專利名稱：處置病毒感染的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒感染的處置。因此，本發(fā)明涉及在制備處置病毒感染的物質(zhì)或組合物方面的一種化合物、物質(zhì)或組合物的用途;涉及用于病毒感染處置的化合物、物質(zhì)或組合物;涉及用作病毒感染處置的藥品或藥劑的化合物、物質(zhì)或組合物;涉及用作病毒感染處置的活性治療劑的化合物、物質(zhì)或組合物;涉及用來制備處置病毒感染的組合物、藥品或藥劑而使用的化合物、物質(zhì)或組合物;涉及適宜用在病毒感染處置方面的新化合物、涉及病毒感染處置的藥品或藥劑;涉及制備化合物的新方法和該方法制備的化合物。本發(fā)明尤其涉及適合處置人體免疫缺乏病毒感染(HIV)，呼吸道融合病毒感染(RSV)和細胞巨化病毒感染(CMV)的所說的用途，所說的化合物、物質(zhì)或組合物;所說藥品或藥劑;所說的制備方法。
按照本發(fā)明，在制備處置人或動物治療體內(nèi)病毒感染，尤其是人體治療體內(nèi)HIV;RSV或CMV感染的物質(zhì)或組合物方面提供化合物、物質(zhì)或組合物的用途，該物質(zhì)或組合物包括含至少一種通式(1)的化合物
其中R1、R2、R3和R4可相同或不同并選自-H，-OH，A，B，C和D，而其中A ＝
B ＝
(其中-OSO
基團的任意1-3個可選地用-OH取代)
C ＝
;及D ＝ -OSO
尤其是，每個式(1)化合物中，R2和R3選自-OH，-H和D;且每個式(1)化合物中，R1和R4選自-OH，A，B，C和D。
更具體的，每個所說的式(1)化合物可選自R1，R2，R3和R4是列于下面表1的化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ)，這些化合物是按所說式(Ⅰ)的優(yōu)選化合物。表1中某些化合物存在于下文詳述的植物提取物中(化合物Ⅴ-Ⅷ)，而另一些是其代謝物(化合物Ⅰ-Ⅳ和Ⅸ-ⅩⅩⅧ)。代謝物Ⅰ-Ⅳ是在人體腸中生成的，而代謝物Ⅸ-ⅩⅩⅧ是在人體內(nèi)通過Ⅱ階段生體轉(zhuǎn)化來生成。Ⅱ階段生體轉(zhuǎn)化意指生物合成反應(yīng)，從而使一種取代基加到前體分子中，一般使前體分子增大水溶性和/或減少生物反應(yīng)性。
(表1化合物Ⅸ，Ⅺ和Ⅻ內(nèi)R2和R3位置的任何羥基可用D取代)。
至少一種所說的通式(1)的化合物可以形成取自為仙茅科(Hypoxidaceae)植物成員的至少一種植物種的部分提取物，優(yōu)選形成自至少一種為選自如下植物屬的一種植物屬成員的植物種的部分提取物Hypoxis、Spiloxene、Curculigo和Campynema。
本發(fā)明使得處置人或動物治療體內(nèi)病毒感染，尤其是處置人體治療體內(nèi)的HIV、RSV或CMV感染的方法成為可能，該方法包括向治療體投用一種物質(zhì)或組合物，該物質(zhì)或組合物包括一種來自為仙茅科植物成員的至少一種植物種的提取物，或者該方法包括向治療體給用一種物質(zhì)或組合物，它們具有包括至少一種上述式(1)化合物的一種活性成分。
該提取物可是干燥提取物。該提取物可為選自如下的至少一種植物種的提取物Hypoxisnitida，H.obtusa，H.rigidula，H.villosa，H.interjecta，H.multiceps，H.nyasica且特別是H.rooperi(也叫作H.hemerocallidea)，H.acuminata及H.latifolia(也叫作H.colchicifolia或H.oligotricha)，Spiloxeneschlechteri及其雜交物。
由于化合物Ⅴ-Ⅷ產(chǎn)生在上述植物提取物中，那么，在按照本發(fā)明的上述用途中，每個通式(1)的化合物(形成部分所說植物提取物)可選自化合物Ⅴ-Ⅷ，所具有的R1、R2、R3和R4列于前面的表1中。自然，作為替代，每個所述的通式(1)的化合物(當(dāng)它不形成部分植物提取物時)可選自化合物Ⅰ-Ⅳ和Ⅸ-XXⅧ，所具有的R1、R2、R3和R4列于前面的表1。因此，每個式(1)化合物可選自化合物Ⅰ-Ⅴ，或者作為替代，每個化合物可選自化合物Ⅸ-XXⅧ。
上述用途可用于的病毒感染選自人體的免疫缺乏病毒(HIV)感染，呼吸道融合病毒(RSV)感染和細胞巨化病毒(CMV)感染，特別是HIV感染。
