱氨酸硫醇基團與該抗體共價結(jié)合(singh等(2002)anal.biochem.304:147-15；harlowe.和lane,d.(1999)usingantibody:alaboratorymanual,coldspringsharborlaboratorypress,coldspringharbor,ny；lundbladr.l.(1991)chemicalreagentsforproteinmodification,2nded.crcpress,bocaraton,fl)。結(jié)合的標記可以起如下作用：(i)提供可檢測信號；(ii)與第二種標記發(fā)生相互作用以改變由第一種或第二種標記提供的可檢測信號，例如得到fret(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)；(iii)使相互作用穩(wěn)定或增加與抗原或配體的結(jié)合親和力；(iv)通過電荷，親水性，形狀或其它物理參數(shù)影響運動性，例如電泳遷移率或細胞滲透性；或(v)提供捕捉模塊(capturemoiety)，以調(diào)節(jié)配體親和力，抗體/抗原結(jié)合或離子絡(luò)合。標記的半胱氨酸改造抗體可以用于診斷試驗，例如用于檢測所關(guān)注抗原在特異性細胞，組織或血清中的表達。就診斷應(yīng)用而言，一般用可檢測模塊標記該抗體?？衫么罅繕擞?，一般可以將它們分成如下類：(a)放射性同位素(放射性核素)，諸如3h，11c，14c，18f，32p，35s，64cu，68ga，86y，89zr，99tc，111in，123i，124i，125i，131i，133xe，177lu，211at，或213bi。放射性同位素標記的抗體用于受體靶向的成像實驗?？梢允褂胏urrentprotocolsinimmunology,(1991)volumes1和2,coligen等,ed.wiley-interscience,newyork,ny,pubs.中所述的技術(shù)用配體試劑標記抗體，所述配體試劑結(jié)合，螯合乃至復(fù)合放射性同位素金屬，其中所述試劑與改造的抗體的半胱氨酸硫醇反應(yīng)?？梢詮?fù)合金屬離子的螯合配體包括dota，dotp，dotma，dtpa和teta(macrocyclics,dallas,tx)?？梢酝ㄟ^與本發(fā)明的抗體-藥物綴合物復(fù)合靶向放射性核素(wu等(2005)naturebiotechnology23(9):1137-1146)。dota-馬來酰亞胺試劑與半胱氨酸改造抗體的游離半胱氨酸氨基酸反應(yīng)并且得到抗體上的金屬復(fù)合配體(lewis等(1998)bioconj.chem.9:72-86)。螯合接頭標記試劑，諸如dota-nhs(1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四乙酸一(n-羥基琥珀酰亞胺酯)為商購的(macrocyclics,dallas,tx)。使用放射性核素標記的抗體成像的受體靶標可以通過檢測和定量腫瘤組織中抗體的進行性蓄積提供活化途徑標記(albert等(1998)bioorg.med.chem.lett.8:1207-1210)。用于成像實驗的適合于作為抗體標記的金屬-螯合物復(fù)合物(us2010/0111856；us5342606；us5428155；us5316757；us5480990；us5462725；us5428139；us5385893；us5739294；us5750660；us5834456；hnatowich等(1983)j.immunol.methods65:147-157；meares等(1984)anal.biochem.142:68-78；mirzadeh等(1990)bioconjugatechem.1:59-65；meares等(1990)j.cancer1990,suppl.10:21-26；izard等(1992)bioconjugatechem.3:346-350；nikula等(1995)nucl.med.biol.22:387-90；camera等(1993)nucl.med.biol.20:955-62；kukis等(1998)j.nucl.med.39:2105-2110；verel等(2003)j.nucl.med.44:1663-1670；camera等(1994)j.nucl.med.21:640-646；ruegg等(1990)cancerres.50:4221-4226；verel等(2003)j.nucl.med.44:1663-1670；lee等(2001)cancerres.61:4474-4482；mitchell,等(2003)j.nucl.med.44:1105-1112；kobayashi等(1999)bioconjugatechem.10:103-111；miederer等(2004)j.nucl.med.45:129-137；denardo等(1998)clinicalcancerresearch4:2483-90；blend等(2003)cancerbiotherapy&radiopharmaceuticals18:355-363；nikula等(1999)j.nucl.med.40:166-76；kobayashi等(1998)j.nucl.med.39:829-36；mardirossian等(1993)nucl.med.biol.20:65-74；roselli等(1999)cancerbiotherapy&radiopharmaceuticals,14:209-20)。(b)熒光標記，諸如稀土元素螯合物(銪螯合物)；熒光素類，包括fitc，5-羧基熒光素，6-羧基熒光素；若丹明類，包括tamra；丹酰；麗絲胺(lissamine)；花青(cyanines)；藻紅蛋白；德克薩斯紅；及其類似物。例如，可以使用同上文的currentprotocolsinimmunology中披露的技術(shù)使熒光標記與抗體綴合。熒光染料和熒光標記試劑包括商購自invitrogen/molecularprobes(eugene,or)和piercebiotechnology,inc.(rockford,il)的那些熒光染料和熒光標記試劑。檢測標記，諸如熒光染料和化學(xué)發(fā)光染料(briggs等(1997)"synthesisoffunctionalisedfluorescentdyesandtheircouplingtoaminesandaminoacids,"j.chem.soc.,perkin-trans.1:1051-1058)提供了可檢測信號并且一般應(yīng)用于標記抗體，這些抗體優(yōu)選具有如下特性：(i)標記的抗體應(yīng)產(chǎn)生極高的信號與低背景，使得可以在無細胞和基于細胞的試驗中靈敏地檢測少量抗體；和(ii)標記的抗體應(yīng)是光穩(wěn)定的，以便可以觀察，監(jiān)測和記錄熒光信號，而無顯著的光漂白。就涉及標記抗體與膜或細胞表面，尤其是活細胞的細胞表面結(jié)合的應(yīng)用而言，標記優(yōu)選(iii)具有良好的水溶性以便獲得有效綴合物濃度和檢測靈敏度和(iv)對活細胞無毒性，以便不會破壞細胞的正常代謝過程或?qū)е逻^早細胞死亡。(c)各種酶-底物標記為可得到的或披露的(us4275149)。酶一般催化可以使用各種技術(shù)測定的顯色底物的化學(xué)改變。例如，酶可催化底物中的顏色改變，而這種改變可以通過分光光度法測定?；蛘?，酶可以改變底物的熒光或化學(xué)發(fā)光。用于定量熒光改變的技術(shù)如上所述?；瘜W(xué)發(fā)光底物通過化學(xué)反應(yīng)變成電激發(fā)的且然后可以發(fā)射可測定的光(例如使用化學(xué)發(fā)光計)或給熒光接受器提供能量。酶促標記的實例包括：熒光素酶(例如熒火蟲熒光素酶和細菌熒光素酶；美國專利no.4,737,456)；螢光素；2,3-二酞嗪二酮類；蘋果酸脫氫酶；尿素酶；過氧化物酶，諸如辣根過氧化物酶(hrp)；堿性磷酸酶(ap)；β-半乳糖苷酶；葡萄糖淀粉酶；溶菌酶；糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)；雜環(huán)氧化酶(諸如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)；乳過氧化物酶；微過氧化物酶等。用于使酶與抗體綴合的技術(shù)描述在o′sullivan等(1981)“methodsforthepreparationofenzyme-antibodycojugateforuseinenzymeimmunoassay”：methodsinenzym.(edj.langone&h.vanvunakis),academicpress,newyork,73:147-166中。酶-底物組合的實例(美國專利no.4,275,149和4,318,980)包括，例如：(i)辣根過氧化物酶(hrp)與作為底物的過氧化氫酶，其中過氧化氫酶氧化染料前體(例如鄰苯二胺(opd)或3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(tmb))；(ii)堿性磷酸酶(ap)與作為顯色底物的磷酸對-硝基苯基酯；和(iii)β-d-半乳糖苷酶(β-d-gal)與顯色底物(例如對-硝基苯基-β-d-半乳糖苷酶)或熒光底物4-甲基傘形基(umbelliferyl)-β-d-半乳糖苷酶。標記可以與半胱氨酸改造抗體間接綴合。例如，抗體可以與生物素綴合，并且上述三大類標記中的任意類可以與親合素蛋白或鏈霉親合素綴合，或反之亦然。生物素選擇性地結(jié)合鏈霉親合素，且由此標記可以按照這種間接方式與抗體綴合。或者，為了實現(xiàn)標記與多肽變體的間接綴合，使多肽變體與小的半抗原(例如地高辛)綴合并且上述不同類型標記之一與抗-半抗原多肽變體綴合(例如抗地高辛抗體)。因此，可以實現(xiàn)標記與多肽變體的間接綴合(hermanson,g.(1996)inbiocojugatetechniquesacademicpress,sandiego)。本發(fā)明的多肽變體可以用于任意已知的測定方法中，諸如elisa，競爭性結(jié)合測定法，直接和間接夾心式測定法和免疫沉淀測定法(zola,(1987)monoclonalantibodies:amanualoftechniques,pp.147-158,crcpress,inc.).檢測標記可以用于定位，顯影和定量結(jié)合或識別結(jié)果。本發(fā)明標記的抗體可以檢測細胞-表面受體。另一種用于檢測標記的抗體的應(yīng)用在于基于珠的免疫捕捉，包含使珠與熒光標記的抗體綴合并且檢測配體結(jié)合時的熒光信號。類似的結(jié)合檢測方法使用表面等離子共振(spr)效應(yīng)以測定和檢測抗體-抗原相互作用。本發(fā)明標記的半胱氨酸改造抗體用作生物醫(yī)學(xué)和分子成像的各種方法和技術(shù)的成像生物標記物和探針，所述的方法和技術(shù)諸如：(i)mri(磁共振成像)；(ii)microct(電子計算機化斷層x線攝影法)；(iii)spect(單光子發(fā)射計算機斷層術(shù))；(iv)pet(正電子發(fā)射斷層照相術(shù))tinianow,j.etal(2010)nuclearmedicineandbiology,37(3):289-297；chen等(2004)bioconjugatechem.15:41-49；us2010/0111856；(v)生物發(fā)光；(vi)熒光；和(vii)超聲。免疫閃爍成像為一種成像方法，其中將放射性物質(zhì)標記的抗體給予動物或人體患者并且取抗體定位的身體部位的圖像(us6528624)?？梢钥陀^測定成像生物標記物并且作為正常生物學(xué)過程，病理過程或?qū)χ委煾深A(yù)的藥理反應(yīng)的指示評價。生物標記物可以具有幾種類型：0型為疾病的天然歷史標記物并且與已知的臨床指標縱向相關(guān)，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中滑液炎癥的mri評價；i型標記捕捉按照作用機制干預(yù)的作用，即使該機制與臨床結(jié)果無關(guān)；ii型標記作為替代終點(surrogateendpoint)起作用，其中生物標記的改變或信號預(yù)測臨床有益性以便“驗證”靶向的反應(yīng)，諸如通過ct在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中測定的骨質(zhì)侵蝕。成像生物標記物由此可以提供有關(guān)下列的藥效(pd)治療信息：(i)靶蛋白的表達；(ii)治療劑與靶蛋白的結(jié)合，即選擇性；和(iii)清除和半衰期藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)。與基于實驗室的生物標記物有關(guān)的體內(nèi)成像生物標記物的優(yōu)點包括：非-侵害性治療；可定量；整體評價；重復(fù)給藥和評價，即多時間點；和從前期臨床(小動物)到臨床(人)結(jié)果的潛在可轉(zhuǎn)移的作用。就某些應(yīng)用而言，生物成像替代了前期臨床研究中的動物實驗或?qū)⑵浯螖?shù)減少到了最低限度。肽標記方法為眾所周知的。參見haugland,2003,molecularprobeshandbookoffluorescentprobesandresearchchemicals,molecularprobes,inc.；brinkley,1992,bioconjugatechem.3:2；garman,(1997)non-radioactivelabelling:apracticalapproach,academicpress,london；means(1990)biogconjugatechem.1:2；glazer等(1975)chemicalmodificationofproteins.laboratorytechniquesinbiochemistryandmolecularbiology(t.s.work和e.work,eds.)americanelsevierpublishingco.,newyork；lundblad,r.l.和noyes,c.m.(1984)chemicalreagentsforproteinmodification,vols.i和ii,crcpress,newyork；pfleiderer,g.(1985)“chemicalmodificationofproteins”,modernmethodsinproteinchemistry,h.tschesche,ed.,walterdegryter,berlin和newyork；和wong(1991)chemistryofproteinconjugationandcross-linking,crcpress,bocaraton,fla.)；deleon-rodriguez等(2004)chem.eur.j.10:1149-1155；lewis等(2001)bioconjugatechem.12:320-324；li等(2002)bioconjugatechem.13:110-115；mier等(2005)bioconjugatechem.16:240-237。使用兩模塊，即熒光報道基團和猝滅物標記的肽類和蛋白質(zhì)能夠充分近似地進行熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)。報道基團一般為由一定波長的光激發(fā)的熒光染料并且可以將能量轉(zhuǎn)移至接受或猝滅基團，其中對于在最大亮度時發(fā)射而言存在適當(dāng)?shù)膕tokes偏移。熒光染料包括具有延長的芳香性的分子，諸如熒光素和若丹明及其衍生物?？梢酝ㄟ^完整肽的猝滅物模塊部分或明顯地使熒光報道分子猝滅。在通過肽酶或蛋白酶裂解肽時，可以測定熒光中的可檢測到的增加(knight,c.(1995)“fluorimetricassaysofproteolyticenzymes”,methodsinenzymology,academicpress,248:18-34)。還可以將本發(fā)明標記的抗體用作親和純化試劑。在該方法中，使用本領(lǐng)域眾所周知的方法將標記的抗體固定在固相上，諸如sephadex樹脂或濾紙上。使固定化抗體與含有要純化的抗原的樣品接觸，且此后用可基本上除去樣品中除要純化的抗原外的所有物質(zhì)的適當(dāng)溶劑洗滌支持物，所述抗原與固定的多肽變體結(jié)合。最終用另一種合適的溶劑，諸如ph5.0的甘氨酸緩沖液洗滌支持物，該溶劑能夠使所述抗原從所述多肽變體中釋放。標記試劑一般具有反應(yīng)性官能基，它可以與：(i)半胱氨酸改造抗體的半胱氨酸硫醇直接反應(yīng)而形成標記的抗體；(ii)與接頭試劑反應(yīng)而形成接頭-標記中間體；或(iii)與接頭抗體反應(yīng)而形成標記的抗體。標記試劑的反應(yīng)性官能基包括：馬來酰亞胺，鹵代乙?；庖阴０风牾啺坊?例如nhs，n-羥基琥珀酰亞胺)，異硫氰酸酯，磺酰氯，2,6-二氯三嗪基，五氟苯基酯和亞磷酰胺，不過，也可以使用其它的官能基。接頭藥物與thiomabtm抗體的綴合將本文所述thiomabtm抗體綴合至兩種不同接頭藥物以演示重和輕鏈內(nèi)每一個位點處的改造的半胱氨酸的綴合效率。在代表性抗體huanti-her24d5(“4d5抗體”)的每一個位置改造半胱氨酸殘基以生成thiomabtm抗體。將每一種thiomabtm抗體分開綴合至兩種接頭藥物(mc-vc-pab-mmae和pds-mmae)。在96孔濾板(體積2ml，聚丙烯，0.45um濾器，來自ekscientific)中實施綴合。該板只容許以500xg離心2分鐘時水性緩沖液流過。作為20％乙醇中的50％漿，對每個孔添加450μlmabselectsure樹脂(gehealthcare)。將樹脂在50mmtrisph8.0，150mmnacl，2mmedta(緩沖液a)中清洗3次并平衡。對每個孔添加每種thiomabtm抗體(1.5mg)，并于室溫在600rpm的搖板儀上容許結(jié)合至樹脂達30分鐘。30分鐘后，將板離心以去除過量的緩沖液。于室溫在搖動下在0.9ml含2mm二硫蘇糖醇的緩沖液a存在下將thiomabtm抗體還原過夜。通過用緩沖液a清洗2次純化掉還原劑和任何半胱氨酸或谷胱甘肽嵌段(block)。將板用1ml含1mm脫氫抗壞血酸(dhaa)的緩沖液a清洗3次以用氧化劑充滿板。最后一次添加0.9ml含1mmdhaa的緩沖液a后，于室溫在搖板儀上容許thiomabtm抗體再氧化3小時。通過離心去除氧化劑。對每個孔添加兩倍摩爾過量(相對于可用的硫醇基團)的在含10％dma的緩沖液a中溶解的接頭-藥物(mc-vc-pab-mmae或pds-mmae任一)，并于室溫在搖板儀上與thiomabtm抗體一起溫育2小時。通過將板用平衡緩沖液清洗6次來純化掉過量的接頭-藥物。于室溫在搖板儀上用0.1m甘氨酸緩沖液ph2.7洗脫綴合的thiomabtm抗體30分鐘。立即用15％0.5mtris，ph8.0中和thiomabtm抗體。通過lc/ms分析量化每個單抗綴合的藥物的數(shù)目。通過大小排阻層析評估綴合物的聚集。質(zhì)譜分析使用液相層析電噴射離子化質(zhì)譜(lc-esi-ms)分析對綴合的thiomabtm抗體進行精確分子量測定(cole,r.b.electrosprayionizationmassspectrometry:fundamentals,instrumentationandapplications.(1997)wiley,newyork)。