專利名稱:用輻射和生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑治療人腫瘤的制作方法
正常的細(xì)胞是通過生長(zhǎng)因子受體經(jīng)由它們各自的配體的高度受控的激活進(jìn)行增殖的。這類受體的一個(gè)例子就是生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶。
癌癥細(xì)胞也是通過生長(zhǎng)因子受體的激活來增殖的,但是它卻喪失了正常增殖的小心的控制??刂频膯适Э赡苁怯蔀閿?shù)眾多的因素,例如生長(zhǎng)因子的自分泌、受體表達(dá)的增加、以及由生長(zhǎng)因子調(diào)控的生物化學(xué)途徑的自發(fā)激活所引起的。
涉及腫瘤發(fā)生的受體的一些例子有表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、血小板衍生生長(zhǎng)因子受體(PDGFR)、胰島素樣生長(zhǎng)因子受體(IGFR)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體(NGFR)、以及纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(FGFR)。
表皮生長(zhǎng)因子(EGF)受體家族的成員是與表皮細(xì)胞的腫瘤發(fā)生相關(guān)聯(lián)的特別重要的生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶。發(fā)現(xiàn)的EGF受體家族的第一個(gè)成員是一個(gè)表觀分子量為大約165kD的糖蛋白。這一糖蛋白被描述于Mendelsohn等的美國專利號(hào)4,943,533中,它被稱為EGF受體(EGFR)也稱為人EGF受體-1(HER1)。
EGFR在許多種類型的表皮狀腫瘤細(xì)胞中過量表達(dá)。EGF和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-α)是兩種已知的EGFR配體。表達(dá)EGF受體的腫瘤的例子包括成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤,以及肺癌、乳癌、頭癌、頸癌、以及膀胱癌。EGF受體在腫瘤細(xì)胞膜上的擴(kuò)增以及/或者過量表達(dá)是與不良預(yù)后相關(guān)聯(lián)的。
在癌癥的治療上已經(jīng)有了一些進(jìn)步。有用的治療包括那些依賴于DNA發(fā)生損傷的細(xì)胞的編程性死亡的治療。細(xì)胞的編程性死亡就是通常所說的細(xì)胞調(diào)亡。
癌癥的治療傳統(tǒng)地包括化學(xué)治療或者放射治療。化學(xué)治療劑的一些例子包括阿霉素、順鉑、以及紫杉醇。放射可以來源于一個(gè)外部的射線束,也可以來源于一個(gè)放置于患者中的源,即近距離放射療法。
另外一種類型的治療包括與細(xì)胞增殖有關(guān)的生長(zhǎng)因子或者生長(zhǎng)因子受體的抑制劑。此類抑制劑中和了生長(zhǎng)因子或者受體的活性并抑制了表達(dá)受體的腫瘤的生長(zhǎng)。
例如,美國專利號(hào)4,943,533描述了一種被稱為225的與EGF受體結(jié)合的鼠單克隆抗體。該專利被授予加州大學(xué)并由ImCloneSystems Incorporated擁有獨(dú)家許可。225抗體能夠抑制培養(yǎng)的EGFR表達(dá)腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng),以及當(dāng)這些腫瘤在裸鼠中以異種移植的形式生長(zhǎng)時(shí),它也可以抑制這些腫瘤在體內(nèi)的生長(zhǎng)。見Masui等,癌癥研究(Cancer Res.)44,5592-5598(1986)。
類似地,Prewett等報(bào)道了用上述的抗-EGFR 225單克隆抗體的一種嵌合形式對(duì)小鼠中非常確定的前列腺腫瘤異種移植體進(jìn)行抑制。上述的嵌合形式被稱為c225。見免疫治療雜志(Journal ofImmunotherapy)19,419-427(1997)。
在人的治療中使用鼠單克隆抗體的一個(gè)缺點(diǎn)是因?yàn)榇嬖谑蟮腎g序列而可能發(fā)生人抗-鼠抗體(HAMA)應(yīng)答。這一缺點(diǎn)可以通過將鼠(或者其它的非人類哺乳動(dòng)物)的抗體的整個(gè)恒定區(qū)替換為人的恒定區(qū)。將鼠抗體的恒定區(qū)替換為人的序列通常被稱為嵌合作用(chimerization)。
也可將鼠抗體的框架可變區(qū)替換為相應(yīng)的人的序列來使嵌合步驟變得更加有效??蚣芸勺儏^(qū)是抗體中除了超變區(qū)之外的可變區(qū)。超變區(qū)也稱為互補(bǔ)性決定區(qū)(complementarity-determining regions,CDR)。
將恒定區(qū)和框架可變區(qū)替換為人的序列通常被稱為人源化(humanization)。當(dāng)有越多的鼠序列被替換為人的序列時(shí),人源化的抗體的免疫原性就會(huì)越低(即所引起的HAMA應(yīng)答會(huì)越少)。不幸的是,當(dāng)將鼠抗體的更多的區(qū)域替換為人的序列時(shí),費(fèi)用和努力也會(huì)增加。
減少抗體免疫原性的另一種方法是使用抗體片段。例如,Aboud-Pirak等的一篇文章,Journal of the National CancerInstitute 80,1605-1611(1988),將一種被稱為108.4的抗-EGF受體抗體的抗腫瘤作用與該抗體片段的抗腫瘤作用進(jìn)行了比較。腫瘤模型是以異種移植于裸鼠中的KB細(xì)胞為根據(jù)的。KB細(xì)胞來源于人口腔鱗狀細(xì)胞癌,并表達(dá)提高水平的EGF受體。