化合物E-1，5-雙(3′-羥基-4′-O-β-D-吡喃葡糖苯基)戊-4-烯-1-炔(也叫作hypoxoside)是R2及R3為-OH而R1及R4為A的式(1)化合物之中的化合物Ⅴ。上述自仙茅科植物的提取物含有一種或多種化合物Ⅰ-Ⅷ，特別是Ⅴ-Ⅶ。Hypoxoside和有關(guān)的自仙茅科植物的1，5-二取代戊-4-烯-1-炔化合物的分離公開在Marini-Bettolo等人的文章Tetrahedron，1982，38，1683-1687，而其合成則公開在南非專利86/4482中。
按照上面所示，應(yīng)當(dāng)注意，在B中任何1-3個硫酸根基團可任選地用-OH取代;而在化合物Ⅸ、Ⅺ和Ⅻ中的任何羥基可用D取代。
化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ的制備詳述如下。
植物提取物，或所說的式(1)化合物，尤其是化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ可口服或腸胃外給藥。
在腸胃外給藥的情況下，植物提取物或化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ可溶在合適的如鹽水的水溶液中靜脈注射給藥。靜脈給藥可連續(xù)或間歇地進行，并可以使血漿中的化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ和/或其代謝物(如其Ⅱ階段生體轉(zhuǎn)化產(chǎn)物)的平均含量達到0.1-400μg/ml(如25-200μg/ml)且優(yōu)選達到50-150μg/ml(如100μg/ml)的方式進行。
對靜脈給藥而言，期望化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ以濃度為1-100mg/ml(典型為50-100mg/ml)的滅菌溶液形式和一定速率給藥，使得上面所說的血漿中化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ的含量達到最高達400μg/ml血漿的穩(wěn)定狀態(tài)。
在口服給藥的情況下，植物提取物或化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ可呈片劑，或粉劑或溶液形式，也可包在膠囊中。溶液可為水溶液，且這種溶液可為一種或多種化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ的純態(tài)混和物溶液，或者是植物提取物的溶液。同樣，片劑、粉劑或膠囊可包含植物提取物或者一種或多種化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ。每個片劑或膠囊可含有作為混和物的一種或多種所說化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ20-500mg，優(yōu)選50-300mg，例如200mg。
對志愿人員的試驗顯現(xiàn)出，將無水甲醇的植物提取物以3200mg/天的速率口服給藥可很好地容許治療體內(nèi)血漿中含藥濃度達到200μg/ml的程度。僅有的付作用只限于小部分治療體(25人中有3人)的某些程度的惡心、嘔吐及腹瀉。
另個試驗中所述無水甲醇的植物提取物以靜脈給藥，溶于鹽水溶液后給藥于羊，其劑量速率是200mghypoxoside/Kg/天，至少給藥30天且至多60天，除增重下降和在給藥部位結(jié)締組織有些變色外，沒有明顯的與藥物相關(guān)的作用。因而將該方法擴展到植物提取物特別是高壓液色譜純化餾分的腸胃外用藥，且尤其是靜脈給藥;所述餾分含有甲醇植物餾分的化合物Ⅴ-Ⅷ，將其溶在水溶液(優(yōu)選鹽水溶液)中。此外，當(dāng)發(fā)現(xiàn)經(jīng)人體口服攝入化合物Ⅴ-Ⅷ后，化合物Ⅸ-XXⅧ在血漿中的加合濃度或總的濃度水平已達400μg/ml血漿時化合物Ⅸ-XXⅧ特別適宜溶在鹽水溶液內(nèi)直接靜脈輸注。
本發(fā)明的另個方面是提供一種化合物、物質(zhì)或組合物，它可用來處置人或動物治療體內(nèi)病毒感染，特別是處置人體治療體內(nèi)的HIV、RSV或CMV感染，該化合物、物質(zhì)或組合物包括至少一種上面限定的通式(1)的化合物。
本發(fā)明的另個方面是提供用途藥品或藥劑的化合物、物質(zhì)或組合物，用來處置人或動物治療體病毒感染，特別是人體治療體內(nèi)HIV、RSV或CMV感染，該化合物、物質(zhì)或組合物包含至少一種如上限定的通式(1)的化合物。