在6224質(zhì)量飛行時間(tof)lc/ms(agilenttechnologies)上實施lc/ms分析。將樣品在加熱至80℃的prlp-s柱，8μm(50mmx2.1mm，agilenttechnologies)上層析。以0.7ml/min流速在3分鐘里使用線性梯度34-42％b(溶劑a，含0.05％tfa的水；溶劑b，含0.04％tfa的乙腈)并使用電噴射源直接將洗提液電離。收集數(shù)據(jù)并使用agilentmasshunter定性分析軟件解卷積。使用lc/ms層析圖中存在的解卷積峰的豐度計算藥物對抗體比(dar)。thiomabtm抗體的聚集分析在1100系列hplc(agilenttechnologies)上實施大小排阻層析。將樣品在shodexkw802.5柱上層析。使用等度方法(其使用流動相0.2m磷酸鉀，0.25m氯化鉀，ph6.2，0.75ml/min，15分鐘)來洗脫綴合物。根據(jù)uv280nm層析圖的聚集體和單體峰的積分面積計算百分比聚集。曲妥珠單抗的thioigg變體的工程化改造在重和輕鏈中的每一個殘基處將半胱氨酸引入全長單克隆抗體，曲妥珠單抗(genentechinc.)(將seqidno.:1(4d5重鏈)和seqidno.:2(4d5輕鏈)的每個天然，非半胱氨酸殘基突變成半胱氨酸)。代表性4d5抗體的重鏈具有450個氨基酸：12個半胱氨酸殘基和438個非半胱氨酸殘基。代表性4d5抗體的輕鏈具有214個氨基酸：6個半胱氨酸殘基和208個非半胱氨酸殘基。具體而言，將單個殘基自它的天然氨基酸突變成半胱氨酸，由此產(chǎn)生具有兩個改造的半胱氨酸殘基的全長抗體。將每種半胱氨酸突變綴合至pds-mmae和mc-vc-mmae。這產(chǎn)生總共648種thiomabtm抗體：648種pds-mmaethiomabtm抗體和648種mc-vc-mmaethiomabtm抗體。在培養(yǎng)基中在hek293t細胞中表達這些半胱氨酸改造抗體(thiomabtm抗體)。evqlvesggglvqpggslrlscaasgfnikdtyihwvrqapgkglewvariyptngytryadsvkgrftisadtskntaylqmnslraedtavyycsrwggdgfyamdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkseqidno:18diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdvntavawyqqkpgkapklliysasflysgvpsrfsgsrsgtdftltisslqpedfatyycqqhyttpptfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgecseqidno:19在一個優(yōu)選的實施方案中，thiomabtm抗體包含表2中的依照kabat編號方式的一處或多處重鏈突變。在一個優(yōu)選的實施方案中，thiomabtm抗體在與表2中所列依照4d5序列的位置等同的位置處包含改造的半胱氨酸。在一個優(yōu)選的實施方案中，thiomabtm抗體中的表2中鑒定的改造的半胱氨酸或位置上等同的改造的半胱氨酸是游離半胱氨酸。在一個優(yōu)選的實施方案中，thiomabtm抗體在依照kabat編號方式的位置hc-a136c(即依照eu編號方式的hc-a140c)處包含改造的半胱氨酸(見實施例11)。在優(yōu)選的實施方案中，thiomabtm抗體包含圖21中的依照eu編號方式的一處或多處重鏈突變。具體而言，半胱氨酸改造抗體中的重鏈半胱氨酸突變選自由依照eu編號方式的hc-t110c，hc-a140c，hc-l174c，hc-l179c，hc-t187c，hc-t209c，hc-v262c，hc-g371c，hc-y373c，hc-e382c，hc-s242c，hc-n434c，和q438c組成的位點組。在優(yōu)選的實施方案中，thiomabtm抗體包含在選自由依照eu編號方式的hc-a140c，hc-l174c，hc-l179c，hc-g371c，hc-y373c，hc-s424c，和hc-q438c組成的組的改造的半胱氨酸處通過pds接頭綴合至藥物模塊的半胱氨酸改造抗體。在優(yōu)選的實施方案中，thiomabtm抗體包含在選自由hc-t110c，hc-t187c，hc-t209c，hc-v262c，hc-g371c，hc-e382c，和hc-n434c組成的組的改造的半胱氨酸處通過vc-(即馬來酰亞胺)接頭綴合至藥物模塊的半胱氨酸改造抗體。在某些實施方案中，thiomabtm抗體包含表3中的依照kabat編號方式的一處或多處重鏈突變。在某些實施方案中，thiomabtm抗體在與表3中所列依照4d5序列的位置等同的位置處包含改造的半胱氨酸。例如，如果抗體在它的重鏈中在依照kabat編號方式的位置5處包含天然丙氨酸(a)(與4d5中的天然纈氨酸(v)相比)，那么可以將該丙氨酸突變成半胱氨酸以產(chǎn)生hc-a5cthiomabtm抗體。在某些實施方案中，thiomabtm抗體中的表3中鑒定的改造的半胱氨酸或位置上等同的改造的半胱氨酸是游離半胱氨酸。表3：依照kabat編號方式的重鏈半胱氨酸突變。在某些實施方案中，thiomabtm抗體包含表3中所列序列。在某些實施方案中，具有表3中所列突變和/或序列的thiomabtm抗體包含pds接頭。在某些實施方案中，具有表3中所列突變和/或序列的thiomabtm抗體包含馬來酰亞胺(例如-vc)接頭。在具體的實施方案中，將重鏈位點(依照kabat編號方式)突變成選自下組的半胱氨酸以形成半胱氨酸改造抗體并使用pds接頭連接至藥物：v2c，t29c，y30c，a37c，e43c，y77c，w96c，g97c，d105c，t139c，n159c，a162c，g166c，g178c，l179c，v188c，i199c，n203c，s207c，e388c，k414c，q418c，s242c，y436c，t437c，q438c，l443c，和m104c。在具體的實施方案中，將重鏈位點(依照kabat編號方式)突變成選自下組的半胱氨酸以形成半胱氨酸改造抗體并使用-vc(即馬來酰亞胺)接頭連接至藥物：v2c，l1c，v2c，l8c，r16c，f24c，i26c，y30c，q36c，a37c，k40c，l42c，e43c，t51c，g53c，t55c，r56c，y57c，a58c，t66c，n74c，q79c，w107c，t120c，k121c，a140c，g166c，g178c，t187c，i199c，t209c，f243c，m252c，e258c，v262c，n276c，v282c，l309c，t335c，s337c，r344c，q347c，k360c，g371c，e382c，p387c，e388c，s403c，k414c，q418c，g420c，n421c，s424c，n434c，y436c，t437c，q438c，k439c，s442c，l443c，m104c，和n81c。在具體的實施方案中，包含選自表2中所列突變的重鏈半胱氨酸突變的半胱氨酸改造抗體具有介于1.0和2.0之間的平均dar，是使用本文所述用于穩(wěn)定性測定測定法的親和捕捉lc-ms測定法測定的(見實施例12和13)。在具體的實施方案中，包含選自表2中所列突變的重鏈半胱氨酸突變的半胱氨酸改造抗體具有介于1.1和1.3之間的平均dar。在具體的實施方案中，包含選自表2中所列突變的重鏈半胱氨酸突變的半胱氨酸改造抗體具有介于1.3和1.5之間的平均dar。在具體的實施方案中，具有選自表1列表的半胱氨酸突變的thiomabtm抗體具有介于1.5和1.8之間的平均dar。在具體的實施方案中，包含選自表2中所列突變的重鏈半胱氨酸突變的半胱氨酸改造抗體平均具有介于1.8和2.0之間的dar。在一個優(yōu)選的實施方案中，半胱氨酸改造抗體包含表2中的依照kabat編號方式的一處或多處重鏈突變。在一個優(yōu)選的實施方案中，半胱氨酸改造抗體在與表2中所列依照4d5序列的位置等同的位置處包含改造的半胱氨酸。例如，如果抗體在它的重鏈中在依照kabat編號方式的位置19處包含天然賴氨酸(k)(與4d5中的天然精氨酸(r)相比)，那么可以將該賴氨酸突變成半胱氨酸以產(chǎn)生k19cthiomabtm抗體。在一個優(yōu)選的實施方案中，thiomabtm抗體中的表2中鑒定的改造的半胱氨酸或位置上等同的改造的半胱氨酸是游離半胱氨酸。表4：依照kabat編號方式的輕鏈半胱氨酸突變。在一個優(yōu)選的實施方案中，thiomabtm抗體包含表1中的依照kabat編號方式的一處或多處輕鏈突變。在一個優(yōu)選的實施方案中，thiomabtm抗體在與表1中所列依照4d5序列的位置等同的位置處包含改造的半胱氨酸。在一個優(yōu)選的實施方案中，thiomabtm抗體中的表1中鑒定的改造的半胱氨酸或位置上等同的改造的半胱氨酸是游離半胱氨酸。在一個優(yōu)選的實施方案中，thiomabtm抗體在依照kabat編號方式的位置lc-k149c處包含改造的半胱氨酸(見實施例2和7)。在優(yōu)選的實施方案中，將lc-k149c抗體經(jīng)由pds接頭綴合至藥物模塊。在優(yōu)選的實施方案中，將lc-k149c抗體經(jīng)由-vc(即馬來酰亞胺)接頭綴合至藥物模塊。在某些實施方案中，thiomabtm抗體包含圖21中的依照kabat編號方式的一處或多處輕鏈突變。具體而言，半胱氨酸改造抗體中的輕鏈半胱氨酸突變選自由依照kabat編號方式的lc-t22c，lc-k39c，lc-y49c，lc-y55c，lc-t85c，lc-t97c，lc-i106c，lc-r108c，lc-r142c，lc-k149c，和lc-v205c組成的位點組。在優(yōu)選的實施方案中，thiomabtm抗體包含在選自由依照kabat編號方式的lc-i106c，lc-r108c，和lc-v205c組成的組的改造的半胱氨酸處通過pds接頭綴合至藥物模塊的半胱氨酸改造抗體。在優(yōu)選的實施方案中，thiomabtm抗體包含在選自由依照kabat編號方式的lc-t22c，lc-k39c，lc-y49c，lc-y55c，lc-t85c，lc-t97c，lc-r142c，和lc-k149c組成的組的改造的半胱氨酸處通過vc-(即馬來酰亞胺)接頭綴合至藥物模塊的半胱氨酸改造抗體。在具體的實施方案中，包含選自表1中所列突變的輕鏈半胱氨酸突變的半胱氨酸改造抗體具有介于1.0和2.0之間的平均dar，是使用本文所述用于穩(wěn)定性測定測定法的親和捕捉lc-ms測定法測定的(見實施例12和13)。在具體的實施方案中，包含選自表1中所列突變的輕鏈半胱氨酸突變的半胱氨酸改造抗體具有介于1.1和1.3之間的平均dar。在具體的實施方案中，包含選自表1中所列突變的輕鏈半胱氨酸突變的半胱氨酸改造抗體具有介于1.3和1.5之間的平均dar。在具體的實施方案中，具有選自表1列表的半胱氨酸突變的半胱氨酸改造抗體具有介于1.5和1.8之間的平均dar。在具體的實施方案中，包含選自表1中所列突變的重鏈半胱氨酸突變的半胱氨酸改造抗體具有介于1.8和2.0之間的平均dar。在具體的實施方案中，包含選自表1中所列突變的重鏈半胱氨酸突變的半胱氨酸改造抗體具有介于0.8和1.4之間的平均dar。在優(yōu)選的實施方案中，thiomabtm抗體包含表1中所列序列。在優(yōu)選的實施方案中，具有表1中所列突變和/或序列的thiomabtm抗體包含pds接頭。在優(yōu)選的實施方案中，具有表1中所列突變和/或序列的thiomabtm抗體包含-vc接頭。在某些實施方案中，thiomabtm抗體包含表4中所列序列。在某些實施方案中，具有表4中所列突變和/或序列的thiomabtm抗體包含pds接頭。在某些實施方案中，具有表4中所列突變和/或序列的thiomabtm抗體包含-vc接頭。在某些實施方案中，包含選自表4中所列突變的輕鏈半胱氨酸突變的半胱氨酸改造抗體具有介于1.0和2.0之間的平均dar，是使用本文所述用于穩(wěn)定性測定測定法的親和捕捉lc-ms測定法測定的(見實施例12和13)。在具體的實施方案中，具有選自表4列表的半胱氨酸突變的thiomabtm抗體具有介于1.3和1.9之間的平均dar。在具體的實施方案中，具有選自表4列表的半胱氨酸突變的thiomabtm抗體具有介于1.3和1.8之間的平均dar。在具體的實施方案中，具有選自表4列表的半胱氨酸突變的thiomabtm抗體具有介于1.5和1.9之間的平均dar。在具體的實施方案中，具有選自表4列表的半胱氨酸突變的thiomabtm抗體具有介于0.8和1.0之間的平均dar。在優(yōu)選的實施方案中，thiomabtm抗體包含圖21中的依照eu編號方式的一處或多處輕鏈突變。具體而言，半胱氨酸改造抗體中的輕鏈半胱氨酸突變選自由依照eu編號方式的lc-t22c，lc-k39c，lc-y49c，lc-y55c，lc-t85c，lc-t97c，lc-i106c，lc-r108c，lc-r142c，lc-k149c，和lc-v205c組成的位點組。在優(yōu)選的實施方案中，thiomabtm抗體包含在選自由依照eu編號方式的lc-t22c，lc-k39c，lc-y49c，lc-y55c，lc-t85c，lc-t97c，lc-r142c，和lc-k149c組成的組的改造的半胱氨酸處通過pds接頭綴合至藥物模塊的半胱氨酸改造抗體。在優(yōu)選的實施方案中，thiomabtm抗體包含在選自由lc-i106c，lc-r108c，和lc-v205c組成的組的改造的半胱氨酸處通過vc-(即馬來酰亞胺)接頭綴合至藥物模塊的半胱氨酸改造抗體。在某個實施方案中，thiomabtm抗體包含表5中所列序列。在某個實施方案中，thiomabtm抗體在與表5中所列依照4d5序列的位置等同的位置處包含改造的半胱氨酸。例如，如果抗體在它的重鏈中在依照kabat編號方式的位置40處包含天然絲氨酸(s)(與4d5中的天然丙氨酸(a)相比)，那么可以將該絲氨酸突變成半胱氨酸以產(chǎn)生s40cthiomabtm抗體。在某個實施方案中，thiomabtm抗體中的表5中鑒定的改造的半胱氨酸或位置上等同的改造的半胱氨酸是游離半胱氨酸。表5：依照kabat編號方式的重鏈和輕鏈半胱氨酸突變。突變體序列seqidnohc-i195cgtqtyccnvnhseqidno:150hc-s420cqgnvfccsvmhseqidno:151hc-y432calhnhctqkslseqidno:152lc-g64cpsrfscsrsgtseqidno:153在某些實施方案中，thiomabtm抗體包含表5中所列序列。在某些實施方案中，具有表5中所列突變和/或序列的thiomabtm抗體包含-vc或pds接頭。在具體的實施方案中，具有選自表5列表的半胱氨酸突變的thiomabtm抗體具有介于1.0和2.0之間的平均dar。在具體的實施方案中，具有選自表5列表的半胱氨酸突變的thiomabtm抗體具有介于1.3和1.9之間的平均dar。在具體的實施方案中，具有選自表5列表的半胱氨酸突變的thiomabtm抗體具有介于1.3和1.8之間的平均dar。在具體的實施方案中，具有選自表5列表的半胱氨酸突變的thiomabtm抗體具有介于1.5和1.9之間的平均dar。依照另一個實施方案，thiomabtm抗體包含表1-5任一中鑒定的改造的半胱氨酸。在優(yōu)選的實施方案中，thiomabtm抗體包含表1和2任一中鑒定的改造的半胱氨酸。依照另一個實施方案，可以為任何靶抗原設(shè)計thiomabtm抗體。thiomabtm抗體設(shè)計和工程化改造將單一半胱氨酸替代引入抗her2hu4d5抗體的重鏈和輕鏈的每個位置(即生成了總共648種具有pds接頭的抗體和總共648種具有-vc接頭的抗體)(實施例1)。還將單一半胱氨酸替代引入抗cd33抗體，抗steap1抗體，抗muc16抗體，抗napi2b抗體，抗ly6e抗體，抗cd22抗體，抗cd79b抗體，抗b7h4抗體，和別的抗her2抗體的選定位置。依照本文所述方法制備所有重鏈突變體和輕鏈突變體。重鏈和輕鏈序列是依照kabat編號系統(tǒng)編號的。圖1a和1b中提供了與每個kabat位置等同的依照順序編號方式和eu編號方式的位置。在輕鏈中，kabat，sequential，和eu編號方式表示相同的編號。將4d5thiomabtm抗體的重和輕鏈經(jīng)由pds或vc接頭綴合至藥物(即生成了總共648種具有pds接頭的抗體和總共648種具有-vc接頭的抗體)。對每種thiomabtm抗體篩選平均藥物-抗體比(dar)，濃度(mg/ml)，聚集(％總的)，和穩(wěn)定性(實施例2)。相應(yīng)地，對每種thiomabtm抗體測量pds和vc綴合物的dar，濃度，聚集，和穩(wěn)定性。本文中提供的表中提供了pds綴合物和測量，而且本文中提供的表中提供了vc綴合物和測量。表6：用pds-接頭綴合的表3和4的半胱氨酸改造抗體的平均dar，濃度，聚集，和穩(wěn)定性(elisa大鼠血漿穩(wěn)定性)。表7：用pds-接頭綴合的表3和4的半胱氨酸改造抗體的平均dar，濃度，聚集，和穩(wěn)定性(質(zhì)譜大鼠血漿穩(wěn)定性)。表8：用-vc接頭綴合的表3和4的半胱氨酸改造抗體的平均dar，濃度，聚集，和穩(wěn)定性(elisa大鼠血漿穩(wěn)定性)。表9：用-vc接頭綴合的表3和4的半胱氨酸改造抗體的平均dar/穩(wěn)定性(質(zhì)譜大鼠血漿穩(wěn)定性)。以起始濃度≥1mg/ml的源材料(即pds-mmaethiomabtm抗體)分析表6和7中鑒定的pds-mmaethiomabtm抗體。表6和7中鑒定的pds-mmaethiomabtm抗體的dar計算均≥dar1。表6和7中鑒定的pds-mmaethiomabtm抗體均具有≤50％聚集，再氧化。表6中鑒定的pds-mmaethiomabtm抗體的elisa復(fù)制品在大鼠基質(zhì)中隨時間展現(xiàn)至少≥77％穩(wěn)定性。表6中分析的樣品同樣用于表7實施的實驗。表7顯示表6的elisa穩(wěn)定性結(jié)果的lcsm確認。以起始濃度≥1mg/ml的源材料(即mc-vc-mmaethiomabtm抗體)分析表8和9中鑒定的mc-vc-mmaethiomabtm抗體。表8和9中鑒定的mc-vc-mmaethiomabtm抗體的dar計算均≥dar1。表8和9中鑒定的mc-vc-mmaethiomabtm抗體均具有≤50％聚集，再氧化。表8中鑒定的mc-vc-mmaethiomabtm抗體的elisa復(fù)制品在大鼠基質(zhì)中隨時間展現(xiàn)至少≥77％穩(wěn)定性。表9顯示表8的elisa穩(wěn)定性結(jié)果的lcsm確認。表10：表1和2的優(yōu)選半胱氨酸改造抗體的平均dar，濃度，和聚集(與表11和12所示相同的樣品)。表11：表1和2的優(yōu)選半胱氨酸改造抗體的elisa和ms穩(wěn)定性結(jié)果(與表10和12所示相同的樣品)。表12：表1和2的優(yōu)選半胱氨酸改造抗體的半胱氨酸還原測定結(jié)果(與表10和11所示樣品相同的樣品)。表8-10中鑒定的pds-mmae和-vc-mmaethiomabtm抗體的dar計算均>dar0。表8中鑒定的pds-mmaethiomabtm抗體的兩份elisa復(fù)制品中的至少一份在大鼠基質(zhì)中隨時間展現(xiàn)至少≥80％穩(wěn)定性。有趣的是，vc-和pds-綴合的半胱氨酸改造抗體(即thiomabtm抗體)的dar，濃度，聚集，和穩(wěn)定性不相同。例如，表6和7(pds接頭)和表8和9(vc接頭)的優(yōu)選半胱氨酸改造抗體不相同。