Aboud-Pirak等發(fā)現(xiàn)抗體和二價(jià)F(ab’)2片段兩者都妨礙腫瘤在體內(nèi)的生長(zhǎng),雖然F(ab’)2片段效率較差??贵w的單價(jià)Fab片段雖然仍保存著對(duì)細(xì)胞關(guān)聯(lián)受體的結(jié)合能力,但是它卻不妨礙腫瘤的生長(zhǎng)。
已經(jīng)嘗試著通過結(jié)合上述的一些技術(shù)來改善癌癥的治療。例如,Baselga等在Journal of the National Cancer Institute 85,1327-1333(1993)中報(bào)道了化學(xué)治療劑阿霉素和抗EGFR單克隆抗體的抗癌作用。
其它人已經(jīng)嘗試著通過將放射線與佐劑相結(jié)合來增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性。例如Bonnen的美國專利號(hào)4,846,782報(bào)道了當(dāng)將放射線與干擾素相結(jié)合時(shí),人癌對(duì)輻射的敏感性增強(qiáng)。Snelling等報(bào)道了在一個(gè)Ⅱ期臨床試驗(yàn)中,當(dāng)將放射線與一種用碘-125標(biāo)記的抗-EGFR單克隆抗體相結(jié)合時(shí),對(duì)帶有整形位點(diǎn)(anaplastic foci)的星細(xì)胞癌患者的放射治療有較小的改善。見雜交瘤(Hybridoma)14,111-114(1995)。
類似地,Balaban等報(bào)道了當(dāng)在放射治療之前施用一種被稱為L(zhǎng)A22的抗EGFR抗體時(shí),抗-EGFR單克隆抗體可以使小鼠中的人鱗狀癌異種移植體對(duì)放射線敏感。見Biochimica et Biophysica Acta 1314,147-156(1996)。Saleh等也報(bào)道了當(dāng)將放射治療與抗-EGFR單克隆抗體相結(jié)合時(shí),在體外以及在小鼠中都可以更好地對(duì)腫瘤進(jìn)行控制。Saleh等作結(jié)論說“進(jìn)一步的研究…可能會(huì)導(dǎo)致一種新穎的結(jié)合形式的放射治療/單克隆抗體(RT/Mab)治療”。見American Association for CancerResearch 37,612(1996)論文集的摘要4197。
雖然上述的一些研究提議在人中進(jìn)一步開展實(shí)驗(yàn),但是所報(bào)道的結(jié)果都是針對(duì)鼠模型的。通過這些模型并不能期望在人中必然能夠獲得成功。正如在1998年5月3日的紐約時(shí)報(bào)(New York Times)中就Judah Folkman所報(bào)道的在用血管發(fā)生抑制因子(制管張素)和內(nèi)抑制素對(duì)小鼠腫瘤進(jìn)行治療中所獲得的壯觀的成功所作的說明“他說,在患者開始使用它們之前作任何預(yù)言是危險(xiǎn)的。Folkman博士說,所有他所知道的是‘如果你患有癌癥而且你是一只小鼠,那么我們就可以很好地照顧你?!币?998年5月3日紐約時(shí)報(bào)(New York Times)第一頁。
癌癥仍然是一個(gè)主要的健康問題。本發(fā)明的目標(biāo)就是提供一種用于治療人某些特定的癌的改進(jìn)的方法。
發(fā)明的概要上述的這一目標(biāo),以及對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所顯而易見的其它的目標(biāo),已經(jīng)通過提供一種對(duì)人患者中腫瘤的生長(zhǎng)進(jìn)行抑制的新方法來實(shí)現(xiàn)。這一方法包括用有效量的放射線和非放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)受體酪氨酸激酶抑制劑的結(jié)合對(duì)病人進(jìn)行治療,其中上述的蛋白質(zhì)受體酪氨酸激酶抑制劑的過量表達(dá)可以導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。
發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明提供了一種用于對(duì)患有癌癥或者有發(fā)展癌癥風(fēng)險(xiǎn)的病人中的腫瘤,特別是惡性腫瘤,進(jìn)行治療的改進(jìn)的方法??梢愿鶕?jù)本發(fā)明進(jìn)行治療的腫瘤類型是那些過量表達(dá)一種或多種生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶的腫瘤。一旦過量表達(dá)就會(huì)導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶的一些例子包括受體的EGFR家族、受體的PDGFR家族、受體的IGFR家族、受體的NGFR家族、受體的TGF家族、以及受體的FGFR家族。
受體的EGFR家族包括EGFR,它在文獻(xiàn)中也被稱為HER1;HER2,它在文獻(xiàn)中也被稱為Neu、c-erbB-2、以及p185erbB-2;erbB-3以及erbB4。在本說明書中,EGFR指的是受體的EGFR家族。受體的EGFR家族中也被稱為EGFR的特定的成員將被稱為EGFR/HER1。
受體的PDGFR家族包括PDGFRα和PDGFRβ。受體的IGF家族包括IGFR-1。受體的FGFR家族FGFR-1、FGFR-2、FGFR-3和FGFR-4。受體的TGFR家族包括TGFRα和TGFRβ。