本發(fā)明的另個方面是提供用作活性治療劑的化合物、物質(zhì)或組合物，用來處置人或動物治療體內(nèi)的病毒感染，尤其是人體治療體內(nèi)的HIV、RSV或CMV感染，該化合物、物質(zhì)或組合物包含如上限定的通式(1)的化合物。
本發(fā)明的另個方面是提供一種化合物、物質(zhì)或組合物，用來制備一種組合物、藥品或藥劑來處置人或動物治療體內(nèi)的病毒感染，特別是人體治療體內(nèi)的HIV、RSV或CMV感染，該化合物、物質(zhì)或組合物包含至少一種如上限定的通式(1)的化合物。
本發(fā)明進而擴展到如上限定的通式(1)的化合物的新化合物，其附加條件是當(dāng)R2和R3兩者選自-OH和-H時，那么，R1和R4不是兩個-OH并且R1和R4不是兩個A。
本發(fā)明又一個方面是提供一種藥品或藥劑來處置人或動物治療體內(nèi)的病毒感染，特別是人體治療體內(nèi)的HIV、RSV和CMV感染，該藥品或藥劑包含作為活性治療劑的至少一種如上限定的通式(1)的化合物，同時受到上面附加條件限制。
藥品或藥劑的形式可選自含活性治療劑的片劑，膠囊，粉劑和液體，片劑和膠囊每個含活性治療劑20-50mg，而粉劑和液體每種含活性治療劑4-10mg/ml。
本發(fā)明還擴展到本文所述化合物Ⅸ-ⅩⅩⅧ的制備的新方法，特別是采用將其從化合物Ⅰ-Ⅷ或從化合物Ⅰ-Ⅷ的衍生物的局部合成的方法。
R1、R2、R3和R4如上文表1所示的，選自化合物Ⅰ-Ⅳ的通式(1)的化合物其制備方式可為將選自化合物Ⅴ-Ⅷ的通式(1)的化合物從為仙茅科植物成員的至少一種植物種中提取，將所說的提取的化合物進行酶水解，從而得到作為產(chǎn)物的選自化合物Ⅰ-Ⅴ的所述化合物。
本發(fā)明進而擴展到制備通式(1)化合物的方法，該化合物選自化合物Ⅸ-Ⅻ，其中的R1、R2、R3和R4如上文表1所示，該方法包括將選自化合物Ⅴ-Ⅷ的通式(1)的化合物從為仙茅科植物成員的至少一種植物種中提取，將該提取的化合物過硫酸化，得到選自化合物Ⅸ-Ⅻ的作為產(chǎn)物的所述化合物。
本發(fā)明還擴展到R1、R2、R3和R4如上表1所示，選自化合物ⅩⅦ-ⅩⅩ的通式(1)的化合物的制備方法，包括將選自化合物Ⅴ-Ⅷ的通式(1)的化合物從為仙茅科植物成員的至少一種植物種中提取，將所述提取的化合物進行酶水解來得到選自化合物Ⅰ-Ⅴ的化合物，該方法還包括將選自化合物Ⅰ-Ⅳ的所述化合物硫酸化來得到作為產(chǎn)物的選自化合物ⅩⅦ-XX的所述化合物。
本發(fā)明還擴展到制備通式(1)化合物中化合物ⅩⅢ的方法，其中R1、R2、R3和R4如上表1所示，該方法包括將通式(1)化合物中化合物Ⅴ從為仙茅科植物成員的一種植物種中提取，對化合物Ⅴ進行酶水解得到化合物Ⅰ，將所述化合物Ⅰ進行葡糖苷酸化，從而得到作為產(chǎn)物的所述化合物ⅩⅢ。
本發(fā)明還擴展到為選自化合物Ⅰ-Ⅳ和Ⅸ-XXⅧ的通式(1)的化合物的制備方法，其中的R1、R2、R3和R4如上文表1所示，該方法包括將選自化合物Ⅴ-Ⅷ的至少一種通式(1)的化合物從為仙茅科植物成員的至少一種植物種中提取，使人或動物治療體攝入提取的化合物，收集攝入之后的治療體的尿，該尿中含有作為選自化合物Ⅴ-Ⅷ的化合物代謝物的選自化合物Ⅰ-Ⅴ和ⅩⅢ-XXⅧ的所述化合物，并從尿中提取作為產(chǎn)物化合物的所述代謝物。
當(dāng)然，該方法包括每種化合物產(chǎn)物的分離及提純步驟。
當(dāng)利用如上限定的本發(fā)明方法制備時，本發(fā)明還擴展到所獲得的選自化合物Ⅰ-Ⅳ及Ⅸ-XXⅧ的通式(1)化合物，其中R1、R2、R3和R4如上文表1中所列。
試驗時出乎意料地發(fā)現(xiàn)，植物提取物特別是自植物提取物得的化合物Ⅴ，尤其在過硫酸化時表現(xiàn)了HIV的體外活性。而且還出乎意料地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)這些以純體形式或作為植物提取物的一部分的化合物生體轉(zhuǎn)化時(Ⅱ階段生體轉(zhuǎn)化)，在體外和體內(nèi)都顯示抗HIV的活性?；衔铫?XXⅧ的實用性尤其不可預(yù)料且另人驚奇，因為化合物的Ⅱ階段生體轉(zhuǎn)化(肝的和/或肝外的)通常導(dǎo)至其生物失活。這些代謝物的抗病原或抗病毒作用因而完全不能予料。在這些試驗中，被處置的治療體與未被處置的治療體在HIV感染的特性平均值方面相比較時，P24HIV核蛋白含量表現(xiàn)為平均降低而特定淋巴細胞亞群的含量表現(xiàn)為平均增加。