例如，對于pds接頭綴合至藥物模塊優(yōu)選的頭等穩(wěn)定位點為lc-t22c，lc-k39c，lc-y49c，lc-y55c，lc-t85c，lc-t97c，lc-r142c，lc-k149c，hc-a140c，hc-l174c，hc-l179c，hc-g371c，hc-y373c，和hc-s424c，而對于-vc接頭綴合至藥物模塊優(yōu)選的頭等穩(wěn)定位點為lc-i106c，lc-r108c，lc-v205c，hc-t110c(kabat編號方式)，hc-t187c，hc-t209c，hc-v262c，hc-g371c，hc-e382c，hc-n434c，依照eu編號方式(見圖21)。如此，只有hc-g371c是該篩選中對于pds和-vc而言的頭等位點。因而，確定哪些位點在將藥物模塊用pds或-vc接頭任一綴合至半胱氨酸改造抗體時對于穩(wěn)定性運作最好，是無法預(yù)測的且需要大量的實驗。thiomabtm抗體的硫醇反應(yīng)性可以通過美國專利no.7,521,541(通過援引將其完整收錄)中記載的生物素化和鏈霉親合素結(jié)合來測量全長igg半胱氨酸改造抗體(thiomabtm抗體)的硫醇反應(yīng)性。具體而言，可以建立western印跡測定法以篩選與生物素-馬來酰亞胺特異性綴合的thiomabtm抗體。在此測定法中，可以在還原性sds-page上分析抗體并通過與鏈霉親合素-hrp一起溫育來特異性探查生物素的存在。取決于使用哪種改造的cys變體，能在重鏈或輕鏈中觀察到鏈霉親合素-hrp相互作用，并且可以將結(jié)合與沒有改造的半胱氨酸的野生型igg的生物素-鏈霉親合素相互作用比較，由此指示與野生型抗體的任何背景結(jié)合相比哪些thiomabtm抗體特異性綴合生物素?？贵w-藥物綴合物本發(fā)明的半胱氨酸改造抗體可以與任意的治療劑，即藥物模塊綴合，所述的治療劑可以通過反應(yīng)性半胱氨酸硫醇基團與抗體共價結(jié)合。對于例示性目的，將本文中提供的表中公開的半胱氨酸改造抗體綴合至美登木素生物堿藥物，具體是mmae?？贵w-藥物綴合物(adc)化合物的典型實施方案包含半胱氨酸改造抗體(ab)和藥物模塊(d)，其中抗體具有一個或多個游離半胱氨酸氨基酸，并且抗體通過接頭模塊(l)經(jīng)由一個或多個游離半胱氨酸氨基酸附著至d；該組成具有式i：ab-(l-d)pi其中p為1，2，3或4?？梢酝ㄟ^硫醇反應(yīng)接頭模塊與抗體分子綴合的藥物模塊的數(shù)量受到通過本文所述方法引入的半胱氨酸殘基數(shù)量的限制。式i的典型adc由此包含具有1，2，3或4個改造的半胱氨酸氨基酸的抗體?？贵w-藥物綴合物化合物(adc)的另一個典型實施方案包含半胱氨酸改造抗體(ab)，清蛋白-結(jié)合肽(abp)和藥物模塊(d)，其中抗體通過接頭模塊(l)與藥物模塊結(jié)合并且抗體通過酰胺鍵或第二種接頭模塊與清蛋白-結(jié)合肽結(jié)合；該組成具有式ia:abp-ab-(l-d)pia其中p為1，2，3或4。本發(fā)明的adc化合物包括那些用于抗癌活性的化合物。特別地，化合物包括與藥物模塊，即毒素，通過接頭與之綴合，即與之共價結(jié)合的半胱氨酸-改造的抗體。當(dāng)所述藥物不與抗體綴合時，藥物具有細胞毒性或抑制細胞效應(yīng)。由此通過與抗體綴合調(diào)節(jié)藥物模塊的生物學(xué)活性。本發(fā)明的抗體-藥物綴合物(adc)將有效劑量的細胞毒性劑選擇性地遞送至腫瘤組織，由此可以實現(xiàn)更大的選擇性，即較低的效應(yīng)劑量(efficaciousdose)。藥物模塊抗體-藥物綴合物(adc)的藥物模塊(d)包括具有細胞毒性或抑制細胞效應(yīng)的任意化合物，模塊(moiety)或基團。藥物模塊包括：(i)可以起微管蛋白抑制劑，有絲分裂抑制劑，拓撲異構(gòu)酶抑制劑或dna嵌入劑作用的化療劑；(ii)可以通過酶促方式起作用的蛋白毒素；和(iii)放射性同位素。典型的藥物模塊包括，但不限于美登木素生物堿，奧瑞司他汀，多拉司他汀(dolastatin)，單端孢霉烯(trichothecene)，cc1065，加利車霉素(calicheamicin)和其它烯二炔類(enediyne)抗生素，紫杉烷(taxane)，吡咯并苯并二氮雜卓(pbd)，1-(氯甲基)-2,3-二氫-1h-苯并[e]吲哚(cbi)二聚體，cbi-pbd異二聚體，蒽環(huán)類抗生素(anthracycline)及其立體異構(gòu)體，同電子排列體(isostere)，類似物或衍生物。適合于用作美登木素生物堿藥物模塊的美登素化合物為本領(lǐng)域眾所周知并且可以按照公知方法分離自天然來源，使用遺傳工程技術(shù)生產(chǎn)(參見yu等(2002)proc.nat.acad.sci.(usa)99:7968-7973)或按照已知方法通過合成制備的美登醇和美登醇類似物。典型的美登木素生物堿藥物模塊包括那些具有修飾的芳族環(huán)的，諸如：c-19-去氯(us4256746)(通過ansamytocinp2的氫化鋁鋰還原制備)；c-20-羥基(或c-20-去甲基)+/-c-19-去氯(美國專利no.4,361,650和4,307,016)(通過使用鏈霉菌屬(streptomyces)或放線菌屬(actinomyces)脫甲基化或使用lah脫氯制備)；和c-20-去甲氧基，c-20-酰氧基(ocor)，+/-去氯(美國專利no.4,294,757)(通過使用?；弱；苽?和那些在其它位置上具有修飾的。典型的美登木素生物堿藥物模塊還包括那些具有諸如如下修飾的：c-9-sh(us4424219)(通過使美登醇與h2s或p2s5反應(yīng)制備)；c-14-烷氧基甲基(去甲氧基/ch2or)(us4331598)；c-14-羥甲基或酰氧基甲基(ch2oh或ch2oac)(us4450254)(由nocardia制備)；c-15-羥基/酰氧基(us4364866)(通過由鏈霉菌屬轉(zhuǎn)化美登醇制備)；c-15-甲氧基(us4313946和4315929)(分離自trewianudlflora)；c-18-n-去甲基(us4362663和4322348)(通過用鏈霉菌屬使美登醇脫甲基化制備)；和4,5-脫氧(us4371533)(通過美登醇的三氯化酞/lah還原制備)。已知美登素化合物上的許多位置用作連接位置，這取決于連接的類型。例如，為了形成酯鍵，具有羥基的c-3位，用羥甲基修飾的c-14位，用羥基修飾的c-15位和具有羥基的c-20位均是合適的。式i的抗體-藥物綴合物(adc)的藥物模塊(d)包括具有如下結(jié)構(gòu)的美登木素生物堿：其中波狀線表示d的硫原子與抗體-藥物綴合物(adc)的接頭(l)共價結(jié)合。r可以獨立為h或c1-c6烷基，所述的c1-c6烷基選自甲基，乙基，1-丙基，2-丙基，1-丁基，2-甲基-1-丙基，2-丁基，2-甲基-2-丙基，1-戊基，2-戊基，3-戊基，2-甲基-2-丁基，3-甲基-2-丁基，3-甲基-1-丁基，2-甲基-1-丁基，1-己基，2-己基，3-己基，2-甲基-2-戊基，3-甲基-2-戊基，4-甲基-2-戊基，3-甲基-3-戊基，2-甲基-3-戊基，2,3-二甲基-2-丁基和3,3-二甲基-2-丁基。使酰胺基與硫原子結(jié)合的亞烷基鏈可以為甲烷基(methanyl)，乙烷基(ethanyl)或丙基，即m為1，2或3。美登素化合物通過抑制有絲分裂過程中的微管蛋白形成抑制細胞增殖，所述的抑制有絲分裂過程中的微管蛋白形成通過抑制微管蛋白，即微管素的聚合來進行(remillard等(1975)science189:1002-1005)。美登素和美登木素生物堿具有高度毒性，但其在癌癥療法中的臨床應(yīng)用因其主要由于對腫瘤的選擇性差導(dǎo)致的嚴重的全身副作用而非常有限。因?qū)χ袠猩窠?jīng)系統(tǒng)和胃腸系統(tǒng)的嚴重不良作用而已中斷了使用美登素的臨床試驗(issel等(1978)can.treatment.rev.5:199-207)。美登木素生物堿藥物模塊為抗體-藥物綴合物中有吸引力的藥物模塊，因為它們：(i)相對易于接近以便通過發(fā)酵或化學(xué)修飾，衍生發(fā)酵產(chǎn)物來制備；(ii)易于使用適合于通過非二硫化物接頭與抗體綴合的官能基衍生；(iii)在血漿中穩(wěn)定；和(iv)對多種腫瘤細胞系有效(us2005/0169933；wo2005/037992；us5208020)。作為其它藥物模塊，對本發(fā)明的化合物而言，關(guān)注美登木素生物堿藥物模塊的所有立體異構(gòu)體，即在d的手性碳上的r和s構(gòu)型的任意組合。在一個實施方案中，美登木素生物堿藥物模塊(d)具有下列立體化學(xué)：美登木素生物堿藥物模塊的典型實施方案包括:dm1，(cr2)m＝ch2ch2；dm3，(cr2)m＝ch2ch2ch(ch3)；和dm4，(cr2)m＝ch2ch2c(ch3)2，它們具有如下結(jié)構(gòu)：根據(jù)連接類型的不同，接頭可以在不同位置上與美登木素生物堿分子結(jié)合。例如，可以通過使用常規(guī)偶聯(lián)技術(shù)與羥基反應(yīng)形成酯鍵。該反應(yīng)可以在具有羥基的c-3位置，使用羥甲基修飾的c-14位置，使用羥基修飾的c-15位置和具有羥基的c-20上進行。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述鍵在美登醇或美登醇類似物的c-3位置上形成。式i的抗體-藥物綴合物(adc)的藥物模塊(d)還包括多拉司他汀及其肽類似物和衍生物奧瑞司他汀(美國專利us5635483；5780588)。已經(jīng)證實多拉司他汀和奧瑞司他汀可干擾微管動力學(xué)，gtp水解以及核和細胞分裂(woyke等(2001)antimicrob.agentsandchemother.45(12):3580-3584)并且具有抗癌(us5663149)和抗真菌活性(pettit等(1998)antimicrob.agentschemother.42:2961-2965)。多拉司他汀或奧瑞司他汀藥物模塊的不同形式可以通過肽藥物模塊的n(氨基)末端或c(羧基)末端與抗體共價結(jié)合(wo02/088172；doronina等(2003)naturebiotechnology21(7):778-784；francisco等(2003)blood102(4):1458-1465)。藥物模塊包括多拉司他汀，奧瑞司他汀(us5635483；us5780588；us5767237；us6124431)及其類似物和衍生物。已經(jīng)證實多拉司他汀和奧瑞司他汀可干擾微管動力學(xué)，gtp水解以及核和細胞分裂(woyke等(2001)antimicrob.agentsandchemother.45(12):3580-3584)并且具有抗癌(us5663149)和抗真菌活性(pettit等(1998)antimicrob.agentschemother.42:2961-2965)。多拉司他汀或奧瑞司他汀藥物模塊可以通過肽藥物模塊的n(氨基)末端或c(羧基)末端與抗體結(jié)合(wo02/088172)。典型奧瑞司他汀實施方案包括n-末端連接的單甲基奧瑞司他汀藥物模塊de和df，其披露在下列文獻中：us7498298和us7659241，特別將這些文獻各自全部披露的內(nèi)容引入本文作為參考。式i的抗體-藥物綴合物(adc)的藥物模塊(d)包括通過n-末端與抗體連接的單甲基奧瑞司他汀藥物模塊mmae和mmaf，并且具有如下結(jié)構(gòu)：例示性mmaeadc顯示于圖11和12。一般而言，可以通過在兩種或多種氨基酸和/或肽片段之間形成肽鍵制備基于肽的藥物模塊。例如，可以按照肽化學(xué)領(lǐng)域眾所周知的液相合成法制備這類肽鍵(參見e.和k.lübke,“thepeptides”,volume1,pp76-136,1965,academicpress)。藥物模塊包括加利車霉素及其類似物和衍生物。加利車霉素族抗生素能夠產(chǎn)生亞-皮摩爾濃度的雙鏈dna斷裂。為了制備加利車霉素族抗生素的綴合物，參見us5712374；us5714586；us5739116；us5767285；us5770701,us5770710；us5773001；us5877296?？梢允褂玫募永嚸顾氐慕Y(jié)構(gòu)類似物包括，但不限于γ1i，α2i，α3i，n-乙?；?γ1i，psag和θi1(hinman等cancerresearch53:3336-3342(1993),lode等cancerresearch58:2925-2928(1998)。在一些實施方案中，adc包含吡咯并苯并二氮雜卓(pbd)。在一些實施方案中，pdb二聚體識別并結(jié)合特定dna序列。天然產(chǎn)物安曲霉素(anthramycin)(一種pbd)首次報告于1965年(leimgruberetal.(1965)j.am.chem.soc.87:5793-5795；leimgruberetal.(1965)j.am.chem.soc.87:5791-5793)。自此以后，報告了一些pbd(天然發(fā)生的和類似物二者)(thurstonetal.(1994)chem.rev.1994，433-465)，包括三環(huán)pbd支架的二聚體(us6,884,799；us7,049,311；us7,067,511；us7,265,105；us7,511,032；us7,528,126；us7,557,099)。并非意圖限于任何特定理論，認為二聚體結(jié)構(gòu)賦予適宜的三維形狀以實現(xiàn)與b型dna的小溝的同螺旋度(isohelicity)，導(dǎo)致在結(jié)合位點處的緊密貼合(kohn，inantibioticsiii.springer-verlag，newyork，pp.3-11(1975)；hurleyandneedham-vandevanter(1986)acc.chem.res.19:230-237)。攜帶c2芳基取代基的二聚pbd化合物已經(jīng)顯示出作為細胞毒劑是有用的(hartleyetal.(2010)cancerres.70(17):6849-6858；antonow(2010)j.med.chem.53(7):2927-2941；howardetal.(2009)bioorganicandmed.chem.letters19(22):6463-6466)。在一些實施方案中，可采用pbd化合物作為藥物前體，這通過用在體內(nèi)可移除的氮保護基團在n10位置處保護它們來實現(xiàn)(wo00/12507；wo2005/023814)。在一些實施方案中，免疫綴合物包含綴合至一個或多個加利車霉素分子的抗體?？股氐募永嚸顾丶易寮捌漕愃莆锬軌蛞詠喥つ枬舛壬呻p鏈dna斷裂(hinmanetal.，(1993)cancerresearch53:3336-3342；lodeetal.，(1998)cancerresearch58:2925-2928)。加利車霉素具有細胞內(nèi)作用位點，但是在某些情況中，不容易穿過質(zhì)膜。因此，在一些實施方案中，這些藥劑經(jīng)由抗體介導(dǎo)的內(nèi)在化的細胞攝取可能大大增強它們的細胞毒效應(yīng)。制備具有加利車霉素藥物模塊的抗體-藥物綴合物的非限制性例示性方法記載于例如us5,712,374；us5,714,586；us5,739,116；和us5,767,285。在一些實施方案中，綴合至抗體的加利車霉素藥物模塊為具有下式的化合物：其中x為br或i；l為接頭；r為氫，c1-6烷基，或-c(＝o)c1-6烷基；且ra為氫或c1-6烷基。在一些實施方案中，x為br，ra為氫且r為異丙基。在其它實施方案中，x為br，ra為氫且r為乙基。在其它實施方案中，x為i，ra為氫且r為異丙基。在其它實施方案中，x為i，ra為氫且r為乙基。在一些實施方案中，x為br，ra為氫且r為-c(＝o)ch3。在其它實施方案中，x為i，ra為氫且r為-c(＝o)ch3。在其它實施方案中，x為i，ra為乙基且r為-c(＝o)ch3。在其它實施方案中，x為br，ra為乙基且r為-c(＝o)ch3。已經(jīng)將pbd二聚體綴合至抗體，而且所得adc顯示出具有抗癌特性(us2010/0203007)。pbd二聚體上的非限制性例示性連接位點包括五元吡咯環(huán)，pbd單元之間的系鏈，和n10-c11亞胺基團(wo2009/016516；us2009/304710；us2010/047257；us2009/036431；us2011/0256157；wo2011/130598)。在一些實施方案中，adc包含吡咯并苯并二氮雜卓(pbd)。在一些實施方案中，pdb二聚體識別并結(jié)合特定dna序列。天然產(chǎn)物安曲霉素(anthramycin)(一種pbd)首次報告于1965年(leimgruberetal.(1965)j.am.chem.soc.87:5793-5795；leimgruberetal.(1965)j.am.chem.soc.87:5791-5793)。自此以后，報告了一些pbd(天然發(fā)生的和類似物二者)(thurstonetal.(1994)chem.rev.1994，433-465)，包括三環(huán)pbd支架的二聚體(us6,884,799；us7,049,311；us7,067,511；us7,265,105；us7,511,032；us7,528,126；us7,557,099)。并非意圖限于任何特定理論，認為二聚體結(jié)構(gòu)賦予適宜的三維形狀以實現(xiàn)與b型dna的小溝的同螺旋度(isohelicity)，導(dǎo)致在結(jié)合位點處的緊密貼合(kohn，inantibioticsiii.springer-verlag，newyork，pp.3-11(1975)；hurleyandneedham-vandevanter(1986)acc.chem.res.19:230-237)。攜帶c2芳基取代基的二聚pbd化合物已經(jīng)顯示出作為細胞毒劑是有用的(hartleyetal.(2010)cancerres.70(17):6849-6858；antonow(2010)j.med.chem.53(7):2927-2941；howardetal.(2009)bioorganicandmed.chem.letters19(22):6463-6466)。在一些實施方案中，可采用pbd化合物作為藥物前體，這通過用在體內(nèi)可移除的氮保護基團在n10位置處保護它們來實現(xiàn)(wo00/12507；wo2005/023814)。adc的非限制性例示性pbd二聚體構(gòu)件為式a：及其鹽和溶劑合物，其中：波形線表示共價附著至接頭的位點；虛線表示c1與c2或c2與c3之間任選存在雙鍵；r2獨立地選自h，oh，＝o，＝ch2，cn，r，or，＝ch-rd，＝c(rd)2，o-so2-r，co2r和cor，且任選還選自鹵素或二鹵素，其中rd獨立地選自r，co2r，cor，cho，co2h，和鹵素；r6和r9獨立地選自h，r，oh，or，sh，sr，nh2，nhr，nrr’，no2，me3sn和鹵素；r7獨立地選自h，r，oh，or，sh，sr，nh2，nhr，nrr’，no2，me3sn和鹵素；q獨立地選自o，s和nh；r11或為h，或為r，或在q為o的情況下為so3m，其中m為金屬陽離子；r和r’各自獨立地選自任選取代的c1-8烴基，c1-12烴基，c3-8雜環(huán)基，c3-20雜環(huán)，和c5-20芳基基團，且任選涉及基團nrr’時，r和r’與它們所附著的氮原子一起形成任選取代的4，5，6或7元雜環(huán)環(huán)；r12，r16，r19和r17分別如為r2，r6，r9和r7定義的；r”為c3-12亞烴基基團，該鏈可以由一個或多個雜原子(例如o，s，n(h)，nme)和/或芳香環(huán)(例如苯或吡啶)(該環(huán)是任選取代的)中斷；且x和x’獨立地選自o，s和n(h)。