專利名稱：：使用加工酶的嵌合蛋白質(zhì)的切斷方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明是關(guān)于在生產(chǎn)生理活性肽或其前體時，成為底物的嵌合蛋白質(zhì)及其生產(chǎn)方法，本發(fā)明進(jìn)而是關(guān)于使該生理活性肽從該嵌合蛋白質(zhì)中游離、精制的方法。正在利用嵌合蛋白質(zhì)表達(dá)法嘗試許多的肽生產(chǎn)方法。作為目的肽的游離方法，正在使用利用化學(xué)的或酶的切斷。作為酶有特異地切斷賴氨酸殘基的C末端側(cè)的肽鍵的賴酰胺肽鏈內(nèi)切酶(無色桿菌蛋白酶I)、特異地切斷谷氨酸殘基的C末端側(cè)的葡萄球菌蛋白酶V8等。作為化學(xué)方法有亞硝酸引起天冬氨酸殘基開裂、CNBr引起甲硫氨酸殘基開裂等?；瘜W(xué)方法不能避免目的肽的修飾，在切斷后的目的肽的精制中，必須從各種類似物中進(jìn)行目的肽的精制。而酶切斷方法特異性高、也可在較溫和的條件下進(jìn)行切斷，因此目的肽的精制是容易的，但是是否可能利用這些酶，要依賴于目的肽的氨基酸序列。因此存在不能選擇現(xiàn)有蛋白酶，而尋求通用性高的切斷酶。在生物體內(nèi)生成肽激素及其前體時，用酶(加工酶)特異地切斷該肽的前體多肽。在這種酶中已經(jīng)知道前體轉(zhuǎn)變酶1/3(PC1/3)、前體轉(zhuǎn)變酶2(PC2)、フリン(furin)等，在啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)的α-因子(α-matingfactor)生成時發(fā)揮功能的Kex2蛋白酶也是其中一種。在從嵌合蛋白質(zhì)中切出目的肽時如果直接使用這些加工酶，能不損害肽激素，而且能夠適用于各種各樣肽，正期待像這樣的生產(chǎn)方法。本發(fā)明人已報導(dǎo)過以來自大腸桿菌β-半乳糖苷酶的多肽作為保護(hù)肽，選擇合適的接頭肽，在大腸桿菌體內(nèi)以不溶性包涵體生產(chǎn)與目的肽嵌合的蛋白質(zhì)的方法(特開平5-328992)。該嵌合蛋白質(zhì)用尿素等變性劑溶解，成為加工酶的底物。另一方面，本發(fā)明人等已報導(dǎo)過通過變化其基因、作為可溶性酶(分泌型Kex2衍生物)生產(chǎn)來自膜結(jié)合型酶的啤酒糖酵母的Kex2蛋白酶的方法(“分泌型Kex2衍生物的制造方法”為題的平成8年3月4日申請的說明書)。但是，在以該酶作為加工酶使用時，未涉及關(guān)于成為其底物的嵌合蛋白質(zhì)的設(shè)計。因此，正期待開發(fā)在大量培養(yǎng)下、在大腸桿菌體內(nèi)作為包涵體能效率良好地生產(chǎn)、在加工酶有效地作用條件下能容易溶化的嵌合蛋白質(zhì)的設(shè)計、生產(chǎn)方法，進(jìn)而期待開發(fā)利用加工酶從嵌合蛋白質(zhì)中有效地切斷目的肽那樣地設(shè)計、生產(chǎn)切斷部位附近的氨基酸序列的方法。另外，同時也期待開發(fā)以高回收率將像上述那樣生產(chǎn)的生理活性肽精制至99％以上的純度的通用性的高精制方法。因此，本發(fā)明想要提供在使用如分泌型Kex2衍生物的加工酶、生產(chǎn)生理活性肽時成為底物的嵌合蛋白質(zhì)的設(shè)計、生產(chǎn)方法及該肽的精制方法。本發(fā)明人等研究了解決上述課題的方法，結(jié)果初次清楚以下事實，從而完成了本發(fā)明。即1)在嵌合蛋白質(zhì)中插入富有His的序列，例如含有{(His)4-Pro-Gly}n(n＝1-6)的接頭肽，與產(chǎn)量增加和在如分泌型Kex2衍生物的加工酶反應(yīng)條件下的溶解性提高有關(guān)的事實，2)以接頭內(nèi)的加工酶作用部位的氨基酸序列作為X1-X2-(Lys/Arg)-Arg，希望作為X1選擇Lys、Arg或His，作為X2選擇His或Phe，是反應(yīng)性高的底物條件的事實，進(jìn)而3)反應(yīng)后，使反應(yīng)液的pH變成弱酸性，再進(jìn)行稀釋，使變性劑的濃度降低，使目的肽以外的成分的大部沉淀，通過離心分離或壓濾，在上清液中能夠回收95％以上的目的肽，然后例如單獨(dú)或者最好組合使用陽離子交換色譜法、低壓反相色譜法、反相HPLC等能夠高純度且高回收率地精制目的肽的事實。因此本發(fā)明提供以下式表示的嵌合蛋白質(zhì)，A-L-B(式中，A是保護(hù)肽；B是目的肽；而L是接頭肽，在其C末端具有序列X1-X2-(Lys或Arg)-Arg(式中，X1和X2是任意的氨基酸)，而在N末端具有富有His的部分。]作為在上述N末端富有His的部分，序列[(His)4-Pro-Gly]n(式中，n是1-6)是理想的，并且X1是Arg、Lys或者His，而且X2是His或者Phe為佳。進(jìn)而，在上述N末端部分的氨基酸序列和上述C末端部分的氨基酸序列之間也可以存在1-5個任意的氨基酸。本發(fā)明還提供以下述為特征的方法，即在上述的嵌合蛋白質(zhì)的制造方法中，用含有編碼該嵌合蛋質(zhì)的DNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)化體，從該培養(yǎng)物中提取上述嵌合蛋白質(zhì)。本發(fā)明又提供以下述為特征的方法，即在上述目的肽(B)的制造方法中，使加工酶作用于上述的嵌合蛋白質(zhì)，而切斷接頭肽(L)的C末端和目的肽(B)的N末端之間的肽鍵，得到目的肽(B)。上述的方法，在優(yōu)選的方式中，用能夠表達(dá)編碼嵌合蛋白質(zhì)的基因的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)化體，再破碎該轉(zhuǎn)化體，得到包涵體的不溶性級分，用可溶化劑處理該不溶性級分，使包涵體中的嵌合蛋白質(zhì)溶化，用如分泌型Kex2衍生物的加工酶切斷該溶化的嵌合蛋白質(zhì)的上述接頭氨基酸殘基的C末端和上述目的肽的N末端之間的肽鍵，從而切出該目的肽，通過沉淀處理、陽離子交換色譜法、低壓反相色譜法和反相HPC精制該目的肽。對附圖的簡要說明圖1表示在合成hProPTH(1-84)基因制作中使用的合成低聚物的序列。圖2表示合成hProPTH(1-84)基因的制作方法。圖3是表示質(zhì)粒pG210S(S/X)的制作方法的圖。Plac表示大腸桿菌的乳糖操縱子的啟動子，Ttrp表示大腸桿菌的TrPE的減弱終止區(qū)。圖4表示表達(dá)嵌合蛋白質(zhì)βGal-139S(FM)PPH84的質(zhì)粒pGP#139的制作方法。圖5表示表達(dá)嵌合蛋白質(zhì)βGal-139S(FM)PPH84的質(zhì)粒pGP#19PP34的制作方法。圖6是表示表達(dá)嵌合蛋白質(zhì)βGal-117SPPH34和βGal-117SnHPP34的質(zhì)粒pG117SPPH34和pG117SnHPPH34的制作方法的前半部分的圖(n＝1-6)。使引物S05轉(zhuǎn)變成S04制成pG97SPPH34和pG97SnHPPH34，使引物S05轉(zhuǎn)變成S06，制成pG139SPPH34和pG139SnHPPH34。圖7是表示表達(dá)嵌合蛋白質(zhì)βGal-117SPPH34和βGal-117SnHPP34的質(zhì)粒pG117SPPH34和pG117SnHPPH34的制作方法的后半部分的圖(n＝1-6)。使引物S05轉(zhuǎn)變成S04制成pG97SPPH34和pG97SnHPPH34，使引物S05轉(zhuǎn)變成S06，制成pG139SPPH34和pG139SnHPPH34。圖8是表示調(diào)查聚組氨酸接頭{(His)4-Pro-Gly}n(n＝1-6)對嵌合蛋白質(zhì)產(chǎn)量影響的SDS-PAGE的結(jié)果的圖。圖中4H表示組氨酸殘基是4個即n＝1。圖9是表示聚組氨酸接頭[(His)4-Pro-Gly]n(n＝1-6)對由Kex2-660引起的hPTH(1-34)的切出效率影響的圖。橫軸表示以βGal-117SPPH34的Kcat值作為1時的相對值。圖10是表示Kex2蛋白酶的識別部位P3的氨基酸對由Kex2-660引起的hPTH(1-34)的切出效率影響的圖。P4的氨基酸固定在纈氨酸殘基上，取代P3部位的氨基酸。橫軸表示以βGal-117S4HVKPH34的Kcat值作為1時的相對值。圖11是表示Kex2蛋白酶的識別部位P4的氨基酸對由Kex2-660引起的hPTH(1-34)的切出效率影響的圖。P3的氨基酸固定在組氨酸殘基上，取代P4部位的氨基酸。橫軸表示以βGal-117S4HVKPH34的Kcat值作為1時的相對值。圖12是表示βGal-117KS4HRHPH34基因的表達(dá)載體pGKSPH34的結(jié)構(gòu)的示意圖。βGal-117ks是βGal-117S的14位的精氨酸殘基被賴氨酸殘基取代的肽。圖13是表示質(zhì)粒pG210ShCT(G)的制作方法的圖。圖14表示HGLP-1(7-37)基因(DNA(1))制作用的合成低聚核苷酸的堿基序列，及以pGKSPH34作為模板用的引物的堿基序列。