專利名稱：：來自殺菌性通透性增強蛋白的功能區(qū)的生物活性肽及其應(yīng)用的制作方法本申請是申請日為1994年1月14日的美國專利申請08/183,222的部分延續(xù)，申請08/183,222是申請日為1993年7月15日的美國專利申請08/093,202的部分延續(xù)，申請08/093,202是申請日為1993年3月12日的美國專利申請系列號No.08/030,644的部分延續(xù)。本發(fā)明涉及來自或基于殺菌性通透性增強蛋白質(zhì)多肽及其在治療上的應(yīng)用。殺菌性通透性增強蛋白質(zhì)(BPI)是從哺乳動物多形核嗜中性白細胞(PMNs)顆粒中分離出來的一種蛋白質(zhì)，PMNs是哺乳動物抵抗微生物入侵所必需的血細胞。經(jīng)酸提取并結(jié)合離子交換層析(Els-bach，1979，J.Biol.Chem.25411000)或E.coli親合層析(Weissetal.，1987，Blood69652)已從PMNs中分離出人BPI，并對廣譜革蘭氏陰性細菌具有明顯殺菌活性。人BPI分子量約為55,000道爾頓(55KD)。人BPI全部氨基酸序列以及編碼BPI的DNA核苷酸序列已由Grayetal.，1989，J.Biol.Chem.2649505闡明，此處引用以供參考(見Grayetal.圖1)。BPI的殺菌效力表現(xiàn)出對敏感的革蘭氏陰性菌具有高度特異性。BPI殺死革蘭氏陰性細胞的精確機制尚不清楚，但已知BPI必須先附著到敏感的革蘭氏陰性細菌表面。BPI與細菌的這種最初的結(jié)合涉及堿性(即帶正電荷)蛋白質(zhì)BPI與脂多糖(LPS)上帶負電荷的位點之間的靜電相互作用。LPS也稱作“內(nèi)毒素”，因為它具有刺激炎癥反應(yīng)的作用。BPI也能中和它所結(jié)合的LPS之內(nèi)毒素活性。由于BPI對革蘭氏陰性菌的殺菌特性和其結(jié)合并中和LPS的能力，BPI可用于治療由革蘭氏陰性細菌引起的哺乳動物疾病，包括敗血癥，內(nèi)毒素血癥和膿毒血癥。BPI的這些雙重特性使它對這類治療給藥特別有效并具優(yōu)勢。相應(yīng)于人BPI氨基末端部分的一段蛋白質(zhì)裂解片段具有天然來源的人55KD全蛋白的LPS結(jié)合和中和活性及抗菌活性。與氨基末端部分相反，分離的人BPI羧基末端區(qū)域僅表現(xiàn)出微量可測的抗菌活性(Ooietal.，1991，J.Exp.Med.174649)。用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)出含有人BPI全蛋白質(zhì)氨基末端前199個氨基酸殘基的23KD蛋白，命名為“rBPI23”(見Gazzano—Santoroetal.，1992，Infect.Immun.604754—4761)。rBPI23的人體臨床試驗已經(jīng)開始。當(dāng)rBPI23與LPS同時注射時，可顯著改善內(nèi)毒素的炎癥反應(yīng)。其它結(jié)合并中和內(nèi)毒素的多肽在本領(lǐng)域中是已知的。一個例子是來自鱟阿米巴狀細胞的鱟屬抗脂多糖因子(LALF)(Warrenetal.，1992，Imfect.Immunol.602506—2513)，另一個例子是來自多粘菌(Bacillaspolymyxa)稱為多粘菌素B1的環(huán)狀陰離子脂肽。多粘菌素B1由6個α，γ—二氨基丁酸殘基，一個D—苯丙氨酸，一個亮氨酸，一個蘇氨酸和一個6—甲基辛酰結(jié)構(gòu)部分組成(MorrisonandJa-cobs，1976，Immunochem.13813—818)并且也具殺菌能力。缺失脂肪酸部分的多粘菌素類似物也是已知的，該類似物保留LPS結(jié)合能力但不能檢測到殺菌活性(Danneretal.，1989，Antimicrob，AgentsChemother，331428—1434)。在合成的環(huán)化的多粘菌素類似物中也發(fā)現(xiàn)相似的特征(Rusticietal.，1993，Science259361—365)。已知的抗菌肽包括殺菌肽(cecropins)和爪蟾抗菌肽(magainins)。殺菌肽是在鱗翅目昆蟲血淋巴中發(fā)現(xiàn)的一個抗菌肽家族(Wadeetal.，1990，Proc，Natl.Acad.Sci.USA.874761—4765)，爪蟾抗菌肽是在非洲爪蟾皮膚和胃粘膜中發(fā)現(xiàn)的一個抗菌肽家族(Zasloffetal.，1988，Proc，Natl.Acad.Sci.USA.85910—913)。這些肽是線型的其長度范圍從約20到大約40個氨基酸。已報道了一種來自豬腸粘膜的活性較低的哺乳動物殺菌肽，即殺菌肽P1(Bomanetal.，1993，Infect.Immun.612978—2984)。據(jù)報道殺菌肽與爪蟾抗菌肽相比具有更強的殺菌活性而對哺乳動物細胞的細胞毒性則較弱。殺菌肽和爪蟾抗菌肽具有特征性的連續(xù)親水脂α—螺旋區(qū)這一結(jié)構(gòu)區(qū)是殺菌活性所不可缺少的。到現(xiàn)在為止發(fā)現(xiàn)的具有最高活性的殺菌肽是殺菌肽A.殺菌肽A的前10個氨基酸序列與BPI氨基酸序列90—99有一定的同源性。然而，已證明是其殺菌活性所必需的殺菌肽A其它27個氨基酸則與BPI基本無同源性。爪蟾抗菌肽與BPI序列的同源性更小。本申請感興趣的是在PCF國際申請PCT/US91/05758中公開的涉及含BPI和一陰離子化合物的組合物，所說的組合物表現(xiàn)出(1)無殺菌活性，(2)內(nèi)毒素中和活性。陰離子化合物優(yōu)選一種蛋白質(zhì)如血清白蛋白的但也可以是多糖，如肝素。另外，Weissetal.(1975，J.Clin，Invest，5533—42)公開了肝素硫酸鹽和LPS能阻斷BPI增強通透性活性的表達。然而，沒有參考文獻公開BIP實際上中和肝素的生物學(xué)活性。肝素結(jié)合并不一定就意味肝素中和作用。例如肝素結(jié)合生長因子(HBGF)家族需要肝素作為輔助因子來引起生物學(xué)反應(yīng)。GBGF的例子包括成纖維細胞生長因子(FGF—1，F(xiàn)GF—2)和內(nèi)皮細胞生長因子(ECGF—1，ECGF—2)。參與凝血過程蛋白酶中的抗凝血酶III的抑制作用是另一個例證表明肝素結(jié)合蛋白發(fā)揮活性需要肝素的結(jié)合而同時確實并不中和肝素。其正中和肝素的肝素結(jié)合蛋白(例如血小板因子IV，魚精蛋白和凝血酶敏感蛋白)對使用肝素作為輔助因子的肝素結(jié)合蛋白所產(chǎn)生的活性一般是抑制性的。BPI(包括其氨基末端片段)具有一些其它重要的生物學(xué)活性。例如在申請日為1993年3月12日的聯(lián)合提交和聯(lián)合指定專利的美國專利申請系列號No.08/030,644及其部分延續(xù)的申請日為1993年7月15日的美國專利申請系列號No.08/093,202中已顯示BPI具有肝素結(jié)合和肝素中和活性，此處引用其公開的內(nèi)容以供參考。由于肝素近年來的臨床應(yīng)用，BPI的這些肝素結(jié)合和中和活性具有重要的意義。在外科手術(shù)如心肺旁路，心臟插管和血液透析手術(shù)中為防止手術(shù)期間的血液凝固，通常以達到400V/kg的劑量注射肝素。當(dāng)在手術(shù)期間為抗凝血效應(yīng)而注射肝素時，手術(shù)后治療的一個重要方面是迅速中和肝素的效力以便恢復(fù)正常的凝血功能。通常，魚精蛋白用于中和肝素。魚精蛋白是一類簡單，富含精氨酸，強堿性，低分子量的蛋白質(zhì)。單獨給藥時，魚精蛋白(通常以魚精蛋白硫酸鹽的形式)具有抗凝血效力。當(dāng)有肝素存在的條件下給藥時，會形成穩(wěn)定的復(fù)合物并且兩種藥物的抗血凝活性消失。然而，魚精蛋白明顯的降血壓和類過敏副作用限制了其臨床應(yīng)用。因此，由于BPI的肝素結(jié)合和中和活性，它有可能作為魚精蛋白的替代物在臨床上用于中和肝素同時避免了限制魚精蛋白應(yīng)用的有害副作用。BPI另外的抗菌和抗內(nèi)毒素效應(yīng)與魚精蛋白相比在手術(shù)后的肝素中和治療中也更具有用和更具優(yōu)勢。另外，部分由于其肝素結(jié)合和中和活性，BPI在抑制血管形成方面有用。在成年人中，血管形成生長因子因血管創(chuàng)傷(傷口愈合)，免疫刺激(自身免疫疾病)，炎癥介質(zhì)(前列腺素)或從腫瘤細胞中釋放。這些因子經(jīng)肝素依賴性的受體結(jié)合機制誘發(fā)內(nèi)皮細胞的增生(它是血管形成所必需的)(見Yayonetal.，1991，Cell64841—848)。血管形成也與一些其他病理學(xué)狀況相關(guān)聯(lián)，包括各種腫瘤的生長，增生和轉(zhuǎn)移，糖尿病性視網(wǎng)膜病，晶狀體后纖維組織形成，新生血管青光眼，牛皮癬，血管纖維瘤，免疫和非免疫炎癥(包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，游動鞏膜斑內(nèi)的毛細血管增生，血管瘤，子宮內(nèi)膜異位和卡波濟肉瘤)。因此，在這些和其他例子中需要抑制血管形成，而BPI的肝素結(jié)合和中和活性對達到這一目標(biāo)是有用的。已知一些其它的肝素中和蛋白抑制血管形成。例如，已知魚精蛋白抑制與腫瘤相關(guān)的血管形成和隨后的腫瘤生長[見Folkmanetal.，1992，InflammationBasicPrinciplesandClinicalCorrelates，2ded.，(Galinetal.，eds.，ReviewPress.N.Y.)，Ch.40.pp.821—839]。第二種肝素中和蛋白即血小板因子IV也抑制血管形成(即具有血管制動性)。已知膠原酶抑制因子也抑制血管形成(見Folkmanetal.，1992，出處同上)。另一已知的血管形成抑制因子即凝血酶敏感蛋白與肝素重復(fù)性絲氨酸/色氨酸結(jié)構(gòu)域結(jié)合而不與堿性氨基酸結(jié)構(gòu)域結(jié)合(見Guoetal.，1992，J.Biol.Chem.26719349—19355)。BPI的另一用途涉及與慢性炎癥相關(guān)的病理狀態(tài)，此時常伴有血管形成。與慢性炎癥相關(guān)的人類疾病的一個例子是關(guān)節(jié)炎，它包括外周關(guān)節(jié)的炎癥。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，炎癥是免疫引起的，而在反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎中，炎癥與滑膜組織被化膿菌或其它感染物所感染有關(guān)。Folkman等(1992，出處同上)也提出許多類型的關(guān)節(jié)炎進展過程是從一種主要在關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥侵潤的階段發(fā)展到后期新血管血管翳侵入關(guān)節(jié)并開始破壞軟骨的階段。在關(guān)節(jié)炎中血管形成是一種發(fā)病因素還是一種伴隨現(xiàn)象尚不清楚，有證據(jù)表明血管形成在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中是維持滑膜炎所必需的。在膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型中，一種已知的血管形成抑制因子(AGM1470)已顯示出阻止關(guān)節(jié)炎的發(fā)作和抑制關(guān)節(jié)炎形成的作用(Peacocketal.，1992，J.Exp.Med.1751135—1138)。雖然非類固醇的抗炎藥品，皮質(zhì)類固醇和其它療法已為緩解關(guān)節(jié)炎提供了治療效果，但同時在本領(lǐng)域仍需要對關(guān)節(jié)炎和其它發(fā)炎疾病更有效的療法。在本領(lǐng)域內(nèi)一直需要用作殺菌劑和內(nèi)毒素中和劑、以及肝素中和和血管形成抑制(正常的或病理的)的新產(chǎn)品新方法。為此，一個研究途徑是確定BPI蛋白質(zhì)中決定其各個生物學(xué)活性的功能區(qū)。據(jù)此包含有一個或多個BPI活性的BPI功能區(qū)多肽可能表現(xiàn)出優(yōu)越的治療效果。發(fā)明總結(jié)本發(fā)明提供易于生產(chǎn)的小肽，其氨基酸序列是BPI功能區(qū)的氨基酸序列，或其亞序列及該序列的變異體，或至少具有BPI生物學(xué)活性之一的亞序列，如肝素結(jié)合、肝素中和，LPS結(jié)合，LPS中和或殺菌活性。此處公開和描述的BPI功能區(qū)包括區(qū)段I，包含從大約17號氨基酸到大約45號氨基酸的BPI氨基酸序列區(qū)段II，包含從大約65號氨基酸到大約99號氨基酸的BPI氨基酸序列；和區(qū)段III，包含從大約142號氨基酸到大約169號氨基酸的BPI氨基酸順序。因此，BPI功能區(qū)多肽以人BPI氨基末端部分為基礎(chǔ)。本發(fā)明的肽包括線型的和環(huán)化的肽，以及特定BPI功能區(qū)氨基酸序列或其亞序列和該序列或亞序列變異體的內(nèi)線型，環(huán)狀和支鏈組合的肽。組合肽包括具有BPI相同或不同功能區(qū)的序列或亞序列和該序列或亞序列變異體共價偶連起來的肽。特別是包括任一特定序列或其亞序列和該序列或亞序列變異體的2個到大約10個肽的組合。本發(fā)明還提供與已知BPI生物學(xué)活性不同的具有附加生物學(xué)活性的肽，包括但不限于具有不同靶細胞種屬特異性的殺菌活性。還提供了具有BPI特定的生物學(xué)特征但與其相比活性增強或減弱的多肽。本發(fā)明的肽包括線型和環(huán)化的肽，以及特定的BPI功能區(qū)氨基酸序列或其亞序列的線型、環(huán)化和支鏈氨基酸取代和增加的變異體。對于取代變異體，其特定多肽來源于BPI功能區(qū)相應(yīng)位置上出現(xiàn)每個肽的一個或多個位點的氨基酸殘基被不同的氨基酸殘基(包括非典型的氨基酸殘基)所取代。對于增加變異體的多肽可能含有總數(shù)大約達到10個的增加的氨基酸共價連接于此處所述的BPI功能區(qū)的肽之氨基末端或羧基末端或其兩端。這些增加的氨基酸可能與BPI中鄰接功能區(qū)的氨基酸重復(fù)或可能與BPI氨基酸序列無關(guān)并可能包括非典型的氨基酸。與每個前述BPI功能區(qū)肽的環(huán)化實施例一樣，在本發(fā)明的肽中還提供了氨基酸取代和增加變異體的線性，環(huán)化和支鏈組合多肽的實施例。另外，本發(fā)明的多肽可能提供與其它功能性目標(biāo)物(如免疫球蛋白片段)形成的融合蛋白。增加變異體包括氨基酸側(cè)鏈化學(xué)基團(如胺、羧酸、烷基和苯基)的衍生物和修飾物。本發(fā)明提供的藥用組合物用于治療哺乳動物中和內(nèi)毒素殺死革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌和真菌，中和肝素的抗凝血特性，抑制血管增生，抑制腫瘤和內(nèi)皮細胞增生，以及治療慢性炎癥疾病。該藥用組合物含有本發(fā)明的單位劑量的BPI肽，以固態(tài)，半固態(tài)和液態(tài)劑量形式提供，如片劑藥丸，粉末，液體溶液或懸液和可注射及可浸入的溶液。本發(fā)明提供的多肽具有氨基酸序列為含人BPI功能區(qū)I的從約17位到大約45位的氨基酸序列，其序列為I區(qū)ASQQG-TAALQKELKRIKIPDYSDSFKIKH(SEQIDNO1)及其具有生物學(xué)活性的亞序列，該活性包括但不限于BPI的一種或多種活性，如，殺菌活性，LPS結(jié)合，LPS中和，肝素結(jié)合或肝素中和。本發(fā)明在該方面還提供具有與含有BPI從約17位到45位氨基酸序列功能區(qū)I肽的氨基酸序列大體相同的序列或其亞序列的肽。另外，本發(fā)明還提供含有兩個或多個相同或不同的I區(qū)肽或亞序列肽共價連接形成的肽。本發(fā)明提供具有氨基酸序列為包含人BPI功能區(qū)II的，從約65位到約99位的氨基酸序列的多肽，具有序列II區(qū)SSQISMVPN-VGLKFSISNANIKISGKWKAQKRFLK(SEQIDNO6)及其具有生物活性的亞序列多肽，該活性包括但不限于BPI的一種或多種活性，例如殺菌活性，LPS結(jié)合，LPS中和，肝素結(jié)合或肝素中和活性。本發(fā)明在該方面還提供具有與含BPI從約65位到約99位的功能區(qū)II氨基酸序列大體相同的序列或其亞序列的肽。另外，本發(fā)明還提供含兩個或多個相同或不同的區(qū)段II肽或亞序列肽共價連接形成的肽。本發(fā)明還提供具有氨基酸序列為含人BPI從約142位到約169位，包含功能區(qū)III的氨基酸序列的多肽，具有序列III區(qū)VHVHISKSKVGWLIQLFHKKIESALRNK(SEQIDNO12)及其具有生物活性的亞序列的肽，該活性包括但不限于BPI的一種或多種活性，例如殺菌活性，LPS結(jié)合，LPS中和，肝素結(jié)合或肝素中和活性。本發(fā)明在該方面還提供具有與含BPI從約142位到約169位的功能區(qū)III氨基酸序列大體相同的序列或其亞序列的肽。另外，本發(fā)明還提供含2個或多個相同或不同III區(qū)肽或亞序列肽共價連接形成的肽。本發(fā)明還提供功能區(qū)之間互相結(jié)合的肽，其中2個或多個來自不同功能區(qū)或其亞序列和變異體的肽共價連接起來。提供了這些功能區(qū)互相結(jié)合的肽線性，環(huán)化和支鏈的實施例。本發(fā)明的肽在其應(yīng)用方面至少具有BPI一種已知的活性，包括LPS結(jié)合，LPS中和，肝素結(jié)合，肝素中和和對革蘭氏陰性細菌的殺菌活性。另外，令人驚奇的是本發(fā)明的一些肽已用作抗革蘭氏陽性菌的殺菌劑。本發(fā)明的一些肽另一令人驚奇并且未料到的用途是作為殺真菌劑。本發(fā)明的肽提供了一類具有中和內(nèi)毒素和殺死內(nèi)毒素產(chǎn)生菌雙重特征的抗生素分子，它在治療由革蘭氏陰性菌引起的哺乳動物疾病中是有用的。本發(fā)明保留該雙重活性并另外增加了抗菌譜的肽代表了另一類新的抗微生物制劑。另外，對傳統(tǒng)抗生素具抗性而對本發(fā)明的增強通透性抗微生物活性的肽敏感的微生物菌株感染時，本發(fā)明的肽提供了一類有用的抗微生物治療制劑。本發(fā)明還提供了本發(fā)明肽的藥用組合物，它含有存在于藥用上可接受的載體或稀釋劑中的肽或肽的組合，或兩者本身，并用于治療病理的或疾病狀態(tài)的方法中或用于其他合適的治療用途。本發(fā)明還提供了這些藥用組合物在治療包括人在內(nèi)的哺乳動物病理學(xué)或疾病狀態(tài)時的使用方法。本發(fā)明還提供了BPI功能區(qū)肽用于各種治療應(yīng)用的藥物制造法。本發(fā)明從下面更詳細描述的一些優(yōu)選實施例和權(quán)利要求中特別優(yōu)選出的實施例將成為證據(jù)。附圖簡要描述圖1a和1b描繪了溴化氰和rBPI23蛋白裂解片段的HPLC吸收譜；圖2是rBPI23蛋白裂解片段的LAL抑制試驗結(jié)果圖；圖3是用15殘基的BPI肽進行肝素結(jié)合試驗的結(jié)果圖；圖4是用15殘基的BPI肽進行鱟屬阿米巴細胞溶胞產(chǎn)物(LAL)抑制試驗的結(jié)果圖；圖5是用15殘基的BPI肽進行環(huán)狀狀擴散殺菌試驗的結(jié)果圖；圖6顯示了BPI功能區(qū)肽在肝素結(jié)合試驗中的作用；圖7a和7b顯示了BPI功能區(qū)肽在凝血酶的ATIII/肝素抑制中的作用；圖8a和8b顯示了BPI功能區(qū)肽在LAL抑制試驗中的結(jié)果；圖9a，9b，9c，9d顯示了BPI功能區(qū)肽在環(huán)狀擴散殺菌試驗中的結(jié)果；圖9e和圖9f顯示了BPI功能區(qū)肽在E.coli培養(yǎng)試驗中的結(jié)果；圖10a，10b，10c，10d和10e顯示了BPI功能區(qū)組合肽在環(huán)狀擴散殺菌試驗中的結(jié)果；圖11a，11b，11c，11d，11e，11f，11g，11h和11i顯示了BPI功能區(qū)肽在環(huán)狀擴散殺菌試驗中的結(jié)果圖11j和11k顯示了用BPI功能區(qū)肽對生長于培養(yǎng)基中的細菌細胞進行殺菌試驗的結(jié)果；圖11l顯示了用BPI功能區(qū)肽BPI.30在人血清中進行殺菌試驗的結(jié)果；圖11m和圖11n顯示了用BPI功能區(qū)肽對革蘭氏陽性細菌進行環(huán)狀擴散殺菌試驗的結(jié)果；圖11o顯示了在用S.aureus細胞進行放射狀擴散殺菌試驗中，BPI功能區(qū)肽與慶大霉素和萬古霉素的比較結(jié)果；圖11p和11q顯示了對生長于培養(yǎng)基中的C.albicans細胞用BPI功能區(qū)肽進行細胞毒性試驗的結(jié)果；圖12a，12b，12c，12d，12e，12f和12g顯示了用BPI功能區(qū)肽進行肝素中和試驗的結(jié)果；圖13是BPIII區(qū)肽BPI.2(BPI序列的85—99氨基酸序列，SEQIDNO7)的結(jié)構(gòu)示意圖；圖14是BPIIII區(qū)肽BPI.11(BPI序列的148—161氨基酸序列，SEQIDNO13)的結(jié)構(gòu)示意圖；圖15a，15b，15c，15d和15e顯示了用BPI功能區(qū)取代肽進行肝素結(jié)合試驗的結(jié)果；圖16顯示了用各種BPI功能區(qū)肽進行肝素結(jié)合實驗的結(jié)果；圖17a和17b顯示了合成的BPI功能區(qū)肽和放射標(biāo)記的rBIP23競爭性結(jié)合脂A試驗的結(jié)果；圖18顯示了合成的BPI.10肽和放射標(biāo)記的rBPI23在血液或磷酸緩沖鹽溶液中競爭結(jié)合脂A試驗的結(jié)果；圖19顯示了合成的BPI肽BPI.7，BPI.29和BPI.30對放射標(biāo)記的rBPI23進行脂A結(jié)合競爭試驗的結(jié)果；圖20a和圖20b顯示了BPI功能區(qū)肽與放射標(biāo)記的rLBP25進行脂A結(jié)合競爭試驗的結(jié)果；圖21顯示了用預(yù)先與HUVEC細胞結(jié)合的BPI功能區(qū)肽進行放射標(biāo)記的RaLPS結(jié)合實驗的結(jié)果；圖22a，22b，22c，22d，22e，22f，22g和22h顯示了測定BPI的LPS中和活性時影響細胞的TNF細胞毒性試驗的各種參數(shù)；圖23a，23b和23c顯示了在LPS刺激的RAW2647細胞中NO產(chǎn)物對γ—干擾素和LBP存在的依賴以及用rBPI23進行該NO產(chǎn)物的抑制作用；圖24a，24b，24c，24d，24e，和24f顯示了用BPI功能區(qū)肽進行的LPS中和，它反映了在以酵母多糖或LPS刺激過的RAW264.7細胞中，它抑制NO產(chǎn)物的能力；圖24g顯示了合成的BPI肽用RAW264.7細胞抑制LPS或酵母多糖刺激的NO產(chǎn)物之IC50值；圖25是rBIP23的示意圖，顯示了它的三個功能區(qū)；圖26a顯示了LPS介導(dǎo)的RAW264.7細胞增生抑制對rLBP存在的依賴；圖26b和26c用實施例20D的試驗顯示了BPI功能區(qū)肽的模型；圖27用實施例20E的試驗顯示了以各種BPI功能區(qū)肽在全血中進行TNF抑制的比較；圖28顯示了用各種BPI功能區(qū)肽進行實施例20G所述的凝血酶凝血時間試驗的結(jié)果。優(yōu)選實施例的詳細描述本發(fā)明提供的肽具有BPI至少一個功能區(qū)的氨基酸序列或其亞序列以及該序列或亞序列的變異體的氨基酸順序。為本發(fā)明的需要，術(shù)語“功能區(qū)”用于指定對蛋白質(zhì)的全部生物學(xué)活性有貢獻的BPI氨基酸序列的區(qū)域，。這些BPI功能區(qū)由蛋白質(zhì)裂解的分裂片段，重疊的15殘基肽和其它合成肽的活性來限定。區(qū)段I定義為含有BPI從約17位氨基酸到大約45位氨基酸的氨基酸序列。該區(qū)段肽在LPS誘導(dǎo)的LAL活性抑制和肝素結(jié)合試驗中具有中等活性，并且不表現(xiàn)出明顯的殺菌活性。區(qū)段II定義為含有從大約65位氨基酸到大約99位氨基酸的BPI氨基酸序列。該區(qū)段肽表現(xiàn)出高LPS和肝素結(jié)合能力并具有殺菌力。區(qū)段III定義為含有從大約142位氨基酸到大約169位氨基酸的BPI氨基酸序列。該區(qū)段肽表現(xiàn)出高LPS和肝素結(jié)合活性并具有殺菌力。此處定義的功能區(qū)包括連續(xù)的區(qū)段I，II和III，即含BPI氨基酸序列連續(xù)部分的區(qū)域。但本發(fā)明也包括含不連續(xù)的BPI部分多肽，即分散于BPI序列中。認識到在天然蛋白質(zhì)中一些不連續(xù)的氨基酸序列延伸部分可能折疊起來使這些氨基酸區(qū)域變成相近或靠近，將不連續(xù)區(qū)域以共價連接起來形成的肽可模擬本發(fā)明的肽結(jié)構(gòu)。含有BPI氨基酸序列不連續(xù)區(qū)域的多肽是本發(fā)明所提供的組合肽的一個例子。按本發(fā)明的需要，組合肽可以是包括線型，環(huán)化的或支鏈的肽，該肽包含具有來自相同或不同BPI功能區(qū)的一段氨基酸序列及其亞序列的2個或多個肽。該范圍特別包含的組合體含有2個到10個左右功能區(qū)肽或其亞序列，特別是2個到3個功能區(qū)肽的組合體(例如，同源二聚體，同源三聚體，異源二聚體和異源三聚體)。含有該組合體的每個組合肽可能具有來自任一特定BPI功能區(qū)氨基酸序列或其亞序列的氨基酸序列。為本發(fā)明的需要，術(shù)語“BPI的生物學(xué)活性”用于包括，但不限于人殺菌通透性增強蛋白質(zhì)(BPI)的生物學(xué)活性，例如包括重組BPI全蛋白，如rBPI(SEQIDNO69)；BPI的氨基末端片段，如rBPI23；BPI突變的氨基末端片段，如rBPI21DDYS(在共同提交和共同指定的申請日為1993年2月2日的美國專利申請系列NO.08/013，801中命名為rBPI(1—193)ala132，此處引用以供參考)。按照在共同提交和共同指定的美國專利申請系列NO.08/093,202(引用以供參考)中所公開的方法生產(chǎn)了具有SEQIDNO69所列序列的rBPI，除了151位的纈氨酸由GTG而不是GTC編碼，185位殘基是谷氨酸(由GAG編碼)而不是賴氨酸(由AAG)編碼)外與在Gray等(出處同上)中所示的一樣。另外，除上述來自Gray等(出處同上)的序列外，用含有31個殘基信號序列和rBPI前199個氨基酸序列的表達載體生產(chǎn)了rBPI23(也見，Gazzarno—Santoroetal.，1992，Infect，Immun，604754—4761)。該生物學(xué)活性包括LPS結(jié)合，LPS中和，肝素結(jié)合和肝素中和，以及殺菌活性。特別是包括本發(fā)明的任一多肽的生物學(xué)活性為BPI或包含BPI相應(yīng)功能區(qū)的相應(yīng)肽之生物學(xué)活性的0.1到10倍?！癇PI生物學(xué)活性”的定義還特地包括一種生物學(xué)活性；如殺菌活性，它與BPI或含有BPI全部相應(yīng)功能區(qū)的相應(yīng)多肽之活性相比具質(zhì)量上的差別。例如，該質(zhì)量差別包括與BPI相應(yīng)功能區(qū)的氨基酸序列有關(guān)多肽能有效殺死的細菌譜或其它微生物譜的差別。因此，該定義包含對BPI以前尚未報道的肽活性，如對革蘭氏陽性細菌的殺菌活性和殺真菌活性。本發(fā)明的任一肽具有的氨基酸序列為人BPI一個功能區(qū)的氨基酸序列或其亞序列。該肽的實施例包括下面典型的區(qū)段I多肽[單個字母代表的氨基酸縮寫見G.Zubay，Biochemistry(zd.ed.)，1988(MacMillenPublishingN.Y.)P.33]BPI.1QQGTAALQKELKRIK(SEQIDNO4)；BPI.4LQKELKRIKIPDYSDSFKIKHL(SEQIDNO3)；BPI.14GTAALQKELKRIKIPDYSDSKHLGKGH(SEQIDNO2)；andBPI.54GTAALQKELKRIKIP(SEQIDNO5)；下面典型的區(qū)段II多肽BPI.2IKISGKWKAQKRFLK(SEQIDNO7)；BPI.3NVGLKFSISNANIKISGKWKAQKRFLK(SEQIDNO11)；andBPI.8KWKAQKRFLK(SEQIDNO8)；和下面典型的區(qū)段III多肽BPI.5VHVHISKSKVGWLIQLFHKKIE(SEQIDNO67)；BPI.11KSKVWLIQLFHKK(SEQIDNO13)；BPI.12SVHVHISKSKVGWLIQLFHKKIFSALRNK(SEQIDNO14)；BPI.13KSKVGWLIQLFHKK(SEQIDNO15)；andBPI.55GWLIQLFHKKIESALRNKMNS(SEQIDNO61).應(yīng)認識到BPI.14，BPI.12和BPI.55是增加變異體的例子。