在一些實施方案中，r和r’各自獨立選自任選取代的c1-12烴基，c3-20雜環(huán)，和c5-20芳基，且任選涉及基團nrr’時，r和r’與它們所附著的氮原子一起形成任選取代的4，5，6或7元雜環(huán)環(huán)。在一些實施方案中，r9和r19為h。在一些實施方案中，r6和r16為h。在一些實施方案中，r7和r17均為or7a，其中r7a為任選取代的c1-4烴基。在一些實施方案中，r7a為me。在一些實施方案中，r7a為ch2ph，其中ph為苯基基團。在一些實施方案中，x為o。在一些實施方案中，r11為h。在一些實施方案中，每一個單體單元中的c2與c3之間存在雙鍵。在一些實施方案中，r2和r12獨立選自h和r。在一些實施方案中，r2和r12獨立為r。在一些實施方案中，r2和r12獨立為任選取代的c5-20芳基或c5-7芳基或c8-10芳基。在一些實施方案中，r2和r12獨立為任選取代的苯基，噻吩基，萘基，吡啶基，喹啉基，或異喹啉基。在一些實施方案中，r2和r12獨立選自＝o，＝ch2，＝ch-rd，和＝c(rd)2。在一些實施方案中，r2和r12各自為＝ch2。在一些實施方案中，r2和r12各自為h。在一些實施方案中，r2和r12各自為＝o。在一些實施方案中，r2和r12各自為＝cf2。在一些實施方案中，r2和/或r12獨立為＝c(rd)2。在一些實施方案中，r2和/或r12獨立為＝ch-rd。在一些實施方案中，當(dāng)r2和/或r12為＝ch-rd時，每一個基團可獨立具有下文所示任一構(gòu)型：在一些實施方案中，一個＝ch-rd處于構(gòu)型(i)。在一些實施方案中，r”為c3亞烴基基團或c5亞烴基基團。在一些實施方案中，adc的一種例示性pbd二聚體構(gòu)件具有式a(i)的結(jié)構(gòu)：其中n為0或1。在一些實施方案中，adc的一種例示性pbd二聚體構(gòu)件具有式a(ii)的結(jié)構(gòu)：其中n為0或1。在一些實施方案中，adc的一種例示性pbd二聚體構(gòu)件具有式a(iii)的結(jié)構(gòu)：其中re和re”各自獨立選自h或rd，其中rd如上文定義的；且其中n為0或1。在一些實施方案中，n為0。在一些實施方案中，n為1。在一些實施方案中，re和/或re”為h。在一些實施方案中，re和re”為h。在一些實施方案中，re和/或re”為rd，其中rd為任選取代的c1-12烴基。在一些實施方案中，re和/或re”為rd，其中rd為甲基。在一些實施方案中，adc的一種例示性pbd二聚體構(gòu)件具有式a(iv)的結(jié)構(gòu)：其中ar1和ar2各自獨立為任選取代的c5-20芳基；其中ar1和ar2可以是相同的或不同的；且其中n為0或1。在一些實施方案中，adc的一種例示性pbd二聚體構(gòu)件具有式a(v)的結(jié)構(gòu)：其中ar1和ar2各自獨立為任選取代的c5-20芳基；其中ar1和ar2可以是相同的或不同的；且其中n為0或1。在一些實施方案中，ar1和ar2各自獨立選自任選取代的苯基，呋喃基，硫苯基和吡啶基。在一些實施方案中，ar1和ar2各自獨立為任選取代的苯基。在一些實施方案中，ar1和ar2各自獨立為任選取代的噻吩-2-基或噻吩-3-基。在一些實施方案中，ar1和ar2各自獨立為任選取代的喹啉基或異喹啉基。喹啉基或異喹啉基基團可以經(jīng)由任何可利用環(huán)位置結(jié)合至pbd核。例如，喹啉基可以是喹啉-2-基，喹啉-3-基，喹啉-4-基，喹啉-5-基，喹啉-6-基，喹啉-7-基和喹啉-8-基。在一些實施方案中，喹啉基選自喹啉-3-基和喹啉-6-基。異喹啉基可以是異喹啉-1-基，異喹啉-3-基，異喹啉-4-基，異喹啉-5-基，異喹啉-6-基，異喹啉-7-基和異喹啉-8-基。在一些實施方案中，異喹啉基選自異喹啉-3-基和異喹啉-6-基。adc的別的非限制性例示性pbd二聚體構(gòu)件為式b：及其鹽和溶劑合物，其中：波形線表示共價附著至接頭的位點；連接至oh的波形線表示s或r構(gòu)型；rv1和rv2獨立選自h，甲基，乙基和苯基(苯基可以是任選用氟取代的，特別是在4位)和c5-6雜環(huán)基；其中rv1和rv2可以是相同的或不同的；且n為0或1。在一些實施方案中，rv1和rv2獨立選自h，苯基，和4-氟苯基。在一些實施方案中，接頭可附著于pbd二聚體藥物模塊的多個位點之一，包括b環(huán)的n10亞胺，c環(huán)的c-2內(nèi)/外位，或連接a環(huán)的系鏈單元(見下文結(jié)構(gòu)c(i)和c(ii))。adc的非限制性例示性pbd二聚體構(gòu)件包括式c(i)和c(ii)：式c(i)和c(ii)以它們的n10-c11亞胺形式顯示。例示性pbd藥物模塊還包括甲醇胺以及受到保護的甲醇胺形式，如下文表中顯示的：其中：x為ch2(n＝1至5)，n，或o；z和z’獨立選自or和nr2，其中r為含有1至5個碳原子的伯，仲或叔烴基鏈；r1，r’1，r2和r’2各自獨立選自h，c1-c8烷基，c2-c8烯基，c2-c8炔基，c5-20芳基(包括取代的芳基)，c5-20雜芳基基團，-nh2，-nhme，-oh，和-sh，其中，在一些實施方案中，烷基，烯基和炔基鏈包含多至5個碳原子；r3和r’3獨立選自h，or，nhr，和nr2，其中r為含有1至5個碳原子的伯，仲或叔烴基鏈；r4和r’4獨立選自h，me，和ome；r5選自c1-c8烷基，c2-c8烯基，c2-c8炔基，c5-20芳基(包括用鹵素，硝基，氰基，烴氧基，烴基，雜環(huán)基取代的芳基)和c5-20雜芳基基團，其中，在一些實施方案中，烷基，烯基和炔基鏈包含多至5個碳原子；r11為h，c1-c8烴基，或保護基團(諸如乙?；阴；?，叔丁氧羰基(boc)，芐氧羰基(cbz)，9-芴基甲基烯酰基羰基(fmoc)，或包含自我犧牲單元的模塊諸如纈氨酸-瓜氨酸-pab)；r12為h，c1-c8烴基，或保護基團；其中r1，r’1，r2，r’2，r5，或r12之一的一個氫或a環(huán)之間的-och2ch2(x)nch2ch2o-間隔物的一個氫用連接至adc的接頭的鍵替換。adc的例示性pdb二聚體部分包括但不限于(波形線表示共價附著至接頭的位點)：pbd二聚體。包含pbd二聚體的adc的非限制性例示性實施方案具有下示結(jié)構(gòu)：pbd二聚體-val-cit-pab-ab；pbd二聚體-phe-lys-pab-ab，其中：n為0至12。在一些實施方案中，n為2至10。在一些實施方案中，n為4至8。在一些實施方案中，n選自4，5，6，7，和8。在一些實施方案中，本文所述包含pbd二聚體的adc可以通過將包括吡啶離去基團的接頭-藥物中間體經(jīng)由硫原子與抗體的半胱氨酸硫醇綴合以形成二硫化物連接來生成。進一步地，在一些實施方案中，本文所述包含pbd二聚體的adc可以通過綴合包括硫代吡啶基離去基團的接頭-藥物中間體來生成，其中吡啶環(huán)是用一個或多個硝基基團取代的。在一些實施方案中，吡啶環(huán)是用-no2單取代的。在一些實施方案中，-no2單取代相對于二硫化物是對位的。在一些實施方案中，pbd二聚體是經(jīng)由n10位置連接的。例如，非限制性的例示性的包含pbd二聚體的adc可以通過將單甲基乙基吡啶基二硫化物，n10連接的pbd接頭中間體(下文所示)綴合至抗體來生成：pbd二聚體-val-cit-pab-ab和pbd二聚體-phe-lys-pab-ab的接頭是蛋白酶可切割的，而pbd二聚體-馬來酰亞胺-乙縮醛的接頭是酸不穩(wěn)定的。pbd二聚體和包含pbd二聚體的adc可依照本領(lǐng)域已知方法來制備。參見例如wo2009/016516；us2009/304710；us2010/047257；us2009/036431；us2011/0256157；wo2011/130598；wo2013/055987。在一些實施方案中，adc包含蒽環(huán)類抗生素。蒽環(huán)類抗生素是展現(xiàn)細胞毒性活性的抗生化合物。并非意圖限于任何特定理論，研究已經(jīng)指出蒽環(huán)類抗生素可通過多種不同機制運作來殺傷細胞，包括：1)將藥物分子插入細胞的dna中，由此抑制dna依賴性核酸合成；2)由藥物生成自由基，然后自由基與細胞高分子反應(yīng)以引起對細胞的損害，和/或3)藥物分子與細胞膜相互作用(參見例如c.petersonetal.，“transportandstorageofanthracyclineinexperimentalsystemsandhumanleukemia”inanthracyclineantibioticsincancertherapy；n.r.bachur，“freeradicaldamage”id.atpp.97-102)。由于它們的細胞毒性潛力，蒽環(huán)類抗生素已經(jīng)用于治療眾多癌癥，諸如白血病，乳腺癌，肺癌，卵巢腺癌和肉瘤(參見例如p.h-wiernik，inanthracycline：currentstatusandnewdevelopmentsp11)。非限制性例示性蒽環(huán)類抗生素包括多柔比星，表柔比星，伊達比星，道諾霉素，奈莫柔比星，及其衍生物。已經(jīng)制備并研究柔紅霉素和多柔比星的免疫綴合物和藥物前體(kratzetal.(2006)currentmed.chem.13:477-523；jeffreyetal.(2006)bioorganic&med.chem.letters16:358-362；torgovetal.(2005)bioconj.chem.16:717-721；nagyetal.(2000)proc.natl.acad.sci.usa97:829-834；dubowchiketal.(2002)bioorg.&med.chem.letters12:1529-1532；kingetal.(2002)j.med.chem.45:4336-4343；ep0328147；us6,630,579)?？贵w-藥物綴合物br96-多柔比星與腫瘤相關(guān)抗原lewis-y特異性反應(yīng)，而且已經(jīng)在i和ii期研究中進行評估(salehetal.(2000)j.clin.oncology18:2282-2292；ajanietal.(2000)cancerjour.6:78-81；tolcheretal.(1999)j.clin.oncology17:478-484)。pnu-159682是一種有力的奈莫柔比星代謝物(或衍生物)(quintierietal.(2005)clinicalcancerresearch11(4):1608-1617)。奈莫柔比星是多柔比星的一種半合成類似物，在多柔比星的糖苷氨基上具有2-甲氧基嗎啉基團，而且已經(jīng)處于臨床評估(grandietal.(1990)cancertreat.rev.17:133；ripamontietal.(1992)brit.j.cancer65:703)，包括針對肝細胞癌瘤的ii/iii期試驗(sunetal.(2003)proceedingsoftheamericansocietyforclinicaloncology22，abs1448；quintieri(2003)proceedingsoftheamericanassociationofcancerresearch44:1sted，abs4649；pacciarinietal.(2006)jour.clin.oncology24:14116)。包含奈莫柔比星或奈莫柔比星衍生物的一種非限制性例示性adc如式ia所示：其中r1為氫原子，羥基或甲氧基基團且r2為c1-c5烴氧基基團，或其藥學(xué)可接受鹽；l1和z一起為本文所述接頭(l)；t為本文所述抗體(ab)；且m為1至約20。在一些實施方案中，m為1至10，1至7，1至5，或1至4。在一些實施方案中，r1和r2二者為甲氧基(-ome)。包含奈莫柔比星或奈莫柔比星衍生物的又一種非限制性例示性adc如式ib所示：其中r1為氫原子，羥基或甲氧基基團且r2為c1-c5烴氧基基團，或其藥學(xué)可接受鹽；l2和z一起為本文所述接頭(l)；t為本文所述抗體(ab)；且m為1至約20。在一些實施方案中，m為1至10，1至7，1至5，或1至4。在一些實施方案中，r1和r2二者為甲氧基(-ome)。在一些實施方案中，含奈莫柔比星的adc的奈莫柔比星構(gòu)件為pnu-159682。在一些此類實施方案中，adc的藥物部分可具有下示結(jié)構(gòu)之一：其中波形線表示附著至接頭(l)?？梢越?jīng)由數(shù)個連接位點和多種接頭(us2011/0076287；wo2009/099741；us2010/0034837；wo2010/009124)(包括本文所述接頭)將蒽環(huán)類抗生素(包括pnu-159682)綴合至抗體。包含奈莫柔比星和接頭的例示性adc包括但不限于：pnu-159682馬來酰亞胺乙縮醛-ab；pnu-159682-val-cit-pab-ab；pnu-159682-val-cit-pab-間隔物-ab；pnu-159682-val-cit-pab-間隔物(r1r2)-ab，其中：r1和r2獨立選自h和c1-c6烴基；和pnu-159682-馬來酰亞胺-ab。pnu-159682馬來酰亞胺乙縮醛-ab的接頭是酸不穩(wěn)定的，而pnu-159682-val-cit-pab-ab，pnu-159682-val-cit-pab-間隔物-ab，和pnu-159682-val-cit-pab-間隔物(r1r2)-ab的接頭是蛋白酶可切割的。例示性pnuadc顯示于圖10d和10e。在一些實施方案中，adc包含1-(氯甲基)-2,3-二氫-1h-苯并[e]吲哚(cbi)。5-氨基-1-(氯甲基)-1,2-二氫-3h-苯并[e]吲哚(氨基cbi)類的dna小溝烷化劑是有力的細胞毒素(atwelletal.(1999)j.med.chem.,42:3400)，而且已經(jīng)作為效應(yīng)器單元用于為癌癥療法設(shè)計的多類前體藥物。這些包括抗體綴合物(jeffreyetal.(2005)j.med.chem.,48:1344)，基于氨基甲酸硝基芐酯的用于基因療法的前體藥物(hayetal.(2003)j.med.chem.46:2456)和作為缺氧活化的前體藥物的相應(yīng)硝基cbi衍生物(terceletal.(2011)angew.chem.,int.ed.,50:2606-2609)。已經(jīng)通過烷基鏈將cbi和吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮雜卓(pbd)藥效團連接到一起(terceletal.(2003)j.med.chem46:2132-2151)。在一些實施方案中，adc包含1-(氯甲基)-2,3-二氫-1h-苯并[e]吲哚(cbi)二聚體(wo2015/023355)。一種例示性cbi二聚體adc顯示于圖10b。在一些此類實施方案中，該二聚體為異二聚體，其中該二聚體的一半為cbi模塊且該二聚體的另一半為pbd模塊。一種例示性cbi-pbd異二聚體adc顯示于圖10c。在一些實施方案中，cbi二聚體包含式：其中r1選自h，p(o)3h2，c(o)nrarb，或與接頭(l)的鍵；r2選自h，p(o)3h2，c(o)nrarb，或與接頭(l)的鍵；ra和rb獨立選自h和任選用一個或多個f取代的c1-c6烷基，或者ra和rb形成五或六元雜環(huán)基基團；t為選自c3-c12亞烷基，y，(c1-c6亞烷基)-y-(c1-c6亞烷基)，(c1-c6亞烷基)-y-(c1-c6亞烷基)-y-(c1-c6亞烷基)，(c2-c6亞烯基)-y-(c2-c6亞烯基)，和(c2-c6亞炔基)-y-(c2-c6亞炔基)的拴系基團；其中y獨立選自o，s，nr1，芳基，和雜芳基；其中亞烷基，亞烯基，芳基，和雜芳基是獨立且任選用f，oh，o(c1-c6烷基)，nh2，nhch3，n(ch3)2，op(o)3h2，和c1-c6烷基取代的，其中烷基是任選用一個或多個f取代的；或者亞烷基，亞烯基，芳基，和雜芳基是獨立且任選用與l的鍵取代的；d′為藥物模塊，其選自：其中波狀線表示附著至t的位點；x1和x2獨立選自o和nr3，其中r3選自h和任選用一個或多個f取代的c1-c6烷基；r4為h，co2r，或與接頭(l)的鍵，其中r為c1-c6烷基或芐基；且r5為h或c1-c6烷基。在一些實施方案中，免疫綴合物包含綴合一個或多個鵝膏蕈毒素分子的抗體。鵝膏蕈毒素是由8個氨基酸構(gòu)成的環(huán)肽。它們可以自蘑菇鬼筆鵝膏(amanitaphalloides)分離或合成制備。鵝膏蕈毒素特異性抑制哺乳動物細胞的dna依賴性rna聚合酶ii，并由此還抑制受影響細胞的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成。細胞中對轉(zhuǎn)錄的抑制引起生長和增殖停止。見例如moldenhaueretal.jnci104:1-13(2012)，wo2010115629，wo2012041504，wo2012119787，wo2014043403，wo2014135282，和wo2012119787，在此通過援引將它們完整收錄。在一些實施方案中，一個或多個鵝膏蕈毒素分子是一個或多個α-鵝膏蕈毒素分子。其它藥物模塊包括蛋白毒素，諸如：白喉毒素a鏈，白喉毒素的非結(jié)合活性片段，外毒素a鏈(來自銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa))，蓖麻毒蛋白a鏈(ricinachain)(vitetta等(1987)science,238:1098)，相思豆毒蛋白a鏈(abrinachain)，蒴蓮根毒蛋白a鏈(modeccinachain)，α-帚曲霉素(alpha-sarcin)，油桐(aleuritesfordii)毒蛋白，香石竹毒蛋白(dianthinproteins)，美洲商陸(phytolacaamericana)毒蛋白(papi，papii和pap-s)，苦瓜(momordicacharantia)抑制物，麻瘋樹毒蛋白(curcin)，巴豆毒蛋白(crotin)，肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制物，白樹毒蛋白(gelonin)，絲林霉素(mitogellin)，局限曲菌素(restrictocin)，酚霉素(phenomycin)，依諾霉素(enomycin)和單端孢菌素(tricothecenes)(wo93/21232)。應(yīng)當(dāng)理解，在多于一個親核基團與藥物-接頭中間體或與接頭試劑反應(yīng)的情況中，所得產(chǎn)物是具有一個或多個藥物模塊附著于抗體之分布的adc化合物混合物?？赏ㄟ^對抗體特異性的和對藥物特異性的雙重elisa抗體測定法自混合物計算每個抗體的平均藥物數(shù)(dar)?；旌衔镏械母鞣Nadc分子可通過質(zhì)譜術(shù)來鑒定，并通過hplc來分離，例如疏水相互作用層析(參見例如mcdonaghetal.(2006)prot.engr.design&selection19(7):299-307；hamblettetal.(2004)clin.cancerres.10:7063-7070；hamblett，k.j.etal.，“effectofdrugloadingonthepharmacology，pharmacokinetics，andtoxicityofananti-cd30antibody-drugconjugate,”abstractno.624，americanassociationforcancerresearch，2004annualmeeting，march27-31，2004，proceedingsoftheaacr，volume45，march2004；alley，s.c.etal.