任何一種過量表達(dá)至少一種生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶而且這一過量表達(dá)可以導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的腫瘤類型可以根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行治療。這些腫瘤類型包括癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肉瘤、腺癌、腺肉癌、以及腺瘤。
這些腫瘤發(fā)生于人體實(shí)際上所有的部分,包括每一個(gè)器官。腫瘤可以存在于,例如,乳房、肺、結(jié)腸、腎、膀胱、頭和頸、卵巢、前列腺、腦、胰臟、皮膚、骨頭、骨髓、血液、胸腺、子宮、睪丸,宮頸、以及肝臟。例如,過量表達(dá)EGF受體的腫瘤包括胸、肺、結(jié)腸、腎、膀胱、頭和頸的腫瘤,特別是頭和頸、卵巢、前列腺、以及腦的鱗狀細(xì)胞癌。
用放射治療和經(jīng)非放射性標(biāo)記的生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑的結(jié)合對(duì)這些腫瘤進(jìn)行治療。為了本說明書的目的,生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶的抑制指的是過量表達(dá)這些受體的細(xì)胞的生長(zhǎng)被抑制。
沒有人暗示任何具體的抑制機(jī)制。然而,生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶通常是通過磷酸化作用事件來激活的。相應(yīng)地,磷酸化化驗(yàn)對(duì)于預(yù)測(cè)在本發(fā)明中有用的抑制劑是有用的。一些用于檢測(cè)酪氨酸激酶活性的有用的化驗(yàn)被描述于Panek等,Journal of Pharmacology andExperimental Therapeutics 283,1433-1444(1997)以及Batley等,生命科學(xué)(Life Sciences)62,143-150(1998)中。這些化驗(yàn)的介紹作為參照被結(jié)合于本文中。
在優(yōu)選的實(shí)施例中,當(dāng)如本文中所述用一種生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶的抑制劑和放射線的結(jié)合對(duì)病人的腫瘤進(jìn)行治療時(shí),存在協(xié)同作用(synergy)。換句話說,抑制劑和放射線的結(jié)合治療對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用比單獨(dú)用抑制劑或者放射線進(jìn)行治療所能期望的效果都要好。協(xié)同作用可以通過例如組合治療,相對(duì)于單獨(dú)的抑制劑或者放射線治療,對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的更大的抑制作用顯現(xiàn)出來。優(yōu)選地,協(xié)同作用通過抑制劑和放射線的結(jié)合治療對(duì)癌癥的緩解顯現(xiàn)出來,而在單獨(dú)使用抑制劑或者放射線進(jìn)行治療時(shí),癌癥無法被緩解。
放射線的來源可以位于待治療的患者的外部或者內(nèi)部。當(dāng)來源位于患者的外部時(shí),治療就被稱為外部射線束放射治療(external beamradiation therapy,EBRT)。當(dāng)來源位于患者的內(nèi)部時(shí),治療就被稱為近距離放射治療(brachytherapy,BT)。
放射線是根據(jù)眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù),使用為此目的制造的標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)備,如AECL Theratron和Varian Clinac進(jìn)行施用的。放射線的劑量取決于數(shù)目眾多的因素,這些都是在本工藝中眾所周知的。這類因素包括待治療的器官、位于放射通道中的可能被不注意地不良地影響的健康器官、患者對(duì)放射治療的耐受性、以及需要治療的身體區(qū)域。劑量典型地為介于1至100Gy之間,更為具體地介于2至80Gy之間。一些已經(jīng)被報(bào)道的劑量包括給骨髓施用35Gy、給腎臟施用20Gy、給前列腺施用65-80Gy。然而,應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是,本發(fā)明并不局限于任何具體的劑量。劑量將由治療的醫(yī)師根據(jù)在一個(gè)給定的情形中的具體的因素,包括上述的因素來確定。
外部放射源和進(jìn)入患者的點(diǎn)之間的距離可以是任何在殺死目標(biāo)細(xì)胞和將副作用減到最小之間獲得可接受平衡的距離。典型地,外部放射源和進(jìn)入患者的點(diǎn)之間的距離介于70至100厘米之間。
近距離放射療法通常是通過在患者中放置一個(gè)放射源來進(jìn)行的。典型地,放射源放置于距離待治療組織大約0-3厘米的地方。已知的方法包括間質(zhì)近距離放射療法、腔內(nèi)近距離放射療法、表面間質(zhì)近距離放射療法。放射源可以是被永久性或者臨時(shí)性植入的。已經(jīng)被用于永久性種植體中的一些典型的放射性原子包括碘-125和氡。已經(jīng)被用于臨時(shí)性種植體中的一些典型的放射性原子包括銫-137和銥-192。已經(jīng)被用于近距離放射療法中的另外的一些放射性原子包括镅-241和金-198。
近距離放射療法的放射劑量可以與上述的在外部射線束放射治療中所用的劑量相同。除了上述的在確定外部射線束放射治療劑量時(shí)所要考慮的因素之外,在確定近距離放射療法劑量時(shí)還考慮了所用的放射活性原子的特性。
