專利名稱：純化的乳糖酶的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及純化的乳糖酶和它的生產(chǎn)。
背景技術：
乳糖酶或β半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)是一種酶，它能夠把乳糖(雙糖)轉(zhuǎn)變成單糖葡萄糖和半乳糖。乳糖存在于乳制品中，特別存在于奶、脫脂奶、奶油及其他奶制品中。乳糖的分解靠天然存在的乳糖酶發(fā)生在人體(和其它哺乳動物)的腸壁中。
很多人(和其它哺乳動物)在他們的消化系統(tǒng)中缺少或部分地缺少乳糖酶而患有乳糖不耐受。在乳糖是食物或飼料的一部分的情況下，對乳糖的減弱消化可以導致腸道疾病。
現(xiàn)在將乳糖酶加入奶品中以分解其中的乳糖。乳糖酶可以在巴氏消毒或滅菌之前，或之后加入奶品中。通常在巴氏消毒或滅菌處理過程中乳糖酶將會被滅活。當在滅菌前將乳糖酶加入時，大量的乳糖酶可能是必需的，以減少加入乳糖酶和巴氏消毒/滅菌之間的存儲時間。盡管乳糖酶是一種活性酶，應注意奶品一般在0℃-8℃的溫度下進行加工和貯存。
另一種可能是在奶品巴氏消毒或滅菌之后和包裝之前加入這種酶。在這種情況下，由于在奶品被消費前至少要經(jīng)過10至24小時，可以加入較少量的乳糖酶。這種酶能夠消化乳糖，該過程可以存在于工廠的運輸和存儲期間、商店和消費者的冰箱中。
有幾種方法可使乳糖酶滅菌，例如用化學和/或熱處理的方法。但是，由于乳糖酶在食品或飼料中應用，過濾除菌是優(yōu)選的選擇。
在期刊Voedingsmiddelentechnologie 13(1980)，23中，進一步闡明了一種方法，在英國專利說明書1477087中亦有敘述。乳糖酶，通常在乳制品加工工業(yè)中作為水溶液來應用，其中可以加入一種或多種穩(wěn)定劑，例如甘油，并且在使用前被過濾。過濾后的酶溶液通過無菌過濾器泵入，然后經(jīng)過計量設備注入預先滅菌的奶或巴氏消毒的奶的生產(chǎn)線中，之后與奶品混合，接著在無菌條件下被包裝在統(tǒng)一的包裝中。
然而，在實踐中，由于被降解的蛋白質(zhì)、多糖和寡糖遺留在該酶溶液中(盡管已經(jīng)過濾)，無菌過濾器經(jīng)常阻塞。根據(jù)EP145092，對于在使用前貯存時間較長的酶，上述降解一般增加，并且，在該酶的生產(chǎn)和其在乳制品加工工業(yè)中的使用之間相當長的時間周期內(nèi)上述降解可以被促進。無菌過濾器的重復清潔處理或更換不是選擇，因為停止整個過程以后再次開始之前需要滅菌。
EP145092敘述了一種自被生產(chǎn)出起14天內(nèi)乳糖酶過濾除菌的方法。EP145092敘述應當在通過發(fā)酵生產(chǎn)的乳糖酶的回收和提純之后，但在足以阻塞無菌過濾器的降解產(chǎn)物形成之前，進行其無菌過濾。但是，用過濾滅菌新鮮生產(chǎn)的乳糖酶溶液的方法，不能滿足對乳糖酶溶液能夠在線過濾并且能夠?qū)⑵浼尤氲綔缇?巴氏消毒奶中的需要。在EP145092中述及的乳糖酶來自在乳制品工業(yè)中得到廣泛應用的克魯維氏酵母菌屬(Kluyveromyces)酵母。多糖很可能是在回收工序期間形成的宿主細胞壁的部分。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種乳糖酶溶液，它含有小于10g/kg多糖和寡糖。