，“controllingthelocationofdrugattachmentinantibody-drugconjugates,”abstractno.627，americanassociationforcancerresearch，2004annualmeeting，march27-31，2004，proceedingsoftheaacr，volume45，march2004)。在某些實施方案中，可通過電泳或?qū)游鲎跃Y合混合物分離具有單一載荷值的同質(zhì)adc。表18的抗體-藥物綴合物51-58(見實施例16)可以通過依照wo2013/055987；wo2015/023355；wo2010/009124；wo2015/095227的規(guī)程偶聯(lián)藥物模塊與接頭試劑，并與本文所述任何抗體，包括半胱氨酸改造抗體綴合來制備。具體的抗體-藥物綴合物記載于表19(見實施例16)。藥物模塊還包括具有核酸降解活性的化合物(例如核糖核酸酶或dna內(nèi)切核酸酶)。治療放射性同位素包括：32p，33p，90y，125i，131i，131in，153sm，186re，188re，211at，212bi，212pb和lu的放射性同位素。可以按照公知方式將放射性同位素或其它標記摻入綴合物(fraker等(1978)biochem.biophys.res.commun.80:49-57；"monoclonalantibodyinimmunoscintigraphy"chatal,crcpress1989)。碳-14-標記的1-異硫氰酸根合芐基-3-甲二乙烯三胺五乙酸(mx-dtpa)為用于放射性核素與抗體綴合的典型螯合劑(wo94/11026)。別的adc的具體例子呈現(xiàn)于實施例16。接頭“接頭”(l)為可用于連接一個或多個藥物模塊(d)與抗體(ab)以形成式i的抗體-藥物綴合物(adc)的雙官能或多官能模塊。在一些實施方案中，可以使用具有用于共價附著至藥物和抗體的反應(yīng)性官能基的接頭制備抗體-藥物綴合物(adc)。例如，在一些實施方案中，抗體(ab)的半胱氨酸硫醇可以與接頭或藥物-接頭中間體的反應(yīng)性官能基形成鍵以生成adc。一方面，接頭具有能夠與抗體上存在的游離半胱氨酸反應(yīng)以形成共價鍵的官能度。非限制性例示性此類反應(yīng)性官能度包括馬來酰亞胺，鹵代乙酰胺，α-鹵代乙酰基，活化的酯諸如琥珀酰亞胺酯，4-硝基苯基酯，五氟苯基酯，四氟苯基酯，酸酐，氯化酸，磺酰氯，異氰酸酯，和異硫氰酸酯。參見例如klussmanetal.(2004)bioconjugatechemistry15(4):765-773第766頁上的綴合方法及本文中的實施例。在一些實施方案中，接頭具有能夠與抗體上存在的親電子基團反應(yīng)的官能度。例示性此類親電子基團包括但不限于醛和酮羰基。在一些實施方案中，接頭的反應(yīng)性官能度的雜原子能與抗體上的親電子基團反應(yīng)并與抗體單元形成共價鍵。非限制性例示性此類反應(yīng)性官能度包括但不限于酰肼(hydrazide)，肟(oxime)，氨基(amino)，肼(hydrazine)，硫代半卡巴腙(thiosemicarbazone)，肼羧酸酯(hydrazinecarboxylate)，和芳酰肼(arylhydrazide)。接頭可包含一種或多種接頭構(gòu)件。例示性接頭構(gòu)件包括6-馬來酰亞胺基己?；?“mc”)，馬來酰亞胺基丙?；?“mp”)，纈氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)，丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)，對氨基芐氧羰基(“pab”)，n-琥珀酰亞胺基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(“spp”)，和4-(n-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1羧酸酯(“mcc”)。本領(lǐng)域已知多種接頭構(gòu)件，下文描述了其中一些。接頭可以是便于釋放藥物的“可切割接頭”。非限制性例示性可切割接頭包括酸不穩(wěn)定接頭(例如包含腙)，蛋白酶敏感(例如肽酶敏感)接頭，光不穩(wěn)定接頭，或含二硫化物接頭(charietal.(1992)cancerresearch52:127-131；us5,208,020)。在某些實施方案中，接頭具有下示式ii：-aa-ww-yy-ii，其中a為“延伸物單元”(stretcherunit)，而a為0至1的整數(shù)；w為“氨基酸單元”，而w為0至12的整數(shù)；y為“間隔物單元”(spacerunit)，而y是0，1，或2；且ab，d，和p如上文關(guān)于式i定義的。此類接頭的例示性實施方案記載于美國專利no.7,498,298，通過述及明確將其收入本文。在一些實施方案中，接頭構(gòu)件包含將抗體連接至另一接頭構(gòu)件或藥物模塊的“延伸物單元”。非限制性例示性延伸物單元顯示于下文(其中波形線指示共價附著至抗體，藥物，或別的接頭構(gòu)件的位點)：在一些實施方案中，接頭可以是肽模擬物接頭，諸如wo2015/095227，wo2015/095124或wo2015/095223中記載的那些，在此通過援引完整收錄這些文件。一方面，接頭具有反應(yīng)位置，該位置上帶有與存在于抗體上的親核半胱氨酸反應(yīng)的親電子基團?？贵w的半胱氨酸硫醇與接頭上的親電子基團反應(yīng)并且與接頭形成共價鍵。有用的親電子基團包括，但不限于馬來酰亞胺和鹵代乙酰胺基團。半胱氨酸改造抗體與接頭試劑或藥物-接頭中間體，與親電子官能基，諸如馬來酰亞胺或α-鹵代羰基按照klussman等(2004)在bioconjugatechemistry15(4):765-773,766頁上的綴合方法和實施例4的方案反應(yīng)。在又一個實施方案中，接頭試劑或藥物-接頭中間體的反應(yīng)基含有可以與抗體的游離半胱氨酸硫醇形成鍵的硫醇-反應(yīng)性官能基。硫醇-反應(yīng)官能基的實例包括，但不限于：馬來酰亞胺；α-鹵代乙?；?；活化的酯類，諸如琥珀酰亞胺酯類，4-硝基苯基酯類，五氟苯基酯類，四氟苯基酯類；酸酐類；?；阮?；磺酰氯類；異氰酸酯類和異硫氰酸酯類。在另一個實施方案中，接頭可以為樹枝狀類型接頭，其用于通過支化多官能接頭模塊與抗體共價結(jié)合一個以上藥物模塊(sun等(2002)bioorganic&medicinalchemistryletters12:2213-2215；sun等(2003)bioorganic&medicinalchemistry11:1761-1768；king(2002)tetrahedronletters43:1987-1990)。樹枝狀接頭可以增加藥物與抗體的摩爾比，即負荷，它與adc的效能相關(guān)。因此，如果半胱氨酸改造抗體僅帶有一個反應(yīng)性半胱氨酸硫醇基團，那么可以通過樹枝狀接頭結(jié)合眾多藥物模塊。接頭可以包含氨基酸殘基，其使抗體(ab)與本發(fā)明的半胱氨酸改造抗體-藥物綴合物(adc)的藥物模塊(d)連接。氨基酸殘基可以形成二肽，三肽，四肽，五肽，六肽，七肽，八肽，九肽，十肽，十一肽或十二肽單元。氨基酸殘基包括那些天然存在的以及最小的氨基酸和非-天然存在的氨基酸類似物，諸如瓜氨酸?？梢栽O(shè)計和優(yōu)化有用的氨基酸殘基單元在通過特定的酶，例如腫瘤相關(guān)蛋白酶進行酶促裂解中的選擇性，以便釋放活性藥物模塊。在一個實施方案中，氨基酸殘基單元諸如纈氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)是其裂解由組織蛋白酶b，c和d或纖維蛋白溶酶蛋白酶催化的單元。接頭單元可以是自我犧牲(self-immolative)類型的，諸如對-氨基芐基氨基甲?；?pab)單元，其中adc具有如下典型結(jié)構(gòu)：其中q為-c1-c8烷基，-o-(c1-c8烷基)，-鹵素，-硝基或-氰基；m為0-4的整數(shù)；并且p為1-4。自我犧牲的間隔物的其它實例包括，但不限于在帶電方式上與pab基團類似的芳族化合物，諸如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(us7375078；hay等(1999)bioorg.med.chem.lett.9:2237)和鄰位或?qū)ξ?氨基芐基乙縮醛類。可以使用在酰胺鍵水解時進行環(huán)化的間隔物，諸如取代和未被取代的4-氨基丁酸酰胺類(rodrigues等(1995)chemistrybiology2:223)，適當(dāng)取代的雙環(huán)[2.2.1]和雙環(huán)[2.2.2]環(huán)系(storm等(1972)j.amer.chem.soc.94:5815)和2-氨基苯基丙酸酰胺類(amsberry,等(1990)j.org.chem.55:5867)。消去在甘氨酸上被取代的含胺的藥物(kingsbury等(1984)j.med.chem.27:1447)也是用于adcs的自我犧牲的(self-immolative)間隔物的實例。在另一個實施方案中，接頭l可以為用于通過支化多官能接頭模塊使一種以上藥物模塊共價結(jié)合抗體的樹枝狀類型的接頭(dendritictypelinker)(sun等(2002)bioorganic&medicinalchemistryletters12:2213-2215；sun等(2003)bioorganic&medicinalchemistry11:1761-1768)。樹枝狀接頭可以增加藥物與抗體的摩爾比，即負荷，它與adc的效能相關(guān)。因此，如果半胱氨酸改造抗體僅帶有一個反應(yīng)性半胱氨酸硫醇基，那么可以通過樹枝狀接頭結(jié)合眾多藥物模塊(wo2004/01993；szalai等(2003)j.amer.chem.soc.125:15688-15689；shamis等(2004)j.amer.chem.soc.126:1726-1731；amir等(2003)angew.chem.int.ed.42:4494-4499)。式ia抗體-藥物綴合物化合物的實施方案包括(val-cit)，(mc-val-cit)，和(mc-val-cit-pab):式ia抗體-藥物綴合物化合物的其它典型實施方案包括以下結(jié)構(gòu):其中x為：-(ch2)n-，-(ch2ch2o)n-，y為：且r獨立為h或c1-c6烷基；并且n為1-12。在另一個實施方案中，接頭帶有反應(yīng)性官能基，該反應(yīng)性官能基具有與存在于抗體上的親電子基團反應(yīng)的親核基團?？贵w上有用的親電子基團包括，但不限于醛和酮羰基。接頭的親核基團的雜原子可以與抗體上的親電子基團反應(yīng)并且與抗體單元形成共價鍵。接頭上有用的親核基團包括，但不限于酰肼，肟，氨基，肼，縮氨基硫脲(thiosemicarbazone)，肼羧酸酯和芳基酰肼。抗體上的親電子基團提供了用于結(jié)合(附著)接頭的便利位置。一般而言，可以通過在兩種或多種氨基酸和/或肽片段之間形成肽鍵制備肽-類接頭。例如，可以按照肽化學(xué)領(lǐng)域眾所周知的液相合成法(e.和k.lübke(1965)“thepeptides”,volume1,pp76-136,academicpress)制備這類肽鍵。在另一個實施方案中，接頭可以被調(diào)節(jié)溶解性或反應(yīng)性的基團取代。例如，帶電荷的取代基，諸如磺酸基(-so3-)或銨可以增加試劑的水溶性并且有利于接頭試劑與抗體或藥物模塊的偶聯(lián)反應(yīng)，或有利于ab-l(抗體-接頭中間體)與d或d-l(藥物-接頭中間體)與ab的偶聯(lián)反應(yīng)，這取決于用于制備adc的合成途徑。特別關(guān)注本發(fā)明的化合物，但不限于：用如下接頭試劑制備的adc：bmpeo，bmps，emcs，gmbs，hbvs，lc-smcc，mbs，mpbh，sbap，sia，siab，smcc，smpb，smph，磺基-emcs，磺基-gmbs，磺基-kmus，磺基-mbs，磺基-siab，磺基-smcc和磺基-smpb以及svsb(琥珀酰亞胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)；并且包括雙-馬來酰亞胺試劑:dtme，bmb，bmdb，bmh，bmoe，bm(peo)3和bm(peo)4，它們商購自piercebiotechnology,inc.,customerservicedepartment,p.o.box117,rockford,il.61105u.s.a,1-800-874-3723,international+815-968-0747。參見467-498頁,2003-2004applicationshandbookandcatalog，雙-馬來酰亞胺試劑能夠使半胱氨酸改造抗體的硫醇基與含硫醇的藥物模塊，標記或接頭中間體按照依次或同時的方式結(jié)合。除馬來酰亞胺外的其它與半胱氨酸改造抗體，藥物模塊，標記或接頭中間體的硫醇基反應(yīng)的官能基包括碘乙酰胺，溴乙酰胺，乙烯基吡啶，二硫化物，吡啶基二硫化物，異氰酸酯(鹽)和異硫氰酸酯(鹽)。還可以通過其它商業(yè)渠道，諸如molecularbiosciencesinc.(boulder,co)獲得或按照下列文獻中所述的操作步驟合成有用的接頭試劑：toki等(2002)j.org.chem.67:1866-1872；walker,m.a.(1995)j.org.chem.60:5352-5355；frisch等(1996)bioconjugatechem.7:180-186；us6214345；wo02/088172；us2003130189；us2003096743；wo03/026577；wo03/043583；和wo04/032828。具有馬來酰亞胺延伸物和對-氨基芐基氨基甲?；?pab)自我犧牲的間隔物的典型纈氨酸-瓜氨酸(val-cit或vc)二肽接頭試劑具有如下結(jié)構(gòu)：其中q為-c1-c8烷基，-o-(c1-c8烷基)，-鹵素，-硝基或-氰基；且m為0-4的整數(shù)。可以按照dubowchik等(1997)tetrahedronletters,38:5257-60所述制備具有馬來酰亞胺延伸物單元和對-氨基芐基自我犧牲的間隔物的典型phe-lys(mtr)二肽接頭試劑并且其具有如下結(jié)構(gòu)：其中mtr為一-4-甲氧基三苯甲基，q為-c1-c8烷基，-o-(c1-c8烷基)，-鹵素，-硝基或-氰基；且m為0-4的整數(shù)。本發(fā)明典型的抗體-藥物綴合物化合物包括：其中val為纈氨酸；cit為瓜氨酸；p為1，2，3或4；且ab為半胱氨酸改造抗體。其它典型的抗體-藥物綴合物具有如下結(jié)構(gòu)，其中美登木素生物堿藥物模塊dm1通過bmpeo接頭與曲妥珠單抗的硫醇基連接：其中ab為半胱氨酸改造抗體；n為0，1或2；和p為1，2，3或4?？贵w-藥物綴合物的制備可以通過幾種途徑，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的有機化學(xué)反應(yīng)，條件和試劑制備式i的adc，包括：(1)半胱氨酸改造抗體的半胱氨酸基團與接頭試劑反應(yīng)，從而通過共價鍵形成抗體-接頭中間體ab-l，隨后與活化的藥物模塊d反應(yīng)；和(2)使藥物模塊的親核基團與接頭試劑反應(yīng)，從而通過共價鍵形成藥物-接頭中間體d-l，隨后與半胱氨酸改造抗體的半胱氨酸基團反應(yīng)。綴合方法(1)和(2)可以用于各種半胱氨酸改造抗體，藥物模塊和接頭以便制備式i的抗體-藥物綴合物。抗體半胱氨酸硫醇基為親核性的并且能夠與接頭試劑和藥物-接頭中間體上的親電子基團反應(yīng)而形成共價鍵，所述的藥物-接頭中間體包括：(i)活性酯類，諸如nhs酯類，hobt酯類，鹵代甲酸酯類和?；u類；(ii)烷基和芐基鹵化物，諸如鹵代乙酰胺類；(iii)醛類，酮類，羧基和馬來酰亞胺基；和(iv)通過硫化物交換的二硫化物，包括吡啶基二硫化物。藥物模塊上的親核基團包括，但不限于：胺，硫醇，羥基，酰肼，肟，肼，縮氨基硫脲，肼羧酸酯和芳基酰肼基團，它們能夠與接頭模塊和接頭試劑上的親電子基團反應(yīng)而形成共價鍵。例如，可以將美登素轉(zhuǎn)化成may-ssch3，可以將其還原成游離硫醇may-sh并且使之與修飾的抗體反應(yīng)(chari等(1992)cancerresearch52:127-131)而生成帶有二硫化物接頭的美登木素生物堿-抗體免疫綴合物。已經(jīng)報導(dǎo)了帶有二硫化物接頭的抗體-美登木素生物堿綴合物(wo04/016801；us6884874；us2004/039176a1；wo03/068144；us2004/001838a1；美國專利us6441163,5208020,5416064；wo01/024763)。使用接頭試劑n-琥珀酰亞胺基4-(2-吡啶硫基)戊酸酯構(gòu)建二硫化物接頭spp。在某些條件下，可以通過用還原劑，諸如dtt(cleland試劑,二硫蘇糖醇)或tcep(三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽處理使半胱氨酸改造抗體反應(yīng)以便綴合接頭試劑；getz等(1999)anal.biochem.vol273:73-80；soltecventures,beverly,ma)。在37℃用約50倍過量的tcep將在cho細胞中表達的全長半胱氨酸改造的單克隆抗體(thiomabtm抗體)還原3小時以便還原可以在新引入的半胱氨酸殘基與存在于培養(yǎng)基中的半胱氨酸之間形成的二硫鍵。用10mm乙酸鈉,ph5稀釋還原的thiomabtm抗體并且上樣至10mm乙酸鈉,ph5中的hitraps柱上并且用含有0.3m氯化鈉的pbs洗脫。在室溫在存在稀(200nm)硫酸銅水溶液(cuso4)的條件下過夜，使親代mab中的半胱氨酸殘基之間重新建二硫鍵。可以使用本領(lǐng)域公知的其它氧化劑，即氧化劑和氧化條件。環(huán)境空氣氧化也是有效的。這種適度的部分再氧化步驟有效地形成具有高保真度的鏈間二硫鍵。加入約10倍過量的藥物-接頭中間體，例如bm(peo)4-dm1，混合并且在室溫下保持約1小時，以便進行綴合并且形成抗體-藥物綴合物(即綴合的thiomabtm抗體)。將綴合混合物進行凝膠過濾并且上hitraps柱且洗脫該柱以便除去過量的藥物-接頭中間體和其它雜質(zhì)。例如，通過援引完整收錄的美國專利公開文本no.20110301334顯示制備由細胞培養(yǎng)物表達的用于綴合的半胱氨酸改造抗體的一般方法。推定帶有各種鏈間二硫鍵的半胱氨酸加合物被還原裂解成抗體的還原形式。在部分氧化條件下，諸如接觸環(huán)境氧重新形成配對半胱氨酸殘基之間的鏈間二硫鍵。新引入的，改造的和未配對的半胱氨酸殘基仍然可以用于與接頭試劑或藥物-接頭中間體反應(yīng)而形成本發(fā)明的抗體綴合物。哺乳動物細胞系中表達的thiomabtm抗體通過-s-s-鍵形成產(chǎn)生與改造的cys產(chǎn)生外部綴合的cys加合物，因此，純化的thiomabtm抗體必須通過還原和氧化操作步驟處理以便產(chǎn)生反應(yīng)性thiomabtm抗體。這些thiomabtm抗體用于綴合含有馬來酰亞胺的細胞毒性藥物，熒光團和其它標記。制備例示性thiomabtm抗體綴合物，而且可以在本文中提供的表格中找到。