生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑是在放射治療之前、期間、以及之后施用的,也可以結(jié)合施用,即在放射治療之前和期間、之前和之后、期間和之后、或者在之前、期間及之后施用的??贵w典型地是在開始放射治療以及/或者終止外部射線束放射治療之前1至30天、優(yōu)選地在3至20天、更優(yōu)選地在5至12天施用。
任何一種生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶(它的過量表達(dá)具有致癌性)的非放射標(biāo)記抑制劑在本發(fā)明的方法中是有用的。過量表達(dá)這類受體的腫瘤的類型在上面已經(jīng)進(jìn)行了討論。抑制劑可以是生物分子或者是小分子。
生物抑制劑包括抑制過量表達(dá)一種生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶的細(xì)胞的生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)或者核酸分子。更典型地,生物分子是抗體、或者抗體的功能同等物。
抗體的功能同等物具有與抗體可比較的結(jié)合特征并抑制過量表達(dá)生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶受體的細(xì)胞的生長(zhǎng)。此類功能同等物包括,例如,嵌合的、人源化的、以及單鏈的抗體及其片段。
抗體的功能同等物包括其氨基酸序列與本發(fā)明抗體的可變區(qū)或者超變區(qū)的氨基酸序列基本相同的多肽?!盎鞠嗤钡陌被嵝蛄性诖吮欢x為一個(gè)序列與另一個(gè)序列的同源性至少為70%、優(yōu)選的為至少大約80%、更為優(yōu)選的為至少大約90%,如采用根據(jù)Pearson和Lipman,美國科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85,2444-2448(1988)的FASTA檢索方法所確定的。編碼抗體功能同等物的DNA分子典型地在嚴(yán)謹(jǐn)條件下結(jié)合到抗體的DNA上。
一個(gè)抗體的功能同等物優(yōu)選的是一個(gè)嵌合的或者人源化的抗體。一個(gè)嵌合的抗體包含非人抗體的可變區(qū)以及人抗體的恒定區(qū)。一個(gè)人源化的抗體包含非人類抗體的超變區(qū)(CDR)。人源化抗體中除了超變區(qū)以外的可變區(qū),例如框架可變區(qū),以及人源化抗體的恒定區(qū)屬于人抗體。
為了這一應(yīng)用的目的,合適的非人抗體的可變區(qū)和超變區(qū)可以來源于任何單克隆抗體在其中被制造的非人類哺乳動(dòng)物產(chǎn)生的抗體。除了人類以外的哺乳動(dòng)物的合適的例子包括,例如,兔子、大鼠、小鼠、馬、山羊、或者靈長(zhǎng)類。小鼠是優(yōu)選的。
功能同等物進(jìn)一步包括那些結(jié)合特征與整個(gè)抗體相同或者可與其相比較的抗體片段。合適的抗體片段包括任何一種含有一個(gè)超變區(qū)(即互補(bǔ)性決定區(qū)域)的足夠部分的片段,其中上述的區(qū)域特異地以足夠的親和力與生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶結(jié)合以抑制過量表達(dá)此類受體的細(xì)胞的生長(zhǎng)。
此類片段可以包括,例如,F(xiàn)ab或者F(ab’)2片段的一個(gè)或者兩個(gè)。優(yōu)選地,抗體片段包括整個(gè)抗體所有的六個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū),雖然不含有全部此類區(qū)域,例如含有三個(gè)、四個(gè)、或者五個(gè)CDR的功能片段也被包括于其中。
優(yōu)選的片段是單鏈抗體,或者是Fv片段。單鏈抗體為至少包含抗體重鏈中與輕鏈的可變區(qū)相連接的可變區(qū),可以含有或者不含有一個(gè)相互連接的連接序列的多肽。因此,F(xiàn)v片段包含整個(gè)抗體結(jié)合部位。這些鏈可以用細(xì)菌或者真核細(xì)胞來生產(chǎn)。
抗體和功能同等物可以是任何免疫球蛋白種類,例如IgG、IgM、IgA、IgD、或者IgE及其亞類的成員。優(yōu)選的抗體為IgG1亞類的成員。功能同等物也可以是任何上述種類和亞類的結(jié)合的同等物。
抗體可以用本領(lǐng)域眾所周知的方法從所需的受體制得。受體可以是市場(chǎng)上可以買到的,或者可以用眾所周知的方法來分離。例如,用于分離和純化EGFR的方法見于Spada的美國專利5,6 46,153,從欄41第55行開始。用于分離和純化FGFR的方法見于Williams等的美國專利5,707,632中實(shí)施例3和4中的。在Spada和Williams等的專利中所描述的用于分離和純化EGFR和FGFR的方法作為參照結(jié)合于本發(fā)明中。
用于制造單克隆抗體的方法包括由Kohler和Milstein在自然(Nature)256,495-497(1975)中以及由Campbell在“單克隆抗體技術(shù),嚙齒目動(dòng)物及人類雜交瘤的制備和性質(zhì)鑒定(MonoclonalAntibody Technology,The Production and Characterization ofRodent and Human Hybridomas)”,Burdon等編輯,《生化和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)(Laboratoty Techniques in Biochemistry andMolecular Biology)》,第13卷,Elsevier Science Publishers,Amsterdam(1985)中所描述的免疫學(xué)方法。由Huse等在科學(xué)(Science),246,1275-1281(1989)中所描述的重組DNA方法也是合適的。