本發(fā)明還提供了相同或不同多肽的線型和支鏈組合體，其中，組合體的每個肽具有的氨基酸序列為人BPI功能區(qū)之一的氨基酸序列或其亞序列。該肽的實施例包括下面典型的組合體功能區(qū)II肽BPI.9.KRFLKKWKAQKRFLK(SEQIDNO51)；BPI.7.KWKAQKRFLKKWKAQKRFLK(SEQIDNO54)；BPI.10.1KRFLKKWKAQKRFLKKWKAQKRFLK(SEQIDNO55)；和BIP.10.2QKRFLKKWKAQKRFLKKWKAQKRFLK(SEQIDNO65)；以及下面典型的支鏈區(qū)段II多肽MAP.1(β—丙氨?！狽a，Ne—取代的—[Na，Ne(BPI.2)賴氨酰]賴氨酸)；和下面典型的組合體區(qū)段III多肽BPI.29KSKVGWLIQLFHKKKSKVGWLIQLFHKK(SEQ.ID.NO56)；和下面典型的支鏈III區(qū)段IV多肽MAP.2(β—丙氨?！狽a，Ne—取代的—[Na，Ne(BPI.13)賴氨酰]賴氨酸)；和下面典型的區(qū)段II—區(qū)段III之間組合肽BPI.30KWKAQKRFLKKSKVGWLIQLFHKK(SEQIDNO52)；BPI.60IKISGKWKAQKRFLKKSKVGWLIQLFHKK(SEQIDNO53)；和BPI.74KSKVGWLIQIFHKKKWKAQKRFLK(SEQIDNO70)；還提供了氨基酸取代變異體，其中每個肽在一個或多個位點的氨基酸殘基與產(chǎn)生該特定肽的BPI功能區(qū)相應(yīng)位點所發(fā)現(xiàn)的氨基酸殘基不同。例如本發(fā)明在該方面的一個實施例中，肽的一個位點以纈氨酸殘基取代了BPI氨基酸序列相應(yīng)位點上所發(fā)現(xiàn)的氨基酸殘基。在另一實施例中，肽的一個位點以諸如苯丙氨酸，亮氨酸，賴氨酸或色氨酸的殘基取代了在BPI氨基酸序列相應(yīng)位點發(fā)現(xiàn)的氨基酸。這些肽的實施例包括下列典型的II區(qū)取代肽BPI.15AKISGKWKAQKRFLK(SEQIDNO16)；BPI.16IAISGKWKAQKRFLK(SEQIDNO17)；BPI.17IKASGKWKAQKRFLK(SEQIDNO18)；BPI.18IKIAGKWKAQKRFLK(SEQIDNO19)；BPI.19IKISAKWKAQKRFLK(SEQIDNO20)；BPI.20IKISGAWKAQKRFLK(SEQIDNO21)；BPI.21IKISGKAKAQKRFLK(SEQIDNO22)；BPI.22IKISGKWAAQKRFLK(SEQIDNO23)；BPI.23IKISGKWKAAKRFLK(SEQIDNO24)；BPI.24IKISGKWKAQARFLK(SEQIDNO25)；BPI.25IKISGKWKAQKAFLK(SEQIDNO26)；BPI.26IKISGKWKAQKRALK(SEQIDNO27)；BPI.27IKISGKWKAQKRFAK(SEQIDNO28)；BPI.28IKISGKWKAQKRFLA(SEQIDNO29)；BPI.61IKISGKFKAQKRFLK(SEQIDNO48)；BPI.73IKISGKWKAQFRFLK(SEQIDNO62)；BPI.77IKISGKWKAQWRFLK(SEQIDNO72)；BPI.79IKISGKWKAKKRFLK(SEQIDNO73)；andBPI.81IKISGKWKAFKRFLK(SEQIDNO75)；和下面典型的III區(qū)取代肽BPI.31ASKVGWLIQLFHKK(SEQIDNO33)；BPI.32KAKVGWLIQLFHKK(SEQIDNO34)；BPI.33KSAVGWLIQLFHKK(SEQIDNO35)；BPI.34KSKAGWLIQLFHKK(SEQIDNO36)；BPI.35KSKVAWLIQLFHKK(SEQIDNO37)；BPI.36KSKVGALIQLFHKK(SEQIDNO38)；BPI.37KSKVGWAIQLFHKK(SEQIDNO39)；BPI.38KSKVGWLAQLFHKK(SEQIDNO40)；BPI.39KSKVGWLIALFHKK(SEQIDNO41)；BPI.40KSKVGWLIQAFHKK(SEQIDNO42)；BPI.41KSKVGWLIQLAHKK(SEQIDNO43)；BPI.42KSKVGWLIQLFAKK(SEQIDNO44)；BPI.43KSKVGWLIQLFHAK(SEQIDNO45)；BPI.44KSKVGWLIQIFHKA(SEQIDNO46)；BPI.82KSKVGWLIQLWHKK(SEQIDNO76)；BPI.85KSKVLWLIQLFHKK(SEQIDNO79)；BPI.86KSKVGWLILLFHKK(SEQIDNO80)；BPI.87KSKVGWLIQLFLKK(SEQIDNO81)；BPI.91KSKVGWLIFLFHKK(SEQIDNO86)；BPI.92KSKVGWLIKLFHKK(SEQIDNO87)；BPI.94KSKVGWLIQLFFKK(SEQIDNO89)；BPI.95KSKVFWLIQLFHKK(SEQIDNO90)；BPI.96KSKVGWLIQLFHKF(SEQIDNO91)；andBPI.97KSKVKWLIQLFHKK(SEQIDNO92).本發(fā)明提供的這種單個氨基酸被取代的BPI功能區(qū)肽的特定用途是鑒定多肽序列中的關(guān)鍵殘基，其中氨基酸序列在特定位置的殘基被取代后至少具有肽生物學(xué)活性中的一個可檢測到的作用。本發(fā)明范圍尤其包含的實施例是具有在這種關(guān)鍵殘基處被取代的本發(fā)明肽無論用任一氨基酸(天然出現(xiàn)的或非典型的)來鑒定，其中所得的取代肽仍具有此處所限定的生物學(xué)活性。此外，還提供的取代肽是多位點的取代體，即，其中在功能區(qū)氨基酸序列中的兩個或多個不同氨基酸殘基分別被另一氨基酸取代。例如在這種雙位點被取代多肽的實施例中，多肽兩個位點被諸如纈氨酸，苯丙氨酸或賴氨酸殘基取代了在BPI氨基酸序列相應(yīng)位點所發(fā)現(xiàn)的氨基酸。這些肽的實施例的例子包括多位點被取代的區(qū)段II多肽BPI.45IKISGKWKAAARFLK(SEQIDNO31)；BPI.56IKISGKWKAKQRFLK(SEQIDNO47)；BPI.59IKISGAWAAQKRFLK(SEQIDNO30)；BPI.60IAISGKWKAQKRFLA(SEQIDNO32)；andBPI.88IKISGKWKAFFRFLK(SEQIDNO82)；和典型的多處被取代的III區(qū)段III多肽BPI.100KSKVKWLIKLFHKK(SEQIDNO94)；和下面典型的多處被取代的區(qū)段II取代體組合肽BPI.101KSKVKWLIKLFFKFKSKVKWLIKLFFKF(SEQIDNO95)；和下面典型的多處被取代的區(qū)段II—區(qū)段III之間取代體組合肽BPI.102KWKAQFRFLKKSKVGWLILLFHKK(SEQIDNO96)。這種氨基酸取代變異體的另一方面是那些取代的氨基酸殘基是非典型氨基酸。本發(fā)明肽在這一方面尤其包含的肽含有D—氨基酸，修飾的或非天然出現(xiàn)的氨基酸，以及改變的氨基酸，，它們使多肽的穩(wěn)定性，活性或生物學(xué)利用度提高。這些多肽的實施例包括下列示范的帶有非典型氨基酸的區(qū)段II肽BPI.66IKISGKWDKAQKRFLK(SEQIDNO49)；BPI.67IKISGKAβ-(1-naphthyl)KAQKRFLK(SEQIDNO50)；BPI.70IKISGKAβ-(3-pyridyl)KAQKRFLK(SEQIDNO63)；BPI.71ADADIKISGKWKAQKRFLK(SEQIDNO66)；BPI.72IKISGKWKAQKRAβ-(3-pyridyl)LK(SEQIDNO64)；BPI.76IKISGKWKAQFDRFLK(SEQIDNO71)；BPI.80IKISGKWKAQAβ-(1-naphthyl)RFLK(SEQIDNO74)；BPI.84IKISGKAβ-(1-naphthyl)KAQFRFLK(SEQIDNO78)；BPI.89IKISGKAβ-(1-naphhthyl)KAFKRFLK(SEQIDNO84)；andBPI.90IKISGKAβ-(1-naphthyl)KAFFRFLK(SEQIDNO85)；具有非典型氨基酸的示范區(qū)段III肽BPI.83KSKVGAβ-(1-萘基)LIQLFHKK(SEQIDNO77)；和具有非典型氨基酸的示范區(qū)段II—區(qū)段III之間組合肽BPI.93IKISGKAβ-(1-萘基)KAQFRFLKKSKVGWLIQLFHKK(SEQIDNO88)；和BPI.98IKISGKAβ-(1-萘基)KAQFRFLKKSKVGWLIFLFHKK(SEQIDNO83)。在多個功能區(qū)發(fā)生多處置換形成的氨基酸取代變異體多肽的線型和支鏈組合體實施例也是本發(fā)明的一個方面。這些肽的實施例包括下列示范的組合體/取代體區(qū)段II肽BPI.46KWKAAARFLKKWKAQRFLK(SEQIDNO57)；BPI.47KWKAQKRFLKKWKAAARFLK(SEQIDNO58)；BPI.48KWKAAARFLKKWAAAKRFLK(SEQIDNO59)；BPI.69KWKAAARFLKKWKAAARFLKKWKAAARFLK(SEQIDNO60)；andBPI.99KWKAQWRFLKKWKAQWRFLKKWKAQWRFLK(SEQIDNO93).本發(fā)明還提供了各個上述BPI功能區(qū)肽的二聚體形成的和環(huán)化的實施例。這些肽的實施例包括下列示范的半胱氨酸被修飾的區(qū)段II肽BPI.58CIKISGKWKAQKRFLK(SEQIDNO9)；BPI.65(red)CIKISGKWKAQKRFLKC(SEQIDNO68)此處描述的BPI功能區(qū)肽作為對革蘭氏陰性細菌的有效抗菌劑并中和革蘭氏陰性細菌膜相關(guān)的LPS毒性作用是有用的。本發(fā)明的肽具有數(shù)量不同的其他BPI活性，包括不直接與革蘭氏陰性細菌感染相關(guān)聯(lián)的活性，如肝素結(jié)合和中和活性。本發(fā)明提供的肽還可具有與BPI已知生物學(xué)活性不同的活性。例如令人驚奇地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明肽的一些實施例中，其殺菌活性的生物學(xué)效應(yīng)范圍比BPI更寬，并表現(xiàn)出對革蘭氏陽性菌以及革蘭氏陰性菌的殺菌活性。本發(fā)明的一些實施例還出人意料地發(fā)現(xiàn)具有殺真菌活性。因此，本發(fā)明的優(yōu)勢在于提供的多肽具有BPI生物學(xué)功能區(qū)的氨基酸序列并有獨特的抗微生物活性。本發(fā)明的肽具有BPI雙重的抗菌和抗內(nèi)毒素特征，包括那些具有增加的抗生譜的肽，它們代表了一類新的抗生素分子。本發(fā)明的BPI功能區(qū)肽具有迄今在BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的生物學(xué)治療用途。例如，在申請日為1994年1月24日共同擁有，共同提交的美國專利申請系列NO.08/188,221中論述了BPI蛋白產(chǎn)物在治療人的革蘭氏陰性細菌內(nèi)毒素血癥的應(yīng)用。申請日為1993年3月12日的共同擁有，共同提交的美國專利申請系列NO.08/031,145論述了用于治療分枝桿菌疾病的BPI蛋白制劑。申請日為1993年10月5日的共同擁有，共同提交的美國專利申請系列NO.08/132,510論述了在治療涉及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)功能受抑制的狀態(tài)中BPI蛋白質(zhì)制劑的應(yīng)用。申請日為1993年9月22日的共同擁有，共同提交的美國專利申請系列NO.08/125,651論述了BPI蛋白質(zhì)制劑和抗生素的協(xié)同組合體。申請日為1993年7月14日的共同擁有，共同提交的美國專利申請系列NO.08/093,201論述了用LBP蛋白質(zhì)制劑加強BPI蛋白質(zhì)制劑殺菌活性的方法。申請日為1993年3月12日的共同擁有，共同提交的美國專利申請系列NO.08/031,144論述了治療彎曲菌感染的BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物的用藥。為舉例證明本發(fā)明的BPI功能區(qū)肽的治療用途，此處特別引用上述申請的公開內(nèi)容以供參考。本發(fā)明的BPI功能區(qū)肽還具有在上述美國專利申請系列Nos.08/030,644，08/093,202和08/183,222專利申請中所公開的治療病理條件和疾病狀態(tài)的治療用途。因此，本發(fā)明的BPI功能區(qū)肽在下列方法中是有用的中和肝素的抗凝作用；抑制血管形成(尤其是與眼視網(wǎng)膜病相聯(lián)系的血管形成)；抑制內(nèi)皮細胞增生(尤其是與受精卵植入相聯(lián)系的子宮內(nèi)膜異位和增生)；抑制惡性腫瘤細胞增生(尤其是卡波濟肉瘤增生)；治療慢性炎癥疾病狀態(tài)(如關(guān)節(jié)炎，尤其是發(fā)作的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)；治療革蘭氏陰性細菌感染及其后遺癥；治療在血液循環(huán)中革蘭氏陰性內(nèi)毒素的有害影響(如增加細胞因子產(chǎn)生)；殺死革蘭氏陰性細菌；治療與網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)功能受抑制相聯(lián)系的有害生理學(xué)影響(尤其涉及肝臟枯否氏細胞功能受抑制，如肝臟受到物理的，化學(xué)的和生物學(xué)損害而引起的病變)；與抗生素(如慶大霉素，多粘菌素B和cefamandolenafate)協(xié)同治療革蘭氏陰性細菌感染及其后遺癥；與抗生素協(xié)同組合殺死革蘭氏陰性細菌；與LBP蛋白質(zhì)制劑聯(lián)合治療革蘭氏陰性菌感染及其后遺癥；與LBP蛋白質(zhì)產(chǎn)物聯(lián)合抗革蘭氏陰性細菌；單獨或與抗生素和/或鉍聯(lián)合治療分枝桿菌感染(尤其是被結(jié)核桿菌，麻瘋桿菌和M.avium的感染)；治療血液循環(huán)中脂肪阿拉伯甘露聚糖的有害生理影響(如增加細胞因子產(chǎn)生)；凈化含脂阿拉伯甘露聚糖的體液(如全血，血漿，血清和骨髓)；和治療與彎曲菌屬的細菌感染相聯(lián)系的疾病狀態(tài)(如胃炎和消化性的胃及十二指腸潰瘍)。本發(fā)明還提供用于上述用途有效量的BPI功能區(qū)多肽的藥物制劑，包括用作口服、腸胃外的、局部的和噴霧劑型的藥劑，以及特殊的附加成份包括可做藥用的稀釋劑，佐劑和載體。關(guān)于與LBP蛋白質(zhì)產(chǎn)物聯(lián)合的BPI功能區(qū)肽的應(yīng)用、此處所用的“LBP蛋白質(zhì)產(chǎn)物”包括天然的和重組的脂多糖結(jié)合蛋白質(zhì)產(chǎn)物；天然的、合成的和重組的生物學(xué)活性多肽片段以及脂多糖結(jié)合蛋白質(zhì)的衍生物；生物學(xué)活性多肽類似物，包括LBP或其生物學(xué)活性片段的雜交融合蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的方法有用的LBP蛋白產(chǎn)物包括如在申請日為1993年7月17日共同擁有和共同提交的美國專利申請系列NO.08/079,510中所述命名為rLBP的，可在轉(zhuǎn)化的真核宿主細胞中以重組基因表達生產(chǎn)的LBP全蛋白。在該申請中還描述了優(yōu)選的缺乏CD14介導(dǎo)的炎癥特性并保留通過CD14受體介導(dǎo)結(jié)合LPS活性能力之LBP蛋白質(zhì)衍生物。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)先使用該LBP蛋白質(zhì)產(chǎn)物，因為過多的CD14—介導(dǎo)的免疫刺激一般認為是無益的、在患感染的個體中尤其如此。優(yōu)選的LBP蛋白質(zhì)衍生物被鑒定為分子量為大約25KD的氨基末端片段。最優(yōu)選的LBP氨基末端片段鑒定為LBP氨基末端的前197個氨基酸的氨基酸序列，如SEQIDNOS97和98所列出的，并命名為rLBP25，該產(chǎn)物在前面提到的共同擁有和共同提交的美國專利申請系列NO.08/079,510中已描述。在保留結(jié)合LPS能力的前提下，期望LBP蛋白質(zhì)衍生物盡可能小于25KD并包含明顯少于全LBP分子氨基末端的前197個氨基酸適用于本發(fā)明。另外，在丟失CDI4介導(dǎo)的免疫刺激活性之成份的前提下，預(yù)期LBP蛋白質(zhì)衍生物大于全LBP分子前197氨基酸殘基并包括rLBP前197個氨基酸羧基末端一例的氨基酸(如SEQIDNOS97和98所公開)同樣證明對本發(fā)明的方法有用。還可預(yù)料到本領(lǐng)域的技術(shù)人員能對SEQIDNOD97和98的氨基酸殘基進行增加，刪除和取代而不失去所需的該分子的生物學(xué)活性。更進一步可經(jīng)刪除，取代、增加或突變包括對編碼LBP全蛋白的DNA序列的指定位點誘變的突變得到LBP蛋白產(chǎn)物，其中的蛋白質(zhì)產(chǎn)物保留了LPS結(jié)合活性而缺乏CD14介導(dǎo)的免疫刺激活性。尤其期望有是可導(dǎo)致改進LBP對細菌和親合性和/或增強體內(nèi)穩(wěn)定性的LBP雜交分子和二聚體形式。這些包括LBP/BPI雜交蛋白和LBP—Ig融合蛋白。這類雜交蛋白質(zhì)還包括那些使用人γ—1或γ—3鉸鏈區(qū)以允許二聚體形成的蛋白質(zhì)。二聚體的其它形式期望具有增強的血清穩(wěn)定性和結(jié)合親合力，包括與缺失CH2區(qū)的Fc融合，或使用亮氨酸或螺旋結(jié)構(gòu)的雜交分子。本發(fā)明的BPI功能區(qū)多肽可以本領(lǐng)域已知的任何方法，包括以組產(chǎn)物的方法來生產(chǎn)和/或分離。1991年7月2日公開的共同擁有的美國專利No.5,028,530，1993年4月27日公開的共同擁有的美國專利NO.5206154和申請日為1993年1月28日的共同擁有,共同提交的美國專利申請系列NO.08/010,676(此處引用以上文件以供參考)均公開了包括抗微生物肽的多肽重組生產(chǎn)的新方法。在細菌中重組生產(chǎn)抗微生物多肽的其他程序已由Piersetal.1993，Gene1347—13描述。申請日為1992年5月19日的共同擁有，共同提交的美國專利申請系列NO.07/885,501及其部分延續(xù)的申請日為1993年5月19日的美國專利申請系列NO.08/072,063(此處引用它們以供參考)均公開了在培養(yǎng)基中純化從基因轉(zhuǎn)化的哺乳動物宿主細胞表達和分泌的重組BPI并且公開了大批量生產(chǎn)重組BPI的方法，以適于配制穩(wěn)定的，純化的藥用制劑。使用任一這類方法也可能有效地生產(chǎn)BPI功能區(qū)多肽。那些本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能分離或化學(xué)合成編碼本發(fā)明各個肽的核酸。該核酸在用作重組表達載體的成份時是重要的成分。其中，該核酸可與轉(zhuǎn)錄和/或翻譯調(diào)控元件進行連接，并且這類重組表達載體能在其轉(zhuǎn)化的各種細胞培養(yǎng)中表達本發(fā)明多肽，包括原核細胞或更好地用真核細胞，或最好用哺乳動物細胞。以本領(lǐng)域已知的任何化學(xué)合成技術(shù)，尤其是固相合成技術(shù)，例如，使用商用自動肽合成儀可能很有效地合成本發(fā)明的肽。該肽也可能以組合肽的形式提供，其中包含組合體的肽是以線型方式互相連接，并且其中的BPI序列在肽中存在重復(fù)，允許選擇的構(gòu)象存在“間隔區(qū)”氨基酸將重復(fù)區(qū)分開或不分開。本發(fā)明還提供支鍵組合體，其中的組合肽是在含有該肽的氨基酸的氨基酸側(cè)鏈上進行具功能性的共價連接。本發(fā)明的功能區(qū)肽能以含有BPI功能區(qū)肽和至少一種其它多肽中至少一部分的重組雜交融合蛋白質(zhì)的形式提供。例如，在由Thofan等共同擁有，共同提交的美國專利申請系列NO.07/885,911(申請日為1992年5月19日)及其部分延續(xù)的美國專利申請系列No.08/064,693(申請日為1993年5月19日)中描述了這類蛋白質(zhì)(此處全面引用以供參考)。一般來說，那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認識到此處所述的肽可用各種化學(xué)技術(shù)進行修飾以產(chǎn)生具有與未修飾的肽活性基本相同并理想地還具有其它有用特征的復(fù)合物。例如，肽的羧酸基團，不管是羧基末端還是側(cè)鏈可以藥用上可接受的陽離鹽的形式提供，或酯化形成C1—C16脂，或轉(zhuǎn)化成式NR1R2的酰胺，其中R1和R2是互不依賴的H或C1—C16烷基，或組合形成雜環(huán)，如5元或6元環(huán)。肽的氨基基團，不管是氨基末端還是側(cè)鏈，可以是藥用上可接受的加酸鹽形式，例如HCl，HBr，乙酸，苯甲酸，甲苯磺酸，馬來酸，酒石酸或其它有機酸鹽，或可被修飾為C1—C16烷基或雙烷基胺或進一步轉(zhuǎn)化為酰胺。使用熟知技術(shù)可將肽側(cè)鏈的羥基轉(zhuǎn)變?yōu)镃1—C16烷氧基或C1—C16酯。肽側(cè)鏈的苯和酚環(huán)可被一個或多個鹵素原子，如氟、氯、溴、碘、或被C1—C16烷基，C1—C16烷氧基、羧酸及其酯、或該羧酸的酰胺所取代。肽側(cè)鏈的亞甲基可延伸成同源C2—C4亞烷基。疏基可用任一熟知的保護基團如乙酰胺基團來保護。本領(lǐng)域的技術(shù)人員也將認識到將環(huán)狀結(jié)構(gòu)導(dǎo)入本發(fā)明的肽中以選擇和提供導(dǎo)致結(jié)合和/或穩(wěn)定性增強的結(jié)構(gòu)制約的構(gòu)象之方法。例如、可羧基末端或氨基末端的半胱氨酸殘基加入肽中，以便該肽氧化時含—二硫鍵，由此產(chǎn)生一環(huán)狀的肽。其它肽的環(huán)化方法包括疏基酯和羧基和氨基末端的酰胺和酯。此處明確地聲明，肽類似物和有機物類似物實施例也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，其中該肽類似物和有機物類似物的三維排列與本發(fā)明多肽骨架結(jié)構(gòu)和氨基酸側(cè)鏈成份相似，導(dǎo)致本發(fā)明肽的肽類似物和有機物類似物具有重要的生物學(xué)活性。它提示每種BPI的所述活性存在一種藥效基團。芘效基團是一種預(yù)測的，為生物學(xué)活性所必需的三維結(jié)構(gòu)的定義。用通用的計算機模擬軟件(計算機輔助藥物設(shè)計)可設(shè)計出適合每個藥效基團的肽類似物和有機物的類似物。藥效基團之間的特異性活性的重疊程度仍有待于鑒定。BPI功能區(qū)多肽的給藥可采用含有BPI功能區(qū)多肽和允許藥用的稀釋劑，佐劑，或載體制成藥用組合物。BPI功能區(qū)肽組合物可與已知的抗生素、表面活性劑或其他化學(xué)治療劑聯(lián)合或單獨給藥。在申請日為1993年2月2日的共同擁有，共同提交的美國專利申請系列NO.08/012,360及其部分延續(xù)的申請日為1994年2月2日的美國專利申請系列NO.08/190,869中已描述了這種組合的實施例，此處引用其公開以供參考。本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易根據(jù)與相應(yīng)生物學(xué)活性相聯(lián)系的通用參數(shù)，例如包括病人的體重，細菌感激的程度和特征。內(nèi)毒素休克的程度和特征，以及對象施用肝素的數(shù)量和施用肝素后的時間來鑒定用于殺菌活性的BPI功能區(qū)肽的有效劑量；對肝素抗凝活性的部分或全部中和，對LPS的部分或全部中和以及其他本發(fā)明所述的作用等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員同樣能使用本發(fā)明實施例的肽來確定本文所述和所期望的治療用途。本發(fā)明的實施例包含的藥物可制備成口服劑，注射劑或其他腸胃外方法的藥劑，并最好包括本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的常規(guī)允許藥用的載體、佐劑和平衡離子。該藥物的最佳形式為單位劑量的固態(tài)、半固態(tài)和液體劑型，如片劑、丸劑、粉末，液體溶液或懸液，以及可注射的和可吸收的溶液。預(yù)期的有效劑量范圍為從約100kg/kg到約10mg/kg體重。下面實施例是本發(fā)明具體實例及其各種用途的例證。實施例1描述了BPI蛋白質(zhì)裂解片段的制備；實施例2描述了用實施例1的蛋白質(zhì)裂解片段進行殺菌試驗的結(jié)果；實施例3描述了用實施例1的蛋白質(zhì)裂解片段進行肝素結(jié)合試驗的結(jié)果；實施例4描述了使用鱟屬阿米巴細胞溶胞產(chǎn)物試驗實施例1的蛋白質(zhì)裂解片段LPS結(jié)合活性的實驗結(jié)果；實施例5描述了BPI15—聚體肽的制備；實施例6描述了使用實施例5的15—聚體肽進行肝素結(jié)合試驗的結(jié)果；實施例7描述了使用實施例5的15聚體肽進行鱟屬阿米巴細胞溶胞產(chǎn)物試驗的結(jié)果；實施例8描述了實施例5的15聚體肽殺菌試驗的結(jié)果；實施例9描述了BPI各個功能區(qū)肽的制備；實施例10描述了使用實施例9的BPI各個功能區(qū)肽進行肝素結(jié)合試驗的結(jié)果；實施例11描述了使用實施例9的BPI各個功能區(qū)肽進行肝素中和試驗的結(jié)果；實施例12描述了使用實施例9的BPI各個功能區(qū)肽進行LPS中和活性的鱟屬阿米巴細胞溶胞產(chǎn)物試驗的結(jié)果；實施例13描述了實施例9的BPI各個功能區(qū)肽殺菌試驗的結(jié)果；實施例14描述了BPI功能區(qū)肽組合體的制備；實施例15描述了實施例14的BPI功能區(qū)肽組合體的殺菌活性試驗；實施例16描述了實施例14的BPI功能區(qū)肽組合體額外的殺菌活性試驗；實施例17描述了使用實施例14的BPI功能區(qū)肽組合體進行體內(nèi)和體外肝素中和試驗的結(jié)果；實施例18描述了BPI取代的各種功能區(qū)肽的制備和殺菌活性，肝素結(jié)合活性和LPS中和活性試驗的功能活性分析；實施例19總結(jié)了有代表性的BPI功能區(qū)肽對殺菌和肝素結(jié)合試驗的結(jié)果；實施例20描述了在各種結(jié)合和中和試驗中BPI功能區(qū)肽的分析；實施例21論述了肝素中和試驗；實施例22描述了在膠原蛋白和細菌誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎動物模型系統(tǒng)中用BPI功能區(qū)肽給藥來例證對慢性炎癥疾病狀態(tài)的治療；實施例23闡明了在小鼠惡性黑色素瘤轉(zhuǎn)移模型系統(tǒng)中BPI功能區(qū)肽的血管抑制作用試驗；實施例24論述了BPI功能區(qū)肽對內(nèi)皮細胞增生的影響；實施例25描述了在動物模型系統(tǒng)中BPI功能區(qū)肽的分析；實施例26描述了在人體內(nèi)試驗本發(fā)明BPI功能區(qū)肽的抗內(nèi)毒素效果的方案。實施例BPI蛋白水解片段的制備對rBPI23進行化學(xué)裂解和酶促消化處理，以產(chǎn)生重組BPI蛋白質(zhì)的各種不同大小的蛋白水解片段。如用溴化氰(CNBr)或蛋白內(nèi)切酶Asp—N進行蛋白水解之前還原并烷基化處理rBPI23。加入冷(4℃)丙酮(1∶1V/V)后經(jīng)過液沉淀使蛋白質(zhì)脫鹽，并在離心(5000×9)10分鐘后經(jīng)沉淀回收沉淀的蛋白質(zhì)。用冷丙酮將rBPI23蛋白質(zhì)沉淀團塊洗兩次并在氮氣流下干燥之。然后在8M尿素/0.1MTris—HCl(pH8.1)中重新配制rBPI23溶液使其終濃度為1mg蛋白質(zhì)/ml，并加入3.4mM二硫蘇糖醇(Cal-biochem，SanDIego，CA)于37℃處理90分鐘以還原之。加入碘乙酰胺(SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)至終濃度5.3mM并在暗處于室溫下保溫30分鐘以完成烷基化。用丙酮沉淀、離心并按上述方法洗經(jīng)過還原和烷基化的蛋白質(zhì)，然后重新溶解沉淀餅以按下述方法進行CNBr或Asp—N消化。為進行CNBr催化的蛋白質(zhì)片段裂解，首先將蛋白質(zhì)沉淀餅溶解在70％三氟乙酸(TFA)(ProteinSequencingGrade，SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)中至蛋白質(zhì)濃度為5mg/ml。