本發(fā)明涉及乳糖酶溶液以及使用其的乳、乳制品等的制造方法。

背景技術(shù)：

乳糖(lactose)不耐癥是指：先天性地?zé)o法很好地分解乳糖，因此由于乳制品等食品中的乳糖而呈現(xiàn)腹痛、腹瀉等諸癥狀的狀態(tài)。乳糖是由半乳糖及葡萄糖構(gòu)成的二糖。為了應(yīng)對乳糖不耐癥，在食品制造行業(yè)中進(jìn)行了如下操作：通過作為酶的乳糖酶，將牛乳等中所含的乳糖預(yù)先分解成半乳糖和葡萄糖。

為了將牛乳等中所含的乳糖分解而使用的乳糖酶溶液一直以來通過下述方法制造：培養(yǎng)產(chǎn)乳糖酶微生物，由細(xì)胞內(nèi)提取乳糖酶或獲取分泌到細(xì)胞外的乳糖酶，除去來自培養(yǎng)物的雜質(zhì)并純化后，添加穩(wěn)定劑并過濾滅菌。

所制造的乳糖酶溶液在冷藏(10℃以下)下進(jìn)行保存、銷售、運(yùn)輸。然后，乳糖酶溶液由使用者添加到牛乳等乳或乳制品中。該乳糖酶的添加方法主要有在乳等的殺菌前添加的方法、以及在殺菌后添加的方法這兩種。前者的情況下，過濾除菌工序并不是必需的，與此相對，后者的情況下必須進(jìn)行乳糖酶的過濾滅菌工序。添加乳糖酶后的乳在灌裝后銷售。

上述這種在殺菌后的乳等中添加乳糖酶的制造工藝中，在過濾滅菌工序中，乳糖酶溶液容易引起過濾器的堵塞，已知這是導(dǎo)致作業(yè)效率顯著降低的原因。為了應(yīng)對該問題，例如專利文獻(xiàn)1(日本特公平6－73454號公報)記載了：在成為堵塞原因的蛋白質(zhì)和多糖類的劣化產(chǎn)物形成之前、例如乳糖酶溶液剛回收后及剛純化后，對乳糖酶液進(jìn)行過濾滅菌。該方法可以在乳糖酶溶液制造時進(jìn)行。但是，一旦形成劣化產(chǎn)物后則無法實(shí)施。這是由于，若將通過該方法制造的乳糖酶溶液在保存或運(yùn)輸后進(jìn)行過濾，則有時會產(chǎn)生堵塞。例如，將通過該方法制造的乳糖酶運(yùn)輸給使用者后，該使用者為了在乳等中添加該乳糖酶而對該乳糖酶進(jìn)行過濾滅菌工序時，有時會產(chǎn)生過濾器的堵塞。如果產(chǎn)生堵塞，則必須停止制造工序并更換過濾器，存在使作業(yè)效率顯著降低的問題。特別是在制造乳的各制造工序連續(xù)進(jìn)行的情況下，由于無法僅停止過濾滅菌工序，因此必須停止全部的乳制造工序。其結(jié)果是，導(dǎo)致乳的制造效率顯著下降，需要對此進(jìn)行改善。

因此，專利文獻(xiàn)1中記載的方法未能解決制品化后的乳糖酶溶液的過濾中的堵塞問題。

另外，專利文獻(xiàn)2(日本特表2004－534527號公報)記載了：使乳糖酶溶液中所含的多糖類和寡糖的濃度為一定值以下，特別是通過色譜來除去這些物質(zhì)。但是，即使使多糖類和寡糖的濃度為一定值以下，有時在如上所述地制品化后的過濾中同樣會產(chǎn)生堵塞問題。

因此，上述問題尚未充分解決。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1：日本特公平6－73454號公報

專利文獻(xiàn)2：日本特表2004－534527號公報

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明要解決的課題

本發(fā)明的目的在于，提供將制劑化后的乳糖酶溶液添加使用在乳中之前的過濾工序中的使過濾裝置(過濾器)的堵塞降低的方法、以及不易引起過濾裝置堵塞的乳糖酶溶液。

用于解決課題的手段

本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)，堵塞現(xiàn)象由于攪拌、振蕩之類的物理刺激和/或溫度負(fù)荷而產(chǎn)生、加速。并且發(fā)現(xiàn)，通過降低乳糖酶溶液中所含的物質(zhì)間的相互作用而可防止堵塞現(xiàn)象，并完成了本發(fā)明。

因此，根據(jù)本發(fā)明，提供以下方案。

〔1〕一種乳糖酶溶液，其特征在于，以達(dá)到5,000NLU/g或10,000ALU/g的活性的濃度在100rpm、10℃下進(jìn)行16小時的攪拌處理，然后，以達(dá)到1,000NLU/g或2,000ALU/g的活性的濃度使其從孔徑0.22μm的膜過濾器透過366kg/m²時，透過速度為5kg/min×m²以上；

〔2〕根據(jù)上述〔1〕所述的乳糖酶溶液，其特征在于，將透過試驗(yàn)剛開始后(透過20g時)的透過速度設(shè)為100％時，透過試驗(yàn)結(jié)束時(透過180g時)的透過速度為10％以上；