圖15表示質(zhì)粒pG117S4HGP的制作過程。圖16表示hGLP-1的精制的分布圖，A表示Kex2反應(yīng)后的結(jié)果，B表示酸性沉淀上清液的結(jié)果，C表示陽離子交換柱后的結(jié)果，D表示低壓逆相柱后的結(jié)果。峰1表示hGLP-1(7-37)，峰2表示hGLP-1，峰3表示保護(hù)肽，峰4表示嵌合蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的方法，用加工酶切斷由上述保護(hù)肽、接頭的生理活性肽(目的肽)組成的嵌合蛋白質(zhì)，能夠制造生理活性肽。作為像這樣的肽，可舉出人副甲狀腺激素(hPTH(1-84)及其衍生物(hPTH(1-34)、hPTH(1-34)、zhPTH(1-38))、人副甲狀腺激素的其他衍生物(hPTH(1-31)Gly、hPTH(1-34)Gly、hPTH(1-37)Gly、hPTH(1-38)Gly、hPTH(3-84)、hPTH(3-34)、hPTH(3-37)、hPTH(3-38))、細(xì)胞增殖因子、降鈣素及其前體、胰高血糖素樣的蛋白質(zhì)1(Glucagon-likepeptide1GLIP-1)及其衍生物(GLIP-1(1-37)GLIP-1(7-37)、GLIP-1(7-36)NH3等)，但并不限于這些。另外，作為加工酶，可以使用Kex2蛋白酶、フリン(Furin)、前體轉(zhuǎn)變酶1(PC1)或前體轉(zhuǎn)變酶2(PC2)或者它們的衍生物等，但并不限于這些。在本發(fā)明中，特別是除去Kex2酶的C末端而得到的分泌型Kex2衍生物是優(yōu)先選擇的。在本發(fā)明中的保護(hù)肽，其大小是220個氨基酸以下的肽為佳。例如由從大腸桿菌β半乳糖苷酶的N末端的1位至90-210個氨基酸組成的肽為佳。更好是從大腸桿菌β半乳糖苷酶的N末端的1位至97位、117位或139位組成的肽。并且更好是這些肽的半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基取代，最好是14位的纈氨酸殘基被賴氨酸殘基取代。另外，在保護(hù)肽中，最好含有通過加工酶識別的序列，例如Arg-Arg、Lys-Arg等，在保護(hù)肽中有該識別序列時，以其他的氨基酸取代像這樣的識別序列中的至少一個氨基酸，通過形成不被加工酶識別的序列，能夠防止利用加工酶的切斷。作為用于改善嵌合蛋白質(zhì)的溶解性的接頭氨基酸，以親水性者為佳。因目的肽的種類不同，嵌合蛋白質(zhì)的電荷變化，因為有造成包涵體生產(chǎn)率降低的情況，所以作為親水性氨基酸，希望使用在是包涵體生產(chǎn)場所的菌體內(nèi)的生理pH(中性)附近保持緩沖能力的組氨酸殘基。進(jìn)而在變性、可溶化后，以使接頭部分的二級結(jié)構(gòu)加寬為目的，希望插入Pro-Gly。最好是要能適應(yīng)多種的生理活性肽那樣，準(zhǔn)備編碼(His)4-Pro-Gly的合成DNA片段，適當(dāng)重復(fù)插入編碼保護(hù)肽的DNA片段，形成{(His)4-Pro-Gly}n(n＝1-6)地設(shè)計接頭。以下將該接頭的N末端部分的序列記作LN。進(jìn)而，本發(fā)明人等已初次清楚，來自大量生產(chǎn)已成為可能的啤酒糖酶的Kex2蛋白酶衍生物(分泌型Kex2衍生物)，以嵌合蛋白質(zhì)作為底物時，Kex2蛋白酶識別部位(Lys/Arg/Pro)-Arg附近的氨基酸也對其活性產(chǎn)生大的影響。即已清楚，以位于接頭的C末端的氨基酸序列作為X1-X2-(LyS/Arg)-Arg(式中X1、X2是任意的氨基酸)，在X1中使用Arg、Lys或His，在X2中使用His或Phe的場合，分泌型Kex2衍生物活性最大。以下將該接頭的C末端部分的序列記作LC。以嵌合蛋白質(zhì)法生產(chǎn)而切出的目的肽，用各種方法進(jìn)行精制，但在使用該嵌合蛋白質(zhì)的場合，通過簡便的操作，能夠有效地除去未反應(yīng)嵌合蛋白質(zhì)、保護(hù)肽類、來自大腸桿菌的不純物。即，已清楚，分泌型Kex2衍生物反應(yīng)后，使pH移向弱酸性側(cè)，再稀釋反應(yīng)液，降低變性劑濃度，以此使來自大腸桿菌的不純物的大部分、未反應(yīng)嵌合蛋白質(zhì)、保護(hù)肽類進(jìn)行95％以上的沉淀，在上清液中能保持95％以上的目的肽，通過離心分離或壓濾就簡便地得到含有目的肽的上清液。在將該上清液進(jìn)行pH調(diào)制等后，通過直接陽離子交換色譜，吸附目的肽，利用鹽濃度的變化或pH的變化進(jìn)行洗脫，再使洗脫級分通過低壓逆相色譜，吸附目的肽，利用有機(jī)溶劑的濃度變化進(jìn)行洗脫且濃縮。有機(jī)溶劑濃度降低后，供給逆相HPLC，利用有機(jī)溶劑濃度的變化，進(jìn)行分離分級，得到高純度的目的肽。下面，例舉目的肽是人副甲狀腺激素衍生物hPTH(1-34)說明本發(fā)明。首先，通過合成DNA低聚物的連接制作hPTH(1-84)基因，接著使制成的基因與編碼質(zhì)粒pG210ShCT[G]的hCT[G]基因的領(lǐng)域進(jìn)行取代，制成βGal-210SPPH84表達(dá)用質(zhì)粒pG210ShProPTH(圖3)。制成將從hPTH(1-84)基因的編碼N末端的第35號氨基酸(Val)的密碼變成翻譯的終止密碼，將編碼βGal-210S(在從大腸桿菌β-半乳糖苷酶的N末端1位至210位的肽中，半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基取代的肽)的基因轉(zhuǎn)變成編碼βGal-117S(在從大腸桿菌β-半乳糖苷酶的N末端1位至177位的肽中，半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基取代的肽)的基因的pG117SHPPH34(圖6-7)。同樣，轉(zhuǎn)變成編碼βGal-210的基因，通過插入編碼βGal-139S的基因或編碼βGal-97S的基因，可以制成pG139SHPPH34或pG97SHPPH34。這些質(zhì)粒，通過接頭肽Phe-Met-Lys-Ser-Val-Lys-Lys-Arg分別使編碼βGal-97S、βGal-117S和βGal-139S的結(jié)構(gòu)基因與衍生物hPTH(1-34)的結(jié)構(gòu)基因連接，編碼該嵌合蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因處于lac啟動子的控制下。另外這些質(zhì)粒含有四環(huán)素耐性基因標(biāo)志。尿素溶液的溶解度高，βGal-97SPPH34產(chǎn)量少，βGal-117SPPH34和βGal-139SPPH34產(chǎn)量高，分泌型Kex2衍生物反應(yīng)條件下的溶解性降低，為了從嵌合蛋白質(zhì)中切出衍生物hPTH(1-34)，需要更多的分泌型Kex2衍生物。因此，為了得到產(chǎn)量高且尿素溶液的溶解度高的嵌合蛋白質(zhì)，在上述保護(hù)肽和接頭Met-Ser-Val-Lys-Lys-Arg之間插入由親水性且在中性附近保持緩沖能力、阻礙嵌合蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)形成的氨基酸組成的接頭LN。作為LN使用由{(His)4-Pro-Gly}n(n＝1-6)組成的肽。{(His)4-Pro-Gly}n(n＝1-6)的導(dǎo)入，以合成編碼(His)4-Pro-Gly或者{(His)4-Pro-Gly}2的DNA片段，然后以適當(dāng)?shù)哪柋炔迦刖幋a保護(hù)肽的DNA片段的3’末端來進(jìn)行，可以制作編碼包含接頭肽的嵌合蛋白質(zhì)的基因，所述的接頭肽含有一個或數(shù)個上述氨基酸序列。再者，DNA片段反轉(zhuǎn)而插入者，以DNA堿基序列分析來確認(rèn)并除外。用編碼這些嵌合蛋白質(zhì)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌M25株，提高嵌合蛋白質(zhì)的生產(chǎn)率(圖8)。其結(jié)果表明，在保護(hù)肽βGal-97S和βGal-139S的場合，n＝3，在βGal-117S的揚(yáng)合，n＝1-6，嵌合蛋白質(zhì)的產(chǎn)量高。另外，將這些嵌合蛋白質(zhì)包涵體進(jìn)行菌體破碎，用離心分離進(jìn)行洗凈、分離，用尿素進(jìn)行溶化和稀釋，供給Kex2-660反應(yīng)(圖9)。其結(jié)果表明，由于{(His)4-Pro-Gly}n(n＝1-6)的導(dǎo)入，所有嵌合蛋白質(zhì)對Kex2-660的感受性變高。因此，考慮嵌合蛋白質(zhì)產(chǎn)量、對Kex2-660的反應(yīng)性和保護(hù)肽的大小，在hPTH(1-34)生產(chǎn)用的嵌合蛋白質(zhì)中，作為保護(hù)肽采用βGal-117S，作為接頭肽采用由(His)4-Pro-Gly組成的βGal-117S4HPPH34。