現(xiàn)在詳述本發(fā)明，利用實施例，結(jié)合參照所進行的說明活體外的抗病毒活性，抗HIV活性的試驗，結(jié)合參照臨床試驗，結(jié)合參照制備新化合物Ⅸ-XXⅧ的實施例，并結(jié)合參照附圖來詳述，其中

圖1表明標(biāo)示Hypoxisrooperi球莖中化合物Ⅴ-Ⅷ的甲醇提取物的mAU(毫吸收單位)對時間(分)的色譜圖，說明提取物中化合物Ⅴ、化合物Ⅵ和化合物(Ⅶ+Ⅷ)的相對量，使用的信號波長是260nm，帶寬20nm，而參照波長是550nm，帶寬50nm;
圖2表示類似于圖1的H.latifolia球莖中化合物Ⅴ-Ⅷ的甲醇提取物的色譜圖，說明提取物中化合物Ⅴ、化合物Ⅳ和化合物(Ⅶ+Ⅷ)的相對量，通過化合物Ⅴ-Ⅷ的酶去糖苷作用分別得到的(非糖部)配基，即分別是化合物Ⅰ-Ⅳ，為對比目的而將其共同色譜分析，保留時間是化合物保留時間(分鐘)Ⅰ12.18Ⅱ14.84(Ⅲ+Ⅳ)13.55Ⅴ8.25Ⅵ8.76(Ⅶ+Ⅷ)8.50圖3表示類似于圖1的以HPLC法將H.rooperi甲醇提取物純化的化合物Ⅴ-Ⅷ的色譜圖，保留時間是化合物保留時間(分鐘)Ⅴ8.28Ⅵ8.79(Ⅶ+Ⅷ)8.54
圖4是類似于圖1的色譜圖，表示攝入1g純化的化合物Ⅴ-Ⅷ(其色譜在圖3中顯示)之前人體血清分析色譜，且在其中疊加有同樣治療體在攝入所述化合物90分鐘后的血清色譜圖，化合物Ⅴ-Ⅷ的代謝物在攝入后色譜圖上具有三個主峰，分別相似于下文圖5和圖6中的餾分A、B和C;
圖5為類似于圖1的色譜圖，是攝入純化的化合物Ⅴ-Ⅷ(其色譜在圖3中顯示)三小時之后人尿的色譜圖，其說明在圖6中被說明的三種尿餾分A、B和C;
圖6示出類似于圖1的三個色譜圖，疊加部分說明用HPLC法從尿(其色譜示于圖5)中制備分離的純化代謝物的三種餾分(即餾分A、B和C)，它們的保留時間是餾分保留時間(分鐘)A7.19B7.90C9.03;
圖7表示二極管系統(tǒng)檢測器紫外吸收光譜圖，說明圖6純化尿代謝物餾分A的吸收光譜，其為mAU對波長(nm)的繪制圖，該光譜圖的吸收波長最大分別是在206.5-210.5nm和258.5-262.5nm，而吸收波長最小處在230.5-234.5nm;
圖8表示類似于圖7的光譜圖，為圖6餾分B的吸收光譜，該光譜圖的吸收波長最大處分別在206.5-210.5nm和258.5-262.5nm，最小處在228.5-232.5nm;
圖9表示類似于圖7的光譜圖，為圖6餾分C的吸收光譜，該吸收光譜的吸收波長最大處分別在204.5-208.5nm和256.5-260.5nm，吸收波長最小處在228.5-232.5nm;
圖10表示類似于圖1的純化的尿餾分A的一種結(jié)合體的HPLC色譜圖，該結(jié)合體是餾分A用β-葡糖苷酸酶和芳基硫酸酯酶在pH＝5.5時水解衍生的，保留時間是化合物保留時間(分鐘)Ⅰ12.35Ⅱ14.91(Ⅲ+Ⅳ)13.58在這些保留時間數(shù)據(jù)與化合物Ⅰ，化合物Ⅱ和化合物(Ⅲ+Ⅳ)(由β-葡糖苷酶對H.latifolia的乙醇提取物(如圖2所示)的作用而衍生)的那些相應(yīng)數(shù)據(jù)間發(fā)現(xiàn)對應(yīng)性，尿和植物衍生的結(jié)合體的吸收光譜也可疊合;
圖11表示類似于圖10的由純化尿餾分B以類似形式衍生的所述結(jié)合體的色譜圖;
圖12表示類似于圖10的由純化尿餾分C以類似方式衍生的所述結(jié)合體的色譜圖;
圖13表示類似于圖1的化合物Ⅰ的葡糖苷酸化產(chǎn)物的色譜圖，該產(chǎn)物即為以改型的Koenigs-Knorr合成方法得到化學(xué)合成的化合物Ⅰ的β-D-吡喃葡糖苷酸酯，該產(chǎn)物可用選擇溶劑分配法純化，化合物Ⅰ的化學(xué)β-D-葡糖苷酸化產(chǎn)生兩種產(chǎn)物，其保留時間和光譜和圖5的尿代謝物餾分A的相一致，所討論的光譜圖疊加在圖13中;
圖14表示類似于圖7的化合物Ⅰ的光譜圖，但將mAU軸標(biāo)度(標(biāo)準(zhǔn)化)，吸收波長最大處分別在210.5-214.5nm，258.5-262.5nm和290.5-294.5nm，吸收波長最小處分別在234.5-238.5nm和282.5-286.5nm;
圖15表示類似圖14但對化合物Ⅱ的光譜圖，吸收波長最大處分別在200.5-204.5nm和258.5-262.5nm，吸收波長最小處在222.5-226.5nm;
圖16表示類似圖14但對化合物(Ⅲ+Ⅴ)的光譜圖，吸收波長最大處分別在202.5-206.5nm和258.5-262.5nm，而吸收波長最小處在228.5-232.5nm;