簡(jiǎn)要地說,為了生產(chǎn)單克隆抗體,如上所述給一只宿主哺乳動(dòng)物接種一種受體或者一種受體的一個(gè)片段,然后,可選地,對(duì)其進(jìn)行免疫增強(qiáng)(boosted)。為了能夠發(fā)揮用途,受體片段必須含有足夠的氨基酸殘基以定義正在被檢測(cè)的分子的抗原決定簇。如果片段太短以致不具有免疫原性,可以將其共綴到一個(gè)載體分子上。一些合適的載體分子包括鑰孔血蘭素和牛血清白蛋白。共綴可以用本領(lǐng)域公知的方法來進(jìn)行。一種這樣的方法是將片段上的半胱氨酸殘基與載體分子上的半胱氨酸殘基相結(jié)合。
在最后一次免疫增強(qiáng)(boost)之后幾天之后從經(jīng)過接種的哺乳動(dòng)物收集脾臟。將來源于脾臟的細(xì)胞懸浮液與腫瘤細(xì)胞相融合。將由此獲得的表達(dá)抗體的雜交瘤細(xì)胞分離、生長(zhǎng)并保持于培養(yǎng)基中。
合適的單克隆抗體以及用于制備它們的生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶也是可以從商業(yè)來源買到的,例如可以購自Upstate Biotechnology,Santa Cruz Biotechnology of Santa Cruz,California、Transduction Laboratories of Lexington,Kentucky、R&D SystemsInc of Minneapolis,Minnesota、以及Dako Corporation ofCarpinteria,California。
用于制備嵌合以及人源化抗體的方法也是本領(lǐng)域中公知的。例如,用于制備嵌合抗體的方法包括那些描述于Boss(Celltech)的以及Cabilly(Genentech)的美國專利中的方法。請(qǐng)分別參照美國專利4,816,397和4,816,567。用于制備人源化抗體的方法被描述于,例如Winter的美國專利5,225,539中。
用于對(duì)抗體進(jìn)行人源化的優(yōu)選的方法被稱為CDR-嫁接(grafting)。在CDR-嫁接中,小鼠抗體中與抗原結(jié)合直接有關(guān)的區(qū)域,即互補(bǔ)性決定區(qū)或者稱CDR,被嫁接到人可變區(qū)以制備“經(jīng)過改造的人”可變區(qū)。然后,將這些充分人類化的可變區(qū)連接到人類的恒定區(qū)以制備完整的“完全人源化”抗體。
為了制備能夠與抗原良好結(jié)合的完全人源化的抗體,仔細(xì)地設(shè)計(jì)經(jīng)過改造的人可變區(qū)是有利的。CDR將被嫁接到其中的人可變區(qū)應(yīng)該被仔細(xì)地挑選,而且通常也需要對(duì)位于人可變區(qū)的框架區(qū)(FR)中的決定性位置上的一些氨基酸進(jìn)行變換。
例如,經(jīng)過改造的人可變區(qū)可以包括在所選的人輕鏈可變區(qū)的FR中的多達(dá)10個(gè)氨基酸變換,以及在所選的人重鏈可變區(qū)的FR中的多達(dá)12個(gè)氨基酸變換。編碼這些經(jīng)過改造的人重鏈以及輕鏈可變區(qū)基因的DNA序列被連接到編碼人類重鏈和輕鏈恒定區(qū)基因的DNA序列上,優(yōu)選地分別連接到γ1和κ上。然后將經(jīng)過改造的人源化抗體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)并將其對(duì)目標(biāo)的親和力與對(duì)應(yīng)的鼠抗體和嵌合抗體進(jìn)行比較。
用于挑選人源化抗體中將被替換的殘基的方法以及進(jìn)行替換的方法都是本領(lǐng)域中眾所周知的。見,例如,Co等,自然(Nature)351,501-502(1992);Queen等,美國科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)86,10029-1003(1989)以及Rodrigues等,Int.J.Cancer,增刊7,45-50(1992)。一種用于對(duì)225抗-EGFR單克隆抗體進(jìn)行人源化和改造的方法被描述于Goldstein等的PCT申請(qǐng)WO 96/40210中。這一方法可以被適用于對(duì)針對(duì)其它生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶的抗體進(jìn)行人源化和改造。
用于制備單鏈抗體的方法在本領(lǐng)域也是公知的。一些合適的例子包括那些在Weis等的歐洲專利申請(qǐng)502 812以及在Int.J.Cancer60,137-144(1995)中所描述。
用于制備上述的功能同等物的其它的方法被描述于PCT申請(qǐng)WO93/21319、歐洲專利申請(qǐng)239 400、PCT申請(qǐng)WO89/09622、歐洲專利申請(qǐng)338 745、美國專利5,658,570、美國專利5,693,780、以及歐洲專利申請(qǐng)EP332 424中。
優(yōu)選的抗體是那些抑制EGF受體的抗體。優(yōu)選的EGFR抗體是那些來源于被稱為225的鼠抗體的嵌合的、人源化的、以及單鏈的抗體。上述的225被描述于美國專利4,943,533中,該專利被授予給加州大學(xué)并由ImClone Systems Incorporated擁有獨(dú)家許可。