由以上結(jié)果可知，作為利用分泌型Kex2衍生物切出生理活性肽用的嵌合蛋白質(zhì)的設(shè)計，不僅為了改善大腸桿菌體內(nèi)的生產(chǎn)率，而且為了改善分泌型Kex2衍生物反應(yīng)條件下的溶解性，可適當(dāng)插入{(His)4-Pro-Gly}n(n＝1-6)這樣的肽。在該過程中，分泌型Kex2衍生物按摩爾比需要1/1000的嵌合蛋白質(zhì)，占制造原材料費(fèi)的大半。因此，有必要設(shè)計利用分泌型Kex2衍生物更容易切斷的嵌合蛋白質(zhì)。βGal-117S4HPPH34的分泌型Kex2衍生物識別部位使用人副甲狀腺激素前體的前序列Lys-Ser-Val-Lys-Lys-Arg。但是，還不清楚該序列在利用分泌型Kex2衍生物的切斷中是否最合適，像在許多其他蛋白酶中看到的那樣，應(yīng)考慮通過最合適化進(jìn)一步增加切斷效率的可能性。在識別部位的C末端側(cè)，因為hPTH(1-34)連續(xù)，所以氨基酸不能取代，但是如果不重新創(chuàng)造識別部位就可以任意選擇N末端一側(cè)的序列。因此，嘗試將是底物的嵌合蛋白質(zhì)的P3部位(X2)轉(zhuǎn)換成任意的氨基酸。對10中所示18種氨基酸序列進(jìn)行研究的結(jié)果已清楚，如果在X2中導(dǎo)入His或Phe，從嵌合蛋白質(zhì)中切出hPTH(1-34)的效率就變高。接著，將副反應(yīng)少的His固定在X2上，研究圖1中所示P4部位的20種氨基酸序列，結(jié)果表明，如果在X1中導(dǎo)入Arg、Lys或His，從嵌合蛋白中切出hPTH(1-34)的效率就變高。其中切出效率最好者是在LC中選擇Arg-His-Lys-Arg。進(jìn)而在本研究的過程中已清楚，存在于βGal-117S的13位、14位的Arg-Arg序列的C末端側(cè)的鈦鍵被Kex2衍生物切斷，該結(jié)果產(chǎn)生的βGal(1-34)，在利用以后的酸性沉淀進(jìn)行精制工序中，與hPTH(1-34)相同在上清級分中被回收，因此將14位的Arg取代成Ays而控制切斷，就抑制βGal(1-34)的生成。以上結(jié)果表明，在hPTH(1-34)生產(chǎn)用嵌合蛋白質(zhì)中，作為保護(hù)肽使用將14位的Arg取代成Lys的βGal-117S(βGal-117KS)，作為接頭肽使用具有Pro-His-His-His-His-Pro-Gly-Gly-Arg-Pro-Ser-Arg-His-Lys-Arg這樣的氨基酸序列的肽。接著本發(fā)明人等，以大腸桿菌表達(dá)像這樣設(shè)計的嵌合蛋白質(zhì)βGal-117KS4HRHPH34，作為包涵體，在洗凈回收后進(jìn)行可溶化，研究供給分泌型Kex2衍生物反應(yīng)時的精制方法。包含來自大腸桿菌的不純物、未反應(yīng)嵌合蛋白質(zhì)和保護(hù)肽的肽，利用在從中性至弱酸性時溶解性極端降低，通過使pH從適合分泌型Kex2衍生物反應(yīng)的pH7.8-8.2向6.2-6.5移動，可以進(jìn)行沉淀。進(jìn)一步通過稀釋降低變性尿(尿素)濃度，能使大部分不純物沉淀。通過離心分離或壓濾除去沉淀，在上清液中高效率地回收hPTH(1-34)。將上清液調(diào)整到pH5.0后使hPTH(1-34)吸附在陽離子交換色譜柱(例如PorosHS/SPトヨパ-ル)上，以0.3mol-0.4molNaCl進(jìn)行洗脫。向洗脫液中添加乙酸，使hPTH(1-34)吸附在低壓逆相色譜上，以30％程度的乙腈進(jìn)行洗脫，除去對濃縮和逆相HPLC產(chǎn)生惡劣影響的不純物。減壓蒸餾除去洗脫液中的乙腈，用0.22μm的膜濾品進(jìn)行過濾，使hPTH(1-34)吸附在逆相HPLC(例如，InertsilPrepODS、TSK120T)上，在用乙腈的梯度洗脫中進(jìn)行分級，集中高純度的級分，以回收率40％-70％得到純度99.5％的hPTH(1-34)。由以上的結(jié)果可知，回收率在到目前為止的報導(dǎo)中是最高，證實了本發(fā)明的有用性。根據(jù)實施例具體地說明本發(fā)明。但本發(fā)明并不限定于這些實施例。下面描述作為本發(fā)明的材料使用的質(zhì)粒、大腸桿菌、在各實施例中共同的基本實驗操作。質(zhì)粒質(zhì)粒pG210ShCT[G]是用大腸桿菌乳糖操縱子的啟動子能表達(dá)嵌合蛋白質(zhì)的質(zhì)粒，所述的嵌合蛋白質(zhì)是在由從β-半乳糖苷酶的N末端1位至210位的氨基酸組成的肽中，通過谷氨酸殘基，將hCT[G](在人降鈣素的32位的氨基酸的C末端上附加甘氨酸殘基的肽)結(jié)合在76位、122位和154位的半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基取代的殘基(βGal-210S)上。將含有編碼以限制性內(nèi)切酶Pvull和EcoRI消化pGHα210(Ser)rop-得到的βGal-210S的一部分的基因的DNA片段與含有以限制性內(nèi)切酶Pvull和EcoRI消化pG97S4DhCT[G]得到的載體部分的DNA片段連接而制作(圖13)。再者，關(guān)于pGHα210(Ser)rop-的制作方法，在特公平6-87788中已公開，含有質(zhì)拉pG97S4DhCT[G]的大腸桿菌W3110株，命名為大腸桿菌SBM323，以保藏號微工研條寄第3503號(FERMBP-3503)、于1991年8月8日保藏在工業(yè)技術(shù)院微生物工業(yè)技術(shù)研究所。如果該編碼目的肽的DNA領(lǐng)域與閱讀框架相吻合、以EcoRI-SalIDNA片段導(dǎo)入質(zhì)粒pG210ShCT[G]中，就能表達(dá)與βGal-210S有關(guān)的嵌合蛋白質(zhì)。作為合成人副甲狀腺激素前體(hProPTH(1-84))基因的克隆和質(zhì)粒pGP#19的制作材料使用(圖13)。大腸桿菌大腸桿菌JM109株以感受細(xì)胞狀態(tài)從東洋紡(株式會社)購入，用于質(zhì)粒的調(diào)制。大腸桿菌M25株(W3110/0mpTSugimulaetal.，Biochem.Biophys.Res.Commun，153，737-759，1988)用于嵌合蛋白質(zhì)的表達(dá)。培養(yǎng)基在大腸桿菌的培養(yǎng)中使用以下的培養(yǎng)基。SB培養(yǎng)基0.5％(W/V)甘油、2.4％(W/V)酵母提取物、1.2％(W/V)胰化胨、0.1mol磷酸氫鉀緩沖液(pH7.5)。NU1合成培養(yǎng)基0.4％(W/V)酵母提取物、0.4％(W/V)K2HPO4、0.4％(W/V)KH2PO4、0.27％(W/V)Na2HPO4、1.2％(W/V)(NH4)2SO4、0.02％(W/V)NH4Cl、0.3％(W/V)L-甲硫氨酸、0.2％(W/V)MgSO4·7H2O、40gm/LFeSO4·7H2O、40mg/LCaCl2·2H2O、10mg/LAlCl2·6H2O、10mg/LCoCl2·6H2O、2mg/LZnSO4·7H2O、2mg/LNa2Mo4·2H2O、1mg/LCuCl2·2H2O、0.5mg/LH3BO3和10mg/LMnSO4·nH2O?；镜膶嶒灢僮髟趯嵤├形淳唧w地表示的情況下，實施操作遵循以下的方法。以使用磷酸酰胺法的全自動合成機(jī)(アプライドバイオツステムズモデル320A)合成DNA引物。以雙脫氧法決定DNA堿基序列。DNA切斷使用事先購入的指定的3-10倍量的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行1小時反應(yīng)。使用0.5-1μg的DNA在20μl反應(yīng)液中進(jìn)行質(zhì)粒結(jié)構(gòu)的解析，在DNA的調(diào)制中，使用3-10μg的DNA在50-100μl反應(yīng)液中進(jìn)行。反應(yīng)溫度、反應(yīng)緩沖劑等條件按照購入品中的指定。在反應(yīng)液中添加1/5容量的色素液(含有0.25％(W/V)溴酚藍(lán)的15％(W/V)Ficoll水溶液)調(diào)制成瓊脂糖凝膠電泳試樣。在瓊脂糖凝膠電泳用緩沖劑中使用TAE緩沖劑(40mmolTris/乙酸、2mmolEDTA)。在質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)解析中，使用Mupid-2(コスモバイオ(株式會社)，進(jìn)行100伏、1小時的電泳，在為了DNA的調(diào)制中，使用水平凝膠(20cm×15cm×0.7cm)，進(jìn)行150伏、4小時或者35伏、13小時的電泳。凝膠用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶翁溶液(0.5μg、ml)染色20分鐘后，照射紫外線，檢測到DNA光譜。瓊脂糖凝膠濃度對照要分級的DNA片段的大小使用1.0％、2.0％(W/V)。將凝膠放入充滿0.1×TAE緩沖劑的透析管內(nèi)，施加電壓使瓊脂糖凝膠中的DNA溶出，從凝膠中提取出。將DNA溶液進(jìn)行苯酚處理、氯仿處理后，進(jìn)行乙醇沉淀，將DNA精制。