圖17表示類似圖14但對化合物Ⅴ的光譜圖，吸收波長最大處分別在210.5-212.5nm，254.5-258.5nm以及288.5-292.5nm，而吸收波長最小處分別在232.5-234.5nm和278.5-282.5nm;
圖18表示類似圖14的對化合物Ⅵ的光譜圖，吸收波長最大處分別在200.5-204.5nm和256.5-260.5nm，而吸收波長最小處在220.5-224.5nm處;
圖19表示類似圖14的化合物(Ⅵ+Ⅷ)的光譜圖，吸收波長最大處分別在204.5-208.5nm和256.5-260.5nm，而吸收波長最小處在226.5-230.5nm;
圖20表示類似圖14但顯示化合物Ⅰ和Ⅴ的疊合吸收光譜的光譜圖;
圖21表示類似圖14但顯示化合物Ⅱ和Ⅵ的疊合吸收光譜的光譜圖;
圖22表示類似圖14但顯示化合物(Ⅲ+Ⅳ)和(Ⅶ+Ⅷ)的疊合吸收光譜的光譜圖;
圖23表示類似圖1的疊合的色譜圖，是分別從天然和合成來源得到的化合物Ⅱ的色譜，天然化合物是將得自H.rooeri的HPLC純化的化合物Ⅴ進行酶去糖苷化而得到，而合成的化合物是照Drewes等人的SyntheticCommunications，1990，20，1671-1679所述方法合成的;
圖24表示類似圖14的光譜圖，為合成和天然型化合物Ⅱ(其中色譜圖示于圖23)的疊合的吸收光譜;
圖25表示類似圖1的色譜圖，其為通過化合物Ⅴ-Ⅷ的混和物過硫酸化獲得的化合物Ⅸ-Ⅻ的混和物的色譜;
圖26的表示類似圖7的光譜圖，其為化合物Ⅸ-Ⅻ(其色譜示于圖25)的混合物的光譜圖;
圖27表示類似圖1的色譜圖，其為由H.rooperi衍生的化合物Ⅰ-Ⅳ的色譜，該化合物是化合物Ⅴ-Ⅷ(其色譜見圖3)通過β-D-葡糖苷酶在PH＝5.5時水解的產(chǎn)物，保留時間是化合物保留時間(分鐘)Ⅰ12.31Ⅱ14.88(Ⅲ+Ⅳ)13.53圖28表示類似圖1的色譜圖，其為化合物Ⅰ和它的半合成二硫酸化產(chǎn)物化合物ⅩⅦ的混和物的色譜，保留時間是化合物保留時間(分鐘)Ⅰ12.29ⅩⅦ8.95圖29表示類似圖14光譜圖，其為化合物Ⅰ和ⅩⅦ的(其色譜見圖28)的光譜，化合物Ⅰ吸收波長最大處分別在210.5-214.5nm，258.5-262.5nm和290.5-294.5nm，而吸收波長最小在234.5-238.5nm和282.5-286.5nm，而化合物ⅩⅦ吸收波長最大在204.5-208.5nm和254.5-258.5nm，且吸收波長最小在226.5-230.5nm;
圖30表示類似圖1色譜圖，其為化合物Ⅱ與半合成的化合物ⅩⅧ(為化合物Ⅱ的二硫酸化結(jié)合產(chǎn)物)的混和物的色譜，保留時間是化合物保留時間(分鐘)Ⅱ14.86ⅩⅧ9.07圖31表示類似圖14光譜圖，其為化合物Ⅱ和ⅩⅧ(其色譜見圖30)的光譜，化合物Ⅱ的吸收波長最大分別在200.5-204.5nm和258.5-262.5nm，吸收波長最小在222.5-226.5nm，而化合物ⅩⅧ吸收波長最大在198.5-202.5nm和254.5-258.5nm，吸收波長最小在220.5-224.5nm，與化合物Ⅱ相比較，二硫酸化產(chǎn)物-化合物ⅩⅧ的吸收光譜呈現(xiàn)出較短波長方面位移;
圖32表示類似圖1色譜圖，其為化合物Ⅰ-Ⅳ和它們半合成二硫酸化結(jié)合物化合物ⅩⅦ-ⅩⅩ的混和物的色譜，將化合物Ⅰ-Ⅳ的混和物二硫酸化即得其結(jié)合物，該圖說明化合物Ⅰ-Ⅳ的二硫酸酯即化合物ⅩⅦ-ⅩⅩ共洗脫，保留時間是
化合物保留時間(分鐘)Ⅰ12.14Ⅱ14.80(Ⅲ+Ⅳ)13.51(ⅩⅦ+ⅩⅩ)9.00圖33表示HIV試驗研究結(jié)果的條形圖表，顯示經(jīng)處置的治療體(本發(fā)明)和未經(jīng)處置的治療體(對比)組內(nèi)以Pg/ml表示的P24核蛋白含量的平均絕對變化情況;
圖34表示如圖33試驗性研究的條形圖表，但其為以細胞/μl表示的所述的處置及未處置組內(nèi)選擇性淋巴細胞亞群的絕對平均變化狀況;及圖35表示如圖33試驗性研究的條形圖表，但其為所述組內(nèi)所述細胞亞群的平均改變百分比。
實施例1化合物Ⅰ-XXⅧ的分析、定性及制備分離方法概要化合物的制備分離進行化合物的制備分離是采用制備性高效液體色譜法。
裝置使用Shimadzu儀器(Kyoto，Jopan)。它含有下列部件SCL-8A系統(tǒng)控制器，2XLC-8A流動相輸送泵，SPD-6AVUV-Vis分光光度檢測器，F(xiàn)CV-130AL容器注入控制器和FCV-100B餾分收集器。