加入溶解可70％TFA中的溴化氰BakerAnalyzedReagent，VWRScientific，SanFrancis-co，CA)，達到CNBr至蛋白質(zhì)2∶1(W/W)的最終比例。這一比例使CNBr相對于rBPI23蛋白質(zhì)中蛋氨酸殘基數(shù)目而言大約是75倍摩爾過量。用氮氣清洗反應(yīng)混合物并使反應(yīng)在暗處于室溫下進行24小時。加入9倍體積的蒸餾水終止反應(yīng)，并冷凍(-70℃)并凍干之。為進行蛋白內(nèi)切酶消化，將經(jīng)過還原和烷基化的rBPI23以0.5mg/ml的濃度溶解在8M尿素/0.1MTris—HCl(pH8.1)中。然后加入等體積的0.1MTris—HCl(pH8.1)以使5M尿素/0.1MTris—HCl(pH8.1)中含有濃度為2.5mg/ml的蛋白質(zhì)。以1∶1000(W/W，酶底物)的比例加入得自Pseudomonasfragi的蛋白內(nèi)切酶Asp—N(Boehringer—Mannhein，Indianapolis，IN)，并于37℃消化6小時。加入終濃度為0.1％的TFA終止反應(yīng)，然后經(jīng)反相HPLC分級分離樣品。在Zorbax蛋白質(zhì)加C3柱(4.6×250mm，300A孔經(jīng)，MACMODAnalyticalInc，Chadsford，PA)上純化CNBr和Asp—N片段混合物。在2小時洗脫期間內(nèi)以1.0ml/分鐘的流速在該柱上通過從5％乙腈(溶于0.1％TFA)至80％乙腈(溶于0.1％TFA)范圍的洗脫梯度。使用BeckmanSystemGoldHPLC(BeckmanScientficInstruments.SanRamon，CA)于220mm處監(jiān)測各洗脫部分。使柱加熱分隔保持在35℃并手工收集各管，于-70℃下冷凍并在SpeedVac濃縮器中干燥。然后將各部分溶解在20mM乙酸鈉(pH4.0)/0.5MNaCl的溶液中備用。由FrancisBitsch博士和JohnKim博士在laboratoryofDriCedricShaehleton，Children’sHospital—OaklandResearchInstitute中，在VGBio—Q質(zhì)譜儀上進行電噴射離子化質(zhì)譜分析(ESI—MS)。根據(jù)對數(shù)據(jù)的術(shù)學(xué)轉(zhuǎn)化得到分子質(zhì)量。雖然rBPI23的DNA序列編碼成熟蛋白質(zhì)的氨基酸殘基1—199，但根據(jù)ESI—MS測定結(jié)果，所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的有意義部分是在Letu—193和Val—195處截短的。經(jīng)分離羧基末端胰酶解肽、測定其序列并用ESI—MS法分析，證實這些羧基末端截短序列的存在。在rBPI23蛋白質(zhì)中的56、70、100、111、170和196位上共有6個蛋氨酸，并如所預(yù)期的經(jīng)用溴化氰化學(xué)裂解后產(chǎn)生6個主要肽片段。CNBr裂解實驗的結(jié)果總結(jié)于表1中。以反相(C3)HPLH法分離各片段(圖1a)并經(jīng)Edman降解確定它們的氨基末端序。用C3H-PLC柱層析和進一步嘗試的離子交換層析，均沒有將兩個最大的片段(C1和C5)分辨開，推測這可能是因為它們有相似的長度和等電點。經(jīng)ESI—MS確定混合物內(nèi)C1和C5片段的特征。推測的C1質(zhì)量為6269(表1)，考慮這是由于在CNBr裂解反應(yīng)期間羧基末端蛋氨酸轉(zhuǎn)化成高絲氨酸而丟失30a.m.u.o所觀察到的6251.51±0.34的質(zhì)量與高絲氨酸內(nèi)酯中間體中丟失水分子(18a、m、u)相符—由于C1片段C末端氨基酸的疏水性，故其有利于高絲氨酸的生成。推測的C5)片段的質(zhì)量為6487，且所觀察到的質(zhì)量為6385.84±0.39(表1)。對于C5片段，C末端氨基酸是親水的，所以可能有利于高絲氨酸內(nèi)酯中間體的水解。根據(jù)序列分析和質(zhì)譜數(shù)據(jù)，C5成分代表C1/C5混合物中材料的大約10—25％。用蛋白內(nèi)切酶Asp—N進行蛋白水解裂解，以提供CNBrC1/C5混合物內(nèi)所包含之區(qū)域的其他片段。rBPI23序列內(nèi)分別在位置15、36、39、57、105和116上共有6個天冬氨酸殘基。測定以C3HPLC分離之6個大Asp—N片段的序列并用ESI—MS測定質(zhì)量(表1)。以1∶1000(W/W，酶底物)的比例進行短期間消化以排除可能的非特異性裂解，特別晨谷氨酸殘基處的裂解。很明顯，這一消化并沒有全部完成，因為分離到了一個Asp殘基(氨基酸15和35)未被裂解的片段(1—38)。Asp—N片段的質(zhì)譜與預(yù)略的各別片段的質(zhì)量相符。與CNBr裂解不同的是羧基末端片段很難分解，可從所有其他Asp—N片段中很好地分辨出從氨基酸116至羧基末端的Asp—N片段。表IrBPI23裂解片段分析的總結(jié)實施例2BPI蛋白水解片段的殺菌效果在環(huán)狀擴散試驗中，使用粗糙型突變體E.coliJ5細菌根據(jù)殺菌效果篩選按實施例1所述方法產(chǎn)生的BPI蛋白水解片段。具體地說，將過夜的E，coliJ5培養(yǎng)物1∶50稀釋到新鮮的胰酶水解大豆培養(yǎng)液中并于37℃保溫3小時，以達到培養(yǎng)物的對數(shù)期生長。然后在Sor-vallRT6000B離心機(SorvallInstruments，Newton，CT)中以3,000rpm離心30分鐘沉淀細菌。加入5ml量的10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.4)并再次離心沉淀之。棄去上清并加入5mL新鮮緩沖液，重新懸浮細菌并經(jīng)于590nm測定吸光率以確定其濃度(在此波長處1.00吸光率值相當(dāng)于懸液中1.25×109CFU/ml的細菌濃度)。在10ml融化的下層瓊脂糖中(約在45℃)將細菌稀釋成4×106CFU/ml，并反復(fù)倒轉(zhuǎn)以在常規(guī)用于此目的的15ml聚丙烯試管中混合之。然后將試管的全部內(nèi)容物倒入水平正方形培養(yǎng)皿中并左右搖動使之分布均勻。瓊脂糖在30秒鐘內(nèi)凝固并有大約1mm的均一厚度。然后用接在真空裝置上的無菌的3mm打孔器在固化瓊脂糖上打出一系列的孔。使用前用100％乙醇消毒打孔器并用干，以避免污染細胞培養(yǎng)物。將5或10μl各BPI片段小心吸移到各小孔內(nèi)。向分立的小孔內(nèi)加入稀釋緩沖液(pH8.3)作為陰性對照，并加入濃度為5μg/ml和1μg/ml的rBPI23作為陽性對照。將各平板于37℃下保濕3小時，然后向水平培養(yǎng)皿中加入10mL融化的覆蓋層瓊脂糖(于大約45℃)，使凝膠固化并于37℃保溫過夜。第二天，看到在那些具有殺菌活性的孔中的對著菌苔的清晰帶。為了提高該帶的視覺可見度，在凝膠上倒入稀釋的考馬斯溶液(含有0.002％考馬斯亮蘭、27％甲醇、15％甲醛(37％儲備液)和水)并著染24小時。用測微計檢查細菌帶。當(dāng)以高達25pmol/孔的量試驗時，沒有鑒定出經(jīng)用CNBr或Asp—N消化所產(chǎn)生之rBPI23片段的殺菌活性。相反，使用低到0.75pmol/孔量的rBPI23則以該檢測法測到了可測出的殺菌活性。另一方面，其量高達100pmol/孔的經(jīng)還原并烷基化的rBPI23也沒有表出現(xiàn)殺菌活性，不過烷基化的rBPI23則保留了相當(dāng)于rBPI23的殺菌活性。實施例3BPI蛋白水解片段對肝素的結(jié)合按照1993年7月15日提交的待批美國專利申請序號08/093,202(該文獻列為本文參考文獻)的實施例1中所述的方法，以肝素結(jié)合試驗估計按上述實施例1制得的rBPI23和BPI蛋白水解片段。簡單地說，將各片段加到其底部配有聚偏二氟乙烯膜(Immobilon—P，Millipore，Bedford，MA)之96孔微量滴定板的小孔中。在每個含飽和濃度3H肝素(20μg/ml)中使用‘100pmol的各片段估測CNBr片段的肝素結(jié)合能力。陽性對照孔含有不同量的rBPI23。干燥小孔并用溶于磷酸鹽緩沖鹽水(pH7.4)中的0.1％牛血清白蛋白(BSA)封閉之。用封閉緩沖液制得3H—肝素(0.03—20LμCi/ml，平均分子量15，000；DuPont—NEN，Wilmington，DE)的稀釋液，并4℃下在含BPI小孔中保溫1小時。吸出未結(jié)合的肝素并用封閉緩沖液將小孔洗3次，干燥后在液體閃爍計數(shù)器(1217型，LKB，Gaithersburg，MD)中作定量分析。雖然封閉緩沖液中的BSA顯示了對結(jié)合肝素的低親和力和低容量，但認為這在生理上是無關(guān)的并且按常規(guī)從試驗化合物信號中扣除本底。鑒于用100倍過量的未標(biāo)記肝素可完全抑制放射標(biāo)記之肝素的結(jié)合，從而確定了片段—肝素結(jié)合的特異性(數(shù)據(jù)未示出)。表II中所示的結(jié)果(重復(fù)孔的平均值±兩個值的差)表明，含有氨基酸71—100(C3)和1—56及112—170(C1，5)的CNBr片段結(jié)合了相似量的肝素。CNBr片段171—196也比對照蛋白質(zhì)奇異果甜蛋白(thaumatin，一種與rBPI23有相似分子量和電荷的蛋白質(zhì))結(jié)合了更多的肝素。Asp—N片段還證明了rBPI23中的多個肝素結(jié)合區(qū)。如表II中所示，57—104Asp—N片段結(jié)合了最高量的肝素，其次是1—38和116—193片段。這些數(shù)據(jù)連同CNBr片段數(shù)據(jù)表明，rBPI23內(nèi)至少有3個分離的肝素結(jié)合區(qū)域，同時如由化學(xué)或酶學(xué)方法產(chǎn)生的rBPI23的片段所證明的，最高肝素結(jié)合能力是在殘基71—100范圍內(nèi)。表IIrBPI23片段的肝素結(jié)合實施例4BPI蛋白水解片段對LAL試驗的影響對按照實施例1所述方法產(chǎn)生的BPI蛋白水解片段進行鱟阿米巴狀細胞溶胞產(chǎn)物(LAL)抑制試驗，以確定這些片段的LPS結(jié)合性質(zhì)。具體地說，在Eppendorf試管中將各片段與固定濃度的E.col0113LPS(終濃度4ng/ml)混合并在不時振蕩下37℃保溫3小時。還試驗還0.05μg/mlrBPI23的添加對照組。保溫后，向各試管內(nèi)加入360μlDulbecco氏磷酸鹽緩沖鹽水(D—PBS；GrandIslandBiologicalCo.(GlBco)，LongIsland，NY)，以使用于LAL試驗的LPS濃度為200pg/ml。然后將各樣品以每孔體積50μl轉(zhuǎn)移到ImmulonII條(Dy-natechChantilly，VA)上。以50μl/孔的體積加入鱟阿米巴狀細胞溶胞產(chǎn)物(定量顯色LAL試驗盒，WhitakerBioproducts，Inc.，Walkersville，MD)并將小孔室溫保溫25分鐘。然后以每孔100μl的體積加入顯色底物并充分混合之。室溫保溫20至30分鐘后，經(jīng)加入100μl的25％(V/V)乙酸終止反應(yīng)。然后在多板讀數(shù)器(Vmax型，MolecularDynamics，MenloPark，CA)中測出在405nm處的光密度，并將以LPS的百分抑制率表示的經(jīng)果示于圖2中。在該圖中，實心圈代表rBPI23；空心圈代表Asp—N片段A3；x代表Asp—N片段A2；實心正方形代表Asp—N片段A4；實心三角形代表Asp—N片段A1A2；空心正方形代表Asp—N片段A6a；小空心正三角形代表CNBr片段C3，且小實心正方形代表CNBr片段C1/C5。含有氨基酸片段1—56和117—170的CNBr消化產(chǎn)物部分抑制LPS誘導(dǎo)的LAL反應(yīng)，IC50值約為100nM。該IC50值大約比在同一試驗中測得的完整rBPI23的IC50值(9nM)高10倍。發(fā)現(xiàn)其他CNBr消化產(chǎn)物片段是非抑制性的。用從Asp—N消化產(chǎn)物產(chǎn)生的片段觀察到稍微不同的結(jié)果，其中發(fā)現(xiàn)有3個片段在LAL試驗中是抑制性的。相當(dāng)于氨基酸116—193的片段表現(xiàn)出與完整rBPI23相似的LAL抑制活性，其濃度為15nM時即完全抑制LPS誘導(dǎo)的LAL反應(yīng)。相當(dāng)于氨基酸57—104和1—38的片段也抑制LAL反應(yīng)，但所用量要高10倍。這些結(jié)果加上用CNBr消化產(chǎn)物測得的結(jié)果進一步支持根據(jù)前述實驗結(jié)果得出的結(jié)論，即rBPI23分子的至少3個區(qū)域具有中和LBS對LAL反應(yīng)的激活作用，并且最強有力的區(qū)域似乎存在于116—193氨基酸片段內(nèi)。使用ELISA檢測法對實施例1中所述的rBPI23蛋白水解片段進行了免疫反應(yīng)性研究。在此檢測法中，使用能夠阻斷rBPI23殺菌和LAL抑制性質(zhì)的兔多克隆抗rBPI23抗體，和兩個不同的非阻斷性小鼠抗rBPI23單克隆抗體探測rBPI23蛋白水解片段。發(fā)現(xiàn)多克隆抗體對116—193和57—104Asp—N片段及1—56和112—170CNBr片段有免疫反應(yīng)活性，而小鼠單克隆抗體則只與代表rBPI23之殘基1—14的Asp—N片段反應(yīng)。實施例5BPI之15殘基肽的制備為了進一步確定按實施例—4所述BPI片段檢測法測得的生物學(xué)活性區(qū)域，制備由衍生于BPI的23KD氨基末端片段之氨基酸序列的15個氨基酸組成的15殘基合成肽，并估測其肝素結(jié)合活性、在鱟阿米巴狀細胞溶胞產(chǎn)物抑制(LAL)試驗中表現(xiàn)的活性以及殺菌活性。具體地說，基于以前在待批美國專利申請系列號08/093,202(1993年7月15日提交)中所述的rBPI23的序列，以一式兩份制備并合成各含15個氨基酸47個合成肽的系列，以使每個肽與該系列的相鄰肽共享有11個氨基酸的交迭氨基酸序列。同時利用CoselcoMimotopesPty.Lid.許可的CambridgeResearchBiochemicalsLtd.的固相技術(shù)，按照Maeji等人(1990，Immunol.Meth—ods13423—33)和Gammon等人(1991，J.Exp.Med.173609—617)的方法合成上述肽。簡單地說，將rBPI23(1—199)的序列分成47個不同的15殘基肽，該肽系列以每到第5個氨基酸即開始下一個肽的方式沿著rBPI23的線性序列前進。該肽合成技術(shù)允許在96孔板形式中分隔的小柱(Pins)上同時小規(guī)模合成多種肽。為此，利用了94個單個的小柱進行合成，而其余兩個小柱(B，B)除去不加入活化的加入活化的FMOC—氨基酸處，和其余94個小柱同樣步驟合成。最后利用含水堿性緩沖液(碳酸鈉，pH8.3)從固相小柱支持物上裂解15殘基肽。在這樣的條件下多肽唯一與小柱的鍵合發(fā)生定量的二酮哌嗪環(huán)化，得到在各肽之羧基末端帶有cyclo(lysyprolyl)基團的裂解肽。氨基末端未被乙酰化從而可使游離氨基基團對陰離子結(jié)合反應(yīng)作出潛在貢獻。每孔收集平均約15μg各15模肽。實施例6BPI的15殘基肽對肝素的結(jié)合按照實施例3中所述方法對實施例5中所述的BPI15模肽進行肝素結(jié)合試驗。這些實驗的結(jié)果示于圖3中，并以結(jié)合的總cpm數(shù)減去只接受封閉緩沖液的對照孔結(jié)合的cpm數(shù)來表赤。這些結(jié)果表明在rBPI23序列中存在三組不同的代表分隔的肝素結(jié)合功能區(qū)的肝素結(jié)合肽。在BPI序列中，發(fā)現(xiàn)第一個區(qū)域從大約氨基酸21處延伸至大約氨基酸51-處；發(fā)現(xiàn)第二個區(qū)域從大約氨基酸65處延伸至大約氨基酸107處；并且發(fā)現(xiàn)第三個區(qū)域從大約氨基酸137處延伸到大約氨基酸171處。來自空白對照小柱的材料未顯示有肝素結(jié)合作用。實施例7BPI的15殘基肽對鱟阿米巴樣細胞溶胞產(chǎn)物(LAL)試驗的影響使用實施例4中所述的LAL試驗來檢測實施例5中所述15殘基肽的LPS結(jié)合活性。這些實驗的結(jié)果示于圖4中。圖4中的數(shù)據(jù)表明，代表rBPI23蛋白質(zhì)之三個不同區(qū)域的至少3個主要亞組的肽具有導(dǎo)致顯著LAL抑制作用的LPS結(jié)合活性。發(fā)現(xiàn)第一個區(qū)域從大約氨基酸17延伸到大約氨基酸55；第二個區(qū)域從大約氨基酸73延伸到大約氨基酸99；且第三個區(qū)域從大約氨基酸137延伸到大約氨基酸163。另外，如圖中所示的其他個別肽也表現(xiàn)有LAL抑制作用。相反，如用LAL檢測法測知的，來自空白對照小柱的材料并沒有表現(xiàn)任何LPS中和作有。實施例8BPI的15殘基肽的殺菌效果用實施例2中所述的環(huán)狀擴散法試驗實施例5中所述15殘基肽的對E.coli之粗糙突變菌株(J5)的殺菌效果。來自空白小柱(B，B)的產(chǎn)物作為陰性對照。圖5中顯示了試驗的結(jié)果。發(fā)現(xiàn)具有殺菌活性的僅有的15殘基肽是相當(dāng)于BPI蛋白質(zhì)之氨基酸85—99的肽。如圖5所示，有不同量rBPI23的陽性對照孔也顯示了殺菌活性，而緩沖液和空白小柱對照組則沒有。這些殺菌試驗連同以上實施例中所述的肝素結(jié)合和LAL試驗的結(jié)果表明，在BPI蛋白質(zhì)中存在不同的功能性區(qū)域。上述實施例1—8中所示的結(jié)果表明，rBPI23至少包含3個貢獻于分子之總生物學(xué)活性的功能區(qū)域。第一個區(qū)域出現(xiàn)在大約氨基酸17和45間的序列中并可在殘基38處經(jīng)Asp—N裂解而被破壞。該區(qū)域在抑制LPS誘導(dǎo)的LAL活性上和肝素結(jié)合試驗表現(xiàn)有中度活性。第二個功能區(qū)域出現(xiàn)在大約氨基酸65和99之間的區(qū)域中，并且其對LPS誘導(dǎo)的LAL活性的抑制作用可因在殘基70處的CNBr裂解而減小。該區(qū)域還表現(xiàn)有最高的肝素結(jié)合能力并含有殺菌肽，即氨基酸85—99。位在大約氨基酸142和169間的第三個功能區(qū)域在抑制LPS誘導(dǎo)的LAL刺激試驗中有活性，并且是這三個區(qū)域表現(xiàn)有最低肝素結(jié)合能力的區(qū)域。實施例9BPI個別功能區(qū)肽的制備基于對實施例5至8中所述交迭肽系列所作試驗的結(jié)果，使用AppliedBiosystems，Inc.432型肽合成儀，按照Merrifield(1963，J.Am.Chem.Soc.852149)和Merrifield等人(1966，Anal.Chem.381905—1914)所述的固相肽合成方法從BPI蛋白質(zhì)的各功能性限定的區(qū)段制備BPI功能區(qū)肽。制備具有下列表III中所列出之BPI之氨基酸殘基1—199部分的氨基酸序列的BPI功能區(qū)肽，并將它們分別定名為BPI.2至BPI.5和BPI.8表III個別BPI功能區(qū)肽<p>實施例10NPI個別功能區(qū)肽的肝素結(jié)合活性按照實施例3中所述方法檢測BPI個別功能區(qū)域肽BPI.2、BPI.3和BPI.8，連同rBPI21Δcys的肝素結(jié)合活性。圖6中所示結(jié)果表明，BPI.3和rBPI21Δcys具有中度肝素結(jié)合活性，BPI.2和BPI.8則有很小或沒有肝素結(jié)合活性。實施例11BPI個別功能區(qū)肽的肝素中和活性按照1993年7月15日提交的共同待批和轉(zhuǎn)讓的美國專利申請系列號08/093,202中實施例3的方法檢測BPI功能區(qū)域肽BPI.2、BPI.3、BPI.4、BPI.5、BPI.6和BPI.8，連同作為陽性對照的rBPI23對由ATIII/肝素復(fù)合物引起的凝血酶失活作用的影響。具體地使用ChromostrateTM抗凝血酶檢測試劑盒(OrganonTeknikaCorp.，Durham，NC)檢測血漿中預(yù)生成的ATIII/肝素復(fù)合物對純化之凝血酶的抑制作用。簡單地說，在96孔微量滴定板中以每孔200μl的終體積一式三份進行檢測。檢測從1.0μg/ml到100μg/ml范圍內(nèi)不同濃度的BPI功能區(qū)肽，以確定在預(yù)生成的ATIII/肝素復(fù)合物存在下它們對凝血酶抑制作用的影響。加入檢測組份的次序如下1)以終體積50μl在PBS中稀釋的rBPI23或BPI功能區(qū)域肽或作為對照蛋白質(zhì)的thaumatin的系列稀釋液，終濃度分別為100、50、25、10和1μg/孔；2)50μl在由制造商提供的緩沖液中1∶100稀釋的血漿；3)50μl在由制造商提供的緩沖液制得的濃度為1nKat/ml的凝血酶；4)50μl在水中濃度為1μmol/ml的生色底物。使反應(yīng)在37℃下進行10分鐘，并經(jīng)加入50μl0.1M檸檬酸終止反應(yīng)。在實施例3中所述的微量板讀數(shù)器上定量比色反應(yīng)結(jié)果。這些檢測的結(jié)果示于圖7a和7c中，其中分別以重量或摩爾濃度表示樣品濃度。BPI功能區(qū)域肽BPI.3和BPI.5各自都表現(xiàn)有最顯著的肝素中和效應(yīng)。在這些試驗中，對照蛋白質(zhì)奇異果甜蛋白沒有顯示中和作用，并且在所有蛋白質(zhì)濃度下都基本上等同于緩沖液對照組。實施例12用LAL檢測法測得的BPI個別功能區(qū)肽的LPS中和活性按照本文實施例4的方法，以LAL試驗估測BPI功能區(qū)肽NPI.2、BPI.3和BPI.8，以及作為陽性對照的rBPI23，確定這些肽的LPS結(jié)合和抑制特性。實驗基本上按實施例3中所述方法進行并且結(jié)果顯示于圖8a和8b，其中樣品濃度分別表示為重量或摩爾濃度。結(jié)果表明BPI.3具有中度LPS抑制活性，BPI.2和BPI.8則沒有明顯的LPS抑制活性。實施例13BPI個別功能區(qū)肽的殺菌活性試驗按照實施例2的方法，以環(huán)狀擴散檢測法檢驗BPI功能區(qū)域肽BPI.2、BPI.3和BPI.8，連同作為日性對照的rBPI23對E.coliJ5(粗糙型)和E.coliO111B4(光滑型)細菌的殺菌作用。這些結(jié)果證明，BPI功能區(qū)肽BPI.2和BPI.3各自都表現(xiàn)有殺菌活性，而BPI.8則幾乎沒有殺菌活性。顯示殺菌活性的各殺菌肽傾向于對粗糙型E.coli菌株比對光滑型更為有效。在附加實驗中，進行液體培養(yǎng)基抗菌試驗以進一步確定某些BPI肽的殺菌活性。具體地說，從瓊脂平板上的單個菌株中選擇E.coliJ5(粗糙型)或E.coliO111B4(光滑型)細菌，將其接種5mlMuellerHinton液體培養(yǎng)基并在37℃下振蕩保溫過夜。將過夜培養(yǎng)物稀釋(約1∶50)到5ml新鮮液體培養(yǎng)基中并在37℃下培養(yǎng)至對數(shù)生長期(約3小時)。以3000rpm(1500×9)離心5分鐘以沉淀分離細菌。將細菌沉淀餅重新懸浮在5mlPBS中用MuellerHinton培養(yǎng)基稀釋至2×106細胞/ml(其中10D570單位等于1.25×109CFU/ml)。將待試驗的BPI功能區(qū)肽在液體培養(yǎng)基中稀釋到200μg/ml并在96孔平板中作2倍系列稀釋(100μl體積)。所有各項均在乙溶終濃度并以每一濃度三份樣品進行實驗。以100μl/孔加入細菌并將平板放在振蕩器上37℃保溫20小時。然后在ELISA平板多頭讀數(shù)器上讀590nm吸光率。在每個肽濃度的三個孔中選擇一個進行菌落形成單位(CFU)測定。向270μlPBS中加入30μl等分樣品并再次進行10倍系列稀釋。然后將50μl等分析品接種在胰酶水解大豆瓊脂上并保溫過夜。計數(shù)菌落數(shù)并測定細菌終濃度。圖9e(E.coliJ5)和9f(E.coliO111B4)中圖示這些試驗的結(jié)果。如這些圖中所示，BPI功能區(qū)肽NPI.3具有明顯的抗E.coliJ5細菌的抗菌活性，并有較弱的抗E.coliO111B4細菌的活性。實施例14BPI細合功能區(qū)肽的制備使用實施例9中所述的固相化學(xué)合成法制制結(jié)合肽。這些肽的序列示于表IV中。將會注意到，定名為BPI.7、BPI.9和BPI.10的肽代表部分的BPI序列甚或某些BPI序列的多次重復(fù)。具體地說，NPI.7包含由單一線性肽鏈中重復(fù)兩次的氨基酸殘基90—99組成的20線基部分。BPI.10包含分別由單一線性肽鏈中氨基酸殘基94—99、90—99、90—99和93—99、90—99、90—99組成的25殘基(稱為BPI.10.1；SEQIDNO55)和26殘基(定名為BPI10.2；SEQIDNO65)的約50∶50混合物。BPI.9包含單一線性肽鏈中的氨基酸殘基94—99然后是殘基90—99。將這些肽用于實施例10—13中所述的各個BPI活性檢測法中。在實施例10中所述的并在圖6中顯示結(jié)果的肝素結(jié)合試驗中，BPI.7具有極強的肝素結(jié)合能力。在實施例11中描述并在圖7a和7b中顯示結(jié)果的肝素中和試驗中，BPI.7與rBPI23相比具有更明顯的肝素中和效應(yīng)。在實施例12中描述并在圖9a—9d中所示的使用環(huán)狀擴散平板的殺菌試驗中，BPI功能區(qū)域肽BPI.7、BPI.9和BPI.10.1及BPI.10.2均表現(xiàn)有殺菌活性，同時還發(fā)現(xiàn)BPI.7、BPI.9和BPI.10.1及BPI.10.2在液體培養(yǎng)基檢測法中也表現(xiàn)有抗粗糙型和平滑型E.coli變異菌株的顯著殺菌活性。BPI.10肽顯示有抗上述細菌菌株的最強殺菌活性。用肽BPI.7和BPI.10測得的這些殺菌活性結(jié)果顯示，BPI區(qū)域II肽KWKAQKRFLK(即BPI.8，SEQIDNO8)的線性二聚體(BPI.7)和線性多聚體(BPI.10.1和BPI.10.2)的混合物具有抗E.-coliJ5菌株的殺菌活性，但單體(BPI.8)基本上未顯示殺菌活性。此外，二聚和多聚體肽具有包括氨基酸94—99、90—99的BPI.9的較高殺菌活性?；谶@些結(jié)果，使用實施例9中所述的方法合成表IV中所示的其他肽。表IVBPI組合功能區(qū)肽<p>實施例15組合功能區(qū)肽的殺細菌活性將實施例14中所述的BPI組合功能區(qū)域肽用于基本上如上文實施例2和13中所述的環(huán)狀擴散殺菌試驗。這些結(jié)果示于圖10a—10e。圖10a中所示結(jié)果證明，包括區(qū)段II肽(氨基酸90—99)之一個拷貝的BPI.8在1000μg/ml下沒有抗E.coliJ5細胞的可檢測的殺菌活性。相反，包含區(qū)段III單體(氨基酸148—161)之一個拷貝的BPI.13的BPI.13在濃度大于30μg/ml下顯示有可檢測的殺菌活性。包含區(qū)段II單體BPI.13之兩個拷貝的BPI.29具有更強的殺菌活性，而包含區(qū)段II肽BPI.8和區(qū)段III肽BPI.13之線性結(jié)合的BPI.30則顯示接近BPI的最高抗J5細胞的殺菌活性。圖10b顯示用包括BPI.8、BPI.7和BPI.10的區(qū)段II肽所作實驗的結(jié)果(還參見表IV)。雖然BPI.8在1000μg/ml濃度下沒有顯示抗E.coliJ5細胞的殺菌活性，但組合肽BPI.7和BPI.10則顯示有高水平的殺菌活性。使用各種不同的其他細菌作為靶細胞進行附加實驗，以檢驗這些BPI功能區(qū)肽的殺菌范圍。圖10c顯示使用E.coli菌株07—K1所作環(huán)狀擴散實驗的結(jié)果。在這些實驗中，rBPI23在100μg/ml濃度下沒有顯示殺菌活性，甚至在1000μg/ml的濃度下也只有低的殺菌活性。發(fā)現(xiàn)包括區(qū)段II(DII)單體的肽BPI.8和包括區(qū)段III(DIII)單體的BPI.13同樣只有低水平的殺菌活性，盡管發(fā)現(xiàn)BPI.13的活性水平高于rBPI23。令人驚奇的是，區(qū)段II二聚體BPI.7和區(qū)段II—區(qū)域III(DII—DIII)異二聚體BPI.30顯示了高水水平的殺菌活性，并且區(qū)段III二聚體BPI.29顯示了中度殺菌活性。這些結(jié)果證明，本文鑒定的功能性BPI功能區(qū)的肽具有定量上不同于BPI分子本身之殺菌活性的殺菌活性。圖10d和10e顯示的結(jié)果進一步證明，本文所述的同二聚體或并二聚體具有定性和定量上抗敏感菌株的不同的殺菌活性譜。圖10d顯示使用肺炎桿菌(Klebsiellapneumroniae)細菌所作環(huán)狀擴散試驗的結(jié)果。