225抗體可以在體外抑制被培養(yǎng)的EGFR/HER1表達(dá)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),當(dāng)這些細(xì)胞被作為異種移植物在裸鼠中表達(dá)時(shí),225可以在體內(nèi)抑制其生長(zhǎng)。見Masui等,癌癥研究(Cancer Res.)44,5592-5598(1986)。最近,一個(gè)結(jié)合225和亞霉素或者順鉑的治療法在針對(duì)小鼠中很好地被確定的人類異種移植物的模型中表現(xiàn)出治療協(xié)同性。Basalga等,J.Natl.Cancer Inst.85,1327-1333(19?3)。
來源于鼠抗體225的嵌合的、人源化的、以及單鏈的抗體可以從225抗體制備,該抗體可以得自ATCC??蛇x地,可以從由Wels等在Int.J.Cancer 60,137-144(1995)中所提供的序列來合成制備嵌合的、人源化的、以及單鏈的225抗體所需的各種不同的片段。嵌合的225抗體(c225)可以根據(jù)上述的方法來制備。人源化的225抗體可以根據(jù)PCT申請(qǐng)WO96/40210的實(shí)施例Ⅳ中所描述的方法進(jìn)行制備。上述的專利申請(qǐng)作為參照被結(jié)合于本發(fā)明中。單鏈的225抗體(Fv225)可以根據(jù)由Wels等在Int.J.Cancer 60,137-144(1995)以及歐洲專利申請(qǐng)502 812中所描述的方法進(jìn)行制備。
輕鏈和重鏈的超變區(qū)(CDR)的序列如下制備。氨基酸序列被標(biāo)示于核苷序列之下。重鏈超變區(qū)(VH)CDR1AACTATGGTGTACAC(SEQ ID 1)N Y G V H (SEQ ID 2)CDR2GTGATATGGAGTGGTGGAAACACAGACTATAATACACCTTTCACATCC(SEQ ID 3)V I W S G G N T D Y N T P F T S(SEQ ID 4)CDR3GCCCTCACCTACTATGATTACGAGTTTGCTTAC (SEQ ID 5)A L T Y Y D Y E F A Y(SEQ ID 6)輕鏈超變區(qū)(VL):CDR1AGGGCCAGTCAGAGTATTGGCACAAACATACAC (SEQ ID 7)R A S Q S I G T N I H (SEQ ID 8)CDR2GCTTCTGAGTCTATCTCT(SEQ ID 9)A S E S I S (SEQ ID 10)CDR3CAACAAAATAATAACTGGCCAACCACG(SEQ ID 11)Q Q N N N W P T T (SEQ ID 12)除了上述的生物分子以外,在本發(fā)明中有用的抑制劑也可以是小分子。為了本說明書的目的,小分子包括除了生物分子以外的任何一種抑制過量表達(dá)至少一種生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶的細(xì)胞的有機(jī)的或者無機(jī)的分子。小分子的分子量典型地小于500,更為典型地小于450。大多數(shù)的小分子是通常包含碳、氫、以及可選地,氧、氮、以及/或者硫原子的有機(jī)分子。
數(shù)目眾多的小分子已經(jīng)被描述可以被用于抑制EGFR。例如,Spada等的美國專利5,656,655公開了抑制EGFR的用苯乙烯基取代的雜芳基化合物。雜芳基是一個(gè)含有一個(gè)或者兩個(gè)雜環(huán)原子的單環(huán),或者是一個(gè)含有1至大約4個(gè)雜環(huán)原子的雙環(huán),其中化合物任選可以被取代或者被多取代。在美國專利5,656,655中所公開的化合物作為參照被結(jié)合于本發(fā)明中。
Spada等在美國專利5,646,153中公開了抑制EGFR以及/或者PDGFR的二單芳基以及/或者二環(huán)芳基雜芳基碳環(huán)以及雜環(huán)化合物。在美國專利5,646,153中所描述的復(fù)合物作為參照被結(jié)合于本發(fā)明中。
Bridges等在美國專利5,679,683中公開了抑制EGFR的三環(huán)嘧啶化合物。該化合物是在欄3第35行至欄5第6行中所描述的融合的雜環(huán)嘧啶衍生物。在欄3第35行至欄5第6行中對(duì)這些化合物的描述作為參照被結(jié)合于本發(fā)明中。
Barker的美國專利5,616,582公開了具有受體酪氨酸激酶抑制活性的喹唑啉衍生物。在美國專利5,616,582中所公開的化合物作為參照被結(jié)合于本發(fā)明中。
Fry等在科學(xué)(Science)265,1093-1095(1994)中公開了一種具有可以抑制EGFR的結(jié)構(gòu)的化合物。該結(jié)構(gòu)被示于
圖1中。被示于Fry等的文章中的圖1中的化合物作為參照被結(jié)合于本發(fā)明中。
Osherov等公開了抑制EGFR/HER1和HER2的酪氨酸磷酸化抑制劑。在Osherov等的文章中被公開的化合物,具體的,那些被列于表Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ中的化合物作為參照被結(jié)合于本發(fā)明中。
Levitzki等的美國專利5,196,446公開了抑制EGFR的雜芳乙烯二基或者雜芳乙烯二基芳基化合物。在美國專利5,196,446的欄2第42行至欄3第40行中所公開的化合物作為參照被結(jié)合于本發(fā)明中。
Batley等在生命科學(xué)(Life Sciences)62.143-150(1998)中公開了一種抑制受體FGF家族成員的被稱為PD161570的化合物。PD161570被鑒定為是叔丁基-3-(6-(2,6-二氯苯基)-2-(4-二乙基氨基-丁基氨基)-吡啶并(2,3-d)嘧啶-7-基)脲,它具有在第146頁中的圖1中所示的結(jié)構(gòu)。在Batley等在生命科學(xué)(Life Sciences)62,143-150(1998)中的文章中的第146頁中的圖1中所示的化合物作為參照被結(jié)合于本發(fā)明中。