〔3〕根據(jù)上述〔1〕或〔2〕所述的乳糖酶溶液，其含有凝聚抑制劑；

〔4〕根據(jù)上述〔3〕所述的乳糖酶溶液，其中，凝聚抑制劑為選自HLB12～15的表面活性劑、保護(hù)劑及金屬離子或其鹽中的一種以上；

〔5〕根據(jù)上述〔3〕或〔4〕所述的乳糖酶溶液，其中，上述HLB12～15的表面活性劑的濃度為0.001質(zhì)量％～5質(zhì)量％；

〔6〕根據(jù)上述〔4〕或〔5〕所述的乳糖酶溶液，其中，上述保護(hù)劑為選自聚醚及增粘多糖類中的一種以上；

〔7〕根據(jù)上述〔6〕所述的乳糖酶溶液，其中，上述聚醚是亞烷基的碳數(shù)為2～8的聚亞烷基二醇；

〔8〕根據(jù)上述〔7〕所述的乳糖酶溶液，其中，上述聚亞烷基二醇的濃度為0.05質(zhì)量％～15質(zhì)量％；

〔9〕根據(jù)上述〔1〕～〔8〕中任一項所述的乳糖酶溶液，其中，乳糖酶的活性為10～100,000NLU/g或10～100,000ALU/g；

〔10〕根據(jù)上述〔1〕～〔9〕中任一項所述的乳糖酶溶液，其含有穩(wěn)定劑；

〔11〕一種乳，其是通過添加上述〔1〕～〔10〕中任一項所述的乳糖酶溶液而得到的；

〔12〕一種乳制品，其是至少將上述〔1〕～〔10〕中任一項所述的乳糖酶溶液或上述〔11〕所述的乳作為一種原料而得到的；

〔13〕一種乳糖酶溶液，其含有凝聚抑制劑。

發(fā)明效果

根據(jù)本發(fā)明，將乳糖酶溶液添加使用在乳中之前的過濾工序中的過濾器堵塞的問題可得到改善。由此，可以降低由堵塞所帶來的過濾器更換及與此相伴隨的生產(chǎn)線的滅菌等頻度，大幅提高作業(yè)效率。另外，本發(fā)明與基于除去堵塞物質(zhì)等的現(xiàn)有方法相比，簡便，在乳糖酶溶液的保存中不會再次形成堵塞物質(zhì)的方面也優(yōu)良。

附圖說明

圖1：圖1為示出對引起堵塞現(xiàn)象的原因進(jìn)行研究而得的結(jié)果的圖。框圖(パネル)A、框圖B、框圖C分別示出在10℃、20℃、30℃振蕩或靜置后測定過濾器透過性的結(jié)果?？驁DD示出在各溫度下振蕩或靜置時的乳糖酶活性的測定結(jié)果。

圖2：圖2為示出通過在10℃攪拌16小時來再現(xiàn)堵塞現(xiàn)象的結(jié)果的圖。

圖3：圖3示出添加各種表面活性劑對防止堵塞現(xiàn)象的有效性的研究結(jié)果。圖3中，◆示出無添加的樣品的情況，●示出加入吐溫80作為添加劑的情況，×示出加入TritonX(Tx)－100作為添加劑的情況，－示出加入RYOTO聚甘油酯作為添加劑的情況。

圖4：圖4示出添加各種聚乙二醇(PEG200、PEG400、PEG4000、PEG6000、PEG20000)對防止堵塞現(xiàn)象的有效性的研究結(jié)果。圖4中，◆示出無添加的樣品，●、○、▲及△分別示出加入各種聚乙二醇作為添加劑的情況。

圖5：圖5示出改變TritonX－100(框圖A)及吐溫80(框圖B)的添加濃度對防止堵塞現(xiàn)象的有效性的研究結(jié)果。

圖6：圖6示出改變PEG6000(框圖A)及PEG20000(框圖B)的添加濃度對防止堵塞現(xiàn)象的有效性的研究結(jié)果。

圖7：圖7示出改變Mg鹽添加濃度對防止堵塞現(xiàn)象的有效性的研究結(jié)果。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的乳糖酶溶液必須含有乳糖酶及防止該乳糖酶溶液中所含的乳糖酶等蛋白質(zhì)凝聚的凝聚抑制劑，任選還含有穩(wěn)定劑等添加劑。以下按照(1)乳糖酶溶液的構(gòu)成成分、(2)乳糖酶溶液的組成(特別是凝聚抑制劑的濃度)、(3)乳糖酶溶液的性質(zhì)、(4)乳糖酶溶液的制造方法、(5)乳糖酶溶液的使用方法·用途的順序進(jìn)行說明。

《乳糖酶溶液的構(gòu)成成分》

＜乳糖酶＞

(原料生物的種類)

從包括微生物在內(nèi)的非常廣范的生物中，分離出乳糖酶。乳糖酶多數(shù)情況下為克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、桿菌屬(Bacillus)之類的微生物的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外成分?？唆斁S酵母屬、特別是脆壁克魯維酵母(K.fragilis)及乳酸克魯維酵母(K.lactis)以及念珠菌屬(Candida)、酵母屬(Torula)及球擬酵母菌屬(Torulopsis)的酵母等是作為酵母酶的乳糖酶的通常來源，另一方面，凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)或環(huán)狀芽孢桿菌(B.circulans)是細(xì)菌乳糖酶的公知來源。來自這些生物的乳糖酶制備物可以由幾種商業(yè)渠道獲得。這些乳糖酶的最適pH均為pH＝6～pH＝8，因此是所謂的中性乳糖酶。另外，黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、多色青霉(Penicillium multicolor)產(chǎn)生細(xì)胞外乳糖酶，美國專利第5,736,374號的說明書中記載了由米曲霉產(chǎn)生的、這種乳糖酶的例子。最適pH、最適溫度等乳糖酶的酶學(xué)特性根據(jù)物種而變化。通常，細(xì)胞外乳糖酶的最適pH為pH＝3.5～pH＝5.0，較低，為所謂的酸性乳糖酶。

本發(fā)明中，優(yōu)選使用中性乳糖酶以及酸性乳糖酶，特別優(yōu)選使用來自克魯維酵母屬的中性乳糖酶以及來自曲霉屬(Aspergillus)的酸性乳糖酶。

(乳糖酶的制法)