體外細胞增殖試驗一般而言，通過下列步驟測定抗體-藥物綴合物(adc)的細胞毒性或細胞生長抑制活性：使具有受體蛋白，例如her2的哺乳動物細胞在細胞培養(yǎng)基中接觸adc的抗體；將細胞培養(yǎng)約6小時－約5天的時間；和測定細胞存活率?；诩毎捏w外試驗用于測定存活率(增殖)，細胞毒性和本發(fā)明adc的程序性細胞死亡誘導(dǎo)(胱天蛋白酶活化)。可以通過細胞增殖試驗測定抗體-藥物綴合物的體外功效。例如，luminescentcellviabilityassay為商購的(promegacorp.,madison,wi)基于鞘翅目(coleoptera)熒光素酶的重組表達的同質(zhì)性試驗方法(homogeneousassaymethod)(美國專利us5583024；5674713和5700670)。該細胞增殖試驗基于對存在的atp進行定量測定了培養(yǎng)物中存活細胞的數(shù)量，其中存在的atp為代謝活性細胞的指示劑(crouch等(1993)j.immunol.meth.160:81-88；us6602677)。在96孔板中進行assay，使得它易于進行自動化高流通量篩選(hts)(cree等(1995)anticancerdrugs6:398-404)。同質(zhì)性試驗操作步驟包括將單一試劑(reagent)直接加入到在血清補充的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞中。無需進行細胞洗滌，除去培養(yǎng)基和多次吸移的步驟。該系統(tǒng)可以在添加試劑并且混合后10分鐘內(nèi)檢測384-孔格中低至15個細胞/孔?？梢杂胊dc連續(xù)處理細胞，或可以處理它們并且從adc中分離。一般而言，暫短，即3小時處理的細胞表現(xiàn)出與連續(xù)處理的細胞相同的功效作用。同質(zhì)性“添加-混合-測定”方式導(dǎo)致細胞裂解并且產(chǎn)生與存在的atp量成比例的發(fā)光信號。atp的量與培養(yǎng)物中存在的細胞數(shù)量成正比。assay產(chǎn)生由熒光素酶反應(yīng)產(chǎn)生的“輝光-型(glow-type)”發(fā)光信號，它具有一般大于5小時的半衰期，這取決于所用的細胞類型和培養(yǎng)基。以相對發(fā)光單位(rlu)反映出存活細胞。底物甲蟲熒光素被重組熒火蟲熒光素酶氧化脫羧化，而同時atp轉(zhuǎn)化成amp并且產(chǎn)生光子。體內(nèi)功效可以通過高度表達的轉(zhuǎn)基因外植體小鼠模型測定本文所述thiomabtm抗體的體內(nèi)功效(例如，可以通過高度表達her2的轉(zhuǎn)基因外植體小鼠模型測定自抗her24d5抗體生成的本文中提供的表格的thiomabtm抗體的體內(nèi)功效)。例如，可以使同種異體移植物從不對療法起反應(yīng)或?qū)λ姆磻?yīng)差的fo5mmtv轉(zhuǎn)基因小鼠增殖?？梢杂每筯er24d5thiomabtm抗體和安慰劑pbs緩沖液對照品(媒介物)治療受試者一次并且可以在3周內(nèi)監(jiān)測以便測定腫瘤體積倍增的時間，log細胞殺傷和腫瘤縮小?？贵w-藥物綴合物的給藥可以通過適合于所治療疾病的任意途徑給予本發(fā)明的抗體-藥物綴合物(adc)。一般通過腸胃外途徑給予adc，即輸注，皮下，肌肉內(nèi)，靜脈內(nèi)，真皮內(nèi)，鞘內(nèi)和硬膜外。藥用配制劑本發(fā)明的治療性抗體-藥物綴合物(adc)通常與藥學(xué)上可接受的腸胃外媒介物一起配制成單位劑量可注射形式的藥用配制劑供腸胃外施用，即快速灌注(bolus)，靜脈內(nèi)注射，腫瘤內(nèi)注射。任選將具有所需純度的抗體-藥物綴合物(adc)與藥學(xué)上可接受的稀釋劑，載體，賦形劑或穩(wěn)定劑混合(remington′spharmaceuticalsciences(1980)16thedition,osol,a.ed.)成凍干劑型或水溶液形式?？梢酝ㄟ^混合具有期望純度的此類抗體(即thiomabtm抗體)與一種或多種任選的藥學(xué)可接受載體(remington’spharmaceuticalsciences，第16版，osol，a.編(1980))以凍干配制劑或水性溶液形式制備如本文中所描述的半胱氨酸改造抗體的藥物配制劑。一般地，藥學(xué)可接受載體在所采用的劑量和濃度對接受者是無毒的，而且包括但不限于緩沖劑，諸如磷酸鹽，檸檬酸鹽，和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基芐基銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨，苯索氯銨；酚，丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烴基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清清蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，組氨酸，精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合劑，諸如edta；糖類，諸如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；成鹽相反離子，諸如鈉；金屬復(fù)合物(例如zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑，諸如聚乙二醇(peg)。本文中的例示性的藥學(xué)可接受載體進一步包含間質(zhì)藥物分散劑諸如可溶性中性活性透明質(zhì)酸酶糖蛋白(shasegp)，例如人可溶性ph-20透明質(zhì)酸酶糖蛋白，諸如rhuph20(baxterinternational，inc.)。某些例示性的shasegp和使用方法，包括rhuph20記載于美國專利公開文本no.2005/0260186和2006/0104968。在一方面，將shasegp與一種或多種別的糖胺聚糖酶諸如軟骨素酶組合。例示性的凍干抗體和免疫綴合物配制劑記載于美國專利no.6,267,958，將其完整收入本文。水性抗體或免疫綴合物配制劑包括那些記載于美國專利no.6,171,586和wo2006/044908(將二者完整收入本文)的，后一種配制劑包含組氨酸-乙酸鹽緩沖液。本文中的配制劑還可含有超過一種所治療具體適應(yīng)癥所必需的活性組分，優(yōu)選那些活性互補且彼此沒有不利影響的。活性成分可包載于例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合制備的微膠囊中(例如分別是羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)，在膠狀藥物投遞系統(tǒng)中(例如脂質(zhì)體，清蛋白微球體，微乳劑，納米顆粒和納米膠囊)，或在粗滴乳狀液中。此類技術(shù)披露于例如remington′spharmaceuticalsciences，第16版，osol,a.編(1980)?？梢灾苽涑掷m(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的合適的例子包括含有抗體或免疫綴合物的固體疏水性聚合物的半透性基質(zhì)，該基質(zhì)為成形商品形式，例如膜，或微膠囊。用于體內(nèi)施用的配制劑一般是無菌的。無菌性可容易地實現(xiàn)，例如通過穿過無菌濾膜過濾。抗體-藥物綴合物治療方法和組合關(guān)注本發(fā)明的抗體-藥物綴合物(adc)可以用于治療各種疾病或病癥，例如其特征在于腫瘤抗原的過表達的疾病或病癥。例示性的疾病是過度增殖性病癥，包括良性或惡性腫瘤和白血病和淋巴樣惡性腫瘤。其它疾病包括神經(jīng)元，神經(jīng)膠質(zhì)，星形膠質(zhì)細胞，下丘腦，腺體，巨噬細胞，上皮細胞，間質(zhì)，囊胚腔，炎性，血管發(fā)生和免疫性疾病，包括自身免疫性疾病。一般而言，所治療的疾病或病癥為過度增殖性疾病，諸如癌癥。本文中要治療的癌癥的實例包括，但不局限于癌，淋巴瘤，母細胞瘤，肉瘤和白血病或淋巴樣惡性腫瘤。更具體地說，這類癌癥包括：鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)；肺癌，包括小細胞肺癌，非小細胞肺癌，肺腺癌和肺鱗癌；腹膜癌；肝細胞癌；胃癌，包括胃腸癌；胰腺癌，成膠質(zhì)細胞瘤；宮頸癌；卵巢癌；肝癌(livercancer)；膀胱癌；肝細胞癌(hepatoma)；乳腺癌；結(jié)腸癌；直腸癌；結(jié)直腸癌；子宮內(nèi)膜癌或子宮癌；唾液腺癌；腎癌；前列腺癌，外陰癌；甲狀腺癌；肝癌(hepaticcarcinoma)；肛門癌；陰莖癌和頭頸部癌。adc化合物可以用于治療的自身免疫性疾病包括風(fēng)濕病(諸如，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；斯耶格侖氏綜合征；硬皮??；狼瘡，諸如sle和狼瘡性腎炎；多肌炎/皮肌炎；冷球蛋白血癥；抗-磷脂抗體綜合征；和牛皮癬性關(guān)節(jié)炎)，骨關(guān)節(jié)炎，自身免疫性胃腸和肝病(諸如，例如炎癥性腸病(例如潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩(crohn′s)病)，自身免疫性胃炎和惡性貧血，自身免疫性肝炎，原發(fā)性膽汁性肝硬變，原發(fā)性硬化性膽管炎和乳糜瀉(celiacdisease))，血管炎(諸如，例如anca相關(guān)血管炎，包括丘-施(churg-strauss)血管炎，韋格納(wegener′s)肉芽腫和多動脈炎)，自身免疫性神經(jīng)疾病(諸如，例如多發(fā)性硬化，斜視眼肌陣攣綜合征(opsoclonusmyoclonussyndrome)，重癥肌無力，眼腦脊髓病，帕金森(parkinson’s)病，阿爾茨海默(alzheimer’s)病和自身免疫性多神經(jīng)病)，腎臟疾病(諸如，例如腎小球腎炎，古德帕斯徹(goodpasture’s)綜合征和貝格爾(berger’s)病)，自身免疫性皮膚病(諸如，例如銀屑病，蕁麻疹(urticaria)，蕁麻疹(hives)，尋常天皰瘡，大皰性類天皰瘡和皮膚紅斑狼瘡)，血液病(諸如，例如血小板減少性紫癜，血栓性血小板減少性紫癜，輸血后紫癜和自身免疫性溶血性貧血)，動脈粥樣硬化，眼色素層炎，自身免疫性聽覺疾病(諸如，例如內(nèi)耳疾病和,聽力喪失)，貝切特(behcet′s)病，雷諾(raynaud′s)綜合征，器官移植和自身免疫性內(nèi)分泌病癥(諸如，例如糖尿病相關(guān)性自身免疫性疾病，諸如胰島素依賴性糖尿病(iddm)，阿狄森(addison’s)病和自身免疫性甲狀腺病(例如格雷夫斯(graves’)病和甲狀腺炎))。更優(yōu)選的這類疾病包括：例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，潰瘍性結(jié)腸炎，anca相關(guān)血管炎，狼瘡，多發(fā)性硬化，斯耶格侖綜合征，格雷夫斯病，iddm，惡性貧血，甲狀腺炎和腎小球腎炎。為了預(yù)防或治療疾病，adc的適當(dāng)劑量取決于如上述定義的所治療的疾病類型，疾病的嚴重程度和時程，給予所述分子是為了預(yù)防還是為了治療目的，先前的治療，患者的臨床病史和對抗體的反應(yīng)以及主治醫(yī)師的判定。將所述的分子適當(dāng)對患者給予一次或在一系列治療過程中給予。根據(jù)疾病類型和嚴重程度的不同，對患者給藥的分子的初始候選劑量約為1μg/kg-15mg/kg(例如0.1-20mg/kg)，例如，無論是通過一次或多次分開的給藥，還是通過連續(xù)輸注。典型的每日劑量可以在約1μg/kg-100mg/kg或更大的范圍，這取決于上述因素。對患者給予的典型的adc的劑量在約0.1-約10mg/kg患者體重的范圍。為了在幾天或幾天以上時程中反復(fù)給藥，根據(jù)病情的不同，將治療持續(xù)至對所需疾病癥狀的抑制發(fā)生為止。典型的給藥方案包含給予約4mg/kg的起始負荷劑量，隨后給予約2mg/kg抗-erbb2抗體的每周維持劑量。其它劑量方案也是有用的。該療法的進展易于通過常規(guī)技術(shù)和試驗監(jiān)測。在一方面，本文中提供的thiomabtm抗體可用于抑制細胞增殖的方法。例如，抗her2thiomabtm抗體可用于抑制her2陽性細胞的細胞增殖。又例如，抗cd33thiomabtm抗體可用于抑制cd33陽性細胞的細胞增殖。因而，可以生成針對腫瘤細胞上表達的任何多肽的抗體，而且可以改造該抗體以包括非天然半胱氨酸用于藥物綴合(即可以將該抗體改造成thiomabtm抗體)。一旦生成thiomabtm抗體，抑制細胞增殖的方法包括在允許thiomabtm抗體結(jié)合細胞表面上的靶物(例如her2)的條件下將細胞暴露于thiomabtm抗體(例如抗her2thiomabtm抗體)，由此抑制細胞增殖。在某些實施方案中，所述方法是體外或體內(nèi)方法。體外細胞增殖抑制可使用可購自promega(madison，wi)的celltiter-glotm發(fā)光細胞存活力測定法來測定。該測定法基于存在的atp(它是代謝活躍細胞的指標)的量化來測定培養(yǎng)物中的可存活細胞數(shù)目。參見crouchetal.(1993)j.immunol.meth.160:81-88；美國專利no.6602677。該測定法可以以96孔或384孔形式進行，使之適應(yīng)自動化高通量篩選(hts)。參見creeetal.(1995)anticancerdrugs6:398-404。該測定法規(guī)程牽涉直接向培養(yǎng)細胞添加單一試劑(試劑)。這導(dǎo)致細胞溶解和通過螢光素酶反應(yīng)產(chǎn)生的發(fā)光信號的生成。發(fā)光信號與存在的atp的量成正比，后者直接與培養(yǎng)物中存在的可存活細胞數(shù)成正比?？梢酝ㄟ^光度計或ccd照相機成像裝置來記錄數(shù)據(jù)。發(fā)光輸出表述成相對光單位(rlu)。在另一方面，提供了作為藥物使用的thiomabtm抗體(例如抗her2thiomabtm抗體)。在其它的方面，提供了在治療方法中使用的thiomabtm抗體。在一個非限制性實施方案中，提供了用于治療her2陽性癌癥的抗her2thiomabtm抗體。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了在治療具有her2陽性癌癥的個體的方法中使用的抗her2thiomabtm抗體，所述方法包括對個體施用有效量的抗her2thiomabtm抗體。在一個此類實施方案中，所述方法進一步包括對個體施用有效量的至少一種其它的治療劑，例如下文描述的。在一個非限制性實施方案中，提供了用于治療cd33陽性癌癥的抗cd33thiomabtm抗體。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了在治療具有cd33陽性癌癥的個體的方法中使用的抗cd33thiomabtm抗體，所述方法包括對個體施用有效量的抗cd33thiomabtm抗體。在一個此類實施方案中，所述方法進一步包括對個體施用有效量的至少一種其它的治療劑，例如下文描述的。在又一方面，本發(fā)明提供了thiomabtm抗體(例如抗her2thiomabtm抗體)在制造或制備藥物中的用途。例如，抗her2thiomabtm抗體藥物用于治療her2陽性癌癥的方法，所述方法包括對具有her2陽性癌癥的個體施用有效量的所述藥物。在一個此類實施方案中，所述方法進一步包括對個體施用有效量的至少一種其它的治療劑，例如如下文所描述的。在又一方面，本發(fā)明提供了thiomabtm抗體(例如抗muc16thiomabtm抗體)在制造或制備藥物中的用途。例如，抗muc16thiomabtm抗體藥物用于治療muc16陽性癌癥的方法，所述方法包括對具有muc16陽性癌癥的個體施用有效量的所述藥物。在一個此類實施方案中，所述方法進一步包括對個體施用有效量的至少一種其它的治療劑，例如如下文所描述的。在又一方面，本發(fā)明提供了thiomabtm抗體(例如抗steap1thiomabtm抗體)在制造或制備藥物中的用途。例如，抗steap1thiomabtm抗體藥物用于治療steap1陽性癌癥的方法，所述方法包括對具有steap1陽性癌癥的個體施用有效量的所述藥物。在一個此類實施方案中，所述方法進一步包括對個體施用有效量的至少一種其它的治療劑，例如如下文所描述的。在又一方面，本發(fā)明提供了thiomabtm抗體(例如抗napi2bthiomabtm抗體)在制造或制備藥物中的用途。例如，抗napi2bthiomabtm抗體藥物用于治療napi2b陽性癌癥的方法，所述方法包括對具有napi2b陽性癌癥的個體施用有效量的所述藥物。在一個此類實施方案中，所述方法進一步包括對個體施用有效量的至少一種其它的治療劑，例如如下文所描述的。在又一方面，本發(fā)明提供了thiomabtm抗體(例如抗ly6ethiomabtm抗體)在制造或制備藥物中的用途。例如，抗ly6ethiomabtm抗體藥物用于治療ly6e陽性癌癥的方法，所述方法包括對具有l(wèi)y6e陽性癌癥的個體施用有效量的所述藥物。在一個此類實施方案中，所述方法進一步包括對個體施用有效量的至少一種其它的治療劑，例如如下文所描述的。在又一方面，本發(fā)明提供了thiomabtm抗體(例如抗b7h4thiomabtm抗體)在制造或制備藥物中的用途。例如，抗b7h4thiomabtm抗體藥物用于治療b7h4陽性癌癥的方法，所述方法包括對具有b7h4陽性癌癥的個體施用有效量的所述藥物。在一個此類實施方案中，所述方法進一步包括對個體施用有效量的至少一種其它的治療劑，例如如下文所描述的。在又一方面，本發(fā)明提供了thiomabtm抗體(例如抗cd79bthiomabtm抗體)在制造或制備藥物中的用途。例如，抗cd79bthiomabtm抗體藥物用于治療cd79b陽性癌癥的方法，所述方法包括對具有cd79b陽性癌癥的個體施用有效量的所述藥物。在一個此類實施方案中，所述方法進一步包括對個體施用有效量的至少一種其它的治療劑，例如如下文所描述的。在又一方面，本發(fā)明提供了thiomabtm抗體(例如抗cd22thiomabtm抗體)在制造或制備藥物中的用途。例如，抗cd22thiomabtm抗體藥物用于治療cd22陽性癌癥的方法，所述方法包括對具有cd22陽性癌癥的個體施用有效量的所述藥物。在一個此類實施方案中，所述方法進一步包括對個體施用有效量的至少一種其它的治療劑，例如如下文所描述的。在又一方面，本發(fā)明提供了通過施用thiomabtm抗體或其藥物來治療癌癥的方法。在具體的實施方案中，thiomabtm抗體或其藥物預(yù)防癌細胞增殖。在具體的實施方案中，thiomabtm抗體或其藥物促進癌細胞凋亡。在具體的實施方案中，thiomabtm抗體或其藥物縮小癌細胞的腫瘤體積。在一個此類實施方案中，所述方法進一步包括對個體施用有效量的至少一種其它的治療劑，如下文所描述的?？梢詥为毣蚺c療法中的其它藥劑組合使用本發(fā)明的thiomabtm抗體。例如，可以與至少一種其它的治療劑共施用本發(fā)明的抗體或免疫綴合物。例如，其它的治療劑可以是第二thiomabtm抗體或本文中定義的化療劑。上文記錄的此類聯(lián)合療法涵蓋聯(lián)合施用(其中兩種或更多種治療劑包含在同一配制劑或分開的配制劑中)，和分開施用，在該情況中，可以在施用其它的治療劑和/或佐劑之前，同時，和/或之后發(fā)生本發(fā)明的抗體或免疫綴合物的施用。