DII—DIII異二聚體BPI.30顯示了最高水平的抗該細菌的殺菌活性，DIII同二聚體BPI.29顯示了中度水平的活性，且DII二聚體(BPI.7)和DIII單體(BPI.13)顯示了低水平活性。在800μg/ml濃度下包括DII單體的BPI.8沒有顯示殺菌活性，這與用E.coli菌株所作試驗證明的該肽缺乏殺菌活性這一結(jié)果相等。圖10e顯示使用革蘭氏陽性細菌金黃色葡萄球菌(Staphylococ-cusaurens)所作環(huán)狀擴散實驗中觀察到的殺菌活性水平。DII—DIII異二聚體BPI.30顯示了抗該細菌的最高殺菌活性，DIII同二聚體BPI.29顯示了中等水平的活性，且DII二聚體(BPI.7)和DIII單體(BPI.13)顯示了低水平活性。包括DII單體的BPI.8在800μg/ml濃度下沒有顯示殺菌活性，這與用其他細菌觀察到的該肽缺乏殺菌活性的結(jié)果一致。上述結(jié)果顯示，本文公開的同二聚體和異二聚體具有不同量的殺菌活性，這種不同體現(xiàn)在殺菌活性的大小和測得殺菌活性所必需的肽的最小有效濃度。這些結(jié)果還顯示，這些肽在定量上，特別是在定性上具有與BPI本身不同的殺菌活性。實施例16BPI組合功能區(qū)肽的附加殺菌活性從實施例15中公開的實驗結(jié)果來看，區(qū)段II—區(qū)段III結(jié)合肽抗多種不同細菌和其他微生物的殺菌活性與BPI區(qū)段II和區(qū)段III肽各組分的殺菌活性差不多。將如上所述的下列BPI功能區(qū)肽用于環(huán)狀擴散殺菌試驗(實施例2)和基本上如實施例15中所述的液體培養(yǎng)基殺菌試驗(實施例13)。這些結(jié)果示于圖11a—11q中。這些附圖顯示了使用下列細菌菌株所作殺菌試驗的結(jié)果革蘭氏陽性細菌測定的BPI肽PseudomonasaeruginosaBPI.8，BPI.13，BPI.30E.coliO18K1H7BPI.8，BPI.13，BPI.30KlebsiellapnewnoniaeBPI.8，BPI.13，BPI.30EcoliO75BPI.8，BPI.13，BPI.30SerratiamarcescernsBPI.8，BPI.13，BPI.30ProteusmirabilisBPI.2，BPI.13，BPI.30SalmonellatyphuriumBPI.23，BPI.30E.coliO86aK61BPI.23，BPI.30E.coliO4K12BPI.30革蘭氏陽性細菌StreptococcuspneumoniaBPI.29，BPI.30.，BPI.48，BPI.55，BPI.13，BPI.69BacillusmegateriumBPI.2，BPI.7，BPI.45，BPI.46，BPI.47，BPI.48StaphyLococcusaureusBPI.7，BPI.8，BPI.10，BPI.13，BPI.30真菌CandidaalbicansBPI.30，BPI.13，BPI.29，BPI.48，BPI.2現(xiàn)將這些實驗的結(jié)果總結(jié)如下。所試驗的BPI肽均沒有顯示對抗粘質(zhì)沙雷氏菌(S.marcescens)(圖11f)或假單胞菌(P.mirabilis)(圖11g)的任何殺菌活性。BPI.8在濃度高達約2000pmol時沒有顯示對抗所有被試微生物的殺菌活性。BPI.13和BPI.30顯示有對抗綠膿假單胞菌(P.aeruginosa)(圖11a)和E.coliO18K1H7)(圖11b)、肺炎桿菌(圖11c)和E.coliO75(圖11d)的殺菌活性。另外，BPI.30在液體培養(yǎng)基試驗中顯示有對抗傷寒桿菌(S.typhurium)(圖11b)和E.ColiO86aK51(圖11j)及E.ColiO4K12圖11k)的殺菌活性。BPI.23在環(huán)狀擴散試驗中顯示有對抗E.ColiO86aK61(圖11i)的殺菌活性。此外，BPI.30顯示有對抗人血清中E.coliO86aK61(圖11e)的殺菌活性。還試驗了本發(fā)明提供的BPI肽對革蘭氏陽性細菌的殺菌能力。令人驚奇的是，在使用金黃色葡萄球菌(圖11e)、肺炎桿菌(圖11m)和巨大芽胞桿菌(B.megatherium)(圖11n)所作的環(huán)狀擴散試驗中，所試驗的每種BPI肽在濃度約為20至2000pmol范圍內(nèi)均顯示了一定程度的殺菌活性。這些結(jié)果顯然與抗生素慶大霉素和萬古霉素的殺菌活性差不多(圖110)。特別令人驚奇的是，發(fā)現(xiàn)一種肽，即BPI.13在用白色念珠菌(Candidaalbicans)進行的液體培養(yǎng)基試驗中表現(xiàn)有殺真菌活性(圖11p和11g)。如這些附圖中所示，BPI.13的活性可明顯地區(qū)別于有更低活性水平的BPI.2、BPI.29、BPI.30和BPI.48。這些結(jié)果證明，本發(fā)明的BPI功能區(qū)肽具有性質(zhì)上不同于以前報導(dǎo)的天然BPI之活性的抗微生物活性。實施例17BPI組合功能區(qū)肽的肝素中和活性經(jīng)檢測BPI組合功以區(qū)肽可逆轉(zhuǎn)肝素化全血和血漿中肝素對凝血時間的抑制效應(yīng)，確定這些實施例14中制備的肽具有體外和體內(nèi)肝素中和能力。在體外，檢測BPI組合功能區(qū)肽對肝素介導(dǎo)的活化部分凝血酶時間(APTT)延長的影響。APTT因外源性或內(nèi)源性凝血酶形成的抑制劑，如治療給藥的肝素存在而被延長。因此，中和肝素之抗凝作用的制劑將會縮短試驗測得的APTT。將加有檸檬酸鹽的人血漿(200μl)與15μl稀釋劑(0.15MNaCl，0.1MTris—HCl，pH7.4)或15μl還含有25μg/ml肝素(187單位/mg)的稀釋劑于37℃共同保溫1分鐘。以15μl體積加入不同濃度(從0.0至56μg/ml)的rBPI23、rBPI21Δcys或BPI組合肽BPI.29(DIII同二聚體)和BPI.30(異二聚體DII＋DIII)，然后立即加入100μl凝血酶試劑(批號845—4，Sig-maChemicalCo.，St.Louis，MO)。使用BBLFibrometer(BectonDicken-sonMicrobiologySystems，Cockeysville，MD)檢測血凝時間(凝血酶時間)。結(jié)果示于圖12a、12b和12e中。圖12a顯示經(jīng)加入不同量rBPI23或rBPI21△cys至使肝素延長的APTT相對減少。這些結(jié)果證明，這些相關(guān)蛋白質(zhì)都能抑制肝素介導(dǎo)的APTT延長。圖12b顯示BPI組合肝BPI.29和BPI.30也抑制肝素介導(dǎo)的APTT的延長。圖12e說明在非對數(shù)范圍上用BPI.30獲得的結(jié)果。圖12g顯示BPI.29、BPI.30、和BPI.7在該試驗中對肝素化全血的凝血時間有更大影響。BPI.3和rBPI23顯示較小的影響，且BPI.14、BPI.2、BPI.4、BPI.5、BPI.7和rBPI25、rBPI及rBPI21△cys在該試驗中均顯示對肝素化全血的凝血時間有較小減少作用。進一步檢測了注射肝素大鼠的BPI組合肽對APTT的體內(nèi)的影響，并與rBPI23的體內(nèi)效應(yīng)相比較。APTT因外源或內(nèi)源性凝血酶生成抑制劑如治療給藥的肝素的存在而被延長。中和肝素之抗凝劑效應(yīng)的制劑減少該試驗中測得的APTT。通過動物的尾靜脈給予按NIH指南飼養(yǎng)的Sprague—Dawley大鼠靜脈內(nèi)推注100U/kg肝素，5分鐘后給不同量的試驗蛋白質(zhì)或與rBPI23比較的對照蛋白質(zhì)。給予試驗或?qū)φ盏鞍踪|(zhì)后2分鐘從腹動脈采血測定血樣的APTT。同時測定未經(jīng)處理的動物，以及只用BPI肽處理的動物的APTT。圖12c顯示rBPI23對肝素介導(dǎo)的部分組織促凝血酶原激酶時間延長的抑制作用的劑量依賴性，并且在給予5mg/kgrBPI23后使注射肝素的經(jīng)用BPI處理的動物的APTT差不多與未經(jīng)處理的對照組動物一樣。圖12d中顯示的相似實驗的結(jié)果表明，無關(guān)蛋白質(zhì)奇異果甜蛋白對注射肝素動物的APTT時間沒有影響。給予BPI.10肽使注射肝素動物的APTT基本上與只用BPI.10處理的對照組動物的APTT相同。使用BPI.30也得到相似的結(jié)果(圖12f)。這些結(jié)果顯示，BPI功能區(qū)組合肽(如BPI.10和BPI.30)及rBPI23可有效地中和肝素對各種凝血蛋白酶的抑制作用?；谶@些特征而沒想將本發(fā)明的BPI組合功能區(qū)肽用于臨床上中和肝素抗凝血劑作用，所用劑量一般在功能上相當(dāng)于所推薦的硫酸魚精蛋白的劑量，而預(yù)期沒有魚精蛋白的嚴重酶致低血壓和類過敏反應(yīng)樣付作用。實施例18BPI取代變異體功能區(qū)肽的制備和功能活性分析以上用含功能區(qū)II和III的肽獲得的結(jié)果，促使我們作進一步的研究以確定肽內(nèi)功能上重要的氨基酸殘基。因此，制備了一系列包含區(qū)段II和III之氨基酸序列，但其中有一個氨基酸被丙氨酸殘基取代的肽。用于取代實驗的區(qū)段肽的圖解說明示于圖13(區(qū)段IIIKISGKWAQKRFLK，SEQIDNO7)和圖14(區(qū)段IIIKSKVG-WLIQLFHKK，SEQIDNO13)中。然后試驗這些肽系列的肝素結(jié)合親和力(Kd)、肝素結(jié)合能力(Hep—CAP)、如使用鱟阿米巴細胞溶胞產(chǎn)物試驗(LAL)測得的LPS中和作用，以及使用環(huán)狀擴散試驗(RAD)測定的對抗E.coliJ5的殺菌活性，各試驗均按上面實施例中所述的方法完成。表V(區(qū)段II)和表VI(區(qū)段III)所示的結(jié)果以在這些試驗中測得的BPI功能區(qū)II和區(qū)III及其各丙氨酸取代的變異肽間的活性倍數(shù)差表示(其中未注明LAL試驗中的相對差異)。就區(qū)段II肽來說，在環(huán)狀擴散試驗中大部分丙氨酸取代的肽都顯示殺菌活性降低2至10倍。該總體特征的例外包括BPI.19(Gly89—Ala89)、BPI.22(Lys92→Ala92)、BPI.23(Gln94一Ala94)和BPI.24(Lys95→Ala95)。相對的，大部分丙氨酸取代的肽在LAL試驗中沒有顯示差異；在該試驗中BPI.17(Ile87→Ala87)和BPI.21(Trp91→Ala91)分別顯示活性的中度和大的增加。對于BPI.21，這些結(jié)果與發(fā)現(xiàn)該肽殺菌活性降低10倍相符，表明氨基酸91(天然序列中的色氨酸殘基)在賦予該肽以生物學(xué)活性上是特別重要的。在幾乎所有例子中，丙氨酸取代對肝素結(jié)合力的影響上下不超過未被取代肽的2倍左右。一個例外是BPI.21的肝素結(jié)合能力比未被取代肽低4倍。這一發(fā)現(xiàn)進一步支持關(guān)于這些肽的各種活性對Trp91的取代特別敏感的早期實驗結(jié)果。在有些例中，被取代的肽的肝素結(jié)合能力有所降低，但Kd值則稍有提高(BPI.18；Ser88→Ala88)或稍有降低(BPI.24)。還有的例子是盡管Kd值增加(BPI.20，Lys90→Ala90)或降低(BPI.19)，但結(jié)合能力未改變。有一例親合力保持未受影響但結(jié)合能力幾乎減小2倍(BPI.25；Arg96→Ala96)。這些結(jié)果表明，在區(qū)段II序列中至少存在1個關(guān)鍵的殘基(Trp91)，并且區(qū)段II肽的活性大部分只受到其他區(qū)段II氨基酸殘基之丙氨酸取代的最小影響。就區(qū)段III肽來說，大多數(shù)丙氨酸取代的肽在環(huán)狀擴散試驗中均顯示有大約降低2至5倍的殺菌活性。這一總特征的例外包括BPI.35(Gly152→Ala152)、BPI.39(Gln156→Ala156)、BPI.42(His159→Ala159)和BPI.44(Lys161→Ala161)。在LAL試驗中大部分丙氨酸取代的肽均顯示沒有差異；BPI.31(Lys145→Ala145)、BPI.32(Ser149→Ala149)、BPI.33(Lys150→Ala150)和BPI.34(Val151→Ala151)顯示LPS結(jié)合活性中度增加，BPI.36(Trp153→Ala153)BPI.40(Leu157→Ala157)則在該試驗中顯示LPS結(jié)合活性的大幅度降低。就BPI.36和BPI.40來說，這些結(jié)果與已發(fā)現(xiàn)這些肽的殺菌活性的降低5倍相一致，表明天然序列中的疏水氨基酸Trpl53和Leu157在賦予肽以生物學(xué)活性上是特別重要的。丙氨酸取代對肝素結(jié)合能的影響倍數(shù)是相似的，即上下不超過未被取代肽的5倍左右。在幾乎每個例子中，丙氨酸取代對肝素結(jié)合的Kd和肝素結(jié)合容易影響的類型是一致的并且有用同樣的倍數(shù)，此不同于用區(qū)段II丙氨酸取代肽所作試驗的結(jié)果。在一個例子中(BPI.42；His159→Ala159)，雖然Kd稍有降低(1.2倍)，但肝素結(jié)合容易未受影響。僅有的一個例子是肝素結(jié)合和肝素容量稍有增加(BPI.35；Gly152→Ala152)；發(fā)現(xiàn)只增加10％。同用區(qū)段II丙氨酸取代肽所作實驗的結(jié)果一樣，這些結(jié)果表明在區(qū)段III序列中至少存在一個關(guān)鍵性的殘基(Trp153)，并且可能還至少有一個其他殘基(Leu157)。結(jié)果還表明，與區(qū)段II丙氨酸取代的肽不同，差不多一半的取代導(dǎo)致被試活性至少相差2倍。在6個例子中，被試的所有4種活性均增加，并在10個例子中殺菌活性、肝素結(jié)合的Kd值和結(jié)合容量降低。僅有的一個例子(BPI.35，Gly152→Aa152)中，發(fā)現(xiàn)在殺菌、肝素結(jié)合Kd和肝素容量試驗中的活性稍有增加。這些結(jié)果表明，對疏水氨基酸殘基Trp91、Trp153和Leu157的丙氨酸取代使這些BPI功能區(qū)取代肽的活性有最大影響。從rBPI23的陽離子性質(zhì)看，這一結(jié)果是未被預(yù)料到的。事實上，其中賴氨酸被丙氨酸或苯丙氨酸取代的區(qū)段II丙氨酸取代肽顯示了活性的顯著增加(如BPI.24，BPI.73)。表V表VIBPI區(qū)段III丙氨酸取代的肽活性倍數(shù)改變RADLALHEPKdHEPCAPBPI.13KSKVGWLIQLFHKKBPI.31A↓2.3↓↓3.9↓1.8BPI.32A↓1.5↓↓2.9↓1.7BPI.33A↓1.4↓↓2.0↓1.6BPI.34A↓2.2↓↑1.9↓1.8BPI.35A↑1.5＝↑1.1↑1.1BPI.36A↓4.9↓↓↓2.6↓4.6BPI.37A↓3.8＝↓5.2↓2.7BPI.38A↓5.0＝↓1.7↓1.9BPI.39A↑1.1＝↓1.3↓1.1BPI.40A↑5.2↓↓↓1.8↓2.3BPI.41A↓4.3＝↓2.1↓3.1BPI.42A↑2.2＝↓1.2＝1.0BPI.43A↓1.3＝↓2.0↓1.3BPI.44↑1.2＝↓1.7↓1.1實施例19BPI功能區(qū)肽之生物學(xué)活性的總結(jié)下列表VII中給出了各種肽的結(jié)構(gòu)類別分配。已檢測了本發(fā)明的BPI功能區(qū)肽或其有代表性的亞組的下列生物學(xué)活性對抗革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌，以及對抗某些其他微生物的殺菌活性；LPS結(jié)合和中和活性；以及肝素結(jié)合和肝素中和活性。分別按實施例8和6中所述方法檢測BPI功能區(qū)肽對E.coliJ5細菌的殺菌活性和肝素結(jié)合活性。表VIII中總結(jié)了本發(fā)明的部分對革蘭氏陰性細菌E.coliJ5(粗糙型)和E.coliO113(光滑型)以及革蘭氏陽性菌S.aureus的殺菌試驗結(jié)果。殺菌活性以產(chǎn)生30mm2殺菌圈所需要的肽量(pmol/孔和μg/孔)來表示。表VII<<p>表VII(續(xù))表VII(續(xù)p><p>表VII(續(xù))<p>表VII(續(xù))表VII(續(xù))表VIII殺菌活性a<p>表VIII(續(xù))殺菌活性a>表VIII(續(xù))殺菌活性a表VIII(續(xù))殺菌活性a</tables>表VIII(續(xù))殺菌活性a<p>表VII(續(xù))殺菌活性a<p>表VIII(續(xù))殺菌活性a<p>表VIII(續(xù))殺菌活性a表VIII(續(xù))殺菌活性a<>a用如實施例15和16所述的PROBIT分析法測得的加到孔中達到30mm2的固著量b在5μg/孔之前無可測活性c未測試從結(jié)果可發(fā)現(xiàn)BPI.84肽具有與rBPI23摩爾等量的抗E.coliJ5細菌殺菌活性。本發(fā)明的BPI功能區(qū)域肽的肝素結(jié)合實驗的結(jié)果以有代表性的實施例的形式示于圖15a—15e和圖16中并總結(jié)于表IX中，其中肝素結(jié)合數(shù)據(jù)以親和力(nM)和容量(ng)表示。將結(jié)合的肝素量對肝素的增加濃度作圖，以非線性最小二乘方法(Grafit，v.2，0.Eritha-cusSoftware，London，England)，將數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)化方程配合，計算結(jié)合常數(shù)(Kd)和容量。表IX<表IX(續(xù))表IX(續(xù))<<p>表IX(續(xù))當(dāng)使用殺菌活性作為預(yù)測的變量并以肝素結(jié)合容量和親和力(Kd)作為預(yù)測變量進行多項回歸分析時，觀察有代表性的BPI功能區(qū)肽間的引人感興趣的關(guān)系。該分析表明只有肝素結(jié)合容量與殺菌活性具有有意義的關(guān)聯(lián)(肝素容量，p＝0.0001和肝素親和力，p＝0.6007)。換句話說，給定的肽能夠以飽和量結(jié)合的肝素量(即容量)與殺菌活性有重要關(guān)系，而與肝素沉淀中某種肽多久達到50％飽和(即親和力)無關(guān)。從LPS結(jié)合競爭和中和數(shù)據(jù)也可以看出，容量是最能預(yù)測殺菌活性的。例如，結(jié)果證明BPI.7、BPI.29、BPI.30、BPI.46、BPI.47、BPI.48、BPI.63、BPI.65(還原的)、BPI.69、BPI.73、BPI.58、MPI.1和MPI.2具有極高的肝素容量并且也有高的殺菌活性。多抗原肽(MAP肽)是在如Posnett和Tam(1989，MethodsinEnzy-moloqy178738—746)所述的分支賴氨酸核心上的多聚肽。相反，BPI.2、BPI.4、BPI.8、BPI.14、BPI.53、BPI.54則有低的肝素結(jié)合容量并因而只有很小或沒有殺菌活性。比較BPI區(qū)段內(nèi)組合肽BPI.30(包括區(qū)段II—區(qū)段III肽)和BPI.74(包括區(qū)段III—區(qū)段II肽)的抗革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌殺菌活性，及肝素結(jié)合和容量。這些結(jié)果令人驚奇地表明，顛倒肽在組合中次序即可改變所觀察到的相對活性水平。例如，發(fā)現(xiàn)與BPI.30相比，BPI.74大大降低了殺菌活性。具體地說，BPI.74抗E.coliJ5細菌的殺菌活性低10倍，抗E.coliO111B4細菌的殺菌活性低50倍，并且抗S.aureus的殺菌活性低3.5倍。還觀察到其肝素結(jié)合容量降低2倍，并且肝素親和力降低2倍。檢驗了其他殺菌和內(nèi)毒素結(jié)合蛋白質(zhì)的肝素結(jié)合活性。以實施例3中所述的直接肝素結(jié)合法檢測CecropinA.magaininII酰胺、多粒菌素B(PolymyxxxinB)(PMB)肽和鱟抗LPS因子(LALF)。爪蟾抗菌肽II酰胺(Sigma，StLouis，MO)表現(xiàn)有與殺菌肽A(Sigma，242ng/2μg肽，Kd＝395nM)、LALF(Assoc.ofCapeCod，WoodsHole，MA，195.3ng/2μg肽，Kd＝1.29μM)和多粒菌素B肽(BachemBio-sciences，philadelphia，PA，58.0ng/2μg肽，Kd＝309mM)相對的最高肝素結(jié)合容量(437.7ng肝素/2μg肽，Kd＝3.17μM)。爪蟾抗菌肽II酰胺是天然爪蟾抗菌肽序列的取代變異體，其中8，13和15位上已有3個丙氨酸取代。據(jù)報導(dǎo)爪蟾抗菌肽II酰胺比天然爪蟾抗菌肽序列有較小的溶血活性。上述結(jié)果支持由BPI肽試驗數(shù)據(jù)證明的肝素結(jié)合LPS結(jié)合和殺菌活性間的關(guān)系，并提示其它LPS結(jié)合蛋白質(zhì)也可與肝素結(jié)合。相應(yīng)地，更具活性的殺菌蛋白質(zhì)，包括殺菌肽A和爪蟾抗菌肽II酰胺表現(xiàn)出在該系統(tǒng)其他LPS結(jié)合蛋白質(zhì)中的最高肝素結(jié)合容量。一種類型的BPI功能區(qū)肽加成變異體在BPI功能區(qū)肽的氨基式羧基末端加入D—丙氨酸—D—丙氨酸。這一研究的理由是經(jīng)加入D—丙氨酸而賦予更大的革蘭氏陽性菌殺菌活性。革蘭氏陽性細菌的細胞壁生物合成包括轉(zhuǎn)肽酶反應(yīng)，其中特異性地結(jié)合并利用D—丙氨酸—D—丙氨酸。β—內(nèi)酰胺抗生素如青霉素可有效地抑制這一反應(yīng)。在活性殺菌肽上摻入D—丙氨酸—D—丙氨酸將使該肽靶向革蘭氏陽性細菌的活躍合成的細胞壁。在BPI功能性區(qū)肽的區(qū)段II取代系列中，當(dāng)Lys95被丙氨酸取代時(BPI.24)觀察到出乎預(yù)料的活性增加。與丙氨酸取代肽相比，繼后的95位上的苯丙氨酸取代(BPI.73)導(dǎo)致了活性的進一步改善。令人驚奇的是，95位上的氨基酸被D—Phe取代則導(dǎo)致活性的顯著降低，以致達到低于原始肽(BPI.2)的水平。這一異構(gòu)體效應(yīng)證明，此種肽的相互作用是立體特異性的，并暗示BPI.73與BPI.76相比能夠折疊成更具活性的構(gòu)象。特別是在研究了其他殘基上的現(xiàn)象后，這種立體特異性為藥效基團開發(fā)提供了重要的決定因素。已經(jīng)利用由本文限定的BPI的功能區(qū)衍生肽來確定了疏水氨基酸(特別是色氨酸)對于最佳活性是最關(guān)鍵的。這一發(fā)現(xiàn)的出乎意料之處是由于BPI的陽離子性質(zhì)。事實上，對于區(qū)段II來說，當(dāng)用丙氨酸或苯丙氨酸取代賴氨酸時，活性即顯著增加(BPI.24，BPI.73)。功能區(qū)域肽的組合，包括來自3個區(qū)段的最具活性的取代肽的組合，也可提高個別肽構(gòu)建體的效力。使用VVDACC—18柱(25mm×4.6mm，5μm粒度，3nm孔徑；SeparationGroup，Hesperia，CA)，以分析性反相HPLC法測定各個新的合成肽的純度。使用在水溶液的5％乙腈/0.1％三氟乙酸(TFA)作為流動相A，并使用80％乙腈/0.065％TFA作為流動相B進行HPLC。在220nm處進行分光光度分析以監(jiān)測洗脫物。流速為1.0ml/分鐘。選擇使各種肽都能得以最佳分辨的梯度洗脫條件。用分布于總峰面積的主峰區(qū)域的百分比表示純度(參見表X)。還使用VGBiotechBio—Q質(zhì)譜儀以電子射流離子化質(zhì)譜法檢測新合成的肽的純度和性質(zhì)。表X總結(jié)了用質(zhì)譜和HPLC法對本發(fā)明的舉例的肽所作純度分析的結(jié)果。表X表X(續(xù))表X(續(xù))</p><p>表X(續(xù))<p>表X(續(xù))使用半制備反相VYDACC—18柱(25cm×10mm，10μm顆粒大小，30mm孔隙大小)純化BPI.13及其他選擇的肽。使用下列梯度純化BPI.1326.7％B至33％B/30分鐘，流速2.0ml/分鐘。將BPI.13以8.8mg/ml的濃度溶解在流動相A中，并以0.5ml體積注射。進行三次分別注射并收集得自每次注射的主峰。合并收集的材料并使用SpeedVac蒸發(fā)至干。用分析性反相系統(tǒng)和上述梯度洗脫條件測定所回收之材料(該純化的材料被稱為BPI.13P)的純度。基于該分析，發(fā)現(xiàn)BPI.13P純度為98％。還使用VGBiotchBio—Q質(zhì)譜儀，以電子射流離子化質(zhì)譜化測定BPI.13P的純度和性質(zhì)。測得分子質(zhì)量為1711.0(預(yù)測的質(zhì)量是1711.1)。用質(zhì)譜法沒有測出雜質(zhì)。BPI.13P的回收率為55％，估計所需的肽占起始材料的69％。如按上述方法進一步純化本發(fā)明的肽，發(fā)現(xiàn)當(dāng)化學(xué)純度增加時，所試驗的肽，即BPI.13P和BPI.30P的生物活性隨之增加。這表明所觀察到的生物學(xué)活性是由于肽本身所產(chǎn)生的。特別是，當(dāng)肽制劑的純度增加到98％時，純度約為69％的BPI.13的抗白色念珠菌(Caridiaalbicans)的完全新的和不可預(yù)見的抗真菌活性也進一步增加。實施例20使用結(jié)合和中和檢測法分析BPI功能區(qū)肽A.LPS結(jié)合試驗對BPI功能區(qū)肽進行LPS結(jié)合試驗。按照Gazzano—Santoro等人(文獻出處同上)所述方法進行這些試驗中的第一個試驗。簡單地說，超聲波處理E.coli菌株J5脂質(zhì)A的懸液并在甲醇中稀釋成0.2μg/ml濃度，然后將50μl等分樣品吸附到小孔內(nèi)(Immulon2RemovawellStrips，Dynatech)。37℃過夜保溫后，用215μlD—PBS/0.1％BSA的溶液37℃封閉小孔3小時。然后，棄去封閉緩沖液，用加在D—PBS中的0.05％吐溫—20(D—PBS/T)溶液洗小孔，在7℃下與50μl加在D—PBS/T中的[125I]—rBPI23的溶液(比活性9.9μci/μg，總放射活性234,000rpm)和逐漸增加濃度的BPI功能區(qū)肽保溫過夜。保溫后，用D—PBS/T將小孔洗三次并使用V計數(shù)器計數(shù)結(jié)合的放射活性。對經(jīng)D—PBS/BSA處理的小孔的結(jié)合被看作非特異性本底結(jié)合并從各小孔內(nèi)結(jié)合的總放射活性中減去。這些實施的結(jié)果示于圖17a(其中各種肽的濃度以nm為單位給出)和17b(其中同一結(jié)果以μg/ml為肽的濃度單位給出)中。用未標(biāo)記的rBPI23作為對照進行競爭實驗。這些結(jié)果證明所有被試驗的肽均具有不同程度的與rBPI23競爭LPS結(jié)合的能力。在加或不加全血的條件下，使用雙倍量的[125I]—rBPI23(總放射活性計數(shù)為454,000cpm，比活性10μci/μg)重復(fù)該實驗，比較BPI.10和rBPI23的LPS結(jié)合親和力。這些實驗結(jié)果示于圖18中，并證明(基于摩爾量)在與放射標(biāo)記的rBPI23競爭的實驗中，BPI.10的結(jié)合能力在rBPI23的2倍以內(nèi)。按照上述第一個實驗的方法，使用肽BPI.7BPI.29和BPI.30重復(fù)實驗，不同的是使用總計數(shù)225,000cpm的[125I]—rBPI23，并以濃度為0.5mg/ml的脂質(zhì)A鋪板。該實驗的結(jié)果示于圖19中，并顯示(基于摩爾量)這些肽結(jié)合脂質(zhì)A的能力比未標(biāo)記的rBPI23小6至10倍。建立第二種結(jié)合檢測法，其中使用放射標(biāo)記的重組LPS結(jié)合蛋白質(zhì)([125I]—rLBP)在與BPI功能肽BPI.2、BPI.3、BPI.4、BPI.5、BPI.7、BPI.13、BPI.14、BPI.29、BPI.30和BPI.48的競爭實驗中代替放射標(biāo)記的rBPI23。這些試驗中使用rBPI、rBPI21△cys和rLBP25作為對照。實驗中，脂質(zhì)A以0.7μg/ml(在甲醇中)的濃度吸附到小孔上。在一系列漸增濃度的BPI肽存在下于37℃將放射標(biāo)記的rLBP(總計數(shù)650,000cpm，比活性3.45μCi/μg)保溫2.5小時。這些結(jié)果示于圖20a和20b中。IC50值(即脂質(zhì)A對放射標(biāo)記的rLBP25的結(jié)合被抑制到?jīng)]有肽時所達到的值的一半所需的濃度)示于附表XI中。表XIIC50肽nMμg/mLrBPI130.65rBPI21Δcys300.69BPI.71000.26BPI.291300.44BPI.482000.48BPI.302500.75BPI.32500.75rLBP2560015BPI.1310001.7BPI.213002.36BPI.517004.42在第三個結(jié)合試驗中。試驗多種BPI功能肽在與人內(nèi)皮細胞(HUVEC)保溫后與放射標(biāo)記的LPS結(jié)合的能力。