本發(fā)明中使用的乳糖酶可以是通過現(xiàn)有的常規(guī)方法從微生物中回收、純化后的乳糖酶。本發(fā)明中使用的乳糖酶可以是細(xì)胞內(nèi)乳糖酶或細(xì)胞外乳糖酶中的任一種。為前者的情況下，乳糖酶通常來自微生物的細(xì)胞質(zhì)。作為細(xì)胞內(nèi)乳糖酶溶液的具體制造方法，可以列舉例如首先進(jìn)行微生物的培養(yǎng)，然后分離乳糖酶的方法。該方法中，為了使酶從細(xì)胞質(zhì)中釋放出來而需要破壞細(xì)胞壁。為了溶解細(xì)胞，使用利用辛醇等有機(jī)溶劑進(jìn)行的細(xì)胞壁透過化、超聲波分解或弗氏壓碎等技術(shù)。可以從溶解后的細(xì)胞中通過公知方法分離·回收乳糖酶。在為后者的情況下，不需要進(jìn)行上述細(xì)胞壁的破壞，例如，可以在培養(yǎng)后通過離心分離或過濾來取得培養(yǎng)液中的細(xì)胞。在發(fā)酵停止后或細(xì)胞取出后，從培養(yǎng)液中回收乳糖酶。任意情況下均可以通過現(xiàn)有手段進(jìn)一步對乳糖酶進(jìn)行純化及分離。

＜凝聚抑制劑I＞

本發(fā)明的乳糖酶溶液含有防止該乳糖酶溶液中所含的乳糖酶等蛋白質(zhì)凝聚的凝聚抑制劑。本發(fā)明中使用的適宜的凝聚抑制劑為(類型1)HLB12～15的表面活性劑、(類型2)脂肪親和性表面活性劑、(類型3)非離子性脂肪親和性表面活性劑、(類型4)非離子性表面活性劑、(類型5)天然產(chǎn)物系表面活性劑。更適宜的是HLB12～15的非離子性表面活性劑?？衫斫鉃椋和ㄟ^使這種凝聚抑制劑存在于體系中，從而降低或防止了蛋白質(zhì)的疏水性相互作用，其結(jié)果，即使在長時間攪拌、振蕩等時也可以防止由于凝聚而導(dǎo)致的堵塞物質(zhì)的形成。從水系溶液中的乳化穩(wěn)定性及疏水性物質(zhì)的分散效果高的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選HLB12～15的表面活性劑。以下對這些表面活性劑進(jìn)行詳細(xì)說明。需要說明的是，這些類型是根據(jù)物性、來源等進(jìn)行分類的，存在屬于某一類型的成分還屬于另一類型的情況。另外，還可以將同一種表面活性劑中的多種組合使用，或者將不同種類的表面活性劑中的多種組合使用。

(類型1)

首先，HLB12～15的表面活性劑中的“HLB”是通過Griffin法算出的值。另外，更適宜的HLB為13～15。作為類型1的表面活性劑，除了陰離子性表面活性劑及兩性離子表面活性劑以外還可以使用后述的非離子性表面活性劑。

(類型2)

然后，作為脂肪親和性表面活性劑，可以列舉例如：醇、聚氧乙烯烷基醚、脂肪酸、膽汁酸、甘油脂肪酸酯、乙酰化甘油脂肪酸酯、低級醇脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚乙二醇甘油脂肪酸酯、聚丙二醇脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、聚乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯甘油酯、單/二甘油酯的乳酸衍生物、丙二醇二甘油酯、失水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物、反式酯化植物油、甾醇、甾醇衍生物、糖酯、糖醚、蔗糖甘油酯(sucroglyceride)、聚氧乙烯植物油、聚氧乙烯氫化植物油、多元醇與選自脂肪酸、甘油酯、植物油、氫化植物油及甾醇中的至少一種要素的反應(yīng)混合物、以及它們的混合物。

(類型3)

另外，作為非離子性脂肪親和性表面活性劑，可以列舉例如：烷基葡糖苷、烷基麥芽糖苷、烷基硫代葡糖苷、月桂基聚乙二醇甘油酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基酚、聚乙二醇脂肪酸酯、聚乙二醇甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯甘油酯、聚氧乙烯甾醇、它們的衍生物及類似物、聚氧乙烯植物油、聚氧乙烯氫化植物油、多元醇與選自脂肪酸、甘油酯、植物油、氫化植物油及甾醇中的至少一種要素的反應(yīng)混合物、生育酚聚乙二醇丁二酸酯、糖酯、糖醚、蔗糖甘油酯以及它們的混合物。

(類型4)

進(jìn)而，作為非離子性表面活性劑，可以列舉：Brij35、聚氧乙烯(20)鯨蠟醚之類的正構(gòu)烷基PEO單醚、Lubrol PX、Lubrol WX、nonidet P－40、聚(乙二醇)n10辛基苯基醚及聚(乙二醇)n7辛基苯基醚之類的正構(gòu)烷基苯基PEO、四甲基丁基苯基PEO、正辛基葡糖苷、辛基－硫代吡喃葡糖苷、吐溫－85、吐溫－80、吐溫－65、吐溫－60、吐溫－40及吐溫－20、以及烷基芳基聚醚醇(TritonX－100)、聚乙二醇叔辛基苯基醚(TritonX－114)。

(類型5)

另外，作為來自天然產(chǎn)物的表面活性劑，可以列舉：蔗糖脂肪酸酯、聚乙烯脂肪酸酯、卵磷脂、溶血卵磷脂、皂樹皂甙。

這些之中，最適宜的凝聚抑制劑I為選自聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯(例如polysorbate80)、烷基芳基聚醚醇(例如TritonX－100)及甘油脂肪酸酯中的至少1種。

＜凝聚抑制劑II＞

作為防止本發(fā)明的乳糖酶溶液中所含的乳糖酶等蛋白質(zhì)凝聚的凝聚抑制劑，可以使用具有覆蓋乳糖酶等蛋白質(zhì)的表面的作用的保護(hù)劑。作為保護(hù)劑，可以使用聚醚及增粘多糖類。

作為聚醚，可以列舉：亞烷基的碳數(shù)為2～8的聚亞烷基二醇(例如，聚氧丙烯衍生物、聚乙二醇)等。從水合性高、具有極其柔軟的結(jié)構(gòu)骨架而有效地保護(hù)蛋白質(zhì)的理由出發(fā)，聚亞烷基二醇中，聚乙二醇是適宜的。作為聚乙二醇的數(shù)均分子量，適宜為200～4000000，更適宜為400～20000。