本發(fā)明還提供了一種乳糖酶溶液的生產(chǎn)方法，由此可以將存在于未經(jīng)處理的溶液中的多糖和寡糖從乳糖酶溶液中分離出來。
本發(fā)明還提供了一種含乳糖酶的奶的生產(chǎn)方法，由此可以將乳糖酶在加入奶品之前滅菌。
本發(fā)明還提供了一種滅菌乳糖酶溶液，并且還提供了包含滅菌乳糖酶溶液的乳制品。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及純化的乳糖酶，特別是涉及生產(chǎn)不含多糖和寡糖的乳糖酶的新方法。多糖和寡糖的去除使得乳糖酶溶液的過濾滅菌更容易，因為過濾器不會被多糖和寡糖堵塞。從而，能夠?qū)⒓兓娜樘敲冈谌橹破飞a(chǎn)過程中過濾殺菌，由此，不存在上述那種反復清除過濾器堵塞的需要。
本發(fā)明提供了一種乳糖酶溶液，它能夠被貯藏，并且貯藏之后依然不含會堵塞的化合物，如多糖和/或寡糖。優(yōu)選的是，該溶液從發(fā)酵工序中回收和提純之后，能夠貯藏至少15天，優(yōu)選的超過30天，更優(yōu)選的超過120天。
不含多糖和寡糖的意思是存在于乳糖酶溶液中的多糖和寡糖小于10g/kg。存在于乳糖酶溶液中的多糖和寡糖，優(yōu)選的小于5g/kg，更優(yōu)選的小于2g/kg，最優(yōu)選的小于1g/kg。
本發(fā)明的乳糖酶溶液非常適合過濾除菌，因為低濃度的如多糖和寡糖的化合物，使乳糖酶溶液能以較小的堵塞過濾器的可能，進行過濾除菌。過濾器能夠長時間的使用，與不是基本上不含多糖的乳糖酶溶液的使用情況相比，長至少4倍。
乳糖酶溶液最好是乳糖酶水溶液。乳糖酶溶液一般會含有10-100000NLU/g，優(yōu)選地為100-10000NLU/g。
乳糖酶溶液可以含有一種或多種溶劑或其它添加劑，以使該酶的活性達到期望的水平，并且可以進一步穩(wěn)定該酶。合適的溶劑例如是山梨糖醇和甘油。將這類溶劑加入乳糖酶溶液的濃度可以是10-70w/w％，或更優(yōu)選地是30-70％w/w。合適的添加劑(穩(wěn)定該酶之用)是例如水解乳糖、葡萄糖、甘露醇和鹽緩沖劑。根據(jù)本發(fā)明一個實施方案，大體上不含如多糖的會堵塞的化合物的乳糖酶溶液，能夠通過層析的方法提純未處理的乳糖酶溶液來獲得，由此可以將全部會造成過濾器堵塞的化合物從乳糖酶溶液中分離。
即使在層析工序之前未處理的乳糖酶溶液已儲存至少15天，甚至多于30天的情況下，經(jīng)過純化的乳糖酶溶液仍能夠很容易地得到過濾滅菌而不堵塞過濾器。
意想不到的是，層析的應用使去除全部可以堵塞無菌過濾器的化合物(多糖、寡糖、蛋白質(zhì)、肽類等等)成為可能。出乎意料的發(fā)現(xiàn)是，僅僅需要一個層析步驟來去除造成無菌過濾器堵塞的全部多糖和全部其他未知非蛋白化合物。有一點必須考慮到，從發(fā)酵培養(yǎng)液中回收和提純的乳糖酶溶液，其會至少含有多糖，而多糖至少部分轉(zhuǎn)化為降解產(chǎn)物。在未處理的乳糖酶溶液中一般多糖的濃度為10-100g/kg。
商業(yè)乳糖酶制劑可以含有40-60％w/w的甘油。所以乳糖酶制劑的粘度應該與存在的甘油的含量相關。但是我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，從乳糖酶制品中去除多糖能夠顯著地降低乳糖酶制品的粘度。這種粘度的降低，使得與根據(jù)現(xiàn)有的方法未純化處理的乳糖酶溶液相比較，乳糖酶制品能夠在過濾器處以較小的壓力差通過過濾器或以相似的壓力差使更多的乳糖酶溶液通過過濾器。本發(fā)明提供的乳糖酶溶液含有10-70w/w％的甘油，優(yōu)選為30-70w/w％，且更優(yōu)選為40-70w/w％，粘度小于100mPa，優(yōu)選的小于80mPa，更優(yōu)選的甚至小于60mPa。