Panek在Journal of Pharmacology and ExperimentalTherapeutics 283,1433-1444(1997)中公開了一種被鑒定為PD166285的能夠抑制受體的EGFR、PDGFR、以及FGFR家族的化合物。PD 166285被鑒定為是6-(2,6-二氯苯基)-2-(4-(2-二乙基氨基乙氧基)苯基氨基)-8-甲基-8H-吡啶并(2,3d)嘧啶-7-酮,它具有在第1436頁中的圖1中所示的結(jié)構(gòu)。被描述于Panek等的文章中第1436頁中的圖1中的化合物作為參照被結(jié)合于本發(fā)明中。
Parrizas等在內(nèi)分泌學(xué)(Endocrinology)138,1427-1433中公開了抑制IGF-1受體的酪氨酸磷酸化抑制劑。被公開于Parrizas等的文章中,具體地于第1428頁的表1中的化合物作為參照被結(jié)合于本發(fā)明中。
給病人施用小分子或者生物藥物是通過本領(lǐng)域公知的方法來進(jìn)行的。對(duì)于小分子,此類方法被描述于Spada的美國專利5,646,153中的欄57第47行至欄69第67行中。施用小分子的描述作為參照被結(jié)合于本發(fā)明中。
當(dāng)如上所述結(jié)合放射給病人施用有效量的生物分子,優(yōu)選地抗體和抗體的功能同等物時(shí),它們能夠顯著地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。抗體和抗體功能同等物的最優(yōu)劑量可以由醫(yī)師根據(jù)許多參數(shù),包括,例如,年齡、性別、體重、被治療疾病的嚴(yán)重程度、被施用的抗體、以及施用的途徑,進(jìn)行確定。一般而言,將多肽和抗體制備為能夠使目標(biāo)受體飽和的血清濃度是合乎需要的。例如,高于大約0.1nM的濃度通常就足夠了。例如,劑量為100mg/m2的C225可以使血清中的濃度在大約8天的時(shí)間內(nèi)維持在大約20nM的水平。
作為一個(gè)大致的方針,抗體的劑量可以是每周施用10-300mg/m2的量。同等劑量的抗體片段應(yīng)該以更短的時(shí)間間隔施用以便將血清中的濃度維持在超過能夠使受體飽和的水平。
一些合適的施用途徑包括靜脈內(nèi)、皮下、以及肌肉施用。靜脈內(nèi)施用是優(yōu)選的。
本發(fā)明的肽和抗體可以與另外的藥物可接受的成分一起施用。此類成分包括,例如,佐劑,如BCG、免疫系統(tǒng)刺激物以及化學(xué)治療劑,如上述的那一些。
實(shí)施例1.臨床試驗(yàn)在一個(gè)臨床試驗(yàn)中,用抗-EGFR的嵌合單克隆抗體c225對(duì)病人進(jìn)行治療,以標(biāo)示的劑量施用,同時(shí)結(jié)合每天2Gy(每部分)的外源射線束放射治療,一周施用5天,持續(xù)7周,反射線總量為70Gy。結(jié)果示于表中,其中CR表示完全應(yīng)答,PR表示部分應(yīng)答,TBD表示待測(cè)定。
表臨床反應(yīng)
*放射治療隨訪(Radiographic follow-up ongoing)補(bǔ)充實(shí)施例(enablement)本發(fā)明,如根據(jù)權(quán)利所要求的,可以依照上面的說明書以及可以容易地獲得的參考文獻(xiàn)和起始材料進(jìn)行實(shí)施。然而,本發(fā)明者們?cè)?998年5月13日將生產(chǎn)被稱為c225的鼠單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系重新保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type CultureCollection),12301 Parklawn Drive,Rockville,Md.,20852 USA(ATCC)中。這一抗體原先是作為對(duì)Mendelsohn等的美國專利4,943,533的支持被保藏的,保藏號(hào)為HB8508。
重新保藏是根據(jù)Budapest Treaty on the InternationalRecognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposesof Patent Procedure及其下的規(guī)則(布達(dá)佩斯條約)進(jìn)行的。這保證了從保藏之日起在30年的時(shí)間內(nèi)對(duì)一種能存活的培養(yǎng)物進(jìn)行保藏。這一生物體可以根據(jù)布達(dá)佩斯公約的條款并且在遵守本申請(qǐng)者與ATCC之間的協(xié)議的前提下由ATCC提供,其中上述的協(xié)議確保在相關(guān)的美國專利被公開后,該生物體可以被沒有限制地獲得。所保藏的菌株的可用性不應(yīng)該被解釋成是允許在違背由任何政府當(dāng)局根據(jù)其專利法所保障的權(quán)利的情況下實(shí)施本發(fā)明。
權(quán)利要求
1.一種抑制腫瘤在病人中生長(zhǎng)的方法,包括用有效量的放射線和非放射標(biāo)記蛋白質(zhì)受體酪氨酸激酶抑制劑的組合對(duì)病人進(jìn)行治療,其中蛋白質(zhì)受體酪氨酸激酶的過量表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其中抑制劑是一種單克隆抗體或是含有單克隆抗體超變區(qū)的片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法,其中單克隆抗體是嵌合的或者是人源化的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其中抑制劑是一種小分子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其中蛋白質(zhì)受體酪氨酸激酶是EGFR、PDGFR、TGF、IGFR、NGFR、或者FGFR。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法,其中生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶是EGFR家族的一個(gè)成員。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法,其中EGFR家族的成員是EGFR/HER-1。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的方法,其中EGFR家族的成員是HER2。