可理解為：聚醚也具有親水性部位和疏水性部位，因此可以防止乳糖酶溶液中所含的乳糖酶等蛋白質(zhì)的疏水性相互作用，其結(jié)果，具有降低堵塞物質(zhì)的形成的效果。另外，可以將同一種聚醚中的多種組合使用，也可以將不同種的聚醚中的多種組合使用。

作為增粘多糖類，可以使用結(jié)冷膠、角叉菜膠、黃原膠、刺槐豆膠、瓜爾膠、果膠、瓊脂、明膠、阿拉伯膠、葡甘露聚糖、塔拉膠、普魯蘭多糖、羅望子種子多糖類、黃蓍膠、刺梧桐樹膠、藻酸、藻酸鈉、擬莖點(diǎn)霉膠(Macrophomopsis gum)、玉米淀粉和木薯淀粉等淀粉、糊精及環(huán)糊精。

＜凝聚抑制劑III＞

進(jìn)而，作為防止乳糖酶溶液中所含的乳糖酶等蛋白質(zhì)凝聚的凝聚抑制劑，可以列舉具有鹽溶效果的金屬離子或其鹽。從乳糖酶溶液中容易得到適當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度的理由出發(fā)，金屬離子中，胍離子、鈣離子或Mg離子或者它們的鹽是適宜的。

通過添加金屬離子或其鹽，溶液的離子強(qiáng)度變得適當(dāng)，乳糖酶溶液中所含的乳糖酶等蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)間的疏水性相互作用減弱。其結(jié)果可理解為：蛋白質(zhì)變得不易凝聚，對堵塞物質(zhì)的形成具有降低效果。另外，可以將同一種金屬離子或其鹽中的多種組合使用，也可以將不同種金屬離子或其鹽中的多種組合使用。

這些凝聚抑制劑I～I(xiàn)II可以單獨(dú)使用，也可以將不同種類的凝聚抑制劑組合使用。例如，可以將凝聚抑制劑I與II、凝聚抑制劑II與III、凝聚抑制劑I與III以及凝聚抑制劑I、II與III一起使用。另外，由于凝聚抑制劑III單獨(dú)時效果微弱，因此優(yōu)選將凝聚抑制劑I與III、以及凝聚抑制劑II與III一起使用。

＜任選成分＞

本發(fā)明的乳糖酶溶液可以根據(jù)需要含有各種成分。作為具體例子，可以列舉：有助于乳糖酶的穩(wěn)定化的金屬鹽類、各種糖類、抗壞血酸、甘油等，用于提高可用性的作為賦形劑的淀粉、糊精，具有緩沖作用的無機(jī)鹽類等。

《乳糖酶溶液的組成(特別是凝聚抑制劑的量)》

＜凝聚抑制劑I＞

乳糖酶溶液中，以乳糖酶溶液的總質(zhì)量為基準(zhǔn)，適宜以0.001質(zhì)量％～5質(zhì)量％的范圍、更適宜0.01質(zhì)量％～1質(zhì)量％、進(jìn)一步適宜0.1質(zhì)量％～0.5質(zhì)量％的范圍來添加凝聚抑制劑I。

＜凝聚抑制劑II＞

乳糖酶溶液中，以乳糖酶溶液的總質(zhì)量為基準(zhǔn)，適宜以0.05質(zhì)量％～15質(zhì)量％的范圍、更適宜0.3質(zhì)量％～10質(zhì)量％的范圍、進(jìn)一步適宜0.5質(zhì)量％～5質(zhì)量％的范圍來添加凝聚抑制劑II。

＜凝聚抑制劑III＞

對于凝聚抑制劑III來說，在乳糖酶溶液中，作為金屬成分，優(yōu)選為0.1mM以上且20mM以下的濃度，更優(yōu)選為0.25mM以上且15mM以下的濃度，進(jìn)一步優(yōu)選為0.5mM以上且10mM以下的濃度，最優(yōu)選為1mM以上且5mM以下的濃度。鹽溶效果高的順序?yàn)殡译x子、鈣離子、鎂離子。鎂離子需要更高的濃度，胍離子及鈣離子可以為比鎂離子低的濃度。

《乳糖酶溶液的性質(zhì)》

＜乳糖酶活性＞

本發(fā)明的乳糖酶溶液期望具有10～100,000NLU/g的中性乳糖酶活性，更期望具有100～90,000NLU/g的活性，進(jìn)一步期望具有1,000～80,000NLU/g的活性?！癗LU”為中性乳糖酶單位?；钚缘臏y定方法例如如下所述。通過將底物鄰硝基苯基－β－吡喃半乳糖苷(ONPG)水解為鄰硝基苯基及半乳糖來測定。通過添加碳酸鈉而使反應(yīng)結(jié)束。所形成的鄰硝基苯基在堿性介質(zhì)中變?yōu)辄S色，吸光度的變化被用于測定酶活性(以NLU/g來表示)。其步驟公布在美國食品化學(xué)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)集(FCC；Food Chemicals Codex)第4版、1996年7月1日、第801～802頁/乳糖酶(中性)(β－半乳糖苷酶)活性中。

本發(fā)明的乳糖酶溶液期望具有10～100,000ALU/g的酸性乳糖酶活性，更期望具有100～90,000ALU/g的活性，進(jìn)一步期望具有1,000～80,000ALU/g的活性?！癆LU”為酸性乳糖酶單位?；钚缘臏y定方法例如如下所述。通過將底物鄰硝基苯基－β－吡喃半乳糖苷(ONPG)水解為鄰硝基苯基及半乳糖來測定。通過添加碳酸鈉來結(jié)束反應(yīng)。所形成的鄰硝基苯基在堿性介質(zhì)中變?yōu)辄S色，吸光度的變化被用于測定酶活性(以ALU/g來表示)。其步驟公布在美國食品化學(xué)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)集(FCC；Food Chemicals Codex)第4版、1996年7月1日、第802～803頁/乳糖酶(酸性)(β－半乳糖苷酶)活性中。

