專利名稱：一種分離氨基酸和多肽的介質(zhì)及其分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化學(xué)領(lǐng)域，提供了一種分離氨基酸和多肽介質(zhì)的制備方法及用于分離氨基酸和多肽的方法。
親和層析分離由于具有很高的特異性，良好的選擇性和極高的純化倍數(shù)，因此該技術(shù)發(fā)展十分迅速，廣泛應(yīng)用于生物工程對(duì)有機(jī)分子的純化分離。與本發(fā)明相近的用于蛋白質(zhì)水解液中氨基酸和多肽的分離技術(shù)，如日本專利公開(kāi)特許公報(bào)平3-282367(1991)和Analy tical Biochemistry雜志[97，367-375(1979)]公開(kāi)了一種改進(jìn)的在葡聚糖-銅介質(zhì)上分離氨基酸和多肽的方法。該方法可用于游離氨基酸的定量分析。所用介質(zhì)是在堿性條件下，使二價(jià)銅結(jié)合于葡聚糖上制成的。在分離過(guò)程中，介質(zhì)必須以堿性緩沖液平衡后，再以堿性緩沖液洗脫，繼之以鹽酸洗脫，才能使氨基酸與多肽完全分離。上述方法，處理量小，分離過(guò)程復(fù)雜。
本發(fā)明的目的是制備一種用于分離氨基酸和多肽的固定化金屬離子親和層析介質(zhì)，并利用該介質(zhì)對(duì)氨基酸酸和多肽進(jìn)行分離。該親和層析介質(zhì)中金屬離子結(jié)合牢固，不易流失，用于分離氨基酸和多肽的過(guò)程簡(jiǎn)單，處理量大。
本發(fā)明的分離氨基酸和多肽的親和層析介質(zhì)是采用高交聯(lián)度葡聚糖凝膠經(jīng)化學(xué)接枝后與二價(jià)金屬離子如Fe++，Cu++或Zn++進(jìn)行化學(xué)鍵合制備而成。具體地說(shuō)是按下步驟1.葡聚糖凝膠與環(huán)氧氯丙烷在堿性介質(zhì)(pH12～14)中進(jìn)行反應(yīng)得到環(huán)氧化葡聚糖凝膠；反應(yīng)溫度為20～40℃，進(jìn)行5～20小時(shí)。2.在上溶液中加緩沖液使pH為10～11，加亞氨基二乙酸(IDA)，得到IDA-葡聚糖凝膠。反應(yīng)于40～80℃下，進(jìn)行15～30小時(shí)。3.取上述凝膠裝柱，通入含F(xiàn)e++，Cu++或Zn++離子的水溶液進(jìn)行化學(xué)鍵合，反應(yīng)在20～30℃下進(jìn)行。即可得到本發(fā)明的親和層析介質(zhì)。
上述制備過(guò)程中，對(duì)于100g葡聚糖凝膠，步聚1中加入20～40ml環(huán)氧氯丙烷；步驟2中加入5～20g亞氨基二乙酸；步驟3中可用含金屬離子的鹽酸鹽、硫酸鹽或硝酸鹽，含金屬離子的濃度為20～50mM。此外，步驟1和2中可加入還原劑例如NaBH4，其加入量為0.1～0.5g。制備過(guò)程所用的堿性介質(zhì)可加入NaOH或KOH。緩沖溶液用Na2CO3-NaHCI3和硼砂-NaOH緩沖液。
利用本發(fā)明制備的親和層析介質(zhì)可以方便的分離氨基酸和多肽。具體作法是將含氨基酸和多肽的水溶液通過(guò)裝有上述介質(zhì)的層析柱。經(jīng)水洗脫、酸洗脫即可使氨基酸和多肽實(shí)現(xiàn)完全分離。該親和層析介質(zhì)經(jīng)水-酸洗脫后還可再生循環(huán)使用。
下面通過(guò)實(shí)例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)給予進(jìn)一步地說(shuō)明。
實(shí)施例1取經(jīng)水溶脹后的葡聚糖凝膠Sephadex G10(100g)，加2MNaOH(50ml)、環(huán)氧氯丙烷(5.0ml)和NaBH4(0.20g)，于室溫下攪拌反應(yīng)，并在2小時(shí)內(nèi)逐漸加入2MNaOH(50ml)和環(huán)氧氯丙烷(25ml)。攪拌過(guò)夜后，加2MNa2CO3-NaHCO3緩沖溶液(pH＝10.5，100ml)，亞氨基二乙酸(IDA，10g)和NaBH4(0.12g)，于60℃下攪拌反應(yīng)24小時(shí)后，用水→乙醇→水洗滌，得白色I(xiàn)DA-SephadexG10凝膠。取部分凝膠裝柱(高5.0cm，直徑2.0cm)后，加20mMCuSO4水溶液流過(guò)凝膠，直至白色凝膠全部轉(zhuǎn)變?yōu)樘焯m色，此即為固定化Cu2+親和層析介質(zhì)。介質(zhì)經(jīng)水充分淋洗平衡后，上氨基酸(L-Val.L-His.L-Tyr和L-Try混合物)與二肽(Tyr-Try肽)混合水溶液樣品2ml(～10ml)后，按30ml/h流速，先后以水和0.1MHCl水溶液洗脫。經(jīng)上述處理，氨基酸與二肽完全分離。