連接反應(yīng)，向含有0.05-1μg的DNA片段的反應(yīng)液(67mmolTris/HCl(pH7.5)、5mmolMgCl2、5mmolDTT、1mmolATP)30μl中添加10單位的T4DNA連接酶，在16℃進(jìn)行12-18小時反應(yīng)，或者使用TAKARA連接試劑盒(寶酒造(株式會社)進(jìn)行。大腸桿菌JM109株的轉(zhuǎn)化按照購入前的指示進(jìn)行，大腸桿菌25株的轉(zhuǎn)化法按照氯化鈣法進(jìn)行，按照耐藥性(四環(huán)素)選擇轉(zhuǎn)化株。添加同量的SDS試樣緩沖劑(63mmolTris/HCl(pH6.8)、10％(W/V)甘油、10％(W/V)SDS、10mg/ml溴酚藍(lán)，煮沸3分鐘調(diào)制成SDS-聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)試樣。使用16％(W/V)SDSPAGEmini(TEFCO)凝膠，每1枚以20mA進(jìn)行70分鐘，凝膠用考馬斯亮藍(lán)G染色。hPTH(1-34)的定量，首先以試樣緩沖劑(1mol乙酸/2mol尿素)將含有hPTH(1-34)的溶液從10倍稀釋至20倍后，得到離心上清液，接著，將其供給連接YMC-ODS-A302(d4.6mm×150mm)柱((株式會社)山村化學(xué)研究所)的HPLC(島津制作所(株式會社)LC10A)，在A液(0.1％(V/V)三氟乙酸(TFA)/10％(V/V)乙腈)、B液(0.094％(V/V)TFA/50％(V/V)乙腈)，B40％→80％/20min梯度體系進(jìn)行展開，將以214nm的吸光度測定檢測出的hPTH(1-34)的峰面積與既知濃度的標(biāo)準(zhǔn)hPTH(1-34)的峰面積進(jìn)行比較。其他，除另外表示的以外，基本的基因操作按照在MolecularCloning(Maniatis等編，ColdSpringHarborlaboratory，NewYork(1982))中記載的方法進(jìn)行。實施例1hProPTH(1-84)基因的制作hProPTH(1-84)基因，如圖1所示，分成U1-U7(序列號1-7)和L1-L7(序列號8-14)的14個片段，進(jìn)行合成。像以下那樣連接各片段制成hProPTH(1-84)基因(圖2)。首先，使DNA片段U1(序列號1)和L7(序列號14(各約1μg)與16單位的T4多核苷酸激酶在含0.5nmol(1molBq以上)的[γ-32P]dATP的磷酸化反應(yīng)液15μl中(50mmolTris/HCl(pH7.6)、10mmolMgCl2、5mmolDTT)、在37℃反應(yīng)15分鐘。再向其中添加含5mmolATP的磷酸化反應(yīng)液5μl，在37℃再反應(yīng)45分鐘。關(guān)于U2(序列號2)和L6(序列號13)、U3(序列號3)和L5(序列號12)、U4(序列號4)和L4(序列號11)、U5(序列號5)和L3(序列號10)、U6(序列號6)和L2(序列號9)、U7(序列號7)和L1(序列號8)也同樣地進(jìn)行。將上述7個反應(yīng)液集中到一起，進(jìn)行乙醇沉淀而回收DNA。將其溶解到80μl的100mmolTris/HCl(pH7.6)、6.5mmolMgCl2、300mmolNaCl中。將其中的40μl在95℃放置5分鐘后，經(jīng)30分鐘使溫度降到43℃。冰冷卻后添加40μl的連接液B(寶酒造(株式會社))，在26℃放置15分鐘。將該試樣供給5％聚丙烯酰胺電泳。電泳后用自動X射線照像術(shù)檢測已連接的DNA片段。從凝膠中提取相應(yīng)約280bp的DNA片段后，按照常規(guī)方法進(jìn)行精制。實施例2βGal-139S(FM)PPH84表達(dá)質(zhì)粒pGP#19的制作在含有合成hProPTH(1-84)基因的約280bp的DNA片段中，在5’末端存在限制性內(nèi)切酶EcoRI部位，在3’末端存在限制性內(nèi)切酶SalI部位。在pG210ShCT[G]的EcoRI/SalI部位插入該EcoRI/SalIDNA片段進(jìn)行hProPTH(1-84)基因的克隆。用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI切斷pG210ShCT[G]后，調(diào)制成含載體部分的約3.5KbDNA片段。將其與由實施例1得到的約280bp組成的hProPTH(1-84)基因的DNA片段連接，得到質(zhì)粒pG210ShProPTH(圖3)。用pG210ShProPTH使大腸桿菌JM109株進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到JM109[pG210ShProPTH]。再在pG210ShProPTH的限制性內(nèi)切酶XhoI/EcoRI部位導(dǎo)入接頭KM091(序列號15)和KM092(序列號16)，制成質(zhì)粒pG210S(S/X)(圖3)。再者，該接頭在兩端保持限制性內(nèi)切酶XhoI和EcoRI部位，在其中間保持SacI部位。pG210S(S/X)用限制性內(nèi)切酶SacI和XhoI消化后，使用Kilo-測序用Deletion試劑盒(寶酒造(株式會社；)，使編碼βGal-210的DNA領(lǐng)域隨時間變化且特異地進(jìn)行缺失。以Klenow片段進(jìn)行末端修復(fù)后，進(jìn)行細(xì)胞連接，得到編碼嵌合蛋白質(zhì)βGal-139S(FM)PPH84的質(zhì)粒pGP#19(圖4)，所述的嵌合蛋白質(zhì)是通過Phe-Met將βGal-139S和hProPTH(1-84)連接的嵌合蛋白質(zhì)。將導(dǎo)入pG#19的大腸桿菌JM109株稱作JM109[pGP#19]。實施例3βGal-117SmHPPH34表達(dá)質(zhì)粒pG117SmHPPH34的制作在本實施例中，雖然例舉出βGal-117SmHPPH34表達(dá)質(zhì)粒pG117SmHPPH34的制作，但通過使用βGal-97S或βGal-139S轉(zhuǎn)變成βGal-117S，能夠制作βGal-97SmHPPH34表達(dá)質(zhì)粒pG139SmHPPH34。1)pG#19PPH34的制作pG#19PPH34的制作過程是，在模板上以S01(序列號17)和S02(序列號18)作為引物，利用PCR法將hPTH(1-84)的35位的纈氨酸殘基的密碼GTT轉(zhuǎn)換成翻譯停止密碼TAA的DNA片段擴(kuò)增后，按照常規(guī)方法將限制性內(nèi)切酶AatII-SalIDNA片段離析精制，與對應(yīng)pGP#19的對應(yīng)部分交換而制成pGP#19PPH34(圖5)。2)pG117SPPH34的制作在模板上以S03(序列號19)和S05(序列號20)作為引物、利用PCR法將pG210(S/X)擴(kuò)增后，以限制性內(nèi)切酶PVuI和SmaI消化形成DNA片段，在模板上以S07(序列號21)和S02作為引物、利用PCR法將pGP#19PPH34擴(kuò)增后，以限制性內(nèi)切酶SalI和SmaI消化形成DNA片段，用T4連接酶將上述兩個DNA片段和包含pGP#19PPH34的復(fù)制開始起點的限制性內(nèi)切酶PvuI-SalIDNA片段連接，就制成pG117SPPH34(圖6-7)。3)pG117SmHPPH34(m＝4或8)的制作在pG117SPPH34的限制性內(nèi)切酶SmaI部位插入編碼(His)4-Pro-Gly的接頭S08(序列號22)和S09(序列號23)、編碼{(His)4-Pro-Gly}2的接頭S10(序列號24)和S11(序列號25)制成pG117SmHPPH34(m＝4或8)。通過變化接頭的長度可以制作m＝12、16或24的質(zhì)粒(圖6-7)。再有，在pG117SPPH34的限制性內(nèi)切酶SmaI部位插入編碼(Lys)4-Pro-Gly的接頭S12(序列號26)和S13(序列號27)，制成pG117S4KPH34。同樣進(jìn)行能夠制成pG97S4KPH34、pG139S4KPPH34。另外，所插入的接頭數(shù)目和方向，在調(diào)制質(zhì)粒后，決定DNA堿基序列后來確認(rèn)，在本實施例中將制成的嵌合蛋白質(zhì)示于表1中。表1表中，H表示組氨酸殘基，K表示賴氨酸殘基、數(shù)字各表示氨基酸數(shù)目。實施例4hPTH(1-34)嵌合蛋白質(zhì)的生產(chǎn)使用SDS-PAGE調(diào)查了表1所示的嵌合蛋白質(zhì)的生產(chǎn)率。將16個含有編碼表1所示嵌合蛋白質(zhì)的基因的質(zhì)粒分別導(dǎo)入大腸桿菌JM109株中，在2ml的SB培養(yǎng)基上于37℃在試管內(nèi)振動培養(yǎng)16小時后，用生理鹽水稀釋，使培養(yǎng)液濁度(OD660)達(dá)到10。向100μl該懸浮液中添加同量的SDS試樣緩沖劑，煮沸3分鐘，使用其10μl上清液進(jìn)行SDS-PAGE，比較每個菌體的嵌合蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。