本發(fā)明的乳糖酶溶液可以是中性乳糖酶溶液，也可以是酸性乳糖酶溶液，還可以是兩者混合成的在中性～酸性范圍內(nèi)起作用的乳糖酶溶液。

＜攪拌后的透過速度(相對值)＞

就本發(fā)明的乳糖酶溶液而言，可以以達(dá)到5,000NLU/g或10,000ALU/g的活性的濃度在100rpm、10℃下進(jìn)行16小時的攪拌處理，然后將在下述條件下測定的透過試驗(yàn)剛開始后(透過20g時)的透過速度(Flux)設(shè)為100％，算出試驗(yàn)結(jié)束時(透過180g時)的透過速度減少了多少，從而來進(jìn)行判斷。透過試驗(yàn)結(jié)束時的透過速度越高越優(yōu)選，優(yōu)選為10％以上，更優(yōu)選為20％以上，進(jìn)一步優(yōu)選為30％以上。上限值為例如75％。

乳糖酶溶液的活性可以通過用離子交換水稀釋或進(jìn)行超濾濃縮來調(diào)節(jié)。

＜攪拌后的透過速度(絕對值)＞

本發(fā)明的乳糖酶溶液，其特征在于，以達(dá)到5,000NLU/g或10,000ALU/g的活性的濃度在100rpm、10℃下攪拌處理16小時，然后在下述條件下測定的過濾器透過速度為5kg/min×m²以上。該過濾器透過速度優(yōu)選為8kg/min×m²以上，進(jìn)一步優(yōu)選為10kg/min×m²以上，最優(yōu)選為20kg/min×m²以上。

＜堵塞現(xiàn)象的再現(xiàn)條件＞

乳糖酶的過濾器堵塞現(xiàn)象可以通過對乳糖酶溶液進(jìn)行往復(fù)振蕩或攪拌操作而再現(xiàn)。進(jìn)行往復(fù)振蕩或攪拌操作的時間雖然也取決于加溫溫度及乳糖酶溶液中所含的活性值，但可以在30分鐘～7天之間來設(shè)定，優(yōu)選為1小時～6天，更優(yōu)選為2小時～5天。進(jìn)行往復(fù)振蕩或攪拌操作時，對乳糖酶溶液進(jìn)行加溫可以促進(jìn)堵塞現(xiàn)象。

乳糖酶溶液的往復(fù)振蕩優(yōu)選為10spm(往復(fù)/分鐘)～300spm(往復(fù)/分鐘)，更優(yōu)選為20spm(往復(fù)/分鐘)～250spm(往復(fù)/分鐘)，進(jìn)一步優(yōu)選為30spm(往復(fù)/分鐘)～200spm(往復(fù)/分鐘)。

乳糖酶溶液的攪拌操作優(yōu)選為10rpm(轉(zhuǎn)/分鐘)～300rpm(轉(zhuǎn)/分鐘)，更優(yōu)選為20rpm(轉(zhuǎn)/分鐘)～250rpm(轉(zhuǎn)/分鐘)，進(jìn)一步優(yōu)選為30rpm(轉(zhuǎn)/分鐘)～200rpm(轉(zhuǎn)/分鐘)。

乳糖酶溶液的加溫溫度優(yōu)選為5℃～70℃左右，更優(yōu)選為6℃～65℃，進(jìn)一步優(yōu)選為7℃～60℃。隨著溫度的升高而容易產(chǎn)生堵塞現(xiàn)象。

乳糖酶溶液的乳糖酶活性在10～100,000NLU/g或10～100,000ALU/g的范圍即可?；钚灾翟礁?，則越容易產(chǎn)生堵塞現(xiàn)象。

＜過濾器透過性試驗(yàn)1＞

可以在低溫環(huán)境下，對具有規(guī)定膜面積的規(guī)定過濾器加壓，使調(diào)整了乳糖酶含量從而達(dá)到一定的乳糖酶活性的被檢體透過，通過測定其速度來評價過濾器透過性。具體而言，例如，可以如下實(shí)施。

(過濾器透過性測定步驟)

在低溫～室溫(例如1～30℃、優(yōu)選為4～15℃、更優(yōu)選為8～12℃)環(huán)境下實(shí)施以下的操作。

1.測定裝置等的溫度

將測定裝置、乳糖酶溶液樣品及離子交換水冷卻到低溫～室溫(例如1～30℃、優(yōu)選為4～15℃、更優(yōu)選為8～12℃)。

2.乳糖酶液的制備

將乳糖酶溶液樣品用離子交換水稀釋或進(jìn)行超濾濃縮，從而將乳糖酶活性調(diào)整到一定值，充分混合。需要說明的是，乳糖酶活性可以根據(jù)乳糖酶溶液的粘度調(diào)整到10～2,000NLU/g或10～4,000ALU/g左右中的任意活性。

3.試驗(yàn)裝置的構(gòu)成

可以將可進(jìn)行加壓的帶槽的過濾器架作為測定樣品導(dǎo)入部并進(jìn)一步與另一過濾器架連接，從而作為試驗(yàn)裝置來使用。帶槽的過濾器架雖然也可以單獨(dú)使用，但為了得到堵塞過濾器的條件，前者是適宜的，就其直徑而言，優(yōu)選該大于所連接的過濾器架的直徑。

通常，過濾器架內(nèi)的樣品透過部分為如下構(gòu)成：從測定樣品的入口側(cè)起，具備O型環(huán)、濾膜、支承網(wǎng)，但并非僅限于此。對濾膜沒有特別限定，其孔徑優(yōu)選為0.05～0.50μm，進(jìn)一步優(yōu)選為0.1～0.45μm。另外，可以為親水性濾膜，也可以為疏水性濾膜。更優(yōu)選親水性濾膜。只要為能夠調(diào)整有效膜面積的大小即可，沒有特別限定。有效膜面積可以通過液體非透過性的標(biāo)簽密封件(ラベルシール)等來調(diào)節(jié)，為例如0.5～1.8cm²，優(yōu)選1.0～1.5cm²。