該試驗法檢測一旦BPI肽結(jié)合到HUVEC細胞上后再結(jié)合LPS的能力。在500μlD—PBS/BSA溶液中，在濃度為1μg/ml或3μg/ml的各種BPI肽存在下，將HUVEC細胞4℃保溫3小時。保溫后用冰冷的D—PBS/BSA將細胞洗兩次，然后在500μl溶于D—PBS/BSA中的[125I]—RaLPS溶液(總放射活性計數(shù)340,000cpm，比活性4.6×106cpm/μg)中4℃下繼續(xù)保溫2.5小時。用D—PBS/BSA將小孔洗三次，溶解于500μl1MNaOh中并使用γ計數(shù)器計數(shù)溶胞產(chǎn)物的放射活性。圖21中所示的這些結(jié)果表明，BPI.29和BPI.30在結(jié)合到HUVEC細胞上之后仍保留有結(jié)合LPS的能力。B.利用TNF細胞毒性對BPI功能區(qū)肽進行LPS中和篩選試驗使用腫瘤壞死因子(TNF)細胞毒性檢測法建立LPS中和的篩選試驗。在以劑量依賴方式用LPS刺激后，使人單核細胞系(THP—1；登記號TIB202，美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，Rockville，MD)生長于添加維生素D的培養(yǎng)基中以產(chǎn)生TNF。小鼠成纖維細胞(L929細胞；ATCCNO.CCL1)對TNF介導(dǎo)的細胞殺傷是敏感的，并且該細胞殺傷也是劑量依賴性的。因此，L929細胞的細胞殺傷程度為檢測THP—1細胞中TNF誘導(dǎo)程度提供了一種敏感檢測法，而其本身又是與THP—1細胞接觸的游離LPS量的敏感指示劑。BPI功能區(qū)肽或rBPI23的LPS結(jié)合和中和作用減少了與THP—1細胞接觸的游離LPS的量，從而減少了所產(chǎn)生的THF的量，后者本身又在標(biāo)準(zhǔn)化檢測法中測得的L929細胞殺傷的量。因此，下述試驗為估計本發(fā)明BPI功能區(qū)肽的LPS結(jié)合和中和能力提供了一種敏感方法。在添加10％FCS和維生素D的RPM1培養(yǎng)基(GIBCO，LongIs-land，NY)中將THR1細胞旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)3天，使細胞密度達到150,000個細胞/ml。然后將細胞以100,000個細胞/孔的密度鋪敷在圓底96孔培養(yǎng)板中，并在沒有維生素D或FCS的培養(yǎng)基中，在5ng/mlE.coliO1113LPS存在下37℃保溫6小時。實驗對照孔還含有不同量的rBPI23或BPI功能區(qū)肽，濃度范圍大約從0.1μg/ml到100μg/ml。保溫后以大約600×g離心平板以沉淀細胞。并將各50μl上清液加到平行制備的每孔含50,000個L929細胞(在50μlRPMI/10％FCS中)的96孔平底培養(yǎng)皿中。在RPMI/10％FCS培養(yǎng)基中單層培養(yǎng)L929細胞達到每平皿約106個細胞，在實驗前一天按1∶2分開關(guān)培養(yǎng)過夜以使細胞在實驗當(dāng)天達到約70％貼壁生長。在向入96孔平板內(nèi)前20分鐘向70％貼壁生長的培養(yǎng)物中加入放射菌素D至終濃度為1μg/ml。在維持細胞生長的標(biāo)準(zhǔn)條件下，在加有THP—1上清液的L929細胞平板37℃保溫16小時(過夜)。然后向各小孔中加入20ml經(jīng)在2mlCellTitre96TMAQucous溶液(Promega，Madison，WI)中稀釋100μl甲磺酸吩嗪酯(phenazinemethylsulfonate)制備的，含有3—[(4，5—二甲基)—硫代—2—基]—5—(3—羧甲氧基苯基)—2—(4—磺酰)—2H—四唑(內(nèi)鹽)的溶液。將培養(yǎng)物于37℃保溫2—4小時并進行分光光度分析以確定490nm(A490)吸光率。相對照已知量TNF(從大約10mg/ml至大約10mg/ml)制作的半對數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線估計實驗結(jié)果。這些實驗的結(jié)果示于圖22a—22h。圖22a顯示在有或沒有5ng/mlLPS時，A490與L929細胞培養(yǎng)物中TNF濃度間的關(guān)系。這些結(jié)果顯示無論檢測培養(yǎng)基中是否存在LPS，A490和TNF濃度間呈現(xiàn)同樣的線性關(guān)系。圖22b圖解顯示在加有漸增量的肝素條件下，將TNF—與L929細胞一起保溫的實驗結(jié)果。這些結(jié)果顯示了濃度為1ng/ml和0.1ng/ml的TNF的恒定和特征性A490吸收值，表明肝素沒有影響TNF引起的L929細胞殺傷。圖22c圖解說明對照實驗，結(jié)果顯示當(dāng)于5ng/mlLPS存在下以所指出的濃度在THP—1培養(yǎng)物中保溫時，rBPI21△cys降低了TNF介導(dǎo)的L929細胞殺傷的量。圖22d顯示通過L929殺傷試驗測定，發(fā)現(xiàn)肝素能通過抑制BPI介導(dǎo)的對LPS刺激的THP—1細胞的TNF產(chǎn)生的抑制作用，而與LPS競爭對rBPI21△cys的結(jié)合。圖22e顯示的是A490對TNF的標(biāo)準(zhǔn)曲線(作為TNF介導(dǎo)的L929細胞殺傷的度量曲線)；圖22g顯示在約1000倍TNF濃度范圍內(nèi)的半對數(shù)作圖中標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系。圖22f顯示試驗中THF—1細胞的依賴因素，其中使用約100,000個THP—1細胞和濃度至少為5ng/ml的LPS很容易產(chǎn)生可檢測量的TNF。最后，圖22h顯示，該試驗依賴于THP—1細胞才能受LPS刺激產(chǎn)生TNF；當(dāng)在試驗中用人組織細胞的淋巴瘤細胞(U937；ATCCNO.CRL1593)代替THP—1細胞時，沒有產(chǎn)生可檢測量的TNF。用這試驗法分析本發(fā)明的多種BPI功能區(qū)肽的LPS結(jié)合和中和能力。這些結(jié)果示于表XII中，并且如通過TNF介導(dǎo)L929細胞殺傷所檢測到的，表明各被試肽均具有抑制THP—1細胞受LPS刺激產(chǎn)生TNF的能力。表XII肽IC50(μg/mL)rBPI21Δcys0.2BPI.730BPI.1320BPI.292-3BPI.306-7BPI.481C.使用細胞一氧化氮(NO)產(chǎn)生試驗建立對BPI功能區(qū)肽的LPS中和篩選法使用對LPS處理的小鼠細胞中NO產(chǎn)生的檢測法(參見Lorsbachetal.，1993，J.Biol.Chem.2681908—1913)發(fā)展另一種篩選BPI功能區(qū)肽的LPS中法試驗法。在該方法中，用細菌LPS處理小鼠RAW264.7細胞(ATCCNo.TIB71)。將細胞加在96孔平板中保溫，并在有或沒有γ干擾素、γLBP、胎牛血清(FBS)或正常人血清(NHS)，或BPI21△cys存在下，用E.coliO113LPS或酵母多糖(zy-mosan)刺激2小時。保溫后，用新鮮培養(yǎng)基洗細胞并在含有10％FCS的培養(yǎng)基中保溫過夜。從積聚在培養(yǎng)基中的細胞內(nèi)釋放NO并自發(fā)轉(zhuǎn)變?yōu)閬喯跛猁}。通過如下所述的Griess反應(yīng)原位檢測該亞硝酸鹽。亞硝酸鹽與所加入之磺胺的伯胺反應(yīng)并形成重氮鹽。然后使該鹽與所加入的萘基乙二胺反應(yīng)生成紅色偶氮染料。Griess反應(yīng)在室溫下進行約10分鐘。根據(jù)在550nm波長處以分光光度法測吸光率得到的Gress反應(yīng)產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線估計所產(chǎn)生的NO的量。該試驗的結(jié)果示于圖23a至23c。圖23a顯示NO產(chǎn)生對γ干擾素存在的依賴性。發(fā)現(xiàn)這種干擾素效應(yīng)在濃度為1000/ml時達到飽和。圖23b顯示LPS刺激的NO產(chǎn)生對LBP(作為純化重組蛋白質(zhì)加入的，或作為細胞保溫培養(yǎng)基的FBS或NHS添加物的成分加入的)存在的依賴性。圖23c顯示rBPI23介導(dǎo)的對LPS刺激的NO產(chǎn)生的抑制作用，其IC50為30—100ng/ml。這些結(jié)果證明，該檢測方法是一種用于BPI和本文所述的BPI功能區(qū)肽之LPS中和活性的簡單、經(jīng)濟和生理上相關(guān)的檢測試驗系統(tǒng)。用BPI功能區(qū)肽完成的這些試驗的結(jié)果示于圖24a—24g中，其中將由未受刺激的細胞產(chǎn)生的本底NO被指定為“NOLPS”。圖24a和24b分別顯示rBPI、rBPI2△cys和rBPI25對酵母多糖和LPS刺激的NO產(chǎn)生的抑制作用。從中看出任何濃度的BPI蛋白質(zhì)對酵母多糖刺激的NO產(chǎn)生均沒有抑制作用(圖24a)。相反，經(jīng)與這些rBPI相關(guān)蛋白質(zhì)一起保溫則以濃度依賴方式抑制LPS刺激的NO產(chǎn)生(圖24b)。圖24c(酵母多糖)和圖24d(LPS)顯示RAW264.7細胞與BPI.2、BPI.3、BPI.4、BPI.7和BPI.14一起保溫對NO產(chǎn)生的影響；其中使用rBPI21△cys作為對照。如使用天然BPI所顯示的，經(jīng)與任何濃度的BPI功能區(qū)肽一起保溫均未能抑制酵母多糖刺激的NO產(chǎn)生(但可能除外高濃度BPI.7引起的小量抑制作用；圖24c)。另一方面，rBPI21△cys可有效地抑制LPS刺激的NO產(chǎn)生，并達到比BPI.3和BPI.7產(chǎn)生的抑制作用較低的程度(圖24d)。使用BPI.5、BPI.13、BPI.29和BPI.30，并以rBPI21△cys作為用于平行比較的對照重復(fù)該實驗。發(fā)現(xiàn)酵母多糖刺激的RAW264.7細胞NO產(chǎn)生受到高濃度(～100μg/ml)BPI.30的抑制，而任何其他的BPI功能區(qū)肽和rBPI21△cys對酵母多糖刺激的NO產(chǎn)生均沒顯示任何刺激作用(圖24e)。LPS刺激的NO產(chǎn)生受到rBPI△cys的有效抑制，并且受到本實驗中試驗的所有BPI功能區(qū)域肽的不同的和較低程度的抑制(圖24f)。根據(jù)這些實驗結(jié)果計算BPI蛋白質(zhì)和肽的IC50值(即酵母多糖或LPS刺激的RAW264.7細胞的NO產(chǎn)生減少到?jīng)]有抑制劑時的一半所需的待測BPI的濃度)并示于圖24g中。發(fā)現(xiàn)除了BPI.30外，各種BPI功能區(qū)肽或rBPI21△cys、rBPI或rLBP在這些實驗中對酵母多糖介導(dǎo)的NO產(chǎn)生均沒有明顯的抑制作用；證明BPI.30抑制由酵母多糖刺激的NO產(chǎn)生的IC50值在10至100μg/ml之間。發(fā)現(xiàn)BPI.3、BPI.5、BPI.13、BPI.29和BPI.30在該試驗中具有可測水平的LPS中和作用，這些肽的相對IC50值示于圖24g中。D.利用細胞增殖試驗建立對BPI功能區(qū)肽的LPS中和篩選方法建立另一種估測BPI功能區(qū)肽的LPS中和篩選法。還可利用這種抑制LPS處理的小鼠細胞中細胞增殖的敏感檢測法，在制備標(biāo)準(zhǔn)曲線后定量分析人血漿中的LPS水平。在該檢測法中，于檢測前首先在50U/ml重組小鼠γ干擾素(Genzyme，Cambridge，MA)存在下，將維持在添加了10mMHEPES緩沖液(pH7.4)，2mML—谷氨酰胺、青霉素(100U/ml)、鏈霉素(100μg/ml)、0.075％碳酸氫鈉0.15M2—硫基乙醇和10％胎牛血清(Myelone，Inc.，Logan，UT)之RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO)中的小鼠RAW264.7細胞(ATCCNO.TIB71)保溫24小時。然后收集被誘導(dǎo)的細胞并在4℃下以500×g離心，重新懸浮于500mlRPMI1640培養(yǎng)基(沒有添加物)后再次離心，并再次重新懸浮在RPMI1640培養(yǎng)基(沒有添加物)中。計數(shù)細胞并將其濃度調(diào)到2×105細胞/ml，然后向96孔微量滴定板的各小孔中加入100μl等分樣品。然后將細胞與E.coli0113LPS(ControlStanderd，Assoc.ofCapeCod，WoodsHole，MA)一起保溫15小時，以在無血清RPMI1640培養(yǎng)基中1ng/ml的濃度(這一濃度是根據(jù)在50pg/ml至100ng/ml的不同濃度LPS進行存在下進行滴定實驗的結(jié)果而確定的)加入等分樣品(100μl/孔)。在加有或沒有濃度為25ng/ml至50μg/ml的BPI功能區(qū)肽情況下進行保溫。實驗開始后5小時加入1μCi/孔[3H]—胸苷以定量檢測細胞增殖情況。保溫15小時后，用細胞收獲器(InotchBiosystems，INB—384，SampleProcessingandFilterCountingSystem，Lansing，MI)將標(biāo)記的細胞收集到玻璃纖維濾膜上。該實驗的結(jié)果示于圖26a—26c中。圖26a顯示LPS介導(dǎo)的對RAW264.7細胞增殖的抑制作用對加到反應(yīng)混合物中之LBP的依賴性這種LBP可以是作為血清成分或重組LBP(濃度為1μg/ml)。圖26b和26c圖解顯示見于上述實驗中的BPI功能區(qū)肽作用的特征性曲線。BPI.5表現(xiàn)有5.3±0.6μg/ml的EC50值(即LPS的生長抑制效應(yīng)消減50％時的肽濃度)。BPI.81不能逆轉(zhuǎn)LPS對RAW264.7細胞的生長抑制效應(yīng)，但顯示IC50(即將RAW細胞生長從不加肽時抑制50％所需的肽濃度)為14±0.2μg/ml的額外生長抑制作用。BPI.98顯示有0.16±0.08μg/ml的EC50值和16.5±1.9μg/ml的IC50值。表XIII中顯示了本實驗中所有被試肽的實驗結(jié)果。表XIIIBPI肽序列EC50IC50BPI.2IKISGKWKAQKRFLK--BPI.5HVHISKSKVGWLIQLFHKKIE5.3±0.6-BPI.7KWKAQKRFLKKWKAQKRFLK＞5037.5±12.5BPI.10QKRFLKKWKAQKRFLKKWKAQKRFLK＞5017.25BPI.13KSKVGWLIQLFHKK1.9±0.437.5±12.5BPI.13pKSKVGWLIQLFHKK2.0±0.3＞50BPI.29KSKVGWLIQLFHKKKSKVGWLIQLFHKK0.1±0.0213.6±0.4BPI.30KWKAQKRFLKKSKVGWLIQLFHKK1.2±1.110.5±1.2BPI.46KWKAAAKRFLKKWKAQKRFLK1.9±1.918.8±0.8BPI.47KWKAQKRFLKKWKAAAKRFLK0.9±0.39.8±0.1BPI.48KWKAAAKRFLKKWKAAAKRFL1.3±0.95.0±0.1BPI.63IKISGKWKAQKRFLKKSKVGWLIQLFHKK0.08±0.027.1±0.02BPI.69KWKAAARFLKKWKAAARFLKKWKAAARFLK0.11±0.072.4±0.3BPI.73IKISGKWKAQFRFLK22±10-BPI.74KSKVGWLIQLFHKKKWKAQKRFLK2.7±0.318.8±0.8BPI.76IKSGKWKAQFDRFLK＞50-BPI.77IKISGKWKAQWRFLK10±32＞50BPI.80IKISGKWKAQAβ-(1-naphthyl)RFLK35±36＞50BPI.81IKISGKWKAFKRFLK-14.0±0.2表XIII(續(xù))BII肽序列EC50IC50BPI.82KSKVGWLIQLWHKK0.8±0.118.8±0.8BPI.83KSKVGWLIQLAβ-(1-naphthyl)HKK1.2±0.137.5±12.5BPI.84IKISGKAβ(1-naphthyl)KAQFRFLK57±28-BPI.85KSKVLWLIQLFHKK1.3±0.117±15.BPI.86KSKVGWLILLFHKK0.13±0.0437.5±12.5.BPI.87KSKVGWLIQLFLKK1.3±0.411.4±1.3BPI.88IKISGKWKAFRFLK＞506.2±7.5BPI.89IKISGKAβ-(1-naphthyl)KAFKRFLK＞5011±0.3BPI.90IKISGKAβ-(1-naphthyl)KAFFRFLK＞506.3±0.7BPI.91KSKVGWLIFLFHKK0.7±0.1-BPI.92KSKVGWLIKLFHKK1.9±0.137.5±12.5BPI.93IKISGKAβ-(1-naphthyl)KAQFRFLKKSKVGWLIQLFHKK0.9±0.259.7±0.1BPI.94KSKVGWLIQLFFKK1.3±0.0223±2BPI.95KSKVFWLIQLFHKK1.0±0.0137.5±12.5BPI.96KSKVGWLIQLFHKF1.6±0.218.8±0.8BPI.97KSKVKWLIQLFHKK2.8±0.337.5±12.5BPI.98IKISGKAβ(1-naphthyl)KAQFRFLKKSKVGWLIFLFHKK0.16±0.0816.5±1.9MAP.1(β-alanyl-Nα，Nε-substituted-[Nα，Nε(BP1.2)lysyl]lysine)0.45±0.137.5±12.5rBPI21Δcys0.08±0.05---增殖堿性達到50μg/mlE.LPS中和試驗基于對全血中LPS誘導(dǎo)之TNF產(chǎn)生的抑制作用按上述步驟檢測全血中本發(fā)明BPI功能區(qū)肽的LPS中和作用。首先將從健康人體抽取的血液收集到無菌試管(ACD，Rutherford，N.J.)中。將等分的血液樣品(170μl)與10μl含2.5ng/mlE.coliO113LPS，并加有濃度范圍為0.5—50μg/ml的不同濃度之本發(fā)明BPI肽的無Ca++、Mg++PBS混合。然后將這些混合物于37℃保溫4小時，保溫后經(jīng)加入55μl冰冷的無Ca++、Mg++PBS終止反應(yīng)，然后以500×g離心7分鐘。然后使用商品ELISA試劑盒(BiokineTMELISATest，T—cellSciences，Cambrige，MA)檢測上清液中的TNF水平。圖27和表XIV中顯示了使用得自兩不同供血者的全血，經(jīng)加入有代表性的肽所作實驗的結(jié)果。圖27顯示對BPI功能區(qū)肽BPI.7、BPI.13和BPI.29的TNF產(chǎn)生抑制作用的比較實驗結(jié)果，其中還給出使用rBPI21△cys所得到的結(jié)果以便比較。表XIV中以IC50值定量給出這些結(jié)果，并與上文C部分中所述的使用RAW264.7細胞的NO產(chǎn)生檢測的LPS中和作用相比較。表XIVIC50(μg/ml)BPI肽TNF試驗NO試驗rBPI21Δcys0.650.4BPI.295.02.4BPI.134216BPI.7無抑制作用無抑制作用F.使用色氨酸熒光猝滅進行LPS和肝素結(jié)合試驗在用波長約在280nm和290nm之間，最好是285nm波長激發(fā)后，天然氨基酸色氨酸可發(fā)射波長在300和300nm之間的可見光(即熒光)。已知由這些熒光產(chǎn)生的發(fā)射光的量受到局部環(huán)境，包括pH和緩沖液條件，以及蛋白質(zhì)和其他分子間相互結(jié)合作用的影響。衍生于區(qū)段II和III的某些BPI功能區(qū)肽含有色氨酸殘基，可利用色氨酸熒光檢測本發(fā)明BPI功能區(qū)肽和LPS或肝素間的結(jié)合相互作用。在有或沒有LPS或肝素條件下，使用SPEXFluorolog熒光計檢測本發(fā)明BPI功能區(qū)肽的色氨酸熒光。使用0.25nm狹縫寬度檢測300—400nm間的發(fā)射波長。數(shù)據(jù)是作為在大約5分鐘時間內(nèi)三次檢測的平均值累積的。在實驗過程中利用循環(huán)水溶使樣品保持在25℃或37℃。使用一種因與LPS結(jié)合而影響色氨酸殘基之內(nèi)在固有熒光的蛋白質(zhì)，即蟹內(nèi)毒素結(jié)合蛋白質(zhì)(CEBP)作為陽性對照(參見Wain-wrightetal.，1990，CellularandMolecularAspectsofEndotoxinReac-tions，Nowotnyetal.，des.，ElsevierSciencePublishingB.V.，TheNetherlands，PP.315—325)。這些實驗的結(jié)果示于表XV中。對作為線圖之斜率負倒數(shù)的猝滅數(shù)據(jù)進行Scatchard型Stern—Volmer作圖，以確定Kd值。對BPI.10、BPI.46和BPI.47的數(shù)據(jù)進行比較，可以看出當(dāng)Kd值增加時(表示LPS的活性增加)，百分熒光猝滅隨之增加。這些肽之間的差異包括當(dāng)與BPI.10比較時可見BPI.48中的堿性和極性氨基酸殘基被非極性氨基酸殘基取代。相反，當(dāng)肝素結(jié)合的Kd值增加時，未檢測到熒光猝滅的百分比增加。這一結(jié)果表明肝素結(jié)合與LPS結(jié)合的位點或性質(zhì)之間的基本差異。表XV猝滅Kd猝滅BPI#ofKdLPSLPS肝素肝素肽Trp(nM)(％)(μM)(％)BPI.102124261.267BPI.472115412.247BPI.48283620.841BPI.69358720.442BPI.73166470.719CEBP*519560.854*于25℃下完成CEBP(LALF)實驗G，肝素介導(dǎo)的凝血酶時間延長的中和試驗檢測BPI功能區(qū)域肽對肝素介導(dǎo)的凝血酶時間(即凝血酶和血漿混合物產(chǎn)生凝血所需要的時間延長的影響。凝血酶時間可因內(nèi)源或外源性凝血酶生成抑制劑，如治療給藥的肝素的存在而延長。中和肝素的抗凝血劑作用的制劑將降低試驗測得的凝血酶時間。在這些實驗中，使用MLAElectra800凝血定時器檢測凝血酶凝血時間。在反應(yīng)瓶中將重新配制的血漿(200μl，SigmaChemicalCo.，No.855—10)于37℃保溫2分鐘。保溫后向反應(yīng)瓶中加入凝血酶的凝血時間試劑(100μl，BaxterDiaghosticsInc.，B4233—50)，然后測定凝血時間。向反應(yīng)瓶中加入肝素鈉(15μl，在PBS中40μg/ml，SigmaChemicalCo.，H3393)和典型的BPI功能區(qū)肽(10μl不同濃度(約0.05μg/ml至10μg/ml的稀釋液)，然后加入血漿以試驗這些肽對凝血酶凝血時間的影響。使用BPI肽測定TCT凝血時間(凝血酶時間)，結(jié)果示于圖28和表XVI中。圖28和下列表XVI中所示的這些結(jié)果證明，如通過抑制肝素介導(dǎo)的凝血酶時間延長所顯示的，被試驗的BPI功能區(qū)肽可中和肝素。定量該抑制作用的IC50值并示于表XVI中。表XVIBPI肽IC50(μg/ml)±SEBPI.100.115±0.014BPI.470.347±0.041BPI.630.362±0.034BPI.690.200±0.025BPI.730.910±0.821BPI.820.200±0.073BPI.840.225±0.029BPI.870.262±0.009BPI.880.691±0.180BPI.900.753±0.210BPI.980.242±0.038BPI.990.273±0.011BPI.1000.353±0.050BPI.1010.285±0.088BPI.1020.135±0.024實施例21肝素中和試驗基于對進入體內(nèi)Matrigel基底膜基質(zhì)中的肝素/FGF誘導(dǎo)的血管生成的抑制作用檢測本發(fā)明的BPI功能區(qū)肽在小鼠體內(nèi)抑制肝素誘導(dǎo)的血管生成的能力。將液體Matriger(CollaborativeBiomedicalProducts，Inc.，Bedford，MA)保存在4℃下并按Massaniti等人(1992，Lab.Invest.67519—528)所述方法向液態(tài)凝膠中加入血管生成因子。以1.250—10.000U/ml的不同濃度將肝素(Sigma，St.Louis，MO)溶解于無菌PBS中。用無菌PBS將重組成纖維細胞生長因子(bhFGF；BACHEMBioscienceInc.，Philadelphia，PA)稀釋到200ng/ml。在給每只小鼠注射的0.5mlMatriger中加2.5ml溶解的肝素溶液和2.5μl重組rhFGF。向此Matrigel混合物中加入在每只實驗動物10μl/0.5mlMatrigel等分樣品中的濃度范圍為0.5至50μg/ml(終濃度)的BPI功能區(qū)肽。用10μl無菌PBS取代BPI功能區(qū)肽，加入Matrigel等分樣品中用于注射對照組動物。在6—8周令雄性C57BL/6J小鼠(JacksonLaboratory，BarHar-bor，ME)背部中線皮下注射按上述方法制備的0.5mlMatrigel的等分樣品。注射后七天，切掉Matrigel凝膠并放500μlDrabkin氏試劑(Sigma)中。用機械方法勻漿化處理凝膠后，測定保存于Drabkin氏試劑中之凝膠的總蛋白質(zhì)和血紅蛋白含量。使用包括于商品試劑盒(DCProteinAssay，Bio—Rad，Richmond，CA)檢測試劑以微量平板檢測法測定總蛋白質(zhì)水平。使用將與本方法一起使用的Sigma(St.Louis，MO)提供的Sigma檢測程序#525和試劑檢測血紅蛋白濃度。用與總蛋白質(zhì)濃度的對比量表示血紅蛋白水平。在從動物身上切下將用于組織學(xué)染色的凝膠，不放在Drabkin氏試驗中而直接用福爾馬林固定。將福爾馬林固定的凝膠包埋在Tissue—TekO.C.T.化合物(Miles，Inc.，Elkhart，IN)中進行冷凍切片。用蘇木精和曙紅著染冷凍干切的載玻片(參見Mumason，1979，AnimalTissueTechniques，4thEd.，W.H.feeman&Co.，SanFransisco，CA，Ch.9，PP.111—131)。用顯微鏡檢查冷凍染色的切片，對比未加BPI肽條件下制備的Matrigel凝膠，檢測本發(fā)明的BPI功能區(qū)肽抑制血管形成的效果。經(jīng)校準(zhǔn)見于含BPI肽切片中的血紅蛋白量，定量分析BPI肽抑制血管形成的程度。實施例22分析慢性炎癥性疾病膠原誘導(dǎo)的式反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎模型中的BPI功能區(qū)肽給膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎動物模型施用BPI功能區(qū)域肽以檢測它們的效應(yīng)。具體地說，按照Stuart等人(1982，J.Clin.Invest.69673—683)的方法在小鼠尾的基部用牛II型膠原皮內(nèi)免疫動物，以誘發(fā)關(guān)節(jié)炎。一般說來，在用膠原免疫后21天小鼠開始發(fā)展關(guān)節(jié)炎癥狀。每隔21—25天通過尾靜脈注射BPI功能區(qū)肽，對照rBPI23或BPI，或緩沖液，在120天期間里以雙盲方式估計被處理小鼠的關(guān)節(jié)炎發(fā)病數(shù)。具體地說，在0天給每只體重約20—50g的各組雄性小鼠(Mouse/DBA/1J)于尾的根部，通過皮內(nèi)注射(0.1mg/小鼠)給予牛II型膠原(SouthernBiotechnologyAssocites，Inc.，Birmingham，AL)。將BPI功能區(qū)肽、和rBPI23及rBPI溶解在由0.5MNaCl、20mM乙酸鈉組成的緩沖液(pH6.0)中并用PBS稀釋后以不同濃度給藥。單獨給予PBS緩沖液作為對照。還使用膠原誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎動物模型，以硫酸魚精蛋白作為對照估測BPI功能區(qū)肽的效能。具體地說，將BPI肽溶解在上述PBS中并以不同濃度給藥。以下述劑量給予其他試驗材料硫酸魚精蛋白(SigmaChemicalCo.，St.Couis，MO)(0.13mg/小鼠)、奇異果甜蛋白(thaurnatin)(0.12mg/小鼠)，和PBS緩沖液(0.1ml)。各組動物均于注射膠原后每28至32天給尾靜脈注射接受試驗材料或?qū)φ詹牧稀＿€按照Yong等人(1988，MicrobiolPathogenesis4305—310)的方法，使用BPI功能區(qū)肽治療小腸結(jié)腸類耶爾森氏菌(Yersiniaente-rocolitica)反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎模型的反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎。具體地說，給以前已經(jīng)靜脈內(nèi)注射過足以誘發(fā)小鼠非敗血性關(guān)節(jié)炎之劑量(4×108個細胞)的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌cWA08T2(按Yong等人所述的缺少毒力質(zhì)粒的菌株)的DBA/2J小鼠注射BPI肽。各組小鼠均通過尾靜脈注射接受試驗或?qū)φ詹牧?。Berreliaburgdorferi是Lyme病反應(yīng)性病和其相關(guān)關(guān)節(jié)炎的病原體，并且在它的細胞壁上具有LPS樣復(fù)合物，其不同于大腸桿菌細胞壁上的相應(yīng)復(fù)合物，但結(jié)構(gòu)與之相關(guān)。以鱟阿米巴樣細胞溶胞產(chǎn)物(LAL)抑制試驗檢測給予BPI功能區(qū)肽后對B.burgdorferiLPS之抑制作用的影響。具體地說，進行實施例4中所述的LAL試驗，以檢測BPI肽對以2.5μg/ml的濃度給藥的B.aurgdorferiLPS和以2ng/ml的濃度給藥的E.coliO113LPS的影響。實施例23在小鼠惡性黑素瘤細胞轉(zhuǎn)移模型中分析BPI功能區(qū)域肽注射BPI功能區(qū)域肽，魚精蛋白或緩沖液對照材料，以試驗它們在小鼠惡性黑素瘤轉(zhuǎn)移模型中的效力。具體地說，在第0天通過尾靜脈注射給各組C57BL/6J小鼠接種105個B16.F10惡性黑素瘤細胞。在實驗的第1、3、6、8、10、13、15、17和19天通過試驗小鼠的尾靜脈注射各種不同濃度的BPI功能區(qū)肽。同時給另外幾組對照小鼠注射作為陽性對照的硫酸魚精蛋白(0.13mg/小鼠)，或作為陰性對照的PBS緩中液(0.1ml/小鼠)。在第20天通過斷頸殺死動物，并檢查其肺組織。灌注各肺葉并通過氣管向肺內(nèi)注射3ml水使肺膨脹。然后借助解剖顯微銳計數(shù)表淺的腫瘤塊并分析見于各組之腫瘤數(shù)目的統(tǒng)計學(xué)類異顯著性。實施例24以小鼠腦毛細血管內(nèi)皮細胞增殖試驗分析BPI功能區(qū)肽以所有內(nèi)皮細胞增殖試驗法試驗BPI功能區(qū)域肽的效力。對進行這些實驗，Bauer所述的(1989，MicrovasculaResearch37148—161)使小鼠腦毛細血管內(nèi)皮細胞(EC)，在含有Earle氏鹽、L—谷氨酰胺和2.2g/L碳酸氫鈉(GIBCO，GrandISland，NY)，加10％熱滅活胎牛血清(FCS；IvineScientific，Irvine，CA)和1％青霉素/鏈霉素(GIBCO)的199培養(yǎng)基中傳代。經(jīng)用胰蛋白酶—EDTA(GIBCO)胰酶解3分鐘，收獲貼壁細胞。向培養(yǎng)瓶中加入10ml傳代培養(yǎng)基終止胰酶消化。在標(biāo)準(zhǔn)平底96孔微量滴定板中對新收獲的EC進行增殖試驗。每個試驗孔終體積為200μl。向各孔中加入總共4×104個EC細胞和不同濃度的BPI肽，或緩沖液(對照)4在5％CO2恒溫箱中培養(yǎng)48小時后，向各孔內(nèi)加入1μCi[3H]胸苷(在10μl199培養(yǎng)基中)。24小時摻入后，經(jīng)胰酶消化將EC細胞收獲到玻璃微纖維濾膜上，并用氣體正比固相β計數(shù)器定量摻入的[3H]胸苷。從貼壁細胞培養(yǎng)瓶中收獲10次傳代的細胞并將胰酶消化的細胞重新懸浮在12.5ml培養(yǎng)基中，以對EC細胞進行BPI肽的直接結(jié)合研究。然后在標(biāo)準(zhǔn)24孔組織培養(yǎng)板的各孔中加入0.5ml細胞懸浮液，并保溫過夜。用加在含鈣和鎂的磷酸鹽緩沖鹽水中的10％牛血清白蛋白(GIBCO)洗平板。根據(jù)[3H]—胸苷攝入量檢測對EC細胞增殖的濃度依賴性抑制作用。實施例25在動物模型中分析BPI功能區(qū)肽A.在小鼠內(nèi)毒素血癥模型中的分析在小鼠內(nèi)毒素血癥模型中試驗BPI功能區(qū)肽的效力。以LD90劑量(例如40mg/kg)給每組至少15只小鼠靜脈內(nèi)注射內(nèi)毒素(如E.coliO111B4，SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)。然后第二次靜脈注射濃度約為0.1mg/kg到100mg/kg，推薦劑量約1至50mg/kg的試驗肽。陰性對照小鼠注射未加肽的緩中液。觀察動物7天并記錄死亡率。將注射肽的小鼠與對照組小鼠相比較，根據(jù)內(nèi)毒素血癥相關(guān)死亡率的降低檢測本發(fā)明肽的效力。B.在小鼠腹膜炎模型中的分析在小鼠急性腹膜炎模型中試驗BPI功能區(qū)肽的效力。用107個E.coli07K1菌株的細菌(0.5mL)攻擊各組至少15只小鼠，然后用10mL濃度范圍約為0.1mg/kg至100mg/kg的BPI功能區(qū)肽的溶液治療小鼠。陰性對照小鼠注射未加肽的緩沖液。觀察動物7天并記錄死亡率。與對照組相比，注射有效BPI功能區(qū)肽的試驗組小鼠顯示死亡率降低。實施例26BPI功能區(qū)肽在人體內(nèi)的內(nèi)毒素中和模型中的治療應(yīng)用按照1994年1月24日提交的共同所有、共同待批的美國專利申請序號No.08/188,221中所述方法設(shè)計和進行受控制的雙盲交叉研究，以研究BPI功能區(qū)肽對靜脈內(nèi)輸注細菌內(nèi)毒素而患內(nèi)毒素血癥的人體內(nèi)的效力。應(yīng)了解的是，前述的公開內(nèi)容強調(diào)本發(fā)明的某些特定實施方案，并且對上述內(nèi)容所有改動和等同替代均在待批權(quán)利要求所列出的本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)。序列表(1)一般信息(i)申請人Little，RogerG.(ii)發(fā)明題目來自殺菌性通透性增強蛋白質(zhì)功能區(qū)的生物活性肽及其應(yīng)用(iii)序列數(shù)98(iv)聯(lián)系地址(A)聯(lián)系人Allegretti和Witcoff，Ltd.(B)街道10SouthWackerDrive.Suite3000(C)城市芝加哥(D)州伊里諾伊斯州(E)國家美國(F)郵編60606(v)計算機可讀形式(A)媒體類型FLOPPY盤(B)計算機兼容制IBMPC(C)操作系統(tǒng)PC—DOS/MS—DOS(D)軟件PatentInRelease#1.0，Version#1.25(vi)最近申請資料(A)申請?zhí)朥S(B)申請日1994年1月11日(C)分類(viii)代理人/代理資料(A)姓名Noonan，KcvinE(B)登記號35,303(C)參考/審查號93,1133(ix)電訊資料(A)電話312—715—1000(B)電傳312—715—1234(C)電報910—221—5317(2)SEQIDNO1資料(i)序列特征(A)長度29氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“I區(qū)”(ix)序列描述SEQIDNO1AlaSerGlnGlnGlyThrAlaAlaLeuGlnLysGluLeuLysArgIle151015LysIleProAspTyrSerAspSerPheLysIleLysHis2025(2)SEQIDNO2資料(i)序列特征(A)長度30氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其它資料“BPI.14”(ix)序列描述SEQIDNO2GlyThrAlaAlaLeuGlnLysGluLeuLysArgIleLysIleProAsp151015TyrSerAspSerPheLysIleLysHisLeuGlyLysGlyHis202530(2)SEQIDNO3資料(i)序列特征(A)長度22氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其它資料“BPI.4”(ix)序列描述SEQIDNO3LeuGlnLysGluLeuLysArgIleLysIleProAspTyrSerAspSer151015PheLysIleLysHisLeu20(2)SEQIDNO4資料(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其它資料“BPI.1”(ix)序列描述SEQIDNO4GlnGlnGlyThrAlaAlaLeuGlnLysGluLeuLysArgIleLys151015(2)SEQIDNO5資料(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其它資料“BPI.54”(ix)序列描述SEQIDNO5GlyThrAlaAlaLeuGlnLysGluLeuLysArgIleLysIlePro151015(2)SEQIDNO6資料(i)序列特征(A)長度35氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其它資料“區(qū)段II”(ix)序列描述SEQIDNO6SerSerGlnIleSerMetValProAsnValGlyLeuLysPheSerIle151015SerAsnAlaAsnIleLysIleSerGlyLysTrpLysAlaGlnLysArg202530PheLeuLys35(2)SEQIDNO7資料(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其它資料“BPI.2”(xi)序列描述SEQIDNO7IleLysIleSerGlyLysTrpLysAlaGlnIysArgPheLeuLys151015(2)SEQIDNO8資料(i)序列特征(A)長度10氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其它資料“BPI.8”(xi)序列描述SEQIDNO8LysTrpLysAlaGlnLysArgPheLeuLys1510(2)SEQIDNO9資料(i)序列特征(A)長度16氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其它資料“BPI.58”(xi)序列描述SEQIDNO9CysIleLysIleSerGlyLysTrpLysAlaGlnLysArgPheLeu151015Lys(2)SEQIDNO10資料(i)序列特征(A)長度17氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其它特征“BPI.65氧化型”(xi)序列描述SEQIDNO10CysIleLysIleSerGlyLysTrpLysAlaGlnLysArgPheLeu151015LysCys(2)SEQIDNO11資料(i)序列描述(A)長度27氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其它資料“BPI.3”(xi)序列描述SEQIDNO11AsnValGlyLeuLysPheSerIleSerAsnAlaAsnIleLysIleSer151015GlyLysTrpLysAlaGlnLysArgPheLeuLys2025(2)SEQIDNO12資料(i)序列特征(A)長度28氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其它資料“區(qū)段III”(xi)序列描述SEQIDNO12ValHisValHisIleSerLysSerLysValGlyTrpLeuIleGlnLeu151015PheHisLysLysIleGluSerAlaLeuArgAsnLys2025(2)SEQIDNO13資料(i)序列特征(A)長度13氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其它資料“BPI.11”(xi)序列描述SEQIDNO13LysSerLysValTrpLeuIleGlnLeuPheHisLysLys1510(2)SEQIDNO14資料(i)序列特征(A)長度29氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其它資料“BPI.12”(xi)序列描述SEQIDNO14SerValHisValHisIleSerLysSerLysValGlyTrpLeuIleGln151015LeuPheHisLysLysIleGluSerAlaLeuArgAsnLys2025(2)SEQIDNO15資料(i)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其它資料“BPI.13”(xi)序列描述SEQIDNO15LysSerLysValGlyTrpLeuIleGlnLeuPheHisLysLys1510(2)SEQIDNO16資料(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其它資料“BPI.15”(xi)序列描述SEQIDNO16AlaLysIleSerGlyLysTrpLysAlaGlnLysArgPheLeuLys151015(2)SEQIDNO17資料(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其它資料“BPI.16”(xi)序列描述SEQIDNO17AlaLysIleSerGlyLysTrpLysAlaGLnLysArgPheLeuLys151015(2)SEQIDNO18資料(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其它資料“BPI.17”(xi)序列描述SEQIDNO18IleAlaIleSerGlyLysTrpLysAlaGlnLysArgPheLeuLys151015(2)SEQIDNO19資料(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其它資料“BPI.18”(xi)序列描述SEQIDNO19IleLysIleAlaGlyLysTrpLysAlaGlnLysArgPheLeuLys151015(2)SEQIDNO20資料(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其它資料“BPI.19”(xi)序列描述SEQIDNO20IleLysIleSerAlsLysTrpLysAlaGlnLysArgPheLeuLys151015(2)SEQIDNO21資料(i)序列描述(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其它資料“BPI.20”(xi)序列描述SEQIDNQ21IleLysIleSerGlyAlaTrpLysAlaGlnLysArgPheLeuLysl51015(2)SEQIDNO22資料(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其它資料“BPI.21”(xi)序列描述SEQIDNO22IleLysIleSerGlyLysAlaLysAlaGlnLysArgPheLeuLys151015(2)SEQIDNO23資料(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其它資料“BPI.22”(ix)序列描述SEQIDNO23IleLysIleSerGlyLysTrpAlaAlaGlnLysArgPheLeuLys151015(2)SEQIDNO24資料(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其它資料“BPI.23”(ix)序列描述SEQIDNO24IleLysIleSerGlyLysTrpLysAlaAlaLysArgPheLeuLys151015(2)SEQIDNO25資料(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(xi)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其它資料“BPI.24”(ix)序列描述SEQIDNO25IleLysIleSerGlyLysTrpLysAlaGlnAlaArgPheLeuLys151015(2)SEQIDNO26資料(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(xi)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其它資料“BPI.25”(ix)序列描述SEQIDNO26IleLysIleSerGlyLysTrpLysAlaGlnLysAlaPheLeuLys151015(2)SEQIDNO27資料(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(xi)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其它資料“BPI.26”(xi)序列描述SEQIDNO27IleLysIleSerGlyLysTrpLysAlaGlnLysArgAlaLeuLys151015(2)SEQIDNO28資料(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(xi)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其它資料“BPI.27”(xi)序列描述SEQIDNO28IleLysIleSerGlyLysTrpLysAlaGlnLysArgPheAlaLys151015(2)SEQIDNO29資料(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(xi)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其它資料“BPI.28”(xi)序列描述SEQIDNO29IleLysIleSerGlyLysTrpLysAlaGlnLysArgPheLeuAla151015(2)SEQIDNO30資料(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(xi)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其它資料“BPI.59”(xi)序列描述SEQIDNO30IleLysIleSerGlyAlaTrpAlaAlaGlnLysArgPheLeuLys151015(2)SEQIDNO31資料(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其它資料“BPI.45”(xi)序列描述SEQIDNO31IleLysIleSerGlyLysTrpLysAlaAlaAlaArgPheLauLys1510l5(2)SEQIDNO32資料(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其它資料“BPI.60”(xi)序列描述SEQIDNO32IleAlsIleSerGlyLysTrpLysAlaGlnLysArgPheLeuAla151015(2)SEQIDNO33資料(i)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.31”(xi)序列描述SEQIDNO33AlaSerLysValGlyTrpLeuIleGlnLeuPheHisLysLys1510(2)SEQIDNO34資料(i)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(B)其他資料“BPI.32”(xi)序列描述SEQIDNO34LysAlaLysValGlyTrpLeuIleGlnLeuPheHisLysLys1510(2)SEQIDNO35資料(i)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.33”(xi)序列描述SEQIDNO35LysSerAlaValGlyTrpLeuIleGlnLeuPheHisLysLys1510(2)SEQIDNO36資料(i)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.34”(xi)序列描述SEQIDNO36LysSerLysAlaGlyTrpLeuIleGlnLeuPheHisLysLys1510(2)SEQIDNO37資料(i)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.35”(xi)序列描述SEQIDNO37LysSerLysValAlaTrpLeuIleGlnLeuPheHisLysLys1510(2)SEQIDNO38資料(i)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.36”(xi)序列描述SEQIDNO38LysSerLysValGlyAlaLeuIleGlnLeuPheHisLysLys1510(2)SEQIDNO39資料(i)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.37”(xi)序列描述SEQIDNO39LysSerLysValGlyTrpAlaIleGlnLeuPheHisLysLys1510(2)SEQIDNO40資料(i)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.38”(xi)序列描述SEQIDNO40LysSerLysValGlyTrpLeuAlaGlnLeuPheHisLysLys1510(2)SEQIDNO41資料(i)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.39”(xi)序列描述SEQIDNO41LysSerLysValGlyTrpLeuIleAlaLeuPheHisLysLys1510(2)SEQIDNO42資料(i)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.40”(xi)序列描述SEQIDNO42LysSerLyaValGlyTrpLeuIleGlnAlaPheHisLysLys1510(2)SEQIDNO43資料(i)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.41”(xi)序列描述SEQIDNO43LysSerLysValGlyTrpLeuIleGlnLeuAlaHisLysLys1510(2)SEQIDNO44資料(i)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.42”(xi)序列描述SEQIDNO44LysSerLysValGlyTrpLeuIleGlnLeuPheAlaLysLys1510(2)SEQIDNO45資料(i)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.43”(xi)序列描述SEQIDNO45LysSerLysValGlyTrpLeuIleGlnLeuPheHisAlaLys1510(2)SEQIDNO46資料(i)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.44”(xi)序列描述SEQIDNO46LysSerLysValGlyTrpLeuIleGlnLeuPheHisLysAla1510(2)SEQIDNO47資料(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.56”(xi)序列描述SEQIDNO47IleLysIleSerGlyLysTrpLysAlaLysGlnArgPheLeuLys151015(2)SEQIDNO48資料(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.61”(xi)序列描述SEQIDNO48IleLysIleSerGlyLysPheLysAlaGlnLysArgPheLeuLys151015(2)SEQIDNO49資料(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.66”(ix)特征(A)名稱/鍵修飾的位點(B)位置5..7(D)其他資料/標(biāo)記—D—Trp/注—“第7位氨基酸是D—色氨酸”(xi)序列描述SEQIDNO49IleLysIleSerGlyLysTrpLysAlaGlnLysArgPheLeuLys151015(2)SEQIDNO50資料(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.67”(ix)特征(A)名稱/鍵修飾的位點(B)位置6..8(D)其他資料/標(biāo)記—取代的Ala/注—“第7位丙氨酸是β—萘基取代型”(xi)序列描述SEQIDNO50LysArgPheLeuLysLysTrpLysAlaGlnLysArgPheLeuLys151015(2)SEQIDNO51資料(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.9”(xi)序列描述SEQIDNO51IleLysIleSerGlyLysAlaLysAlaGlnLysArgPheLeuLys151015(2)SEQIDNO52資料(i)序列特征(A)長度24氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.30”(xi)序列描述SEQIDNO52LysTrpLysAlaGlnLysArgPheLeuLysLysSerLysValGlyTrp151015LeuIleGlnLeuPheHisLysLys20(2)SEQIDNO53資料(i)序列特征(A)長度29氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.63”(xi)序列描述SEQIDNO53IleLysIleSerGlyLysTrpLysAlaGlnLysArgPheLeuLysLys151015SerLysValGlyTrpLeuIleGlnLeuPheHisLysLys2025(2)SEQIDNO54資料(i)序列特征(A)長度20氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.7”(xi)序列描述SEQIDNO54LysTrpLysAlaGlnLysArgPheLeuLysLysTrpLysAlaGlnLys151015ArgPheLeuLys20(2)SEQIDNO55資料(i)序列特征(A)長度25氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.10.1”(xi)序列描述SEQIDNO55LysArgPheLeuLysLysTrpLysAlaGlnLysArgPheLeuLysLys151015TrpLysAlaGlnLysArgPheLeuLys2025(2)SEQIDNO56資料(i)序列特征(A)長度28氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.29”(xi)序列描述.SEOIDNO.56LysSerLysValGlyTrpLeuIleGlnLeuPheHisLysLysLysSer151015LysValGlyTrpLeuIleGlnLeuPheHisLysLys2025(2)SEQIDNO57資料(i)序列特征(A)長度20氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.46”(xi)序列描述SEQIDNO57LysTrpLysAlaAlaAlaArgPheLeuLysLysTrpLysAlaGlnLys151015ArgPheLeuLys20(2)SEQIDNO58資料(i)序列特征(A)長度20氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.47”(xi)序列描述SEQIDNO58LysTrpLysAlaGlnLysArgPheLeuLysLysTrpLysAlaAlaAla151015ArgPheLeuLys20(2)SEQIDNO59資料(i)序列特征(A)長度20氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.48”(xi)序列描述SEQIDNO59LysTrpLysAlaAlaAlaArgPheLeuLysLysTrpLysAlaAlaAla151015ArgPheLeuLys20(