也可以與放射療法組合使用本發(fā)明的抗體或免疫綴合物?？梢酝ㄟ^任何合適的手段，包括胃腸外，肺內(nèi)，和鼻內(nèi)，及若期望用于局部治療的話，損傷內(nèi)施用來施用本發(fā)明的thiomabtm抗體(和任何其它的治療劑)。胃腸外輸注包括肌肉內(nèi)，靜脈內(nèi)，動脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，或皮下施用。部分根據(jù)施用是短暫的還是長期的，劑量給藥可以通過任何合適的路徑，例如通過注射，諸如靜脈內(nèi)或皮下注射進行。本文中涵蓋各種劑量給藥日程表，包括但不限于單次施用或在多個時間點里的多次施用，推注施用，和脈沖輸注。本發(fā)明的thiomabtm抗體應(yīng)當(dāng)以一種符合良好的醫(yī)學(xué)實踐的方式配制，確定劑量及給藥。關(guān)于這一點考慮的因素包括在治療的特定病癥，在治療的特定哺乳動物，患者個體的臨床狀態(tài)，病因，藥物遞送部位，給藥方法，服藥日程以及其它為開業(yè)醫(yī)生所知的因素。thiomabtm抗體無需但任選地與一種或多種目前用于預(yù)防或治療所述病癥的藥物一起配制。上述其它藥物的有效量取決于配方中所存在的抗體或免疫綴合物的量，療法和病癥的類型，以及其它上述討論的因素。這些藥物通常以相同的劑量使用并具有本文中所描述的給藥途徑，或以約1-99％的本文所描述的劑量使用，或以任何劑量并通過任何途徑使用，所述劑量和途徑是憑經(jīng)驗確定的/經(jīng)臨床測定合適的。為了預(yù)防或治療疾病，本發(fā)明的thiomabtm抗體(當(dāng)單獨或與一種或多種其它另外的治療劑聯(lián)合使用時)的合適劑量應(yīng)取決于所要治療的疾病的類型，抗體或免疫綴合物的種類，疾病的嚴重性和病程，給予thiomabtm抗體是出于預(yù)防還是治療目的，之前的治療，患者的臨床史和對thiomabtm抗體的應(yīng)答，以及主治醫(yī)師的斟酌決定。thiomabtm抗體適合于在一次或一系列的治療中給予患者。取決于疾病的類型和嚴重性，約1μg/kg-15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的thiomabtm抗體可作為首次候選用量給予患者，無論是例如通過一次或多次單獨的給藥或通過連續(xù)輸注。取決予上述提及的因素，一個典型的日劑量可在約1μg/kg-100mg/kg或更多的范圍內(nèi)。對于幾天或更長時間的重復(fù)給藥，取決于病情，治療應(yīng)通常持續(xù)直至出現(xiàn)病癥得到期望的抑制為止。thiomabtm抗體的一種例示性劑量會在約0.05mg/kg到約10mg/kg的范圍中。如此，可以對患者施用一劑或多劑約0.5mg/kg，2.0mg/kg，4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意組合)。上述劑量可間歇給予，如每周或每三周給予一次(如使得患者得到約2-約20個，或例如約6個劑量的抗體)?？山o予初始較高的負荷劑量，接著給予一個或多個較低的劑量。然而，可使用其它給藥方案。通過常規(guī)技術(shù)和測定方法易于監(jiān)測該治療的進展。應(yīng)當(dāng)理解，可以使用本發(fā)明的thiomabtm抗體和第二化療劑(如本文中定義的)二者實施任何上述配制劑或治療性方法。標記的抗體成像方法在本發(fā)明的另一個實施方案中，可以用放射性核素，熒光染料，激發(fā)生物發(fā)光的底物模塊，激發(fā)化學(xué)發(fā)光的底物模塊，酶和其它檢測標記通過半胱氨酸硫醇來標記半胱氨酸改造抗體以便用于具有診斷，藥效學(xué)和治療應(yīng)用的成像實驗。一般而言，通過注射，灌注或口服攝入對活生物體，例如人，嚙齒動物或其它小動物，灌注器官或組織樣品給予標記的半胱氨酸改造抗體，即“生物標記物”或“探針”。在一定時間過程中檢測探針的分布并且由影像顯示。制品在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了含有用于治療上述病癥的物質(zhì)的制品或“試劑盒”。所述的制品包含容器和在容器上或與其相連的標簽或包裝說明書。合適的容器包括：例如瓶，小瓶，注射器，泡罩包等，容器可以由各種材料，諸如玻璃或塑料形成。容器可以容納有效治療疾病的本發(fā)明thiomabtm抗體并且可以具有無菌存取口(例如容器可以為靜脈用溶液袋或具有可刺入皮下注射針頭的塞的小瓶)。組合物中至少一種活性劑為thiomabtm抗體。標簽或包裝說明書表示組合物用于治療選擇的疾病，諸如癌癥?；蛘呋蛄硗?，所述制品可以進一步含有第二種(或第三種)容器，該容器包含藥學(xué)上可接受的緩沖劑，諸如抑菌性注射用水(bwfi)，磷酸緩沖鹽水，林格液和葡萄糖溶液。它可以進一步包括從商業(yè)和使用者角度而言需要的其它物質(zhì)，包括其它緩沖液，稀釋劑，過濾器，針頭和注射器。實施例實施例1-thiomabtm抗體的制備使用hu4d5質(zhì)粒作為雙鏈dna模板，生成thiomabtm抗體。使用來自agilenttechnologies的quickchangeiixl試劑盒實施基于pcr的定點誘變。使用該方法進行定點誘變以生成thiomabtm抗體：1)使用hu4d5質(zhì)粒dna(50-100ng)，2)使用含有期望突變的正向和反向引物(各1μm)，3)將dntp(0.4mm)和pfuultrahfdna聚合酶(2.5個單位)添加至25μl反應(yīng)混合物，4)將樣品在熱循環(huán)儀(appliedbiosystems，fostercity，ca)中溫育，初始變性(4min，94℃)，接著是20個循環(huán)的0.5min變性(94℃)，0.5min退火(52℃)和10min鏈延伸(68℃)，5)將pcr擴增dna樣品與dpni限制酶一起于37℃溫育4小時，6)用經(jīng)dpni處理的pcr樣品(2μl)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞(novabluesingles，50μl)，7)自轉(zhuǎn)化板挑取單菌落并在5ml含有羧芐青霉素(50ug/ml)的2yt培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并8)純化質(zhì)粒dna并通過dna測序篩選所獲得的克隆以鑒定抗體序列的輕和重鏈區(qū)中的半胱氨酸替代和非特異性突變?nèi)笔?。將半胱氨酸改造的hu4d5質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入哺乳動物細胞系進行蛋白質(zhì)生成。用于這項研究的293t細胞系是經(jīng)過sv40大t抗原穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的懸浮適應(yīng)性hek293細胞系。在瞬時轉(zhuǎn)染之前，在80％增濕溫箱中在37℃，5％co2，和150rpm搖速，25mm擺動直徑的條件下在搖瓶中作為種子培養(yǎng)物培養(yǎng)細胞。使用補充有1％超低igg血清(sigma，st.louis，mo)的gibcofreestyle293表達培養(yǎng)基(lifesciences，carlsbadca)作為種子培養(yǎng)和生產(chǎn)培養(yǎng)基。除非另有規(guī)定，所有瞬時轉(zhuǎn)染均是在50ml離心管中進行的(stettleretal.，2007)，最終工作體積30ml，而且以96分批處理。為效率起見，使用biomekfxp液體操作機器人來將細胞大量分配入96個離心管中。轉(zhuǎn)染后，將細胞在80％增濕kuhnerisf1-x溫箱中于37℃，5％co2和225rpm搖速，50mm擺動直徑培養(yǎng)7天。對于轉(zhuǎn)染，以1.0e6個細胞/ml接種細胞，并在轉(zhuǎn)染之前于37℃，5％co2溫育2小時。在接種時以75mm的濃度對生產(chǎn)培養(yǎng)物添加丙戊酸。以大量制備規(guī)模(sigma，st.louis，mo)純化編碼選定thiomabtmhuigg1抗體的質(zhì)粒dna。利用標準瞬時轉(zhuǎn)染工藝，在基于dmem的培養(yǎng)基中將30ugdna稀釋至3ml的終體積。然后將60ul7.5mm25kda線性pei添加至dna溶液，混合，并于室溫溫育10分鐘，之后添加至細胞。實施例2-thiomabtm抗體的綴合將依照實施例1生成的每種半胱氨酸改造抗體(thiomabtm抗體)分開綴合至兩種接頭藥物：mc-vc-pab-mmae和pds-mmae。例如，4d5lc-k149c半胱氨酸改造抗體生成兩種不同thiomabtm抗體：1)4d5lc-k149c-mc-vc-pab-mmae和2)4d5lc-k149c-pds-mmae。優(yōu)選綴合的另外的例子可以在表1和2中找到且在本文中有描述，而且包括但不限于依照eu編號方式的4d5hc-a140c-mc-vc-pab-mmae和4d5hc-a140c-pds-mmae和依照eu編號方式的4d5hc-l174c-mc-vc-pab-mmae和4d5hc-l174c-pds-mmae。全抗體篩選中鑒定的頭等穩(wěn)定綴合物的其它例子可以在表3和4中找到。-vc和pds綴合的優(yōu)選位點見圖21。在96孔濾板(體積2ml，聚丙烯，0.45um濾器，來自ekscientific)中實施thiomabtm抗體的綴合。該板只容許以500xg離心2分鐘時水性緩沖液流過。作為20％乙醇中的50％漿，對每個孔添加450μlmabselectsure樹脂(gehealthcare)。將樹脂在50mmtrisph8.0，150mmnacl，2mmedta(緩沖液a)中清洗3次并平衡。對每個孔添加1.5mg每種thiomabtm抗體，并于室溫在600rpm的搖板儀上容許結(jié)合至樹脂達30分鐘。30分鐘后，將板離心以去除過量的緩沖液。然后于室溫在搖動下在0.9ml含2mm二硫蘇糖醇(dtt)的緩沖液a存在下將thiomabtm抗體還原過夜。通過用緩沖液a清洗2次去除還原劑(即dtt)和任何半胱氨酸或谷胱甘肽嵌段(block)。然后將板用1ml含1mm脫氫抗壞血酸(dhaa)的緩沖液a清洗3次以用氧化劑充滿板。最后一次添加0.9ml含1mmdhaa的緩沖液a后，于室溫在搖板儀上容許thiomabtm抗體再氧化3小時。通過離心去除氧化劑。添加兩倍摩爾過量(相對于可用的硫醇基團)的在含10％dma的緩沖液a中溶解的接頭-藥物(mc-vc-pab-mmae或pds-mmae)，并于室溫在搖板儀上與thiomabtm抗體一起溫育2小時。通過將板用平衡緩沖液(緩沖液a)清洗6次來去除過量的接頭-藥物。于室溫在搖板儀上用0.1m甘氨酸緩沖液ph2.7洗脫thiomabtm抗體30分鐘。然后立即用15％0.5mtris，ph8.0中和thiomabtm抗體。通過lc/ms分析量化每個thiomabtm抗體綴合的藥物的數(shù)目。通過大小排阻層析評估綴合物的聚集。實施例3-thiomabtm抗體的質(zhì)譜分析使用質(zhì)譜分析(即lc/ms分析)測定每種thiomabtm抗體的藥物-抗體比(dar)。在6224質(zhì)量飛行時間(tof)lc/ms儀器(agilenttechnologies)上實施lc/ms分析。將樣品在加熱至80℃的prlp-s柱，8μm(50mmx2.1mm，agilenttechnologies)上層析。以0.7ml/min流速在3分鐘里使用線性梯度34-42％b(溶劑a，含0.05％tfa的水；溶劑b，含0.04％tfa的乙腈)并使用電噴射源直接將洗提液電離。收集數(shù)據(jù)并使用agilentmasshunter定性分析軟件解卷積。使用lc/ms層析圖中存在的解卷積峰的豐度計算藥物dar。dar計算可見例如上文表6-12。而且，對在抗體中的每一個位置處含有單一改造的半胱氨酸突變的4d5半胱氨酸改造抗體實施lc/ms分析。表13-16中的空白單元格代表非決定性的實驗，不是0dar。表13：pds連接的具有重鏈半胱氨酸替代的thiomabtm抗體的dar。表14：pds連接的具有輕鏈半胱氨酸替代的thiomabtm抗體的dar。表15：vc連接的具有重鏈半胱氨酸替代的thiomabtm抗體的dar。表16：vc連接的具有輕鏈半胱氨酸替代的thiomabtm抗體的dar。實施例4-mc-vc-mmae和pds-mmaethiomabtm抗體的聚集分析經(jīng)由大小排阻測定法對表6-10中呈現(xiàn)的每種thiomabtm抗體實施聚集分析。在1100系列hplc(agilenttechnologies)上實施大小排阻層析。將樣品在shodexkw802.5柱上層析。使用等度方法(其使用流動相0.2m磷酸鉀，0.25m氯化鉀，ph6.2，0.75ml/min，15分鐘)來洗脫綴合物。根據(jù)uv280nm層析圖的聚集體和單體峰的積分面積計算百分比聚集。圖3顯示用于聚集分析和計算的聚集體和單體峰的代表性圖。實施例5-thiomabtm抗體的綴合分析使用液體層析-質(zhì)譜(lc/ms或lcms)實施thiomabtm抗體的綴合分析。如圖4a和圖4b中所示，thiomabtm抗體的uv280lc/ms層析顯示dar0(裸抗體)，dar1，和dar2綴合。完整抗體半胱氨酸(其中生成在抗體內(nèi)的每一個位置處具有單一半胱氨酸突變的4d5抗體以測定抗體內(nèi)對于附著接頭-藥物以生成adc的目的不可預(yù)測的最穩(wěn)定位點)篩選的最穩(wěn)定位點的lcms結(jié)果顯示于表7和9。實施例6-mc-vc-mmae和pds-mmaethiomabtm抗體的穩(wěn)定性分析。對于3個時間點(0小時，48小時和96小時)的大鼠血漿和緩沖液(0小時)二者一式兩份生成pds-mmae和mc-vc-mmaethiomabtm抗體的穩(wěn)定性樣品。穩(wěn)定性篩選的實驗規(guī)程的流程圖提供于圖5。為了創(chuàng)建穩(wěn)定性樣品，將9μl每種thiomabtm抗體(即源材料)添加至351μl大鼠血漿或緩沖液(1xpbs，0.5％bsa，15ppmproclin)任一，然后徹底混合。源材料的濃度提供于例如表6，8，和10。一旦混合，將120μl大鼠血漿穩(wěn)定性樣品等分入分開的三套試管，用于三個不同時間點。然后將0小時時間點的大鼠血漿和緩沖液置于-80℃冰箱中，而將48小時和96小時時間點的大鼠血漿置于37℃溫箱中的搖床上。當(dāng)48小時和96小時樣品到達給定時間點時，也將它們置于-80℃冰箱中。使用質(zhì)譜分析顯示mc-vc-mmae和pds-mmaelc-r142cthiomabtm抗體在0小時，48小時，和96小時時的穩(wěn)定性的代表性圖提供于圖6a和6b。使用elisa測定法測定pds-mmae和mc-vc-mmaethiomabtm抗體的穩(wěn)定性。通過elisa測定大鼠血漿中總的抗體(綴合的和未綴合的thiomabtm抗體)的濃度，使用人erb2的胞外域(ecd)作為捕捉劑，使用山羊抗人igg-辣根過氧化物酶(hrp)作為檢測抗體。該測定法具有0.5mg/ml的檢測限度(lod)及800倍的最小稀釋度。通過elisa測定大鼠血漿中綴合的pds-mmae和mc-vc-mmaethiomabtm抗體的濃度，使用抗藥物單克隆抗體進行捕捉，使用山羊抗人igg-hrp進行檢測。該測定法具有0.5mg/ml的檢測限度(lod)及800倍的最小稀釋度。計算基于特定半胱氨酸改造位點處的綴合的藥物載荷穩(wěn)定性。使用時間0小時時的綴合抗體濃度對0小時時的總抗體濃度(通過elisa測定)之比來計算0小時時針對總抗體標準化的綴合抗體濃度，使得[c0]/[t0]＝nc0。使用時間48小時時的綴合抗體濃度對48小時時的總抗體濃度(通過elisa測定)之比來計算48小時時針對總抗體標準化的綴合抗體濃度，使得[c48]/[t48]＝nc48。通過計算48小時時的綴合抗體對0小時時的綴合抗體(通過elisa測定)之比來確定百分比穩(wěn)定性，由此計算百分比藥物載荷穩(wěn)定性，使得nc48/nc0＝百分比藥物載荷穩(wěn)定性。圖7顯示48小時時間點時測量的優(yōu)選pds-mmaethiomabtm抗體的穩(wěn)定性的圖。圖8顯示48小時時間點時測量的優(yōu)選mc-vc-mmaethiomabtm抗體的穩(wěn)定性的圖。所有篩選的pds-mmae和mc-vc-mmaethiomabtm抗體的穩(wěn)定性可以在本文中提供的表中找到。實施例7-lc-k149c，lc-v205c，和hc-a114cthiomabtm抗體的制備使用抗cd33和抗her2抗體生成lc-k149c，lc-v205c，和hc-a114cthiomabtm抗體，并基于平均dar評估那些thiomabtm抗體的穩(wěn)定性(圖9)。與hc-a114c和lc-v205c相比，抗her2lc-k149cthiomabtm抗體在抗her2抗體中顯示令人驚訝的穩(wěn)定性。具體而言，抗her2lc-k149cthiomabtm抗體的藥物綴合是穩(wěn)定的，而且thiomabtm抗體在綴合后六天保持dar為2。類似地，抗cd33lc-k149cthiomabtm抗體也保留dar為2達6天。與之對比，抗her2lc-v205c和hc-a114cthiomabtm抗體。實施例8-pds-mmaethiomabtm抗體在綴合后48小時和96小時時的穩(wěn)定性對抗體實施半胱氨酸篩選以確定哪些所得pds-thiomabtm抗體具有≥1的dar，≥1mg/ml的源儲液濃度，≤50％的聚集，再氧化，vc變體藥物載荷在大鼠血漿中在48小時上基于elisa(兩份復(fù)制品)≥80％的穩(wěn)定性，pds變體藥物載荷在大鼠血漿中在48小時上基于elisa(兩份復(fù)制品)≥70％的穩(wěn)定性，和直至96小時通過可靠ms譜確認的穩(wěn)定性。具體而言，將4d5抗體用于例示目的，使得本領(lǐng)域技術(shù)人員會了解任何抗體可替代4d5抗體。篩選鑒定出輕鏈和重鏈內(nèi)對于半胱氨酸工程化改造和接頭-藥物附著以生成穩(wěn)定adc而言優(yōu)選的候選位點(見表1和2)和另外的穩(wěn)定位點(見表3和4)。該實驗的結(jié)果提供于表6-12。實施例9-mc-vc-mmaethiomabtm抗體在綴合后48小時和96小時時的穩(wěn)定性對抗體實施半胱氨酸篩選以確定哪些所得mc-vc-thiomabtm抗體具有≥1的dar，≥1mg/ml的源儲液濃度，≤50％的聚集，再氧化，vc變體藥物載荷在大鼠血漿中在48小時上基于elisa(兩份復(fù)制品)≥80％的穩(wěn)定性，pds變體藥物載荷在大鼠血漿中在48小時上基于elisa(兩份復(fù)制品)≥70％的穩(wěn)定性，和直至96小時通過可靠ms譜確認的穩(wěn)定性。具體而言，將4d5抗體用于例示目的，使得本領(lǐng)域技術(shù)人員會了解任何抗體可替代4d5抗體。該篩選鑒定出輕鏈和重鏈內(nèi)對于半胱氨酸工程化改造和接頭-藥物附著以生成穩(wěn)定adc而言優(yōu)選的候選位點(見表1和2)和另外的穩(wěn)定位點(見表3和4)。該實驗的結(jié)果提供于表6-12。實施例10-體外細胞增殖試驗可以通過使用下列方案的細胞增殖試驗測定thiomabtm抗體的功效(celltitergloluminiscentcellviabilityassay,promegacorp.technicalbulletintb288；mendoza等(2002)cancerres.62:5485-5488)：1.