從乳糖酶溶液中分離會堵塞的化合物，可以通過使乳糖酶與合適的層析樹脂結合而實現(xiàn)。能夠應用于從乳糖酶溶液中分離會堵塞的化合物的合適的樹脂是陰離子和陽離子交換樹脂。當pH值大于它的等電點的乳糖酶溶液應用于在相同pH值平衡的陰離子交換劑時，可以應用陰離子交換劑，如Q-瓊脂糖(Q-sepharose)。乳糖酶，而不是會堵塞的化合物，與樹脂結合。用提高離子強度和/或改變陰離子交換樹脂的pH值，能夠把結合的不含會堵塞的化合物的乳糖酶從樹脂中洗脫出來(解吸)。在解吸或洗脫時，離子強度和/或pH值的變化能夠逐步地或在連續(xù)的梯度下發(fā)生。
用陽離子交換劑，如SP-瓊脂糖(SP-sepharose)，能夠?qū)崿F(xiàn)同樣的分離，其中乳糖酶制品是在樹脂的等電點之下與之接觸。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，HAP(羥基磷灰石)層析不能使多糖和寡糖從乳糖酶中分離。一種可能的解釋是，多糖和寡糖也可以結合到羥基磷灰石基體上。
優(yōu)選的樹脂是疏水相互作用介質(zhì)(HIC)。在HIC介質(zhì)上，基于疏水性的差別能夠獲得分離?？梢岳貌煌腍IC樹脂，它們含有不同配體，例如乙基、丙基、丁基、苯基和辛基。在容許乳糖酶結合到樹脂上的條件下，使其與乳糖酶水溶液接觸，將會堵塞的化合物與乳糖酶分離是可能的。
一種典型的促進結合或吸附到HIC樹脂的方案是，讓在非變性pH值和相對較高的離子強度之下的乳糖酶水溶液與樹脂接觸。高離子強度可以通過向乳糖酶溶液中加鹽來獲得。合適的鹽是例如硫酸銨、氯化鈉和硫酸鈉。
在結合或吸附步驟之后，降低離子強度能夠洗脫或解吸乳糖酶。在洗脫或解吸時，離子強度和/或pH值的變化能夠逐步地或在連續(xù)的梯度下發(fā)生。其他合適的樹脂是例如凝膠過濾介質(zhì)和疏水電荷誘導介質(zhì)(HIC和離子交換層析的組合)。
本發(fā)明提供的乳糖酶是用酵母，優(yōu)選用克魯維氏酵母菌株，更優(yōu)選用乳克魯維氏酵母(K.lactis)或脆壁克魯維氏酵母(K.fragilis)而生產(chǎn)的。上述乳糖酶是根據(jù)本發(fā)明進行提純，所得到的乳糖酶溶液易于滅菌。引起無菌過濾器堵塞的化合物的全部去除是非常驚人的，因為在發(fā)酵工序之后，經(jīng)過回收和提純的乳糖酶會含有多糖，而多糖至少部分轉(zhuǎn)化為降解產(chǎn)物。因此，相信乳糖酶溶液中亦存在的蛋白酶和其它污染蛋白質(zhì)在層析工序去除。優(yōu)選用于乳糖酶溶液滅菌的無菌過濾器一般存在于奶品在線生產(chǎn)過程中。就奶品生產(chǎn)工藝而言，過濾滅菌處理最適于在線進行，其中，一個或多個薄膜濾器被采用。合適的無菌過濾器為例如孔徑0.22μm的薄膜濾器。
根據(jù)本發(fā)明所述的乳糖酶溶液有利于在巴氏消毒奶的制備中應用。
實施例1本實施例敘述乳糖酶的一般層析提純方法，其采用苯基瓊脂糖LS作為層析樹脂。