實(shí)施例2將用過(guò)30次的實(shí)施例1的層析介質(zhì)，經(jīng)0.1MHCl→水充分淋洗后，上貽貝的酶水解液2ml后，以30ml/h流速，先后以水和0.1MHCl水溶液洗脫，經(jīng)上述處理貽貝水解液中的氨基酸和多肽完全分離。洗脫液分別合并，濃縮析出，干燥后，得多肽54mg，復(fù)合氨基酸30mg。復(fù)合氨基酸為白色帶針狀結(jié)晶粉末，純度大于96.0％。
比較例1將葡聚糖Sephadex G25(10g)，于1.0MCuSO4水溶液中溶脹后，在攪拌下加1.0MNaOH使pH＝10，溶液由蘭綠色變?yōu)樘m色，再加硼砂-NaOH緩沖溶液(0.05M，pH＝10.5)，攪拌靜置，除去上清液，裝柱(高30cm，直徑1.5cm)，以硼砂-NaOH緩沖溶液平衡，上蛋白質(zhì)水解液1ml，以25ml/h流速，先后用硼砂-NaOH緩沖溶液(0.05M，pH＝10.5)和0.2MHCL水溶液洗脫。經(jīng)上處理蛋白質(zhì)水解液中的氨基酸和多肽完全分離。
由上述實(shí)例，本發(fā)明的分離氨基酸和多肽的介質(zhì)，其制備過(guò)程簡(jiǎn)單，金屬離子結(jié)合牢固，用于分離氨基酸和多肽的方法方便。介質(zhì)又可再生循環(huán)使用，用量小，處理量大，適于在生產(chǎn)中采用。
權(quán)利要求
1.一種用于分離氨基酸和多肽的親合層析介質(zhì)的制備方法，其特征在于是按下步驟1)葡聚糖凝膠與環(huán)氧氯丙烷在堿性介質(zhì)pH12～14中，于20～40℃，進(jìn)行5～20小時(shí)反應(yīng)制得環(huán)氧化葡聚糖凝膠；2)在上溶液中加入緩沖液使pH保持在10～11，加亞氨基二乙酸進(jìn)行化學(xué)接枝反應(yīng)，反應(yīng)溫度20～40℃，反應(yīng)時(shí)間為15～30小時(shí)；3)取2)的凝膠裝柱，通入含有Fe++，Cu++或Zn++離子的水溶液進(jìn)行化學(xué)鍵合，反應(yīng)在20～30℃下進(jìn)行，即可得到親合層析介質(zhì)。
2.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于對(duì)于100g葡聚糖凝膠反應(yīng)物，步驟1)中加入20～40ml環(huán)氧氯丙烷；步驟2)中加入5～20g亞氨基二乙酸；步驟3)中用含金屬離子的水溶液濃度為20～50mM。
3.按照權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于含金屬離子的水溶液用含金屬離子的鹽酸，硫坩或硝酸鹽水溶液。
4.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟1)和2中可加入還原劑NaBH4，其加入量對(duì)于100g葡聚糖凝膠步驟1)和2)中各為0.1～0.5g。
5.一種利用權(quán)利要求1所制備的親和層析介質(zhì)進(jìn)行分離氨基酸和多肽的方法，其特征在于洗脫過(guò)程采用水-酸洗脫。
6.按照權(quán)利要求5所述的分離方法，其特征在于酸洗脫過(guò)程采用稀鹽酸進(jìn)行。
全文摘要
一種分離氨基酸和多肽的親合層析介質(zhì)是葡聚糖與環(huán)氧氯丙烷及亞氨基二乙酸進(jìn)行化學(xué)接枝反應(yīng)后，再用含F(xiàn)e
文檔編號(hào)C07K1/22GK1163902SQ9611527
公開(kāi)日1997年11月5日 申請(qǐng)日期1996年4月30日 優(yōu)先權(quán)日1996年4月30日
發(fā)明者邵昌平, 劉宇新 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所