可以使在培養(yǎng)基中含有約104個細胞(skbr-3，bt474，mcf7或mda-mb-468)的100μl細胞培養(yǎng)物等份沉積在96-孔不透明壁的平板的各孔中。2.可以制備含有培養(yǎng)基，但不含細胞的對照孔。3.可以將thiomabtm抗體加入到實驗孔中并且溫育3-5天。4.可以使平板平衡至室溫約30分鐘。5.可以加入等于存在于各孔中的細胞培養(yǎng)基的體積的celltiter-gloreagent。6.可以將內(nèi)含物在定軌振蕩器上混合2分鐘以便誘導(dǎo)細胞裂解。7.可以將平板在室溫溫育10分鐘以便穩(wěn)定發(fā)光信號。8.可以記錄發(fā)光并且作為rlu＝相對發(fā)光單位在圖中報導(dǎo)?？梢詫⒛承┘毎?000-2000個/孔(pc3系)或2000-3000個/孔(ovcar-3)接種在96孔平板上，50μl/孔。在1(pc3)或2(ovcar-3)天后，可以加入在50μl體積中的thiomabtm抗體至終濃度為9000，3000，1000，333，111，37，12.4，4.1或1.4ng/ml，其中"無adc"對照孔僅接受培養(yǎng)基。條件為一式兩份或一式三份。3(pc3)或4-5(ovcar-3)天后，加入100μl/孔celltitergloii(基于熒光素酶的試驗；根據(jù)atp水平測定的增殖)并且可以使用發(fā)光計測定細胞計數(shù)。例如，可以以各組重復(fù)測定的發(fā)光平均值將數(shù)據(jù)繪圖，其中使用標準偏差條柱形圖?；蛘?，可以依照promega的方法實施celltitergloluminiscentcellviabilityassay(promega)：1.用1000個細胞/孔的pc3/muc16，pc3/neo(在50μl/孔中)的培養(yǎng)基鋪板。應(yīng)將ovcar3細胞以2000個細胞/孔(在50μl中)的其培養(yǎng)基鋪板(pc3/neo和pc3/muc16生長在50/50/10％fbs/谷氨酰胺/250μg/mlg-418中ovcar-3生長在rpmi/20％fbs/谷氨酰胺中)。允許細胞附著過夜。2.以18μg/ml的工作濃度開始在培養(yǎng)基中以1:3連續(xù)稀釋thiomabtm抗體(這導(dǎo)致終濃度為9μg/ml)。將50μl稀釋的adc加入到已經(jīng)在孔中的50μl細胞和培養(yǎng)基中。3.孵育72-96小時(標準品為72小時，但在細胞達到85-95％融合率時，觀察到0ug/ml濃度，終止試驗)。4.加入100μl/孔的promegacelltiterglo試劑，振搖3分鐘并且在發(fā)光計上讀數(shù)。實施例11-高度表達her2的轉(zhuǎn)基因外植體小鼠的腫瘤生長抑制體內(nèi)功效適合于轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灥膭游锟梢垣@自標準商業(yè)來源，諸如taconic(germantown,n.y.)。許多品系都是合適的，但優(yōu)選fvb雌性小鼠，因為它們對腫瘤形成高度易感。將fvb雄小鼠用于交配并且將切除輸精管的cd.1種畜用于刺激假性妊娠。切除輸精管的小鼠可以獲自任何商品供應(yīng)商。使用fvb小鼠或129/bl6xfvbp53雜合型小鼠繁殖建立者(founder)。將在p53等位基因上具有雜合性的小鼠用于潛在地增加腫瘤形成。然而，已經(jīng)證實這是不必要的。因此，某些f1腫瘤具有混合的品系。建立者的腫瘤僅為fvb。獲得了有某種程度的腫瘤發(fā)生但未產(chǎn)仔的6個建立者。通過iv注射adc用單劑量或多劑治療具有腫瘤(由fo5mmtv轉(zhuǎn)基因小鼠繁殖的同種異體移植物)的動物。在注射后的不同時間點評價腫瘤體積。腫瘤易于在轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生，這些小鼠表達neu的突變活化形式，即大鼠her2的同源物，而在人乳腺癌中過表達的her2未突變并且腫瘤形成遠低于過表達未突變her2的轉(zhuǎn)基因小鼠(webster等(1994)semin.cancerbiol.5:69-76)。為了改善具有未突變的her2的腫瘤形成，使用her2cdna質(zhì)粒生成轉(zhuǎn)基因小鼠，其中atg的上游缺失，以便防止在這類上游atg密碼子上起始翻譯，否則就可能減少從her2的下游真正起始密碼子起始翻譯的頻率(例如，參見child等(1999)j.biol.chem.274:24335-24341)。另外，將嵌合內(nèi)含子添加到5’末端上，這也應(yīng)如以前報導(dǎo)的提高表達水平(neuberger和williams(1988)nucleicacidsres.16:6713；buchman和berg(1988)mol.cell.biol.8:4395；brinster等(1988)proc.natl.acad.sci.usa85:836)。嵌合內(nèi)含子來源于promega載體，即pci-neo哺乳動物表達載體(bp890-1022)。cdna3’-末端位于人生長激素外顯子4和5和聚腺苷酸化序列的側(cè)翼。此外，使用fvb小鼠，因為該品系更易感腫瘤發(fā)生。來自mmtv-ltr的啟動子用于確保在乳腺中的組織特異性her2表達。給動物飼喂ain76a膳食以便增加對腫瘤形成的易感性(rao等(1997)breastcancerres.andtreatment45:149-158)?？梢詾榱硗獾哪[瘤類型生成和研究類似的體內(nèi)模型。例如，可以生成體內(nèi)模型來使用cd33表達性模型研究抗cd33thiomabtm抗體的功效。實施例12-hc-a140c在穩(wěn)定性方面挽救接頭-藥物的用途如本文中討論的，由于它在保持接頭-藥物方面的穩(wěn)定性(即接頭-藥物保持在改造的lc-k149c位置處結(jié)合至抗體)，發(fā)現(xiàn)lc-k149c(依照kabat編號方式)是對于半胱氨酸替代優(yōu)選的位點。然而，出乎意料地發(fā)現(xiàn)即使接頭保持在lc-k149c處結(jié)合至半胱氨酸改造抗體，某些藥物當(dāng)在位置lc-k149c處連接至半胱氨酸改造抗體時進行酶促修飾。具體而言，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)經(jīng)由接頭附著至lc-k149c的某些藥物進行酶促修飾諸如氨基甲酸根基團損失，乙?；鶕p失(即脫乙?；?，磷酸根損失，糖損失，和其它切割。在觀察到某些藥物(包括但不限于cryptophycin，tubulysinm，類紫杉烷藥物，和cbi-pbd異二聚體接頭-藥物中間體)當(dāng)在lc-k149c處附著至半胱氨酸改造抗體時的修飾之后，檢查來自表1-4的另外的位點(包括hc-a118c，lc-v205c，hc-s121c，和hc-a140c)以查看它們的使用是否能降低和/或消除藥物修飾。具體而言，觀察到當(dāng)經(jīng)由接頭綴合至半胱氨酸改造抗體上的lc-k149c時，cryptophycin發(fā)生酰胺切割，tubulysin發(fā)生乙?；鶕p失(即脫乙?；?，cbi-pbd異二聚體接頭-藥物中間體發(fā)生氨基甲酸根損失，而類紫杉烷是不穩(wěn)定的且顯示切割(見圖13)。出乎意料地發(fā)現(xiàn)hc-a140c對tubulysin的乙酰基基團提供保護(見圖14a-14c)。具體而言，使用lcms顯示了溫育24小時后使用hc-a140c作為附著位點時的藥物降解比lc-k149c更少(圖14a)。使用一種新穎的全血測定法類似地顯示了hc-a140c更加穩(wěn)定。對于該新穎的全血(wb)測定法(本文中首次描述)，在小鼠(cb17scid)，大鼠(sprague-dawley)，食蟹猴和/或人全血血漿以及緩沖液中生成樣品(0和24小時)。通過bioreclamation收集血液，然后冷鏈運輸過夜并在全血達到后立即創(chuàng)建樣品。為了創(chuàng)建穩(wěn)定性樣品，在緩沖液(1xpbs，0.5％bsa，15ppmproclin)中生成源材料的初始稀釋液，使得所有分子的濃度為1mg/ml。然后實施1:10x稀釋(36ul1mg/ml初始稀釋液+324ul血液或緩沖液)以生成終濃度100ug/ml的穩(wěn)定性樣品。一旦混合，將150μl全血/緩沖液穩(wěn)定性樣品等分入分開的兩套試管，用于兩個不同時間點。然后將0小時時間點置于-80℃在三輪wb測定法中確認hc-a140c和lc-k149c處的乙酰基損失。確認了hc-a140c挽救乙?；鶕p失修飾(圖15)。出乎意料地發(fā)現(xiàn)hc-a140c對cbi-pbd異二聚體接頭-藥物中間體的氨基甲酸根基團提供保護(見圖16a-16c)。具體而言，使用lcms顯示了溫育24小時后使用hc-a140c作為附著位點時的藥物降解比lc-k149c更少(圖16a)。類似地使用新穎的全血測定法顯示了hc-a140c更加穩(wěn)定(圖17)。還出乎意料地發(fā)現(xiàn)hc-a140c提供保護免于類紫杉烷的修飾(見圖18a-18c)。具體而言，使用lcms顯示了溫育24小時后使用hc-a140c作為附著位點時的藥物降解比lc-k149c更少(圖18a)。類似地使用新穎的全血測定法顯示hc-a140c更加穩(wěn)定(例如就保護類紫杉烷藥物損失而言)(圖19)。正如通過將藥物連接至hc-a140c代替lc-k149c而對tubulysin，cbi-pbd異二聚體接頭-藥物中間體，和類紫杉烷藥物出乎意料地觀察到保護，還發(fā)現(xiàn)到hc-a140c保護cryptophycin免于酰胺和酯切割(見圖20)。對具有pds和/或馬來酰亞胺(即vc-)接頭的抗her2抗體(具體是4d5)和/或抗cd22抗體實施實驗。實施例13-對pds連接而言的最穩(wěn)定位點的鑒定通過使用親和捕捉lc-ms測定法分析0，48和96小時血漿穩(wěn)定性樣品進一步評估來自elisa篩選的頭等穩(wěn)定變體。首先將鏈霉親合素包被的磁珠(lifetechnologiescorporation，grandisland，ny)用hbs-ep緩沖液(gehealthcare，sunnyvale，ca)清洗2次，然后與使用kingfisherflex(thermofisherscientific，waltham，ma)生物素化的人erb2胞外域(ecd)混合，并于室溫在溫和搖動下溫育2小時。2小時后，將sa-珠/生物素-ecd復(fù)合物用hbs-ep緩沖液清洗2次，與稀釋的血漿穩(wěn)定性樣品混合，然后于室溫在溫和搖動下溫育2小時。2小時后，將sa-珠/生物素-ecd/樣品復(fù)合物用hbs-ep緩沖液清洗2次，接著用水(optimah2o，fisherscientific，pittsburgh，pa)清洗2次，最后用10％乙腈清洗1次。然后，為了洗脫，將珠置于30％乙腈/0.1％甲酸中，在其中于室溫在溫和搖動下溫育30分鐘，之后收集珠。然后將洗脫的樣品加載到lc-ms(synapt-g2s，waters，milford，ma)上進行分析。還使用半胱氨酸還原測定法評估頭等穩(wěn)定pds-mmae變體，其中將樣品用水稀釋至100ug/ml并與100um半胱氨酸和100mm碳酸氫銨緩沖液1:1混合得到終濃度50um半胱氨酸和50mm碳酸氫銨。然后將樣品于室溫在黑暗中溫育過夜18小時，然后添加等體積的60％乙腈/0.2％甲酸以淬滅反應(yīng)。然后將樣品加載到lc-ms(synapt-g2s，waters，milford，ma)上進行分析。表1和2中鑒定了優(yōu)選的穩(wěn)定pds-mmae變體，而表3和4中鑒定了另外的穩(wěn)定變體。具體而言，圖21和實施例2中清楚地鑒定了頭等pds-mmae變體。實施例14-對-vc(即馬來酰亞胺)連接而言的最穩(wěn)定位點的鑒定通過使用親和捕捉lc-ms測定法分析0，48和96小時血漿穩(wěn)定性樣品進一步評估來自elisa篩選的頭等穩(wěn)定變體。首先將鏈霉親合素包被的磁珠(lifetechnologiescorporation，grandisland，ny)用hbs-ep緩沖液(gehealthcare，sunnyvale，ca)清洗2次，然后與使用kingfisherflex(thermofisherscientific，waltham，ma)生物素化的人erb2胞外域(ecd)混合，并于室溫在溫和搖動下溫育2小時。2小時后，將sa-珠/生物素-ecd復(fù)合物用hbs-ep緩沖液清洗2次，與稀釋的血漿穩(wěn)定性樣品混合，然后于室溫在溫和搖動下溫育2小時。2小時后，將sa-珠/生物素-ecd/樣品復(fù)合物用hbs-ep緩沖液清洗2次，接著用水(optimah2o，fisherscientific，pittsburgh，pa)清洗2次，最后用10％乙腈清洗1次。然后，為了洗脫，將珠置于30％乙腈/0.1％甲酸中，在其中于室溫在溫和搖動下溫育30分鐘，之后收集珠。然后將洗脫的樣品加載到lc-ms(synapt-g2s，waters，milford，ma)上進行分析。表1和2中鑒定了優(yōu)選的穩(wěn)定vc-mmae變體，而表3和4中鑒定了另外的穩(wěn)定變體。具體而言，圖21和實施例2中清楚地鑒定了頭等vc-mmae變體。實施例15-能改造成具有單一半胱氨酸突變(即兩個半胱氨酸每個抗體)的例示性抗體任何抗體能改造成具有單一半胱氨酸突變(即兩個半胱氨酸每個抗體)。已經(jīng)使用本文所述方法改造成具有單一半胱氨酸突變(即兩個半胱氨酸每個抗體)的例示性抗體包括但不限于針對下述抗原的抗體：her2，muc16，steap1，napi2b，cd22，ly6e，cll-1，b7h4，和cd79。已經(jīng)進行半胱氨酸改造的某些抗her2抗體包括4d5和7c2(見本文中的實施例和圖)。類似地，已經(jīng)在抗cd33，抗muc16，抗steap1，抗ly6e，抗b7h4，抗cd22，和抗cd79b抗體中進行了單一半胱氨酸突變。已經(jīng)改造成具有單一半胱氨酸突變(即兩個半胱氨酸每個抗體)的抗muc16抗體的例子包括具有下述序列的抗體：已經(jīng)改造成具有單一半胱氨酸突變(即兩個半胱氨酸每個抗體)的抗steap1抗體的例子包括具有下述序列的抗體：已經(jīng)改造成具有單一半胱氨酸突變(即兩個半胱氨酸每個抗體)的抗napi2b抗體的例子包括具有下述序列的抗體：已經(jīng)改造成具有單一半胱氨酸突變(即兩個半胱氨酸每個抗體)的抗ly6e抗體的例子包括具有下述序列的抗體：已經(jīng)改造成具有單一半胱氨酸突變(即兩個半胱氨酸每個抗體)的抗cd79b抗體的例子包括具有下述序列的抗體：已經(jīng)改造成具有單一半胱氨酸突變(即兩個半胱氨酸每個抗體)的抗cd22抗體的例子包括具有下述序列的抗體：seqidno:描述序列192抗cd22hvr-h1gyefsrswmn193抗cd22hvr-h2griypgdgdtnysgkfkg194抗cd22hvr-h3dgsswdwyfdv195抗cd22hvr-l1rssqsivhsvgntfle196抗cd22hvr-l2kvsnrfs197抗cd22hvr-l3gyefsrswmn對上文所述改造成具有l(wèi)c-k149c突變的抗ly6e抗體實施了實驗。對上文所述改造成具有l(wèi)c-k149c突變的抗napi2b抗體實施了實驗。類似地，對上文所述改造成具有l(wèi)c-k149c突變的抗cd22抗體實施了實驗。而且，還將本文所述抗cd22抗體改造成具有依照eu編號方式的hc-l174c突變。對上文所述改造成具有hc-a140c突變(依照eu編號方式)的抗cd22抗體實施了實驗。對上文所述改造成具有hc-l174c突變(依照eu編號方式)的抗cd22抗體實施了實驗。某些抗cll1抗體已經(jīng)進行半胱氨酸改造以包括表1或2中的優(yōu)選位點之一且能改造成具有表3和4中公開的穩(wěn)定位點之一。具體而言，將抗cll1抗體進行半胱氨酸改造以包括lc-k149c半胱氨酸突變。某些抗b7h4抗體能進行半胱氨酸改造以包括表1或2中的優(yōu)選位點之一且能改造成具有表3和4中公開的穩(wěn)定位點之一。在本文所述實驗以外，本文所述任何抗體能改造成具有表1或2中描述的任何優(yōu)選的改造的半胱氨酸位點以生成半胱氨酸改造抗體(即thiomabtm抗體)。而且，本文所述任何抗體能改造成具有表3或4中描述的任何穩(wěn)定的改造的半胱氨酸位點以生成半胱氨酸改造抗體(即thiomabtm抗體)。具體而言，本文所述任何抗體能改造成具有l(wèi)c-k149c，hc-a140c(依照eu編號方式)，或hc-l174c(依照eu編號方式)且能用pds或-vc接頭綴合至本文所述藥物之一。實施例16-例示性adc本文所述任何抗體能使用接頭綴合至本文所述任何類別的藥物，該接頭將藥物附著至改造的半胱氨酸殘基。此類adc的例子可以通過依照wo2013/055987；wo2015/023355；wo2010/009124；wo2015/095227的規(guī)程偶聯(lián)藥物模塊與接頭試劑，并與本文所述任何半胱氨酸改造抗體綴合來制備。下表中使用了下述術(shù)語和縮寫：dar＝平均藥物/抗體比，a118c(重鏈，eu編號方式)(或者依照gne的順序編號方式稱作a121c(見圖1b)，或者依照kabat編號方式稱作a114c)，k149c(輕鏈，kabat編號方式)，a140c(eu編號方式)重鏈野生型("wt")，半胱氨酸改造的突變體抗體("thio")，輕鏈("lc")，重鏈("hc")，6-馬來酰亞胺基己?；?“mc”)，馬來酰亞胺基丙?；?“mp”)，纈氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)，丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)，對氨基芐基(“pab”)，對氨基芐氧羰基(“pabc”)，1-(氯甲基)-2,3-二氫-1h-苯并[e]吲哚(“cbi”)，吡咯并苯并二氮雜卓(“pbd”)，和單甲基奧瑞司他汀(“mmae”)。此類另外的adc的例子包括但不限于下文表17中提供的那些。表17：例示性抗體-藥物綴合物#51-69的結(jié)構(gòu)。注意，為簡便起見，所述結(jié)構(gòu)和adc51至63的結(jié)構(gòu)只顯示一個接頭-藥物基團附著至一個抗體。如上文提到的，多于一個接頭-藥物基團能附著至一個抗體。表18和19中提供了已經(jīng)生成的adc的具體例子。表18提供已經(jīng)生成的其中l(wèi)-d在半胱氨酸改造位點lc-k149c處附著至抗體的adc的例子。表19提供已經(jīng)生成的其中l(wèi)-d在半胱氨酸改造位點hc-a140c處附著至抗體的adc的例子。表18：已經(jīng)生成的其中l(wèi)-d在半胱氨酸改造位點lc-k149c處附著至抗體的adc的例子。表19：已經(jīng)生成的其中l(wèi)-d在半胱氨酸改造位點hc-a140c處附著至抗體的adc的例子。在表18和19二者中，dar是在緩沖鹽水中計算的。本發(fā)明并不限于由實施例中披露的具體實施方案的范圍，這些實施例用來例示本發(fā)明的幾個方面并且在功能上等效的任意實施方案均屬于本發(fā)明的范圍。實際上，除本文所示和所述的外，本發(fā)明的各種變型也對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言也是顯而易見的并且屬于本文所附權(quán)利要求的范圍。通過述及明確收錄貫穿本說明書引用的所有專利，專利申請，和參考文獻全文用于所有目的。當(dāng)前第1頁12