將4.2.中稀釋后的乳糖酶溶液樣品(以后簡記為樣品)加入測定樣品導(dǎo)入部。

5.使用氮?dú)?也可以用空氣、氧氣、氬氣等)對帶槽過濾器架施加0.1～1MPa、優(yōu)選為0.2MPa的壓力，記載每次透過規(guī)定量(例如10～30g)、優(yōu)選為20g的樣品的經(jīng)過時間。

(堵塞抑制效果的判定)

按照上述過濾器透過性測定步驟且使用現(xiàn)有的乳糖酶溶液(不含凝聚抑制劑)作為乳糖酶溶液時，透過試驗(yàn)結(jié)束時，透過速度大幅下降。在透過速度比該現(xiàn)有的乳糖酶溶液大時，可以判斷出作為凝聚抑制劑而添加的物質(zhì)具有堵塞抑制效果。

《乳糖酶溶液的制造方法》

本發(fā)明的乳糖酶的具體制造方法的細(xì)節(jié)如上所述，這里省略記載，例如含有：(1)進(jìn)行酵母的培養(yǎng)后的、與細(xì)胞壁的破壞相伴隨的乳糖酶提取工序，和(2)用于從該提取的乳糖酶中除去來自培養(yǎng)物的雜質(zhì)等的純化工序。本發(fā)明的乳糖酶溶液的制造方法含有：(3)在上述乳糖酶(既可以是新鮮制備的，也可以是市售品)中添加凝聚抑制劑(+根據(jù)需要的其它添加劑)的工序，和(4)為了滅菌而進(jìn)行過濾的工序。

《乳糖酶溶液的使用方法·用途》

(乳糖酶溶液的使用方法)

作為乳糖酶溶液的具體利用方式，可以列舉例如在發(fā)酵乳的制造中使用。進(jìn)行了乳糖分解的發(fā)酵乳的制造方法包括：1.在殺菌前的乳中添加乳糖酶而進(jìn)行乳糖的分解后，在對乳進(jìn)行加熱殺菌的同時使乳糖酶失活，然后將乳發(fā)酵的方法(日本特開平5－501197號公報)，2.在殺菌乳中添加乳糖酶而進(jìn)行乳糖的分解后，通過加熱處理使乳糖酶失活，然后將乳發(fā)酵的方法，3.通過經(jīng)固定化的乳糖酶將乳中的乳糖分解，然后將乳發(fā)酵的方法(日本特開昭46－105593號公報、日本特開昭59－162833號公報)，4.將預(yù)先進(jìn)行了乳糖分解或乳糖除去的原材料用為殺菌乳并將其發(fā)酵的方法等。

進(jìn)而，作為本發(fā)明的乳糖酶溶液的具體利用方式，可在長儲存期牛奶的制造中使用。長儲存期牛奶是保質(zhì)期長的牛奶，制造工序包括滅菌工序和連續(xù)式無菌包裝工序，通常通過135～150℃下數(shù)秒的超高溫短時間滅菌法來處理，并通過能夠進(jìn)行無菌包裝的工序灌裝到預(yù)先進(jìn)行了過氧化氫滅菌的紙容器中。

添加到長儲存期牛奶中的乳糖酶溶液，通常在過濾滅菌后在對超高溫短時間滅菌后的牛乳進(jìn)行灌裝時添加。

(乳糖酶溶液的用途)

本發(fā)明的乳糖酶溶液特別適合于乳制品制造用途。這里，乳制品是指冰激凌、長儲存期牛奶等牛奶類、酸奶、奶油、酸奶油、乳酪等。本發(fā)明的乳糖酶溶液特別適合于長儲存期牛奶的制造用途。

(乳糖酶的用途和其pH曲線)

另外，在考慮乳糖酶的用途的情況下，根據(jù)是中性乳糖酶還是酸性乳糖酶可以大致分為2類。這取決于用途中的pH曲線?？梢哉f中性pH的用途中通常優(yōu)選中性乳糖酶，酸性乳糖酶更適合于酸性范圍的用途。

這里，上述的過濾器透過性試驗(yàn)1不僅可以應(yīng)用于乳糖酶溶液，而且還可以應(yīng)用于蛋白質(zhì)、肽。如后所述，其原因在于，可認(rèn)為通過分子中的疏水性部分彼此接觸、附著而形成凝聚物。

以下，對這種過濾器透過性的試驗(yàn)進(jìn)行詳細(xì)說明。

本試驗(yàn)方法為一種對堵塞進(jìn)行評價的試驗(yàn)方法，其特征在于，使用具有：

具有第一直徑的第一圓筒狀流路、

具有小于上述第一直徑的第二直徑、并且按照能夠與上述第一圓筒狀流路導(dǎo)通流體的方式連接且配置在上述第一圓筒狀流路的下游的第二圓筒狀流路、和

配置在上述第二圓筒狀流路的、與上述第一圓筒狀流路相反側(cè)的開口部的膜過濾器的單元，

測定液體的每單位面積的透過量(permeate(kg/m²))和/或透過速度(flux(kg/min×m²))的變化，從而對堵塞進(jìn)行評價，

上述測定方法具有：對測定對象的液體進(jìn)行加壓，使該液體介由上述第一圓筒狀流路及上述第二圓筒狀流路從上述膜過濾器排出到該單元外部的工序，并且，

上述單元具有：

設(shè)置在上述膜過濾器的下游側(cè)且靠近上述膜過濾器的位置的支承網(wǎng)、和

一個或多個液體非透過性密封件，其貼合在上述支承網(wǎng)上的、上述膜過濾器側(cè)，且上述一或多個密封件的總面積小于上述膜過濾器的面積，

上述膜過濾器和上述液體非透過性密封件處于接觸狀態(tài)。

根據(jù)本試驗(yàn)方法，可以再現(xiàn)膜過濾器的堵塞現(xiàn)象，可以簡單地實(shí)施堵塞現(xiàn)象的對策等的檢驗(yàn)試驗(yàn)。