用C8鍵合硅石(PartisilBioprep20μmC875A)填充制備色譜柱(50×300mm)，該硅石由Whatman購得(Fairfield，NewJorsey，U.S.A)。
操作條件包括流動相(水中15%的乙腈，V/V)的ioscratic輸送，其流速溶為100ml/min。檢測器設(shè)定在260nm波長，餾分收集設(shè)定為收集250ml等分試樣。進行樣品裝載時將樣品(5g)溶在水(50ml)中直接泵送到柱上，色譜柱已予裝載有水。Hypoxoside(化合物Ⅴ)和Hypoxoside的同種物[化合物(Ⅶ+Ⅷ)和Ⅵ]被依次洗脫，其起始是在8.5L的保留體積，獲得的餾分富集各自化合物達80-100%的質(zhì)量純度。
半制備性分離和定性分析將標(biāo)準(zhǔn)的高效液體色譜(HPLC)技術(shù)(Kruger等人，J.Chromatography，1993，612，191-198)用于所有化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ的分析、定性和半制備性分離。
裝置使用HewlettPackard儀器(Waldbron，德國)。它含有下列部件HP1090M液色譜儀，它帶有二元DR5溶劑輸送系統(tǒng)和手動閥門注入器;HP1040二極管系統(tǒng)檢測器;HP79994A工作臺;HP310SPU帶彩色監(jiān)視的程序處理儀器;HP9153C20MB溫徹斯特磁盤驅(qū)動器;AP2225Athinkjet打印機和HP7440AX-Y繪圖儀。
分析(色譜)柱(4.6×250mm)用5μm規(guī)則顆粒尺寸的尾端加蓋的C8鍵合二氧化硅(Whatman，Maidstone，英國)來填充，同時用薄膜的C18鍵合二氧化硅(Whatman)填充保護柱(2.1×75mm)。在線使用的提取前置柱(2.1×30mm)則用40μm顆粒尺寸的制備級C18鍵合二氧化硅來填充(AnalytichemInternational，HarborCity，CA)。
操作條件包括流速程控在1.5ml/min的線性溶劑梯度，起始時用的流動相A(0.05M KH2PO4)中加入10%V/V的流動相B(乙腈-異丙醇80∶20V/V)。將這種混和物保持1分鐘后形成流動相A和B的線性梯度，16分鐘后以70%V/V的B結(jié)束。柱溫度維持在50℃。
在線提取前置柱用樣品混合物(溶于50μl乙醇或至多200μl的水相)裝載并用含硫酸鈲鹽(8.05M)和硫酸銨(1.02M)的水溶液充至500μl。樣品引入前后用500μl的硫酸銨水液(0.5M)沖洗提取柱。然后將在線提取柱上截留的溶質(zhì)在分析柱上以基于起始分析的流動相來洗脫。
程控二極管系統(tǒng)檢測器參數(shù)以監(jiān)視260nm的信號并且也給出200-400nm的吸收光譜。
實施例2制備Hypoxis物種的無水甲醇提取物將洗滌后的Hypoxis種球莖切碎，切碎物置于干燥托盤并于70℃經(jīng)3.5小時在對流烘箱中脫水。將切碎物磨成200目細粉，得棕色細粉末(12.5Kg球莖得大約5.0Kg干粉)。干磨粉(5.0Kg)用甲醇(25L)于室溫經(jīng)30分鐘攪拌來提取。過濾淤漿，真空蒸發(fā)棕色清液得1.25Kg淺棕色Hypoxis種球莖提取物，其始終含有45-50%m/m的Hypoxoside和其同種物[化合物(Ⅴ-Ⅷ)]，而其中Hypoxoside(化合物Ⅴ)是主要成分(90-95%m/m)，其含量依所用的具體Hypoxis物種而定。
實施例3化合物Ⅴ-Ⅷ的制備分離(見圖1-2)化合物Ⅴ由Hypoxisrooperi的甲醇提取物中分離，然后用實施例1所述的制備性HPLC純化(見圖1)。
化合物Ⅵ和(Ⅶ+Ⅷ)由Hypoxislatifolia的乙醇提取物中分離，然后，用實施例1所述制備性的HPLC技術(shù)提純。若必須進行這些化合物的進一步提純則采用使用實施例1所述標(biāo)準(zhǔn)化分析性HPLC系統(tǒng)(見圖2)的半制備性HPLC法進行。
實施例4化合物Ⅰ-Ⅳ的分離(見圖2)化合物Ⅰ、Ⅱ和(Ⅲ+Ⅳ)分別作為化合物Ⅴ、Ⅵ和(Ⅶ+Ⅷ)的酶水解產(chǎn)物的分離如下化合物Ⅴ、Ⅵ和(Ⅶ+Ⅷ)(每種100mg)分別溶于乙酸鹽緩沖水液(10ml，0.1M，PH＝5.5)，且各加入β-葡糖苷酶(100mg)。該混和物于37℃培育4小時，之后將水解產(chǎn)物用乙醚(5ml)提取。用碳酸氫鈉水液(5ml，0.5M)洗滌乙醚提取液而后用無水硫酸鈉干燥。氮氣流保護蒸發(fā)乙醚相分別得到5-10mg的化合物Ⅰ、Ⅱ和(Ⅲ+Ⅳ)。每種產(chǎn)物用實施例2所述校準(zhǔn)的分析HPLC系統(tǒng)以半制備性HPLC方法來提純。通過標(biāo)準(zhǔn)反相吸著技術(shù)從HPLC餾分中去除HPLC溶劑緩沖鹽并以低壓升華干燥法獲得各種最終粉末產(chǎn)物。