2)SEQIDNO60資料(i)序列特征(A)長度30氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.69”(xi)序列描述SEQIDNO60LysTrpLysAlaAlaAlaArgPheLeuLysLysTrpLysAlaAlaAla151015ArgPheLeuLysLysTrpLysAlaAlaAlaArgPheLeuLys202530(2)SEQIDNO61資料(i)序列特征(A)長度21氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.55”(xi)序列描述SEQIDNO61GlyTrpLeuIleGlnLeuPheHisLysLysIleGluSerAlaLeuArg151015AsnLysMetAsnSer20(2)SEQIDNO62資料(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.73”(xi)序列描述SEQIDNO62IleLysIleSerGlyLysTrpLysAlaGlnPheArgPheLeuLys151015(2)SEQIDNO63資料(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.70”(ix)特征(A)名稱/鍵修飾位點(B)位置8..10(D)其他資料/標(biāo)記—取代的Ala/注—“第7位的丙氨酸是β—3—吡啶—取代型”(xi)序列描述SEQIDNO63IleLysIleSerGlyLysAlaLysAlaGlnLysArgPheLeuLys151015(2)SEQIDNO64資料(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.71”(ix)特征(A)名稱/鍵修飾位點(B)位置15..15(D)其他資料/標(biāo)記—取代的Ala/注—“13位的丙氨酸是β—3—吡啶—取代型”(xi)序列描述SEQIDNO66IleLysIleSerGlyLysTrpLysAlaGlnLysArgAlaLeuLys151015(2)SEQIDNO65資料(i)序列特征(A)長度26氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.10.2”(xi)序列描述SEQIDNO65GlnLysArgPheLeuLysLysTrpLysAlaGlnLysArgPheLeuLys151015LysTrpLysAlaGlnLysArgPheLeuLys2025(2)SEQIDNO66資料(i)序列特征(A)長度17氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.72”(ix)特征(A)名稱/鍵修飾位點(B)位置1..3(D)其他資料/標(biāo)記—D—丙氨酸注—“位點1和位點2的丙氨酸殘基是D—丙氨酸”(xi)序列描述SEQIDNO64AlaAlaIleLysIleSerGlyLysTrpLysAlaGlnLysArgPheLeu151015Lys(2)SEQIDNO67資料(i)序列特征(A)長度22氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.5”(xi)序列描述SEOIDNO67ValHisValHisIlaSerLysSerLysValGlyTrpLeuIleGlnLeu151015PheHisLysLysIleGlu20(2)SEQIDNO68資料(i)序列特征(A)長度17氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.65還原型”(ix)特征(A)名稱/鍵二硫鍵(B)位置1..17(xi)序列描述SEQIDNO68CysIleLysIleSerGlyLysTrpLysAlaGlnLysArgPheLeuLys151015Cys(2)SEQIDNO69資料(i)序列特征(A)長度487氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“rBPI”(xi)序列描述SEQIDNO69MetArgGluAsnMetAlaArgGlyProCysAsnAlaProArgTrpVal-31-30-25-20SerLeuMetValLeuValAlaIleGlyThrAlaValThrAlaAlaVal-15-10-51AsnProGlyValValValArgIleSerGlnLysGlyLeuAspTyrAla51015SerGlnGlnGlyThrAlaAlaLeuGlnLysGluLeuLysArgIleLys202530IleProAspTyrSerAspSerPheLysIleLysHisLeuGlyLysGly354045HisTyrSerPheTyrSerMetAspIleArgGluPheGlnLeuProSer50556065SerGlnIleSerMetValProAsnValGlyLeuLysPheSerIleSer707580AsnAlaAsnIleLysIleSerGlyLysTrpLysAlaGlnLysArgPhe859095LeuLysMetSerGlyAsnPheAspLeuSerIleGluGlyMetSerIle100105110SerAlsAspLeuLysLeuGlySerAsnProThrSerGlyLysProThr115120125IleThrCysSerSerCysSerSerHisIleAsnSerValHisValHis130135140145IleSerLysSerLysValGlyTrpLeuIleGlnLeuPheHisLysLys150155160IleGluSerAlaLeuArgAsnLysMetAsnSerGlnValCysGluLys165170175ValThrAsnSerValSerSerLysLeuGlnProTyrPheGlnThrLeu180185190ProValMetThrLysIleAspSerValAlaGlyIleAsnTyrGlyLeu195200205ValAlaProProAlaThrThrAlaGluThrLeuAspValGlnMetLys210215220225GlyGluPheTyrSerGluAsnHisHisAsnProProProPheAlaPro230235240ProValMetGluPheProAlaAlaHisAspArgMetVelTyrLeuGly245250255LeuSerAspTyrPhePheAsnThrAlaGlyLeuValTyrGlnGluAla260265270GlyValLeuLysMetThrLeuArgAspAspMetIleProLysGluSer275280285LysPheArgLeuThrThrLysPhePheGlyThrPheLeuProGluVal290295300305AlaLysLysPheProAsnMetLysIleGlnIleHisVaLSerAlaSer310315320ThrProProHisLeuSerValGlnProThrGlyLeuThrPheTyrProAlaValAspValGlnAlaPheAlaValLeuProAsnSerSerLeuAla340345350SerLeuPheLeuIleGlyMetHisThrThrGlySerMetGluValSer355360365AlaGluSerAsnArgLeuValGlyGluLeuLysLeuAspArgLeuLeu370375380385LeuGluLeuLysHisSerAsnIleGlyProPheProValGluLeuLeu390395400GlnAspIleMetAsnTyrIleValProIleLeuValLeuProArgVal405410415AsnGluLysLeuGlnLysGlyPheProLeuProThrProAlaArgVal420425430GlnLeuTyrAsnValValLeuGlnProHisGlnAsnPheLeuLeuPhe435440445GlyAlaAspValValTyrLys(2)SEQIDNO70資料(i)序列特征(A)長度24氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.74”(xi)序列描述SEQIDNO70LysSerLysValGlyTrpLeuIIeGlnLeuPheHisLysLysLys151015TrpLysAlaGlnLysArgPheLeuLys20(2)SEQIDNO71資料(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.76”(ix)特征(A)名稱/鍵修飾位點(B)位置10..12(D)其他資料/標(biāo)記—D—Phe/注—“11位的氨基酸是D—苯丙氨酸”(xi)序列描述SEQIDNO71IleLysIleSerGlyLysTrpLysAlaGlnPheArgPheLeuLys151015(2)SEQIDNO72資料(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.77”(xi)序列描述SEQIDNO72IleLysIleSerGlyLysTrpLysAlaGlnTrpArgPheLeuLys15l015(2)SEQIDNO73資料(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.79”(xi)序列描述SEQIDNO73IleLysIleSerGlyLysTrpLysAlaLysLysArgPheLeuLys151015(2)SEQIDNO74資料(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.80”(ix)特征(A)名稱/鍵修飾—位點(B)位置10..12(D)其他資料/標(biāo)記—取代型—Ala/注—“11位丙氨酸是β—1—苯基—取代型”(xi)序列描述SEQIDNO74IleLysIleSerGlyLysTrpLysAlaGlnAlaArgPheLeuLys151015(2)SEQIDNO75資料(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.81”(xi)序列描述SEQIDNO75IleLysIleSerGlyLysTrpLysAlaPheLysArgPheLeuLys151015(2)SEQIDNO76資料(i)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.82”(xi)序列描述SEQIDNO76LysSerLysValGlyTrpLeuIleGlnLeuTrpHisLysLys1510(2)SEQIDNO77資料(i)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.83”(ix)特征(A)名稱/鍵修飾位點(B)位點10..12(D)其他資料/標(biāo)記—取代的Ala/注—“6位丙氨酸是β—1—萘基取代型”(xi)序列描述SEQIDNO77LysSerLysValGlyAlaLysIleGlnLeuPheHisLysLys1510(2)SEQIDNO78資料(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.84”(ix)特征(A)名稱/鍵修飾位點(B)位置6..8(D)其他資料/標(biāo)記—取代型—Ala/注—“7位丙氨酸是β—1—萘基—取代型”(xi)序列描述SEQIDNO78IleLysIleSerGlyLysAlaLysAlaGlnPheArgPheLeuLys151015(2)SEQIDNO79資料(i)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.85”(xi)序列描述SEQIDNO79LysSerLysValLeuTrpLeuIleGlnLeuPheHisLysLys1510(2)SEQIDNO80資料(i)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.86”(xi)序列描述SEQIDNO80LysSerLysValGlyTrpLeuIleLeuLeuPheHisLysLysl510(2)SEQIDNO81資料(i)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.87”(xi)序列描述SEQIDNO81LysSerLysValGlyTrpLeuIleGlnLeuPheLeuLysLys1510(2)SEQIDNO82資料(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.88”(xi)序列描述SEQIDNO82IleLysIleSerGlyLysTrpLysAlaPhePheArgPheLeuLys151015(2)SEQIDNO83資料(i)序列特征(A)長度29氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.98”(ix)特征(A)名稱/鍵修飾位點(B)位置6..8(D)其他資料/標(biāo)記—取代型—Ala/注—“7位丙氨酸是β—1—萘基取代型”(xi)序列描述SEQIDNO83IleLysIleSerGlyLysAlaLysAlaGlnPheArgPheLeuLys151015LysSerLysValGlyTrpLeuIlePheLeuPheHisLysLys2025(2)SEQIDNO84資料(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.89”(ix)特征(A)名稱/鍵修飾位點(B)位置6..8(D)其他資料/標(biāo)記—取代型—Ala/注—“7位丙氨酸是β—1—萘基—取代型”(xi)序列描述SEQIDNO84IleLysIleSerGlyLysAlaLysAlaPheLysArgPheLeuLys151015(2)SEQIDNO85資料(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.90”(ix)特征(A)名稱/鍵修飾位點(B)位置6..8(D)其他資料/標(biāo)記—取代型—Ala/注—“7位丙氨酸是β—1—萘基取代型”(xi)序列描述SEQIDNO85IleLysIleSerGlyLysAlaLysAlaPhePheArgPheLeuLys151015(2)SEQIDNO86資料(i)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.91”(xi)序列描述SEQIDNO86LysSerLysValGlyTrpLeuIlePheLeuPheHisLysLys1510(2)SEQIDNO87資料(i)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.92”(xi)序列描述SEQIDNO87LysSerLysValGlyTrpLeuIleLysLeuPheHisLysLys1510(2)SEQIDNO88資料(i)序列特征(A)長度29氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.93”(ix)特征(A)名稱/鍵修飾位點(B)位置6..8(D)其他資料/標(biāo)記—取代型—Ala/注—“7位丙氨酸是β—1—萘基—取代型”(xi)序列描述SEQIDNO88IleLysIleSerGlyLysAlaLysAlaGlnPheArgPheLeuLys151015LysSerLysValGlyTrpLeuIleGlnLeuPheHisLysLys2025(2)SEQIDNO89資料(i)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.94”(xi)序列描述SEQIDNO89LysSerLysValGlyTrpLeuIleGlnLeuPhePheLysLys1510(2)SEQIDNO90資料(i)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.95”(xi)序列描述SEQIDNO90LysSerLysValPheTrpLeuIleGlnLeuPheHisLysLys1510(2)SEQIDNO91資料(i)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.96”(xi)序列描述SEQIDNO91LysSerLysValGlyTrpLeuIleGlnLeuPheHisLysPhe1510(2)SEQIDNO92資料(i)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.97”(xi)序列描述SEQIDNO92LysSerLysValLysTrpLeuIleGlnLeuPheHisLysLys1510(2)SEQIDNO93資料(i)序列特征(A)長度30氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.99”(xi)序列描述SEQIDNO93LysTrpLysAlaGlnIrpArgPheLeuLysLysTrpLysAlaGln151015TrpArgPheLeuLysLysTrpLysAlaGlnTrpArgPheLeuLys202530(2)SEQIDNO94資料(i)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.100”(xi)序列描述SEQIDNO94LysSerLysValLysTrpLeuIleLysLeuPheHisLysLys1510(2)SEQIDNO95資料(i)序列特征(A)長度28氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.101”(xi)序列描述SEQIDNO95LysSerLysValLysTrpLeuIleLysLeuPhePheLysPheLysSerl51015LysValLysTrpLeuIleLysLeuPhePheLysPhe2025(2)SEQIDNO96資料(i)序列特征(A)長度24氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“BPI.102”(xi)序列描述SEQIDNO96LysTrpLysAlaGlnPheArgPheleuLysLysSerLysValGlyTrp151015LeuIleLeuLeuPheHisLysLys20(2)SEQIDNO97資料(i)序列特征(A)長度1443堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型DNA(ix)特征(A)名稱/鍵CDS(B)位置1..1443(ix)特征(A)名稱/鍵mot肽(B)位置76-1443(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“rLBP”(xi)序列描述SEQIDNO97ATGGGGGCCTTGGCCAGAGCCCTGCCGTCCATACTGCTGGCATTGCTG48MetGlyAlaLeuAlaArgAlaLeuProSerIleLeuLeuAlaLeuLeu-25-20-15-10CTTACGTCCAGCGCAGAGGGTCTGGGTGCCAACCCCGGGTTGGTCGCC96LeuThrSerThrProGluAlaLeuGlyAlaAsnProGlyLeuValAla-515AGGATCACCGACAAGGGACTGCAGTATGCGGCCCAGGAGGGGCTATTG144ArgIleThrAspLysGlyLeuGlnTyrAlaAlaGlnGluGlyLeuLeu101520GCTCTGCAGAGTGAGCTGCTCAGGATCACGCTGCCTGACTTCACCGGG192AlaLeuGlnSerGluLeuLeuArgIleThrLeuProAspPheThrGly253035GACTTGAGGATCCCCCACGTCGGCCGTGGGCGCTATGAGTTCCACAGC240AspLeuArgIleProHisValGlyArgGlyArgTyrGluPheHisSer40455055CTGAACATCCACAGCTGTGAGCTGCTTCACTCTGCGCTGAGGCCTGTC288LeuAsnIleHisSerCysGluLeuLeuHisSerAlaLeuArgProVal606570CGTGGCCAGGGCCTGAGTCTCAGCATCTCCGACTCCTCCATCCGGGTG336ProGlyGlnGlyLeuSerLeuSerIleSerAspSerSerIleArgVal758085CAGGGCAGGTGGAAGGTGCGCAAGTCATTCITCAAACTACAGGGCTCC384GlnGlyArgTrpLysValArgLysSerPhePheLysLeuGlnGlySer9095100TTTGATGTCAGTGTCAAGGGCATCAGCATTTCGGTCAACCTCCTGTTG432PheAspValSerValLysGlyIleSerIleSerValAsnLeuLeuLeu105110115GGCAGCGAGTCCTGCGGGAGGCCCACAGTTACTGGCTCGAGCTGCAGC480GlySerGluSerSerGlyArgProThrValThrAlaSerSerCysSer120125130135AGTGACATCGCTGACGTGGAGGTGGACATGTCGGGAGACTTGGGGTGG528SerAspIleAlaAspValGluValAspMetSerGlyAspLeuGlyTrp140145150CTGTTGAACCTCTTCCACAACCAGATTGAGTCCAAGTTCCAGAAAGTA576LeuLeuAsnLeuPheHisAsnGlnIleGluSerLysPheGlnLysVal155160165CTGGAGAGCAGGATTTGCGAAATGATCCAGAAATCGGTGTCCTCGGAT624LeuGluSerArgIleCysGluMetIleGlnLysSerValSerSerAsp170175180CTACAGCCTTATCTCCAAACTCTGCCAGTTACAACAGAGATTGACAGT672LeuGlnProTyrLeuGlnThrLeuProValThrThrGluIleAspSer185190195TTCGCCGACATTGATTATAGCTTAGTGGAAGCCCCTCGGGCAACAGCC720PheAlaAspIleAspTyrSerLeuValGluAlaProArgAlaThrAla200205210215CAGATGCTGGAGGTGATGTTTAAGGGTGAAATCTTTCATCGTAACCAC768GlnMetLeuGluValMetPheLysGlyGluIlePheHisArgAsnHis220225230CGTTCTCCAGTTACCCTCCTTGCTGCAGTCATGAGCCTTCCTGAGGAA816ArgSerProValThrLeuLeuAlaAlaValMetSerLeuProGluGlu235240245CACAACAAAATGGTCTACTTTGCCATCTCGGATTATGTCTTCAACACG864HisAsnLysMetValTyrPheAlaIleSerAspTyrValPheAsnThr250255260GCCAGCCTGGTTTATCATGAGGAAGGATATCTGAACTTCTCCATCACA912AlaSerLeuValTyrHisGluGluGlyTyrLeuAsnPheSerIleThr265270275GATGAGATGATACCGCCTGACTCTAATATCCGACTGACCACCAAGTCC960AspGluMetIleProProAspSerAsnIleArgLeuThrThrLysSer280285290295TTCCGACCCTTCGTCCCACGGTTAGCCAGGCTCTACCCCAACATGAAC1008PheArgProPheValProArgLeuAlaArgLeuTyrProAsnMetAsn300305310CTGGAACTCCAGGGATCAGTGCCCTCTGCTCCGCTCCTGAACTTCAGC1056LeuGluLeuGlnGlySerValProSerAlaProLeuLeuAsnPheSer315320325CCTGGGAATCTGTCTGTGGACCCCTATATGGAGATAGATGCCTTTGTG1104ProGlyAsnLeuSerValAspProTyrMetGluIleAspAlaPheVal330335340CTCCTGCCCAGCTCCAGCAAGGAGCCTGTCTTCCGGCTCAGTGTGGCC1152LeuLeuProSerSerSerLysGluProValPheArgLeuSerValAla345350355ACTAATGTGTCCGCCACCTTGACCTTCAATACCAGCAAGATCACTGGG1200ThrAsnValSerAlaThrLeuThrPheAsnThrSerLysIleThrGly360365370375TTCCTGAAGCCAGGAAAGGTAAAAGTGGAACTGAAAGAATCCAAAGTT1248PheLeuLysProGlyLysValLysValGluLeuLysGluSerLysVal380385390GGACTATTCAATGCAGAGCTGTTGGAAGCGCTCGTCAAGTATTAGATC1296GlyLeuPheAsnAlaGluLeuLeuGluAlaLeuLeuAsnTyrTyrIle395400405CTTAACACCTTCTAGCCCAAGTTCAATGATAAGTTGGCCGAAGGCTTC1344LeuAsnThrPheTyrProLysPheAsnAspLysLeuAlaGluGlyPhe410415420CCCCTTCCTCTGCTGAAGCGTGTTCAGCTCTACGACCTTGGGCTGCAG1392ProLeuProLeuLeuLysArgValGlnLeuTyrAspLeuGlyLeuGln425430435ATCCATAAGGACTTCCTGTTCTTGGGTGCCAATGTCCAATACATGAGA1440IleHisLysAspPheLeuPheLeuGlyAlaAsnValGlnTyrMetArg(22)SEQIDNO98資料(i)序列特征(A)長度481氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱/鍵混合特征(D)其他資料“rLBP”(xi)序列描述SEQIDNO98MetGlyAlaLeuAlsArgAlaLeuProSerIleLeuLeuAlaLeuLeu-25-20-15-10LeuThrSerThrProGluAlaLeuGlyAlaAsnProGlyLauValAla-515ArgIleThrAspLysGlyLeuGlnTyrAlaAlaGlnGluGlyLeuLeu101520AlaLeuGlnSerGluLeuLeuArgIleThrLeuProAspPheThrGly253035AspLeuArgIleProHisValGlyArgGlyArgTyrGluPheHisSer40455055LeuAsnIleHisSerCysGluLeuLeuHisSerAlaLeuArgProVal606570ProGlyGlnGlyLeuSerLeuSerIleSerAspSerSerIleArgVal758085GlnGlyArgTrpLysValArgLysSerPhePheLysLeuGlnGlySer9095100PheAspValSerValLysGlyIleSerIleSerValAsnLeuLeuLeu105110115GlySerGluSerSerGlyArgProThrValThrAlaSerSerCysSer120125130135SerAspIleAlaAspValGluValAspMetSerGlyAspLeuGlyTrp140145150LeuLeuAsnLeuPheHisAsnGlnIleGluSerLysPheGlnLysVal155160165LeuGluSerArgIleCysGluMetIleGlnLysSerValSerSerAsp170175180LeuGlnProTyrLeuGlnThrLeuProValThrThrGluIleAspSer185190195PheAlaAspIleAspTyrSerLauValGluAlaProArgAlaThrAls200205210215GlnMetLeuGluValMetPheLysGlyGluIlePheHisArgAsnHis220225230ArgSerProValThrLeuLeuAlaAlaValMetSerLeuProGluGlu235240245HisAsnLysMetValTyrPheAlaIleSerAspTyrValPheAsnThr250255260AlaSerLeuValTyrHisGluGluGlyTyrLeuAsnPheSerIleThr265270275AspGluMetIleProProAspSerAsnIleArgLeuThrThrLysSer280285290295PheArgProPheValProArgLeuAlaArgLeuTyrProAsnMetAsn300305310LeuGluLeuGlnGlySerValProSerAlaProLeuLeuAsnPheSer315320325ProGlyAsnLeuSerValAspProTyrMetGluIleAspAlaPheVal330335340LeuLeuProSerSerSerLysGluProValPneArgLeuSerValAla345350355ThrAsnValSerAlaThrLauThrPheAsnThrSerLysIleThrGly360365370375PheLeuLysProGlyLysValLysValGluLeuLysGluSerLysVal380385390GlyLeuPheAsnAlaGluLauLauGluAlaLeuLeuAsnTyrTyrIle395400405LeuAsnThrPheTyrProLysPheAsnAspLysLeuAlaGluGlyPhe410415420ProLeuProLeuLeuLysArgValGlnLeuTyrAspLeuGlyLeuGln425430435IleHisLysAspPheLeuPheLeuGlyAlaAsnValGlnTyrMetArg440445450455Val權(quán)利要求1.