9.根據(jù)權(quán)利要求6的方法,其中EGFR家族的成員是erbB3。
10.根據(jù)權(quán)利要求6的方法,其中EGFR家族的成員是erbB4。
11.根據(jù)權(quán)利要求5的方法,其中生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶是PDGFR家族的一個(gè)成員。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法,其中PDGFR家族的成員是PDGFRα。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的方法,其中PDGFR家族的成員是PDGFRβ。
14.根據(jù)權(quán)利要求5的方法,其中生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶是FGFR家族的一個(gè)成員。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法,其中FGFR家族的成員是FGFR-1。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的方法,其中FGFR家族的成員是FGFR-2。
17.根據(jù)權(quán)利要求14的方法,其中FGFR家族的成員是FGFR-3。
18.根據(jù)權(quán)利要求14的方法,其中FGFR家族的成員是FGFR-4。
19.根據(jù)權(quán)利要求5的方法,其中生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶是IGFR家族的一個(gè)成員。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法,其中IGFR家族的成員是IGFR-1。
21.根據(jù)權(quán)利要求5的方法,其中生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶是TFR家族的一個(gè)成員。
22.根據(jù)權(quán)利要求5的方法,其中生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶是NGFR。
23.根據(jù)權(quán)利要求2的方法,其中單克隆抗體是EGFR/HER1特異性的。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法,其中單克隆抗體抑制EGFR/HER1的磷酸化作用。
25.根據(jù)權(quán)利要求3的方法,其中抗體是EGFR/HER1特異性的。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法,其中抗體抑制EGFR/HER1的磷酸化作用。
27.根據(jù)權(quán)利要求4的方法,其中小分子是EGFR特異性的。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法,其中小分子抑制EGFR的磷酸化作用。
29.根據(jù)權(quán)利要求2的方法,其中腫瘤過量表達(dá)EGFR/HER1。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法,其中腫瘤是乳腺、肺、結(jié)腸、腎臟、膀胱、頭和頸、卵巢、前列腺、以及腦的腫瘤。
31.根據(jù)權(quán)利要求2的方法,其中抗體是在放射治療之前施用。
32.根據(jù)權(quán)利要求2的方法,其中抗體是在放射治療期間施用。
33.根據(jù)權(quán)利要求2的方法,其中抗體是在放射治療之后施用。
34.根據(jù)權(quán)利要求2的方法,其中抗體是在放射治療之前和期間施用。
35.根據(jù)權(quán)利要求2的方法,其中抗體是在放射治療期間和之后施用。
36.根據(jù)權(quán)利要求2的方法,其中抗體是在放射治療之前和之后施用。
37.根據(jù)權(quán)利要求2的方法,其中抗體是在放射治療之前、期間和之后施用。
38.根據(jù)權(quán)利要求2的方法,其中放射線的源位于病人的外部。
39.根據(jù)權(quán)利要求2的方法,其中放射線的源位于病人的內(nèi)部。
全文摘要
一種對(duì)人患者中腫瘤的生長(zhǎng)進(jìn)行抑制的方法,包括用有效量的放射線和非放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)受體酪氨酸激酶抑制劑的結(jié)合對(duì)病人進(jìn)行治療,其中上述的蛋白質(zhì)受體酪氨酸激酶的過量表達(dá)可以導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。
文檔編號(hào)C07K16/18GK1314917SQ99808614
公開日2001年9月26日 申請(qǐng)日期1999年5月14日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月15日
發(fā)明者H·W·瓦克薩爾, M·N·薩勒, F·羅伯特, D·J·布赫斯鮑姆 申請(qǐng)人:伊姆克羅尼系統(tǒng)公司, Uab研究基金會(huì)