實施例5化合物ⅩⅢ-XXⅧ的分離(見圖3-12)用制備性HPLC(見實施例1)技術(shù)純化Hypoxisrooperi球莖的甲醇提取物得一混和物，該混和物含有主要成分的化合物Ⅴ(90-95%m/m)，還得到少量的化合物Ⅵ和(Ⅶ+Ⅷ)(見圖3)。將這種產(chǎn)物(1g)溶在于(200ml)中，并讓成年男性治療對象以單一劑量口服。隨后收集尿液并處置如下經(jīng)柱床用甲醇和水對C18鍵合二氧化硅吸著劑材料(200g，40μm)進行予處理。使過濾的尿液(5L)流經(jīng)吸著劑床，隨后依次用下列物洗脫水(400ml)，甲醇水液(10%V/V，400ml)，甲醇水液(30%V/V，800ml)，最后用甲醇(400ml)隨后用水(400ml)。
將甲醇水液餾分(30%V/V，800ml)用水(1600ml)稀釋，使其再次流經(jīng)吸著劑床，該床隨后用水(400ml)最后用甲醇(400ml)洗脫。
真空下于50℃蒸發(fā)最終的甲醇溶液至含水剩余物，將其低壓升華干燥得代謝物ⅩⅢ-XXⅧ和內(nèi)生的尿成分的混和物(1g)。取合適體積的這種剩余物的過濾水溶液(10ml/ml)注入校準(zhǔn)HPLC系統(tǒng)(見實施例1)的在線前置柱上，這樣便在柱的輸出端收集餾分A、B和C(見圖5-6)。采用標(biāo)準(zhǔn)反相吸著技術(shù)使這些餾分去除流動相緩沖鹽，再將其低壓升華干燥為干燥產(chǎn)物，即化合物ⅩⅢ-ⅩⅩⅧ混和物樣品。
實施例6化學(xué)合成硫酸鹽結(jié)合物硫酸吡啶鎓作為硫酸化試劑用于部分合成化合物Ⅸ-Ⅻ和化合物ⅩⅦ-ⅩⅩ。
制備硫酸吡啶鎓試劑向無水乙酸乙酯(1L)和濃硫酸(25L，0.469mol)的混和物伴隨攪拌緩慢加入無水吡啶(50ml，0.620mol)。冷卻混和物，通過潷析從乙酸乙酯中分離生成的硫酸吡啶鎓沉淀，將其用部分無水乙酸乙酯漂洗并于60℃真空干燥得85g產(chǎn)物(產(chǎn)率100%)。使該產(chǎn)物(85g，0.480mol)溶于無水二甲基甲酰胺(250ml)中得1.921M的硫酸吡啶鎓溶液，本文稱做硫酸吡啶鎓試劑。該試劑置于無水硫酸鈣(25g)上貯存在氣密的琥珀瓶內(nèi)。Hypoxoside(化合物Ⅴ)和Hypoxoside同種物[化合物Ⅵ和(Ⅶ+Ⅷ)]的過二硫酸化來分別制備化合物Ⅸ、Ⅹ和(Ⅺ+Ⅻ)向Hypoxoside(2g，0.0033mol)(見實施例3及圖1)的無水二甲基甲酰胺(130ml)溶液加入硫酸吡啶鎓試劑(70ml，0.135mol)，無水硫酸鈣(4g)和乙酐(13.2ml，0.14mol)，在氮氣氛下于25℃攪拌該混和物24小時。將反應(yīng)混和物過濾得清液，攪拌清液并加入甲醇和異丙醇的混和物(600ml，1∶2V/V)，隨后加異丙醇(250ml)。連續(xù)攪拌使所形成的沉淀凝固并洗析除去溶劑混和物。將凝固的沉淀用異丙醇淋洗，然后溶于水(40ml)。向這個溶液攪拌加入甲醇(100ml)，隨后加氫氧化鈉的甲醇溶液(50ml，1M)使PH為7-11。所得沉淀通過過濾分離，用甲醇洗滌后溶于水(200ml)。將此溶液流經(jīng)C18鍵合二氧化硅吸著劑顆粒床(顆粒尺寸40μm，床尺寸為內(nèi)徑50mm長50mm)，該床已用甲醇和水作予調(diào)理。將另一份200ml水流經(jīng)吸著劑床并與前面的洗脫液合并，得400ml硫酸化Hypoxoside的清澈的鈉鹽溶液。發(fā)現(xiàn)這一溶液能夠被低壓升華干燥成白色產(chǎn)物(2g)。還發(fā)現(xiàn)通過添加乙醇(400ml)和乙酸乙酯(1200ml)可從洗脫液中沉淀出硫酸化Hypoxoside的鈉鹽。經(jīng)過濾收集該沉淀，真空干燥得白色干燥產(chǎn)物。硫酸化Hypoxoside的鈉鹽易溶于水，與Hypoxoside(即化合物Ⅴ)不一樣，其對諸如C18鍵合二氧化硅顆粒的反相色譜介質(zhì)幾乎或根本沒有親合力，甚至有水存在時亦是如此。以類似方式將化合物Ⅵ及(Ⅶ+Ⅷ)過硫酸化。