一種肽，具有人殺菌性/通透性增強蛋白質(zhì)(BPI)從大約17位到大約45位的氨基酸序列，其亞序列，該序列或其亞序列的變異體，具有為BPI活性的生物學(xué)活性。2.權(quán)利要求1的肽，具有下列氨基酸順序ASQQGTAALQKELKRIKIPDYSDSFKIKH(SEQIDNO1)；GTAALQKELKRIKIPDYSDSFKIKHLGKGH(SEQIDNO2)；LQKELKRIKIPDYSDSFKIKHL(SEQIDNO3)；QQGTAALQKELKRIK(SEQIDNO4)；或GTAALQKELKRIKIP(SEQIDNO5)3.一種肽，含有2個或3個相同或不同的根據(jù)權(quán)利要求1的肽以共價連接起來。4.一種藥用組合物，含有根據(jù)權(quán)利要求1的肽和一種藥用上可接受的載體或稀釋劑。5.和中肽，具有人殺菌性/通透性增強蛋白質(zhì)(BPI)從大約65位到大約99位的氨基酸序列，其亞序列以及該序列或其亞序列的變異體，具有為BPI活性的生物學(xué)活性。6.權(quán)利要求5的肽，具有下列氨基酸順序SSQISMVPNVGLKFSISNANIKISGKWKAQKRFLK(SEQIDNO6)；IKISGKWKAQKRFLK(SEQIDNO7)；KWKAQKRFLK(SEQIDNO8)；CIKISGKWKAQKRFLK(SEQIDNO9)；CIKISGKWKAQKRFLKC(SEQIDNO10)；NVGLKFSISNANIKISGKWKAQKRFLK(SEQIDNO11)；AKISGKWKAQKRFLK(SEQIDNO16)；IAISGKWKAQKRFLK(SEQIDNO；17)；IKASGKWKAQKRFLK(SEQIDNO18)；IKIAGKWKAQKRFLK(SEQIDNO29)；IKISAKWKAQKRFLK(SEQIDNO20)；IKISGAWKAQKRFLK(SEQIDNO21)；IKISGKAKAQKRFLK(SEQIDNO22)；IKISGKWAAQKRFLK(SEQIDNO23)；IKISGKWKAAKRFLK(SEQIDNO24)；IKISGKWKAQARFLK(SEQIDNO25)；IKISGKWKAQKAFLK(SEQIDNO26)；IKISGKWKAQKRALK(SEQIDNO27)；IKISGKWKAQKRFAK(SEQIDNO28)；IKISGKWKAQKRFLA(SEQIDNO29)；IKISGAWAAQKRFLK(SEQIDNO30)；IKISGKWKAAARFLK(SEQIDNO31)；IAISGKWKAQKRFLA(SEQIDNO32)；IKISGKWKAKQRFLK(SEQIDNO47)；IKISGKWKAQWRFLK(SEQIDNO72)；IKISGKWKAKKRFLK(SEQIDNO73)；IKISGKWKAFKRFLK(SEQIDNO75)；IKISGKFKAQKRFLK(SEQIDNO48)；IKISGKWDKAQKRFLK(SEQIDNO49)；IKISGKWKAFFRFLK(SEQIDNO82)；IKISGKWKAQFRFLK(SEQIDNO62)；IKISGKAβ-(3-吡啶)KAQKRFLK(SEQIDNO63)；IKISGKWKAQKRAβ-(3-吡啶)LK(SEQIDNO64)；ADADIKISGKWKAQKRFLK(SEQIDNO66)；IKISGKWKAQFDRFLK(SEQIDNO71)；ILISGKWKAQAβ-(1-萘基)RFLK(SEQIDNO74)；IKISGKAβ-(1-萘基)KAQFRFLK(SEQIDNO78)；IKISGKAβ-(1-萘基)KAFKRFLK(SEQIDNO84)；IKISGKAβ-(1-萘基)KAFFRFLK(SEQIDNO85)；或IKISGKAβ-(1-萘基)KAQKRFLK(SEQIDNO50)。7.一種肽，含有2個或3個相同或不同的根據(jù)權(quán)利要求5的肽以共價連接起來。8.權(quán)利要求7的肽，具有下列氨基酸順序KRFLKKWKAQKRFLK(SEQIDNO51)；KWKAQKRFLKKWKAQKRFLK(SEQIDNO54)；KRFLKKWKAQKRFLKKWKAQKRFLK(SEQIDNO55)；KWKAAARFLKKWKAQKRFLK(SEQIDNO57)；KWKAQKRFLKKWKAAARFLK(SEQIDNO58)；KWKAAARFLKKWKAAARFKL(SEQIDNO59)；KWKAQWRFLKKWKAQWRFLKKWKAQWRFLK(SEQIDNO93)；KWKAAARFLKKWKAAARFLKKWKAAARFLK(SEQIDNO60)；或QKRFLKKWKAQKRFLKKWKAQKRFLK(SEQIDNO65).9.一種藥用組合物，含有根據(jù)權(quán)利要求5的肽和一種藥用上可接受的載體或稀釋劑。10.一種肽，具有人殺菌性通透性增強蛋白質(zhì)(BPI)從大約142位到大約169位氨基酸序列，其亞序列和該序列或其亞序列的變異體，具有為BPI活性的生物學(xué)活性。11.權(quán)利要求10的肽具有下面的氨基酸序列VHVHISKSKVGWLIQLFHKKIESALRNK(SEQIDNO12)；KSKVWLIQLFHKK(SEQIDNO13)VHVHISKSKVGWLIQLFHKKIE(SEQIDNO67)；SVHVHISKSKVGWLIQLFHKKIESALRNK(SEQIDNO14)；KSKVGWLIQLFHKK(SEQIDNO15)；ASKVGWLIQLFHKK(SEQIDNO33)；KAKVGWLIQLFHKK(SEQIDNO34)；KSAVGWLIQLFHKK(SEQIDNO35)；KSKAGWLIQLFHKK(SEQIDNO36)；KSKVAWLIQLFHKK(SEQIDNO37)；KSKVGALIQLFHKK(SEQIDNO38)；KSKVGWAIQLFHKK(SEQIDNO39)；KSKVGWLAQLFHKK(SEQIDNO40)；KSKVGWLIALFHKK(SEQIDNO41)；KSKVGWLIQAFHKK(SEQIDNO42)；KSKVGWLIQLAHKK(SEQIDNO43)；KSKVGWLIQLFAKK(SEQIDNO44)；KSKVGWLIQLFHAK(SEQIDNO45)；GWLIQLFHKKIESALRNKMNS(SEQIDNO61)；KSKVGWLIQLWHKK(SEQIDNO76)；KSKVLWLIQLFHKK(SEQIDNO79)；KSKVGWLILLFHKK(SEQIDNO80)；KSKVGWLIQLFLKK(SEQIDNO81)；KSKVGWLIFLFHKK(SEQIDNO；86)；KSKVGWLIKLFHKK(SEQIDNO87)；KSKVGWLIQLFFKK(SEQIDNO89)；KSKVFWLIQLFHKK(SEQIDNO90)；KSKVGWLIQLFHKF(SEQIDNO91)；KSKVKWLIQLFHKK(SEQIDNO92)；KSKVKWLIKLFHKK(SEQIDNO94)；KSKVGAβ-(1-萘基)LIQLFHKK(SEQIDNO77)；或KSKVGWLIQLFHKA(SEQIDNO46).12.一種肽，含有2個或3個相同或不同的根據(jù)權(quán)利要求10的肽以共價連接起來。13.權(quán)利要求12的肽，具有下列氨基酸序列KSKVKWLIKLF-FKFKSKVKWLIKLFFKF(SEQIDNO95)；或KSKVG-WLIQLFHKKKSKVGWLIQLFHKK(SEQIDNO56)。14.一種藥用組合物，含有一種根據(jù)權(quán)利要求10的肽和一種藥用上可接受的載體或稀釋劑。15.一種肽，其中2個或3個相同或不同的根據(jù)權(quán)利要求1、5或10的肽成直線的以共價連接起來。16.權(quán)利要求15的肽，具有下列氨基酸序列KWKAQKRFLKKSKVGWLIQLFHKK(SEQIDNO52)；IKISGKWKAQKRFLKKSKVGWLIQLFHKK(SEQIDNO53)；KSKVGWLIQLFHKKKWKAQKRFLK(SEQIDNO70)；IKISGKAβ-(1-萘基)KAQFRFLKKSKVGWLIQLFHKK(SEQIDNO88)；IKISGKAβ-(1-萘基)KAQFRFLKKSKVGWLIFLFHKK(SEQIDNO83)或KWKAQFRFLKKSKVGWLILLFHKK(SEQIDNO96)。17.一種藥用組合物，含有一種根據(jù)權(quán)利要求15的肽和一種藥用上可接受的載體或稀釋劑。18.一種中和肝素的抗凝血效力的方法，包含給對象施用有效量的權(quán)利要求1，5，10或15的肝素結(jié)合肽。19.一種抑制血管形成的方法，包括給對象施用一定量的能產(chǎn)生有效抑制血管形成的權(quán)利要求1，5，10或15的肽。20.權(quán)利要求19的方法，其中的血管形成抑制與視網(wǎng)膜病相聯(lián)系。21.一種抑制內(nèi)皮細胞增生的方法，包括給對象施用一定量的對抑制增生有效的權(quán)利要求1，5，10或15的肽。22.一種治療子宮內(nèi)膜異位的方法，包括給子宮內(nèi)膜施用一定量的對抑制內(nèi)皮細胞增生有效的權(quán)利要求1，5，10或15的肽。23.一種避孕方法，包括給對象的子宮內(nèi)膜施用一定量的對阻止與受精卵植入相聯(lián)系的內(nèi)皮細胞增生有效的權(quán)利要求1，5，10或15的肽。24.一種抑制惡性腫瘤細胞增生的方法，包括給對象施用一定量的對抑制增生有效的權(quán)利要求1，5，10或15的肽。25.權(quán)利要求24的方法，其中的惡性腫瘤是卡波濟肉瘤。26.一種治療慢性炎癥疾病狀態(tài)的方法，包含給對象施用對減輕炎癥有效量的權(quán)利要求1，5，10，或15的肽。27.權(quán)利要求26的方法，其中的慢性炎癥疾病是關(guān)節(jié)炎。28.一種權(quán)利要求27的方法，其中的關(guān)節(jié)炎癥癥性疾病狀態(tài)是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。29.一種權(quán)利要求27的方法，其中治療的關(guān)節(jié)炎癥性疾病狀態(tài)是反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎。30.一種權(quán)利要求1，5，10，或15的肽用作肝素結(jié)合藥物。31.一種權(quán)利要求1，5，10或15的肝素結(jié)合肽，用于中和肝素的抗凝血效力。32.一種權(quán)利要求1，5，10或15的肽素結(jié)合肽，用于抑制血管形成。33.根據(jù)權(quán)利要求32的肽，其中抑制的血管形成與視網(wǎng)膜病相聯(lián)系。34.一種權(quán)利要求1，5，10或15的肝素結(jié)合肽，用于抑制內(nèi)皮細胞增生。35.根據(jù)權(quán)利要求34的肽，其中的內(nèi)皮細胞增生與子宮內(nèi)膜異位相聯(lián)系。36.一種權(quán)利要求1，5，10或15的肝素結(jié)合肽，用作一種避孕藥。37.一種權(quán)利要求1，5，10或15的肝素結(jié)合肽，用于抑制亞性腫瘤細胞增生。38.根據(jù)權(quán)利要求37的肽，其中的惡性腫瘤是卡波濟肉瘤。39.一種權(quán)利要求1，5，10或15的肝素結(jié)合肽，用于治療慢性炎癥疾病狀態(tài)。40.根據(jù)權(quán)利要求39的肽，其中的慢性炎癥疾病是關(guān)節(jié)炎。41.根據(jù)權(quán)利要求40的肽，其中的關(guān)節(jié)炎癥性疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。42.根據(jù)權(quán)利要求40的肽，其中的關(guān)節(jié)炎癥性疾病是反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎。43.權(quán)利要求1，5，10或15的肽用于肝素結(jié)合藥物的生產(chǎn)。44.權(quán)利要求1，5，10或15的肽，用于中和肝素抗凝血效力的肝素結(jié)合藥物之生產(chǎn)。45.權(quán)利要求1，5，10或15的肽，用于抑制血管形成的肝素結(jié)合藥物的生產(chǎn)。46.權(quán)利要求1，5，10，或15的肽，用于抑制與視網(wǎng)膜病相聯(lián)系的血管形成的肝素結(jié)合藥物之生產(chǎn)。47.權(quán)利要求1，5，10或15的肽，用于抑制內(nèi)皮細胞增生的肝素結(jié)合藥物之生產(chǎn)。48.權(quán)利要求1，5，10或15的肽，用于以抑制內(nèi)皮細胞增生來治療子宮內(nèi)膜異位的肝素結(jié)合藥物之生產(chǎn)。49.權(quán)利要求1，5，10或15的肽，用于肝素結(jié)合避孕藥的生產(chǎn)。50.權(quán)利要求1，5，10或15的肽，用于抑制惡性腫瘤細胞增生的肝素結(jié)合藥物。51.根據(jù)權(quán)利要求50的用途，其中的惡性腫瘤是卡波濟肉瘤。52.權(quán)利要求1，5，10或15的肽，在用于治療慢性炎癥疾病狀態(tài)的肝素結(jié)合藥物中的用途。53.根據(jù)權(quán)利要求52的用途，其中的慢性炎癥疾病是關(guān)節(jié)炎。54.根據(jù)權(quán)利要求53的用途，其中的關(guān)節(jié)炎癥性疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。55.根據(jù)權(quán)利要求53的用途，其中的關(guān)節(jié)炎癥性疾病是反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎。56.一種在對象中治療革蘭氏陰性細菌感染及其后遺癥的方法，包括施用權(quán)利要求1，5，10或15的肽。57.一種在對象中治療革蘭氏陰性感染及其后遺癥的藥用組合物，含有效劑量的權(quán)利要求1，5，10或15的肽。58.一種權(quán)利要求57的藥用組合物，含有藥用上有效的稀釋劑、佐劑或載體。59.權(quán)利要求1，5，10或15的肽，用于治療革蘭氏陰性細菌感染和其后遺癥的藥物之生產(chǎn)。60.一種治療對象的血液循環(huán)中革蘭氏陰性內(nèi)毒素有害影響的方法，包括施用權(quán)利要求1，5，10，或15的肽。61.一種治療血液循環(huán)中革蘭氏陰性細菌內(nèi)毒素的有害影響的藥用組合物，含有權(quán)利要求1，5，10，或15的肽。62.一種權(quán)利要求61的藥用組合物，含有藥用上可接受的稀釋劑、佐劑或載體。63.一種權(quán)利要求1，5，10，或15的肽，在用于治療血液循環(huán)中革蘭氏陰性內(nèi)毒素的有害影響的藥物之生產(chǎn)中的用途。64.一種殺死革蘭氏陰性細菌的方法，包含施用權(quán)利要求1，5，10，或15的肽。65.用于殺死革蘭氏陰性細菌的藥用組合物，含有效劑量的權(quán)利要求1，5，10，或15的肽。66.一種權(quán)利要求65的藥用組合物，包含一種藥用上可接受的稀釋劑、佐劑或載體。67.一種權(quán)利要求1，5，10或15的肽，用于殺死革蘭氏陰性細菌的藥物之生產(chǎn)。68.一種治療與網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)功能抑制相聯(lián)系的有害生理學(xué)影響的方法，包括給遭受網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)功能抑制的對象施用有效劑量的權(quán)利要求1，5，10，或15的肽。69.權(quán)利要求68的方法，其中所說的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)功能抑制包括肝臟枯否氏細胞功能的削弱。70.權(quán)利要求69的方法，其中所說的枯否氏細胞功能的削弱起因于肝臟的物理損傷。71.權(quán)利要求69的方法，其中所說的枯否氏細胞功能的削弱由肝臟的化學(xué)損害引起。72.權(quán)利要求69的方法，其中所說的枯否氏細胞功能的削弱由肝臟的生物學(xué)損傷引起。73.權(quán)利要求68的方法，其中所說的肽與藥用上可接受的稀釋劑、佐劑或載體聯(lián)合用藥。74.用于治療與網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)功能受抑制相聯(lián)系的有害生理學(xué)影響的藥用組合物，含有效量劑的權(quán)利要求1，5，10或15的肽。75.根據(jù)權(quán)利要求74的藥用組合物，含有藥用上可接受的稀釋劑、佐劑或載體。76.權(quán)利要求1，5，10或15的功能區(qū)肽，用于治療與網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞功能受抑制相聯(lián)系的有害生理學(xué)影響的藥物之生產(chǎn)。77.一種在對象中治療革蘭氏陰性細菌感染及其后遺癥的方法，包括施用一種權(quán)利要求1，5，10或15的肽和協(xié)同有效劑量的抗生素。78.權(quán)利要求77的方法，其中的抗生素是一種非蛋白質(zhì)抗生素。79.權(quán)利要求77的方法，其中的抗生素選自由慶大霉素，多粘菌素B和Cefamandolenafate組成的類別之中。80.權(quán)利要求77的方法，其中所說的抗生素和所說的肽以各自單獨對革蘭氏陰性細菌感染具殺菌效力的劑量給藥。81.權(quán)利要求77的方法，其中所說的肽和抗生素以全身給藥方式給藥。82.權(quán)利要求77的方法，其中所說的肽和抗生素以局部的方式給藥。83.一種殺死革蘭氏陰性細菌的方法，包括按有效劑量聯(lián)合施用一種權(quán)利要求1，5，10或15的肽和一種抗生素。84.權(quán)利要求83的方法，其中所說的肽和所說的抗生素進行體內(nèi)給藥。85.權(quán)利要求84的方法，其中所說的肽和所說的抗生素以全身的方式約藥。86.權(quán)利要求84的方法，其中所說的肽和所說的抗生素以局部的方式給藥。87.權(quán)利要求83的方法，其中所說的肽和所說的抗生素進行體外用藥。88.權(quán)利要求83的方法，其中所說的抗生素選自由慶大霉素、多粘菌素B和Cefamandolenafate組成的類別之中。89.用于治療革蘭氏陰性細菌感染及其后遺癥的藥用組合物，含有協(xié)同有效劑量的一種權(quán)利要求1，5，10或15的肽和一種抗生素。90.權(quán)利要求89的藥用組合物，含有一種藥用上可接受的稀釋劑、佐劑或載體。91.權(quán)利要求89的藥用組合物，其中所說的抗生素選自由慶大霉素，多粘菌素B和Cefamandolenafate組成的類別之中。92.有效劑量的一種權(quán)利要求1，5，10或15的肽聯(lián)和一種抗生素在用于治療革蘭氏陰性細菌感染及其后遺癥的藥物之生產(chǎn)中的用作。93.權(quán)利要求92的用途，其中所說的抗生素選自由慶大霉素、多粘菌素B和Cefamandolenafate組成的類別之中。94.一種在對象中治療革蘭氏陰性細菌感染及其后遺癥的方法，包括施用一種權(quán)利要求1，5，10，或15的肽和一種LBP蛋白質(zhì)產(chǎn)物。95.一種權(quán)利要求94的方法，其中的LBP蛋白質(zhì)產(chǎn)物以有效劑量用藥以增強所說肽的殺菌特性。96.權(quán)利要求94的方法，其中的LBP蛋白質(zhì)產(chǎn)物是一種LBP的氨基末端片段。97.權(quán)利要求94的方法，其中的LBP蛋白質(zhì)產(chǎn)物被鑒定為分子量約25KD。98.權(quán)利要求94的方法，其中的LBP蛋白質(zhì)產(chǎn)物是LBP全蛋白質(zhì)。99.權(quán)利要求94的方法，其中的蛋白質(zhì)以全身方式投藥。100.權(quán)利要求94的方法，其中的蛋白質(zhì)以局部的方式投藥。101.一種殺死革蘭氏陰性細菌的方法，包括聯(lián)合施用一種權(quán)利要求1，5，10，或15的肽和能在有效劑量增強其殺菌特性的LBP蛋白質(zhì)產(chǎn)物。102.權(quán)利要求101的方法，其中所說的肽和所說的LBP蛋白質(zhì)產(chǎn)物進行體內(nèi)投藥。103.權(quán)利要求101的方法，其中所說的肽和所說的LBP蛋白質(zhì)產(chǎn)物進行體外投藥。104.權(quán)利要求101的方法，其中的LBP蛋白質(zhì)產(chǎn)物是一種LBP氨基末端片段。105.權(quán)利要求101的方法，其中的LBP蛋白質(zhì)產(chǎn)物被鑒定為分子量為大約25KD。106.權(quán)利要求101的方法，其中的LBP蛋白質(zhì)產(chǎn)物是全蛋白。107.一種用于治療革蘭氏陰性細菌感染及其后遺癥的藥用組合物，含有一種權(quán)利要求1，5，10，或15的肽和一種增強其殺菌特性有效劑量的LBP蛋白質(zhì)產(chǎn)物。108.權(quán)利要求107的藥用組合物，含有一種藥用上可接受的稀釋劑、佐劑或載體。109.權(quán)利要求107的藥用組合物，其中的LBP蛋白質(zhì)產(chǎn)物是一種LBP氨基末端片段。110.權(quán)利要求107的藥用組合物，其中的LBP蛋白質(zhì)產(chǎn)物鑒定為分子量為大約25KD。111.一種革蘭氏陰性菌的細胞毒組合物，含有權(quán)利要求1，5，10或15的肽和對增強所說的功能區(qū)肽有效劑量的LBP蛋白質(zhì)產(chǎn)物。112.權(quán)利要求1，5，10或15的肽和一種LBP蛋白質(zhì)產(chǎn)物，用于治療革蘭氏陰性感染及其后遺癥的藥物之生產(chǎn)。113.權(quán)利要求1，5，10或15的肽和一種LBP蛋白質(zhì)產(chǎn)物，用于殺死革蘭氏陰性細菌的藥物之生產(chǎn)。114.一種治療患分枝桿菌感染的對象的方法，包括給對象施用含有權(quán)利要求1，5，10或15肽的組合物。115.權(quán)利要求114的方法，其中的組合物以口服的方式投藥。116.權(quán)利要求114的方法，其中的組合物以靜脈注射的方式投藥。117.權(quán)利要求114的方法，其中的組合物以噴霧劑的形式用藥。118.權(quán)利要求114的方法，治療的感染由選自結(jié)核桿菌、麻瘋桿菌和M.avium組成的類型中的分枝桿菌屬細菌所引起。119.權(quán)利要求114的方法，其中的組合物還含有一種抗生素。120.權(quán)利要求114的方法，其中的組合物還含有一種表面活性劑。121.一種治療患血液循環(huán)中脂阿拉伯甘露聚糖的存在引起的有害生理學(xué)影響的對象之方法，所說的方法包括給對象施用含權(quán)利要求1，5，10或15的肽的組合物。122.權(quán)利要求121的方法，其中的有害生理學(xué)影響包含由脂阿拉伯甘露糖誘導(dǎo)的，對巨噬細胞的T—細胞淋巴因子激活的抑制導(dǎo)致對微生物或腫瘤的免疫應(yīng)答抑制。123.權(quán)利要求121的方法，其中的有害生理學(xué)影響包括對象的細胞因子產(chǎn)物增加。124.權(quán)利要求121的方法，其中的組合物以口服的形式用藥。125.權(quán)利要求121的方法，其中的組合物以靜脈注射的方式用藥。126.權(quán)利要求121的方法，其中的組合物以一種噴霧劑的形式用藥。127.權(quán)利要求121的方法，其中的組合物還含有一種表面活性劑。128.一種凈化含有脂阿拉伯甘露聚糖的液體方法，所說的方法包括、在其中的脂阿拉伯甘露聚糖結(jié)合所說的肽的條件下將權(quán)利要求1，5，10或15的肽與液體接觸并從所說的液體中分離所說的結(jié)合物質(zhì)。129.權(quán)利要求128的方法，其中的液體選自由血液、血漿、血清和骨髓組成的類別中。130.權(quán)利要求128的方法，其中的液體選自由等滲溶液，藥用試劑，和細胞培養(yǎng)試劑組成的類別中。131.一種治療分枝桿菌感染的藥用組合物，含有有效量的權(quán)利要求1，5，10或15的肽。132.一種權(quán)利要求131的藥用組合物，含有藥用上可接受的稀釋劑、佐劑或載體。133.一種權(quán)利要求1，5，10，或15的肽在治療分枝桿菌感染的藥物生產(chǎn)中的用途。134.權(quán)利要求1，5，10或15的肽在生產(chǎn)用于治療循環(huán)中脂阿拉伯甘露聚糖的存在引起的有害生理影響的藥物中的用途。135.一種治療患與彎曲菌屬細菌種類感染相聯(lián)系的疾病狀態(tài)之對象的方法，包括給對象施用含有權(quán)利要求1，5，10或15的肽的組合物。136.權(quán)利要求135的方法，其中的感染部位是胃腸消化道。137.權(quán)利要求136的方法，其中的感染細菌是幽門彎曲菌。138.權(quán)利要求137的方法，其中的疾病狀態(tài)是胃炎。139.權(quán)利要求137的方法，其中的疾病是消化潰瘍疾病。140.權(quán)利要求139的方法，其中的疾病狀態(tài)是胃潰瘍疾病。141.權(quán)利要求140的方法，其中的疾病狀態(tài)是十二指腸潰瘍病疾病。142.權(quán)利要求135的方法，其中的組合物以靜脈注射的方式用藥。143.權(quán)利要求135的方法，其中的組合物以口服的方式用藥。144.權(quán)利要求135的方法，其中的組合物還含有一種抗生素。145.權(quán)利要求135的方法，其中的組合物還含有一種表面活性劑。146.權(quán)利要求135的方法，其中的組合物還包含一種鉍化合物。147.權(quán)利要求1，5，10或15的肽在生產(chǎn)治療與彎曲菌屬的細菌種類感染相聯(lián)系的疾病狀態(tài)的藥物中的用途。148.根據(jù)權(quán)利要求147的用途，其中的感染部位是胃腸消化道。149.根據(jù)權(quán)利要求147的用途，其中的的感染細菌是幽門彎曲菌。150.根據(jù)權(quán)利要求147的用途，其中的疾病狀態(tài)是胃炎。151.根據(jù)權(quán)利要求147的用途，其中的疾病狀態(tài)是消化潰瘍病疾病。152.根據(jù)權(quán)利要求147的用途，其中的疾病狀態(tài)是胃潰瘍病疾病。153.根據(jù)權(quán)利要求147的用途，其中的疾病狀態(tài)是十二指腸潰瘍病疾病。154.根據(jù)權(quán)利要求147的用途，其中的藥物適于靜脈內(nèi)用藥。155.根據(jù)權(quán)利要求147的用途，其中的藥物適于口服用藥。156.根據(jù)權(quán)利要求147的藥物生產(chǎn)中的用途，包括一種抗生素。全文摘要本發(fā)明提供的肽具有的氨基酸序列為人殺菌/增強通透性蛋白質(zhì)(BPI)功能區(qū)的氨基酸序列或其亞序列，以及該序列的變異體或其亞序列，它們具有至少一種BPI的生物學(xué)活性，如肝素結(jié)合，肝素中和，LBS結(jié)合，LPS中和或殺菌活性，本發(fā)明提供了用于各種治療用途的肽和該肽的藥用組合物。文檔編號C07K14/47GK1122602SQ94191894公開日1996年5月15日申請日期1994年3月11日優(yōu)先權(quán)日1993年3月12日發(fā)明者R·G·李特爾申請人:愛克斯歐瑪公司