將含有5000NLU/g的商品Maxilact5000LX(從荷蘭DSM可買到)用軟化水稀釋5倍，加入硫酸銨到最終濃度為1M后，pH值調(diào)到7.5。
將樣品20ml在線性流速150cm/h下加至20ml HiPrep苯基16/10反應柱，該柱直徑16mm長10cm。用100mM Tris(pH7.5)的1M硫酸銨平衡該柱。加樣之后，用平衡緩沖劑以150cm/h流速洗滌柱，直至達到基線為止。乳糖酶的洗脫在150cm/h(100mM Tris pH7.5)的分級梯度下完成。乳糖酶洗脫之后，將乳糖酶溶液脫鹽并且濃縮至大約10.000NLU/g的最終活性。濃縮之后，用甘油以50％w/w的最終濃度配制乳糖酶溶液，配制后的乳糖酶最終活性大約為5.000NLU/g。
乳糖酶活性是通過測定底物鄰硝基苯-β-半乳吡喃糖苷(ONPG)水解為鄰硝基苯基和半乳糖來測定的。此反應由加入碳酸鈉終止。所生成的鄰硝基苯基的吸光度，在堿性介質(zhì)中呈黃色，被用于測試酶的活性(表示為NLU/g)。該測試方法發(fā)表于FCC，fourth edition，July1，1996，page 801 to 802/乳糖酶(中性)(β半乳糖苷酶)的活性(Lactase(neutral)(β-galactosidase)activity)。
表1列出了測試結果表1
多糖和寡糖的含量，用測定游離糖的量和測定多糖轉(zhuǎn)化后存在的糖量的方法來測定。
多糖含量是用高效液相色譜(HPLC)測定的。檢測用RI(折光指數(shù))檢測器來進行。所用色譜柱是BioRad Aminex HPX 87N，長度30cm，內(nèi)徑7.8mm，在85℃下恒溫。流動相是一種把0.71g硫酸鈉加入到1升水中的溶液，以每分鐘0.68ml的流速流動。
進行了兩種不同樣品的預處理，二者均用酸轉(zhuǎn)化和不用酸轉(zhuǎn)化。未經(jīng)酸轉(zhuǎn)化的樣品預處理進行如下取5g放入50ml容量瓶中，在流動相中溶解，注射5μl到色譜柱。
經(jīng)酸轉(zhuǎn)化的樣品預處理進行如下取2g樣品放入離心管，加入水3.00ml和2.58mol/l的鹽酸2.50ml，100℃下加熱75分鐘，加入2.58mol/l的氫氧化鈉2.50ml。把所得溶液5μl注射到色譜柱。
葡萄糖的含量，是以50ml流動相中含400mg葡萄糖的標準溶液來計算。三糖、雙糖和果糖的濃度用以葡萄糖為標準的反應系數(shù)來計算。
實施例2本實施例敘述乳糖酶溶液的過濾滅菌。
把一個注射器用1ml Maxilact LX 5000裝滿，并在注射器頂部安置一個無菌過濾器，其為Millipore的Millex GV 0.22μm，表面積4.91cm2。施加手壓之后，該產(chǎn)品不能通過該過濾器過濾，增加壓力導致過濾器損壞。
把另一個注射器用1ml含有50％w/w甘油(最終濃度)的按照實施例1所述而制備的純化乳糖酶裝滿，并在注射器頂部安置一個無菌過濾器，其為Millipore的Millex GV 0.22μm，表面積4.91cm2。施加手壓之后，令人吃驚的是至少1ml乳糖酶溶液容易地通過了該過濾器而進行了過濾滅菌。
因此，層析的應用使全部可堵塞無菌過濾器的化合物被去除掉，從而，過濾滅菌不再成為問題。
實施例3本實施例敘述配制的乳糖酶溶液的粘度測定。
可購買到的商品Maxilact LX 5000和用50％w/w甘油(最終濃度)按照實施例1所述而配制的純化乳糖酶的粘度被測定?？少徺I到的商品Maxilact也含有50％w/w甘油。