結(jié)果示于圖8中。結(jié)果表明，通過β-半乳糖苷酶衍生物和組氨酸殘基數(shù)的組合變化表達(dá)量，βGal-97S，在{(His)4-Pro-Gly}n中，n＝2.3，βGal-117S，n＝1、2、3、4、6，βGal-139S，n＝2.3獲得高產(chǎn)量。尤其，在βGal-117S的衍生物中，由于導(dǎo)入{(His)4-Pro-Gly}n(n＝1-6)，表達(dá)量顯著增加，它們的產(chǎn)量更多利用賴氨酸殘基單獨(dú)改變電荷。實施例5從嵌合蛋白質(zhì)中切出hPTH(1-34)關(guān)于高產(chǎn)量的嵌合蛋白質(zhì)(βGal-97SmHPPH34(n＝12)、βGal-117SmHPPH34(m＝0、4、8、12、16、24)、βGal-139SmHPPH34(m＝0、12)；控制m＝0)，為了調(diào)查作為Kex2-660的底物的適用性，回收嵌合蛋白質(zhì)包涵體，以8mol尿素溶解后，進(jìn)行稀釋以形成反應(yīng)液組成(20mmolTris/HCl(pH8.2)、100mmolNaCl、3.0mol尿素、2.0mmolCaCl2、8ml/ml嵌合蛋白質(zhì))，添加Kex2-660，使終濃度成為20kU/ml，進(jìn)行hPTH(1-34)的切出。在本條件下，在1小時控制的βGal-117SPPH3490％以上被切斷。各衍生物的Kex2-660反應(yīng)性根據(jù)與pG117SPPH34的Kcat的比示于圖9中。以“基本的實驗操作”所示的方法進(jìn)行hPTH(1-34)的定量。該結(jié)果表明，在所有的實施的例子中，由于導(dǎo)入{(His)4-Pro-Gly}nKex2-660的反應(yīng)性也得到改善。尤其，βGal-117S4HPPH34插入1個(His)4-Pro-Gly接頭，嵌合蛋白質(zhì)的產(chǎn)量和Kex2-660的反應(yīng)性被改善，而且還知道，βGal-139SPPH34的15g/L以上與8g/L相比，Kex2反應(yīng)條件下的溶解度也得到改善。實施例6hPTH(1-34)的大量生產(chǎn)為了大量地得到高表達(dá)而且也適合作為Kex2-660的底物的嵌合蛋白質(zhì)βGal-117S4HPPH34，以具有編碼本嵌合蛋白質(zhì)的基因的質(zhì)粒pG117S4HPPH34使大腸桿菌M25株(W3110/ompT)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到M25[pG117S4HPPH34]株。使用由2％(W/V)酵母提取物、1％(W/V)胰化胨、1.2％(W/V)K2HPO4、0.3％(W/V)KH2PO4、0.5％(W/V)甘油組成的培養(yǎng)基，在20L培養(yǎng)槽中在37℃進(jìn)行培養(yǎng)。菌體濃度，在OD660＝1.0時，添加IPTG(異丙基β硫代半乳糖苷)，使最溶濃度達(dá)到1mmol，繼續(xù)培養(yǎng)至菌體濃度OD660＝12。集中菌體后，懸浮在TE(10mmolTris/HCl、1mmolEDTA(pH8.0)中，用高壓勻漿器(Manton-Gaullin)被碎菌體后，離心分離所得到的勻漿產(chǎn)物，得到含有嵌合蛋白質(zhì)的沉淀，接著用TE和去離子水洗凈該沉淀。這樣，從20L的培養(yǎng)物中得到含有嵌合蛋白質(zhì)的包涵體100g。向250ml包涵體懸浮液(160g/L)中添加1molTris/HCl(pH8.2)100ml、5molNaCl50ml、去離子水500ml、尿素900g，在30℃的恒溫槽中進(jìn)行30分鐘攪拌溶解，用溫去離子水稀釋，在30℃形成5L。一面攪拌，一面向其中平穩(wěn)地添加250mmolCaCl2溶液500ml，再以Kex2-660形成20kU/ml添加Kex2-660。2小時后，(切斷效率90％以上)用乙酸調(diào)節(jié)至pH6.4，再用去離子水稀釋至2倍，使未反應(yīng)嵌合蛋白質(zhì)和保護(hù)肽凝聚而沉淀。通過離心分離得到含有hPTH(1-34)的上清液，用乙酸調(diào)節(jié)至pH5.0，通過以10mmol乙酸鈉緩沖液平衡的陽離子交換樹脂(SPトヨパ-ル)柱，吸附hPTH(1-34)，用0.4molNaCl使hPTH(1-34)洗脫出。向其中使最終形成3％(V/V)那樣添加乙酸，通過以3％(V/V)乙酸平衡化的低壓逆相柱(SodenODS-W)，吸附hPTH(1-34)，用含乙酸的30％(V/V)乙腈溶液洗脫出hPTH(1-34)。在減壓下除去乙腈，用0.22μm的膜濾器進(jìn)行過濾，逆相HPLC分離柱(TSKgelODS120Tφ55×600)進(jìn)行精制。以乙腈的直線濃度梯度(A5％(V/V)乙酸/10％(V/V)乙腈；B5％(V/V)乙酸/40％(V/V)乙腈；％B＝20％→80％/60分、流速40ml/min)進(jìn)行洗脫。各過程的hPTH(1-34)的回收率示于表2中。表2<tablesid="table2"num="002"><tablewidth="898">過程名稱PTH量(g)回收率(％)Kex2-660反應(yīng)7.0100酸沉淀上清液6.795陽離子交換柱6.085低壓逆相柱5.882HPLC4.07</table></tables>實施例7嵌合蛋白質(zhì)的Kex2-660識別部位P3的氨基酸取代為了將P3部位的氨基酸(Lys)轉(zhuǎn)換成其他的氨基酸，合成已轉(zhuǎn)換對應(yīng)P3部位的密碼的多核苷酸S14-S18(序列號28-32)，以它們和S02(序列號18)作為引物，以pG117S4HPPH34作為模板，用PCR法合成DNA片段。用乙醇沉淀法精制該DNA片段，以StuI和SalI切斷后，進(jìn)行2.0％(W/V)瓊脂糖電泳，將作為目的的0.4Kbp的StuI-SalI片段精制。接著，將該DNA片段和將以StuI和SalI消化、進(jìn)行同樣的精制的pG17S4HPPH34的β-半乳糖苷酶部分編碼的DNA片段供給連接反應(yīng)。反應(yīng)后，使大腸桿菌JM109株進(jìn)行轉(zhuǎn)化。每個組合選擇10個四環(huán)素耐性克隆，利用DNA序列決定分析來自這些克隆的質(zhì)粒，得到作為目的表達(dá)的載體。即得到下述的嵌合蛋白質(zhì)βGal-117S4HVXPH34的表達(dá)pG117S4HVXPH34，所述的蛋白質(zhì)保持pG117S4HPPH34的編碼嵌合蛋白質(zhì)的Kex2-660識別部位Ser-Val-Lys-Lys-Arg被Ser-Val-X-Lys-Arg(X＝Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Asp、Glu、Asn、Gln、Lys、Arg、Phe、Tyr、Trp、His、Pro)取代的氨基酸序列。為了調(diào)查各嵌合蛋白質(zhì)和Kex2-660反應(yīng)性，在50ml的SB培養(yǎng)基中培養(yǎng)各克隆，在菌體濃度OD660＝1.0時，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，再繼續(xù)培養(yǎng)4小時，然后收集菌體，進(jìn)行TE緩沖液洗凈、懸浮、破碎、離心分離，得到包涵體。再用1％(W/V)TritonX100、10mmolEDTA和TE洗凈，得到精制的包涵體。在該包涵體中包含的肽成分的90％以上是作為目的的嵌合蛋白質(zhì)。向各嵌合蛋白質(zhì)的包涵體懸浮液中添加1molTrIs/HCl(pH8.2)20μl、5molNaCl20μl、10mol尿素300μl，溶解包涵體用650μ去離子水稀釋后，在30℃的恒溫槽中保溫10分鐘，向其中添加250mmolCaCl2溶液10μl，再形成20kU/ml那樣添加Kex2-660。在此條件下，在1小時對照的βGal-117SPPH34，90％以上被切斷。hPH(1-34)的生成，以使用上述的ODS柱的HPLC進(jìn)行定量。各衍生物的Kex2-660反應(yīng)性，以與pG117S4HPPH34的Kcat之比表示(圖10)。在X＝Phe、His時，由Kex2-660引起的hPTH(1-34)的切出效率良好，在X＝Pro時，幾乎沒有看到由Kex2-660引起的切出。實施例8嵌合蛋白量的Kex2-660識別部位P4的氨基酸取代從實施例7的結(jié)果以及因為切斷時的副產(chǎn)物少，所以選擇在P3部位保持組氨酸殘基的嵌合蛋白質(zhì)βGal-117S4HVHPH34作為用于生產(chǎn)hPTH(1-34)的嵌合蛋白質(zhì)，試驗由P4部位的氨基酸取代而引起的Kex2-660反應(yīng)性的提高。合成多核苷酸S19-S24(序列號33-38)，以它們和S02作為引物，以pG117S4HVHPH34作為模板，按照PCR法合成導(dǎo)入變異的DNA質(zhì)粒。