實(shí)施例

1.堵塞現(xiàn)象的再現(xiàn)條件的研究

使用YNL(合同酒精株式會社制，商品名：GODO－YNL)作為乳糖酶溶液，調(diào)查產(chǎn)生堵塞的條件。需要說明的是，使用的GODO－YNL是來自克魯維酵母屬的中性乳糖酶，活性為5,000NLU/g。

(往復(fù)振蕩處理)

將200g的YNL加入到500ml PP制塑料瓶(アイボーイ)(廣口(AS ONE Corporation制、型號7－2102－03))中，在10、20或30℃下用振蕩裝置(大洋科學(xué)工業(yè)株式會社制、制品名TAIYO INCUBATOR PERSONAL、振幅3cm)往復(fù)振蕩(100spm(往復(fù)/分鐘)))或靜置0、2、4或7天。分別量取各YNL 40g，用離子交換水稀釋5倍而將活性調(diào)整為1,000NLU/g，將其作為樣品來測定過濾器透過性。

(過濾器透過性試驗(yàn))

以下詳細(xì)記載本實(shí)施例中的上述過濾器透過性試驗(yàn)1的詳細(xì)條件。

(過濾器透過性測定步驟)

在10℃的環(huán)境下實(shí)施以下操作。

1.將測定裝置、乳糖酶溶液樣品及離子交換水冷卻到10℃。

2.將乳糖酶溶液樣品用離子交換水稀釋或進(jìn)行超濾濃縮而將乳糖酶活性調(diào)整為1,000NLU/g，充分混合。

3.試驗(yàn)中，在47mm帶槽不銹鋼支架(ADVANTEC東洋公司制、制品名“KST－47”)上連接25mm不銹鋼制過濾器架(PALL公司制、制品型號1209(有效膜面積3.7cm²))，將其作為裝置來使用。上述過濾器架內(nèi)的樣品透過部分為從測定樣品的入口側(cè)起具備O型環(huán)、濾膜、支承網(wǎng)的構(gòu)成(本發(fā)明的試驗(yàn)中，帶槽不銹鋼支架的過濾器及過濾器保持部分的組件(支承網(wǎng)和其支承體)未進(jìn)行安裝)。使用Merck Millipore公司制、制品名DURAPORE(孔徑0.22mm,親水性PVDF制)作為濾膜，使用上述過濾器架附帶的Type 316不銹鋼作為支承網(wǎng)。另外，為了調(diào)節(jié)透過速度，在支承網(wǎng)的上部(測定樣品的入口側(cè))左右對稱地貼上4片直徑0.9cm的圓形的標(biāo)簽密封件(AONE株式會社制、制品名A－one彩色標(biāo)簽07010)(有效膜面積1.26cm²)，設(shè)置膜過濾器(孔徑0.22μm)。濾膜在用50％甘油水溶液淋洗后安裝到不銹鋼制過濾器架上。

將4.2.中稀釋后的乳糖酶溶液樣品(樣品)加入帶槽不銹鋼支架。

5.使用氮?dú)鈱Р鄄讳P鋼支架施加0.2MPa的壓力，記錄每次透過20g的經(jīng)過時間。由其結(jié)果通過以下方法求出以1m²膜換算的透過量(permeate(kg/m²))和透過速度(flux(kg/min×m²))。

計算式(概念式)

Permeate(kg/m²)＝n點(diǎn)的透過量(g)/(膜半徑(mm)×膜半徑(mm)×圓周率)(m²)×1000

Flux(kg/min×m²)＝(n點(diǎn)的permeate－(n－1)點(diǎn)的permeate)/(n點(diǎn)的透過時間(min)－(n－1)點(diǎn)的透過時間(min))

※n表示測定點(diǎn)。由于記錄每次透過20g的經(jīng)過時間，因此，例如，n點(diǎn)為透過20g時的透過量或permeate時，(n－1)點(diǎn)為透過0g時的透過量或permeate。

將結(jié)果示于圖1?？驁DA示出10℃時、框圖B示出20℃時、框圖C示出30℃時分別靜置或往復(fù)振蕩的結(jié)果。各溫度下，靜置的樣品不論靜置天數(shù)如何，透過速度的降低都小，與此相對地，往復(fù)振蕩的樣品的透過量在振蕩天數(shù)越多時透過速度越急劇降低，在20℃或30℃振蕩7天的樣品由于堵塞而無法測定。因此，可認(rèn)為，主要是由于往復(fù)振蕩處理而形成凝聚物而引起堵塞的。另一方面，20℃往復(fù)振蕩樣品、30℃往復(fù)振蕩樣品中，在第2天以后可見有些渾濁，而靜置樣品則未見渾濁。但是，往復(fù)振蕩樣品及靜置樣品這兩者都可見溫度越高則透過量越降低的傾向。發(fā)現(xiàn)了：溫度上升使振蕩所引起的凝聚物的形成加速。

如框圖D所示，各溫度下振蕩或靜置時，乳糖酶活性都幾乎沒有變化。因此可知，引起堵塞的凝聚物的形成對乳糖酶活性幾乎沒有影響。

進(jìn)而，調(diào)查了攪拌而非往復(fù)振蕩下是否會觀察到同樣的現(xiàn)象。將50g的YNL加入到100ml燒杯中，在10℃下用攪拌裝置(AS ONE Corporation制、商品名HS－400)以各速度(攪拌速度最小：100rpm、速度2：170rpm、速度3：240rpm、速度4：310rpm)攪拌16小時。然后，與上述相同地制備樣品，與上述過濾器透過性試驗(yàn)同樣地測定過濾器透過性。