用Physica UDS 200在25℃用MK 21圓錐探頭測定粘度。
表2顯示，用50％w/w甘油(最終濃度)配制的5.000NLU/g純化乳糖酶，由于全部會堵塞的化合物的去除，其粘度降低。
表2粘度測定結果
權利要求
1.一種乳糖酶溶液，它含有小于10g/kg多糖和寡糖。
2.根據(jù)權利要求1所述的乳糖酶溶液，其在貯藏至少15天后，優(yōu)選為30天后，含有小于10g/kg多糖和寡糖。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的乳糖酶溶液，其是一種水溶液。
4.根據(jù)權利要求1-3任意一項所述的乳糖酶溶液，進一步含有穩(wěn)定溶劑。
5.根據(jù)權利要求4所述的乳糖酶溶液，其中穩(wěn)定溶劑是山梨糖醇或甘油。
6.根據(jù)前面的權利要求中任意一項所述的乳糖酶溶液，進一步含有至少一種穩(wěn)定添加劑。
7.根據(jù)權利要求6所述的乳糖酶溶液，其中的添加劑選自水解乳糖、葡萄糖、甘露醇和鹽緩沖劑。
8.根據(jù)前面的權利要求中任意一項所述的乳糖酶溶液，其中乳糖含量為10-100,000NLU/g。
9.乳糖酶溶液，含有10-70w/w％甘油并且粘度小于100mPa，優(yōu)選的小于80mPa。
10.根據(jù)權利要求1-9任意一項所述的乳糖酶溶液，其中乳糖酶是由克魯維氏酵母菌株生產(chǎn)的。
11.根據(jù)權利要求1-10任意一項所述的乳糖酶溶液的生產(chǎn)方法，其中把在未經(jīng)處理的乳糖酶溶液中存在的多糖和寡糖從乳糖酶溶液中分離出來。
12.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中采用層析方法從未經(jīng)處理的乳糖酶溶液中除去多糖和寡糖。
13.一種滅菌乳糖酶溶液，其中權利要求1-10任意一項所述的乳糖酶溶液在無菌過濾器中滅菌。
14.一種乳制品，其中包含根據(jù)權利要求13所述的滅菌乳糖酶溶液。
15.一種含乳糖酶的奶的生產(chǎn)方法，由此根據(jù)權利要求1-10任意一項所述的乳糖酶溶液在加入奶品之前滅菌。
16.根據(jù)權利要求15所述的方法，其中滅菌在至少一個過濾器上進行，該過濾器安置在奶品生產(chǎn)工藝線中。
17.根據(jù)權利要求15或16所述的方法，由此奶品是巴氏消毒奶或滅菌奶。
18.一種無菌乳糖酶的生產(chǎn)方法，由此根據(jù)權利要求1-10任意一項所述的乳糖酶溶液優(yōu)選用無菌過濾器滅菌。
19.層析方法的應用，以把多糖和寡糖從乳糖酶溶液中分離出來。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種乳糖酶溶液，它含有少于10g/kg多糖和寡糖，還涉及一種從未經(jīng)處理的乳糖酶溶液生產(chǎn)上述乳糖酶溶液的方法和無菌乳糖酶溶液，此外還涉及一種含有無菌乳糖酶的奶品生產(chǎn)方法，由此，上述乳糖在奶品生產(chǎn)過程中過濾滅菌。
文檔編號A23C9/12GK1500143SQ02807286
公開日2004年5月26日 申請日期2002年4月3日 優(yōu)先權日2001年4月4日
發(fā)明者R·F·W·C·范比克霍文, R F W C 范比克霍文, P·A·范帕里頓, 范帕里頓 申請人:Dsmip資產(chǎn)有限公司