按照實施例7所示方法，得到下述的嵌合蛋白質(zhì)βGal-117S4HXHPH34的表達(dá)載體pG117S4HXHPH34，所述的嵌合蛋白質(zhì)保持嵌合蛋白質(zhì)的Kex2-660識別部位Ser-Val-His-Lys-Arg被Ser-X-His-Lys-Arg(X＝Gly、Ala、Leu、Ile、Ser、Thr、Asp、Glu、Asn、Gln、Lys、Arg、Cys、Met、Phe、Tyr、Trp、His、Pro、Val)取代的結(jié)構(gòu)。以該嵌合蛋白質(zhì)作為底物，以和實施例6相同的條件，判斷對Kex2-660的感受性。在X＝Lys、Arg時，由Kex2-660引起為hPTH(1-34)的切出效率變好，在X是酸性氨基酸(Asp、Glu)時，幾乎看不到由Kex2-660引起的hPTH(1-34的切斷(圖11)。由此初次清楚，Kex2-660蛋白酶不僅在P1部位要求精氨酸殘基，在P2部位要求強(qiáng)堿性氨基酸或脯氨酸殘基，而且在P3部位希望是組氨酸殘基或苯丙氨酸殘基，在P4部位是強(qiáng)堿性氨基酸，以及如果在P3部位有丙氨酸殘基，或者在P4部位有酸性氨基酸，就極端地降低嵌合蛋白質(zhì)的切斷活性。實施例9保護(hù)肽的Kex2-660切斷部位的除去隨時間變化對實施例7和8中的Kex2-660切斷反應(yīng)追蹤的結(jié)果表明，保護(hù)肽βGal-117S的13、14位的Arg-Arg序列的C末端的肽鍵已切斷。預(yù)料在利用酸性沉淀進(jìn)行精制時混入由此產(chǎn)生的βGal(1-14)。因此，將14位的Arg取代成Lys，抑制由Kex2-660引起的切斷，抑制βGal(1-14)的生成。像以下那樣制作編碼14位的Arg被Lys取代的嵌合蛋白質(zhì)(βGal-117KS4HRHPH34)的質(zhì)粒pGKSPH34(圖12)。首先，以低聚核苷酸S25(序列號39)和S26(序列號40)作為引物，以pG117S4HRHPH34作為模板，用PCR法合成導(dǎo)入變異的DNA片段、AseI-RK。同樣以低聚核苷酸S27(序列號41)和S28(序列號42)作為引物，合成DNA片段、RK-BglII。將各DNA片段精制，分別各混合約1ng，在引物不存下進(jìn)行4次PCR，合成導(dǎo)入變異的AseI-BglII質(zhì)粒。向其中再添加低聚核苷酸S25和S28，繼續(xù)PCR，將同一質(zhì)粒擴(kuò)增。用乙醇沉淀法精制該質(zhì)粒，以AseI和BglII切斷后，進(jìn)行2.0％(W/V)瓊脂糖電泳，調(diào)制成作為目的的0.35Kbp的片段。將pG117S4HRHPH34的AseI/SphI(1.8Kbp)片段和SphI/BglII(1.4kbp)片段進(jìn)行1.0％(W/V)瓊脂糖電泳，并進(jìn)行精制。在上述3個片段進(jìn)行連接反應(yīng)后，使大腸桿菌JM109進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到耐四環(huán)素菌株，用堿性法調(diào)制質(zhì)粒后，解析變異導(dǎo)入部分的DNA堿基序列，選擇保持下述質(zhì)粒pGKSPH34的目的克隆，所述質(zhì)粒包含編碼保護(hù)肽14位的Arg的DNA序列CGG被AAG取代的基因。以實施例5所示的方法，得到嵌合蛋白質(zhì)的包涵體，Kex2-660反應(yīng)的結(jié)果表明，通過上述取代基本能完全抑制保護(hù)肽的切斷，能減輕精制工序的負(fù)擔(dān)。實施例10嵌合蛋白質(zhì)βGal-117KS4HRHPH34的大量調(diào)制和hPTH(1-34)的生產(chǎn)以試管規(guī)模被認(rèn)為最適合作為Kex2-660的底物的嵌合蛋白質(zhì)Gal-117KS4HRHPH34在大量培養(yǎng)條件下的生產(chǎn)率和利用Kex2-660蛋白酶的切出，以及進(jìn)行hPTH(1-34)的精制。用pGKSPH34進(jìn)行大腸桿菌M25株的轉(zhuǎn)化，得到耐四環(huán)素菌株，制成生產(chǎn)菌株M25][pGKSPH34]。將M25[pGKSPH34]株在包含2％(W/V)葡萄糖的NU1培養(yǎng)基中進(jìn)行大量培養(yǎng)。消耗葡萄糖后，作為碳源供給甘油，邊調(diào)整到pH7.0，邊培養(yǎng)24小時。最終達(dá)到的菌體濃度是150-200OD。該嵌合蛋白質(zhì)即使在大量培養(yǎng)條件下也顯示穩(wěn)定的生產(chǎn)率，盡管大量表達(dá)，也未出現(xiàn)顯著地妨礙宿主大腸桿菌的生育。包涵體產(chǎn)量是約5g/L培養(yǎng)基。用TE和去離子水洗凈菌體破碎后的不溶性級分后，得到精制的包涵體。用尿素進(jìn)行可溶化后進(jìn)行稀釋，以20mmolTris/HCl(pH8.2)、50mmolNaCl、2.5mmolCaCl、2.7mol尿素、8.0mg/ml嵌合蛋白質(zhì)作為反應(yīng)液組成，在30℃反應(yīng)溫度，使成為5kU/ml地添加Kex2-660，進(jìn)行從嵌合蛋白質(zhì)中切出hPTH(1-34)，對hPTH(1-34)的生成進(jìn)行定量。在30分鐘，切斷率達(dá)到90％以上，與βGal-117S4HPH34相比，Kex2-660量減少到1/4。反應(yīng)終了后，hPTH(1-34)進(jìn)行與實施例5相同地精制。精制工序的回收率與實施例5大體相同。實施例11βGal-117S4HGP生產(chǎn)質(zhì)粒、pG117S4HGP的制作生產(chǎn)包含胰高血糖素樣的肽I(hGLP-I(7-37))的嵌合蛋白質(zhì)(βGal-117S4HGP)的質(zhì)粒、pG117S4HGP按以下序列制作。首先，合成如圖4所示的4種DNA(GLP-1(序列號43)、GLP-2(序列號44)、GLP-3(序列號45)、GLP-4(序列號46)，使用多核苷酸磷酸化酶將它們5’末端磷酸化后，將它們混合，進(jìn)行退火，調(diào)制成HGLP-1(7-37)基因(DNA(I))。另一方面，圖14(b)所示的2種合成DNA(117S4HSphI引物(序列號47)、117S4HBg1II引物(序列號48)作為RCR引物使用，以pGKSPH34作為模板進(jìn)行PCR。得到的PCR產(chǎn)物以BglII和SphI消化，調(diào)制成保持BglII和SphI的粘附末端的DNA片段(DNA(II))。接著，以BglII和SalI消化pGKSPH34后，進(jìn)行1％瓊脂糖電泳，用凝膠回收大的一方的DNA片段(DNA(III))。用T4DNA連接酶連接如此得到的DNA(I)、DNA(II)和DNA(III)，制作成pG117S4HGP(圖15)。實施例12嵌合蛋白質(zhì)βGal-117S4HGP的生產(chǎn)在32℃、在含有1.5％葡萄糖、4g/LK2HPO4、4g/LKH2PO4、2.7g/LNa2HPO4、0.2g/LNH4Cl、1.2g/L(NH4)2)SO4、4g/L酵母提取物、2g/LL-甲硫氨酸、2g/LMgSO4·7H2O、40mg/LCaCl2·2H2O、40mg/LFeSO4·7H2O、10mg/LMnSO4·nH2O、10mg/LAlCl3·H2O、4mg/LCoCl2·6H2O、2mg/LZnSO4·7H2O、2mg/LNaMoO4·2H2O、1mg/LCuCl2·2H2O、0.5mg/LH3BO4、10mg/L四環(huán)素的培養(yǎng)基中、以pH7.0培養(yǎng)具有已制成的pG117S4HGP的大腸桿菌W3110M25株，葡萄糖枯竭后，以甘油作為碳源，在37℃再培養(yǎng)8小時，使在菌體內(nèi)產(chǎn)生βGal-117S4HGP的包涵體。培養(yǎng)終了后，使用マントンゴリ勻漿器(マントンゴリ公司制，型號15M-8tA)、在600KG/cm2的條例上處理培養(yǎng)液，通過離心分離(CEPA離心分離機(jī))回收沉淀級分。將得到的沉淀懸浮在與培養(yǎng)液等量的緩沖液(10mmolTris-HCl(pH8.0)、1mmolEDTA)中后，再次以離心分離回收沉淀，懸浮在與培養(yǎng)液等量的去離子水中。然后，再進(jìn)行離心分離，回收沉淀后，懸浮于與沉淀等量的去離子水中，用于以后的操作。實施例13從嵌合蛋白質(zhì)中切出hGLP-1(7-37)回收以實施例12得到的嵌合蛋白質(zhì)包涵體，以8mol尿素溶解后進(jìn)行稀釋，以形成反應(yīng)組成(20mmolTris-HCl(pH8.2)、100mmolNaCl、3.0mol尿素、2.0mmolCaCl2、8mg/ml嵌合蛋白質(zhì))，以10000U/ml添加Kex2-660，進(jìn)行hGLP-1(7-37)的切出。在此條件下，在1小時控制的βGal-117S4HGP，90％以上被切斷。