將結(jié)果示于圖2。可以確認(rèn)出，與不進(jìn)行處理的情況相比，攪拌操作導(dǎo)致透過性顯著惡化。

由以上結(jié)果可明確：振蕩或攪拌之類的物理刺激是會引發(fā)堵塞的凝聚物形成的主要原因。因此可認(rèn)為，通過乳糖酶溶液制造后的運(yùn)輸中產(chǎn)生的振動等，也會形成凝聚物。

需要說明的是，雖然圖中未示出，但已經(jīng)確認(rèn)：使用乳糖酶溶液中所含的多糖類及寡糖類的含量低于10g/kg的樣品、及超過10g/kg的樣品進(jìn)行上述攪拌處理，其結(jié)果，任一乳糖酶溶液中均以同等程度地形成凝聚物。這表明：凝聚物的產(chǎn)生幾乎不受乳糖酶溶液中所含的多糖類及寡糖類的影響。

以下的研究中，將會產(chǎn)生堵塞現(xiàn)象的凝聚物形成的再現(xiàn)條件設(shè)為100rpm、10℃、16小時的攪拌條件，在該條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.抑制凝聚物的形成的物質(zhì)的探索

由于振蕩、溫度而產(chǎn)生堵塞物質(zhì)(凝聚物)的機(jī)制尚不明確，暫且可認(rèn)為機(jī)制如下。由于振蕩等物理刺激，蛋白質(zhì)分子和蛋白質(zhì)分子發(fā)生碰撞。此時，分子中的疏水性部分彼此接觸、附著，從而形成凝聚物。因此，本發(fā)明人等認(rèn)為，通過添加可以降低疏水性相互作用的成分，有可能可以防止會產(chǎn)生堵塞的凝聚物的形成，并且，對各種成分的添加效果進(jìn)行了調(diào)查。

2－1.表面活性劑

將作為表面活性劑的吐溫80(HLB15.0)、TritonX－100(Tx100、HLB13.5)及RYOTO聚甘油酯(HLB12.0)作為添加劑，分別以0.1質(zhì)量％的濃度添加到Y(jié)NL(100ml燒杯中，50g)中，通過攪拌處理使其形成會產(chǎn)生堵塞現(xiàn)象的凝聚物。然后，與上述同樣地制備樣品，通過上述過濾器透過性試驗(yàn)測定過濾器透過性。將不添加添加劑而進(jìn)行了攪拌處理的情況作為對照，同樣測定過濾器透過性。將結(jié)果示于圖3。所添加的物質(zhì)中，TritonX－100及吐溫80作為凝聚抑制劑特別有效。

這里，就具體的堵塞的判定而言，由試驗(yàn)剛開始后(透過20g時)的Flux算出試驗(yàn)結(jié)束時(透過180g時)降低了百分之幾(透過180g時的相對透過速度(％))來進(jìn)行判斷。在判定添加劑的堵塞抑制效果時，上述計算結(jié)果大于對照(5.8％)時，可以說有效果。不進(jìn)行攪拌的樣品的計算值為約75％，因此將該數(shù)值設(shè)為最大值，將35％以上者評價為◎、將10～35＜者評價為○、0～10＜者評價為×、將不能透過200g者評價為××。將結(jié)果示于表1。

[表1]

【表1】

2－2.聚亞烷基二醇

將作為聚亞烷基二醇的聚乙二醇(PEG200(和光純藥工業(yè)株式會社制)、PEG400(關(guān)東化學(xué)株式會社制)、PEG4000(關(guān)東化學(xué)株式會社制)、PEG6000(關(guān)東化學(xué)株式會社制)、PEG200000(和光純藥工業(yè)株式會社制))作為添加劑，添加0.5質(zhì)量％，除此以外，與表面活性劑時同樣地測定了過濾器透過性。將結(jié)果示于圖4及表2。

[表2]

【表2】

2－3.金屬離子或其鹽

將作為金屬離子或其鹽的MgSO₄作為金屬成分，按照規(guī)定濃度進(jìn)行添加，除此以外，與表面活性劑時同樣地測定過濾器透過性。將結(jié)果和后述添加濃度的研究一起示于圖7及表6。

3‐1.添加濃度的研究(表面活性劑)

對于上述實(shí)驗(yàn)中特別有效的TritonX－100及吐溫80，改變添加濃度，進(jìn)行與上述相同的實(shí)驗(yàn)，來研究有效添加濃度。將結(jié)果示于圖5及表3。

[表3]

【表3】

該實(shí)驗(yàn)條件下，TritonX－100(框圖A)在0.01～0.5％的范圍可確認(rèn)到效果，吐溫80(框圖B)在0.05～0.5％的范圍可確認(rèn)到效果。

3－2.添加濃度的研究(聚亞烷基二醇)

使用作為聚亞烷基二醇的各種聚乙二醇，改變添加濃度而進(jìn)行與表面活性劑同樣的實(shí)驗(yàn)，研究有效添加濃度。將結(jié)果示于圖6及表4～表5。

[表4]

【表4】

[表5]

【表5】

3－3.添加濃度的研究(金屬鹽)

使用作為金屬鹽的MgSO₄，改變添加濃度(0.5mM、1mM、5mM)，進(jìn)行與表面活性劑同樣的實(shí)驗(yàn)，研究有效添加濃度。將結(jié)果示于圖7及表6。

[表6]

【表6】

需要說明的是，雖然圖中未示出，但在乳糖酶溶液中所含的多糖類及寡糖類的含量小于10g/kg的樣品、及超過10g/kg的樣品中分別含有TritionX－1000.01％、0.05％及0.5％及吐溫800.05％、0.1％及0.5％的情況下，對其進(jìn)行上述攪拌處理，其結(jié)果，顯示出與表1及表2所示傾向同樣的傾向。并且，在加入各種聚乙二醇、Mg鹽時，在過濾器透過性的提高方面也顯示出同樣的傾向。即表明，乳糖酶溶液中所含的多糖類及寡糖類對Flux及相對透過速度幾乎沒有影響。