實施例14hGLP-1(7-37)的均分(圖16、表3)為了大量得到高表達(dá)而且也適合作為Kex2-660的底物的嵌合蛋白質(zhì)βGal-117S4HGP，用編碼該嵌合蛋白質(zhì)的質(zhì)粒pG117S4HGP進(jìn)行大腸桿菌M25(W3110/ompT)的轉(zhuǎn)化，在20L培養(yǎng)槽中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基由酵母提取物20g/L、細(xì)菌胰化胨10g/L、K2HPO412g/L、KH2PO43g/L、甘油5g/L組成，在菌體濃度是OD660＝1.0，添加IPTG(異丙基β硫代半乳糖苷，使最終濃度成為1mmol。使用消泡劑(デイスフオムCC-222，(株式會社)日本油脂)。在37℃繼續(xù)培養(yǎng)至菌體濃度OD60＝12。集中菌體后，懸浮在TE(10mmolTris/HCl、1mmolEDTApH8.0)中，用高壓勻漿器(Manton-Gaulline)破碎菌體，離心分離得到的勻漿產(chǎn)物，得到含有嵌合蛋白質(zhì)的沉淀，接著用TE和去離子水洗凈該沉淀。這樣從20L的培養(yǎng)物中得到約100g含有嵌合蛋白質(zhì)的包涵體。向250ml包涵體懸浮液(160g/L)中添加1molTirs/HCl(pH8.2)100ml、5molNaCl溶液50ml、去離子水500ml、尿素900g，在30℃的恒溫槽中進(jìn)行30分鐘攪拌溶解，用溫去離子水稀釋，在30℃形成5L。邊攪拌邊緩慢地向其中添加250mmolCaCl2溶液50ml，再形成20000單位/ml(約4.0mg/L)地添加Kex2-660。2小時后，(切斷率90％以上)用乙酸調(diào)整至pH6.4，再用去離子水稀釋至2倍，使未反應(yīng)嵌合蛋白質(zhì)和保護(hù)肽凝集沉淀。用離心分離得到含hGLP-1(7-37)的上清液，用乙酸調(diào)整至pH5.0，通過用2mol尿素·10mmol乙酸鈉緩沖液(pH5.0)平衡化的陽離子交換樹脂(SPトヨパ-ル)柱，吸附hGLP-1(7-37)，用2mol尿素·10mmol乙酸鈉緩沖液(pH6.2)洗凈后，以0mol至300mmol的氯化鈉濃度梯度洗脫hGLP-1(7-37)。預(yù)先在級分管中放入乙酸，最終形成3％，抑制hGLP-1(7-37)的凝集。集中含有hGLP-7(7-37)的級分，通過以5％乙酸平衡化的低壓逆相柱(SokenODS-W)，吸附hGLP-1(7-37)，用含5％乙酸的50％乙腈溶液洗脫hGLP-1(7-37)。在減壓下除去乙腈，用0.22μm的磨濾器過濾后，進(jìn)行凍結(jié)干燥。以下詳述hGLP-1(7-37)的定量。以試樣緩沖劑(1mol乙酸/2mol尿素)將含有hGLP-1(7-37)的溶液從10倍稀釋至20倍，得到離心上清液。在HPLC(島津LC10A)中接續(xù)YMC-C8-A302)4.6mmI.D.×150mm)柱，用A液(0.1％TFA/10％乙腈)、B液(0.094％TFA/60％乙腈)、B40％→80％/20min梯度的體系將該上清液的10μl至20μ展開，從以220nm的吸光度測定檢測的hGLP-1(7-37)與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)hGLP-1(7-37)的峰面積比進(jìn)行定量?；厥章适居诒?中。表3hGLP-1(7-37)回收率工序名稱容積/[l]hGLP-1/[g]回收率/[％]Kex2-6604.04.8100酸沉淀上清液7.83.368陽離子交換柱0.52.860低壓逆相柱2.040序列表序列號1序列長40序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列AATTCATGAAATCTGTTAAAAAGCGTTCTGTTTCTGAAAT序列號2序列長41序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列TCAGCTGATGCATAACCTGGGCAAACACCTGAATAGCATGG序列號3序列長41序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列AACGCGTCGAGTGGCTGCGTAAGAAACTGCAGGACGTCCAC序列號4序列長41序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列AACTTCGTTGCGCTGGGTGCACCGCTGGCTCCACGTGATGC序列號5序列長39序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列AGGATCCCAACGTCCGCGTAAGAAAGAAGATAACGTACT序列號6序列長40序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列GGTTGAATCTCATGAGAAATCCCTGGGCGAAGCTGACAAA序列號7序列長40序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列GCCGATGTTAACGTGCTGACCAAAGCGAAAAGCCAGTAAG序列號8序列長33序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列TCGACTTACTGGCTTTTCGCTTTGGTCAGCACG序列號9序列長40序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列TTAACATCGGCTTTGTCAGCTTCGCCCAGGGATTTCTCAT序列號10序列長40序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列GAGATTCAACCAGTACGTTATCTTCTTTCTTACGCGGACG序列號11序列長41序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀順序種類合成DNA序列TTGGGATCCTGCATCACGTGGAGCCAGCGGTGCACCCAGCG序列號12序列長41序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列CAACGAAGTTGTGGACGTCCTGCAGTTTCTTACGCAGCCAC序列號13序列長41序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列TCGACGCGTTCCATGCTATTCAGGTGTTTGCCCAGGTTATG序列號14序列長46序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列CATCAGCTGAATTTGAGAAACAGAACGCTTTTTAACAGATTTCATG序列號15序列長24序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列TCGAGGTCGACGGTACCGAGCTCG序列號16序列長24序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列AATTCGAGCTCGGTACCGTCGACC序列號17序列長45序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列AAACTGCAGGACGTCCACAACTTCTAAGCGCTGGGTGCACCGCGT序列號18序列長24序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列CATTAAAGCTTTGCGATGATAAGC序列號19序列長26序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列CGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTT序列號20序列長35序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列TTTCCCGGGCCTCCGTGGGAACAAACGGCGGATTG序列號21序列長42序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列TTTCCCGGGAGGCCTTCTGTTAAAAAGCGGTCTGTTTCTGAA序列號22序列長18序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列CACCATCATCACCCTGGA序列號23序列長18序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列TCCAGGGTGATGATGGTG序列號24序列長36序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列CACCACCATCATCCTGGACACCATCATCACCCTGGA序列號25序列長36序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列TCCAGGGTGATGATGGTGTCCAGGATGATGGTGGTG序列號26序列長18序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列AAGAAGAAGAAGCCTGGA序列號27序列長18序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列TCCGGACTTCTTCTTCTT序列號28序列長36序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列GGGAGGCCTTCTGTTNCAAAGCTTTCTGTTTCTGAA序列號29序列長36序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列GGGAGGCCTTCTGTTNATAAGCTTTCTGTTTCTGAA序列號30序列長36序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列GGGAGGCCTTCTGTTNTTAAGCTTTCTGTTTCTGAA序列號31序列長36序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列GGGAGGCCTTCTGTTBGGAAGCTTTCTGTTTCTGAA序列號32序列長36序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列GGGAGGCCTTCTGTTSAAAAGCTTTCTGTTTCTGAA序列號33序列長33序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列GGGAGGCCTTCTADTCATAAGCTTTCTGTTTCT序列號34序列長33序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列GGGAGGCCTTCTAHGCATAAGCTTTCTGTTTCT序列號35序列長33序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列GGGAGGCCTTCTGHGCATAAGCTTTCTGTTTCT序列號36序列長33序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列GGGAGGCCTTCTTKKCATAAGCTTTCTGTTTCT序列號37序列長34序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列GGGAGGCCTTCTCVACATAAGCTTTCTGTTTCTG序列號38序列長34序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列GGGAGGCCTTCTBATCATAAGCTTTCTGTTTCTG序列號39序列長27序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列AATTAATGTGAGTTAGCTCACCATTAG序列號40序列長24序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列ATCCCAGTCTTTAGCTTGTAAAAC序列號41序列長24序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列GTTTTACAACGTAAAGACTGGGAT序列號42序列長31序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列TTTAGATCTGACTCCAGCAAGCTGTCCGGCA序列號43序列長57序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列CGGAAGGTACCTTTACCAGCGATGTGAGCTCGTATCTGGAAGGTCAGGCGGCAAAAG序列號44序列長48序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列ACCTTCCAGATACGAGCTCACATCGCTGGTAAAGGTACCTTCCGCATG序列號45序列長36序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列AATTCATCGCGTGGCTGGTGAAAGGCCGTGGTTAAG序列號46序列長53序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列TCGACTTAACCACGGCCTTTCACCAGCCACGCGATGAATTCTTTTGCCGCCTG序列號47序列長38序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列TGAATTTCAGAAGCATGCCGCTTATGTCGAGAAGGCCT序列號48序列長24序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序順種類合成DNA序列GACTCAGATCTTCCTGAGGCCGAT權(quán)利要求1.由下式表示的嵌合蛋白質(zhì)，A-L-B式中，A是保護(hù)肽；B是目的肽；L是接頭肽，在其C末端部分具有序列X1-X2-(Pro、Lys或Arg)-Arg(式中，X1和X2是任意的氨基酸)，而且在N末端具有富有His的部分。2.權(quán)利要求1所述的嵌合蛋白質(zhì)，其中，上述N末端的富有His的部分具有序列[(His)4-Pro-Gly]n(式中，n是1-6)。3.權(quán)利要求1或2所述的嵌合蛋白質(zhì)，其中，在上述N末端部分的氨基酸序列和上述C末端部分的氨基酸序列之間存在1-5個任意的氨基酸。4.權(quán)利要求1-3中任一項所述的嵌合蛋白質(zhì)，其中，X1是Arg、Lys或His，而X2是His或Phe。5.權(quán)利要求1-4中任一項所述的嵌合蛋白質(zhì)，其中，A是不含氨基酸序列Pro-Arg、Arg-Arg和Lys-Arg的多肽。6.權(quán)利要求1-4中任一項所述的嵌合蛋白質(zhì)，其中，A是含有氨基酸序列Pro-Arg、Arg-Arg或Lys-Arg的多肽的場合時，該氨基酸序列中至少一種氨基酸被其他氨基酸取代，以便在A中不含有該氨基酸序列。7.權(quán)利要求1-6中任一項所述的嵌合蛋白質(zhì)，其中，A是220氨基酸殘基以下的多肽。8.權(quán)利要求7所述的嵌合蛋白質(zhì)，其中，A是來自大腸桿菌的β-半乳糖苷酶的N末端側(cè)的1位氨基酸至97位、117位或139位氨基酸的肽。9.權(quán)利要求1-8中任一項所述的嵌合蛋白質(zhì)，其中，A中的半胱氨酸殘基被其他氨基酸取代。10.權(quán)利要求9所述的嵌合蛋白質(zhì)，其中，上述其他氨基酸是絲氨酸殘基。11.權(quán)利要求1所述的嵌合蛋白質(zhì)，其中，B是人副甲狀腺激素或其衍生物。12.權(quán)利要求11所述的嵌合蛋白質(zhì)，其中，上述人副甲狀腺激素衍生物是具有從天然的人副甲狀腺激素的N末端的1位或3位氨基酸殘基至31位、34位、37位、38位或84位氨基酸殘基的序列的片斷，或者是在它們的C末端附加Gly的片段。13.權(quán)利要求1所述的嵌合蛋白質(zhì)，其中，B是GLIP-1或其衍生物。14.權(quán)利要求1-13中任一項所述的嵌合蛋白質(zhì)的制造方法，其特征在于，以包含編碼該嵌合蛋白質(zhì)的DNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，培養(yǎng)所得到的轉(zhuǎn)化體，從該培養(yǎng)物中提取上述嵌合蛋白質(zhì)。15.目的肽(B)的制造方法，其特征在于，使加工酶作用于權(quán)利要求1-13中任一項所述的嵌合蛋白質(zhì)，切斷接頭肽(L)的C末端與目的肽(B)的N末端之間的肽鍵，得到目的肽(B)。16.權(quán)利要求15所述的方法，其特征是，上述的加工酶是Kex2蛋白酶、フリン(Furin)、前體轉(zhuǎn)變酶1/3(PC1/3)或者前體轉(zhuǎn)變酶2(PC2)、或者它們的衍生物。17.權(quán)利要求14-16中任一項所述的方法，其特征是，在得到目的肽(B)時使用等電點沉淀處理。全文摘要提供一種包含目的蛋白質(zhì)的嵌合蛋白質(zhì)，該嵌合蛋白質(zhì)利用加工酶能容易地開裂，能高效率地回收目的蛋白質(zhì)，是以下式表示的嵌合蛋白質(zhì)A-L-B。式中，A是保護(hù)肽，B是目的肽，L是接頭肽，在其C末端部分具有序列X1-X2-(Tro、Lys或Arg)-Arg(式中，X1和X2是任意的氨基酸)，而在N末端具有富有His的部分。文檔編號C07K14/635GK1167155SQ9710969公開日1997年12月10日申請日期1997年3月4日優(yōu)先權(quán)日1996年3月4日發(fā)明者鈴木雄司,孫田浩二,增田豐文申請人:三得利公司