化合物Ⅰ、Ⅱ和(Ⅲ+Ⅳ)硫酸化來分別制備化合物ⅩⅦ、ⅩⅧ和(XIX+XX)向化合物Ⅰ(100mg，0.00355mol)(見實施例4及圖2)的無水二甲基甲酰胺(2.2ml)溶液加入硫酸吡啶鎓試劑(1.5ml，0.00288mol)和乙酐(0.3ml，0.00318mol)。令該混和物于無水條件下在90-100℃保持30分鐘，冷卻，之后將其傾入冷水(40ml)并同時攪拌。隨后使該溶液流經(jīng)C18-鍵合硅石吸著劑床(顆粒尺寸40μm)，該床已用甲醇和水依次進行予處理。
依次分別用下列物流經(jīng)吸著劑床水(40ml)，碳酸氫鈉水液(40ml，0.1M)，水(40ml)和甲醇(10ml)，個別地收集甲醇餾分。真空下于50℃蒸發(fā)甲醇洗脫液得到含水剩余物，將其低壓升華干燥得0.07g的化合物ⅩⅦ。以同樣步驟從化合物Ⅱ和(Ⅲ+Ⅳ)分別制備化合物ⅩⅧ和(XIX+XX)。
實施例7化學(xué)合成化合物ⅩⅢ(見圖13)將化合物Ⅰ經(jīng)葡糖苷酸化而衍生化合物ⅩⅢ?；衔铫竦亩?β-葡糖苷酸通過傳統(tǒng)的Koenigs-Knorr反應(yīng)而衍生，該反應(yīng)包括在碳酸銀存在下將保護的溴代葡糖苷酸偶聯(lián)于糖苷配基。該保護的溴代葡糖苷酸，即(2，3，4-三-O-乙?；?α-D-吡喃葡糖基-1-溴化物)糖醛酸甲酯，是按Bollenback等人所述方法制備的，見J.Amer.Chem.Soc.1955，77，3310-3315。
考慮到微量產(chǎn)量，產(chǎn)物不必制備性分離，但可按下文實施例8所示進行定性。
實施例8標(biāo)準(zhǔn)化HPLC工藝和酶水解(見實施例1)將化合物定性的一般工藝化合物的定性基于它們的絕對色譜保留時間，它們的保留時間彼此相關(guān)，還基于標(biāo)準(zhǔn)分析參數(shù)下所得到它們的二極管系統(tǒng)檢測器吸收光譜。發(fā)現(xiàn)在同一制造商的系列分析(色譜)柱上的大約30秒以內(nèi)的保留時間可重復(fù)再現(xiàn)。二極管系統(tǒng)檢測器吸收光譜在檢測器分辨限度范圍內(nèi)表面，且最大和最小吸收以波長范圍來表示，該范圍為4-6nm。
苯被用作參照化合物。甲醇內(nèi)苯的分析以如下的關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)化HPLC法來定性。
保留時間＝13.84分鐘最大吸收＝198.5-202.5nm和252.5-256.5nm最小吸收＝220.5-224.5nm化合物ⅩⅢ-ⅩⅩⅧ的另一定性基于用β-葡糖苷酸酶和芳基硫酸酯酶的選擇性酶水解來推斷。D-葡糖二酸-1，4-內(nèi)酯(σ50375)(1mg/mg)和硫酸鈉(0.01M)用來分別選擇性抑制β-葡糖苷酸酶和芳基硫酸酯酶的活性，其中在大規(guī)模的酶制備中發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)。水解在乙酸鹽緩沖液(0.1M，PH5.5)中進行。
化合物Ⅰ-Ⅷ的定性(見圖1-2和圖14-22)由Hypoxisroopri甲醇提取物(見實施例2)制備的化合物Ⅴ(見實施例3)水溶液用標(biāo)準(zhǔn)HPLC方法(見實施例1)進行分析?；衔铫?見圖1)作為主要成分被分離，其保留時間是8.25分鐘，具有UV最大處分別在210.5-212.5;254.5-258.5和288.5-292.5nm(見圖17)。Marini-Bettolo等人在Tetrahedron，1982，38，1683-1687中援引的值是UV最大分別在258、291、298和310nm，這是在甲醇中測得的?；衔铫跖c堿經(jīng)歷不可逆反應(yīng)，而酚基與鐵氰化鐵則進行正向反應(yīng)?；衔铫龊?Ⅶ+Ⅷ)在Hypoxiolatifolia的乙醇提取物中更普遍存在，因此在由Hypoxiolatifolia得到的分離物中被較好地定性(見圖2)。
化合物Ⅵ和(Ⅶ+Ⅷ)的UV光譜與化合物Ⅴ的光譜(見圖17-19)的類似性暗示出它們在結(jié)構(gòu)上與化合物Ⅴ相關(guān)。
化合物Ⅴ、Ⅵ和(Ⅶ+Ⅷ)通過PH＝5.5時被β-D-葡糖苷酸酶水解分別產(chǎn)生化合物Ⅰ、Ⅱ和(Ⅲ+Ⅳ)，見圖2說明。
化合物Ⅴ、Ⅵ和(Ⅶ+Ⅷ)及其同種物化合物Ⅰ，Ⅱ和(Ⅲ+Ⅳ)的洗脫次序仍是分別相同的(見圖2)。從這點可推斷，就它們同種物上取代基而論，化合物Ⅴ、Ⅵ和(Ⅶ+Ⅷ)彼此并不相同。因而從化合物Ⅴ到化合物(Ⅶ+Ⅷ)，然后到化合物Ⅵ保留時間的增加，以及分別從化合物Ⅰ到化合物(Ⅲ+Ⅳ)然后到化合物Ⅱ保留時間的增加，都與同種物上羥基數(shù)目減少是一致的。
由Hypoxislatifolia衍生的化合物Ⅱ與按照Drewes等人(Phytochemistry，1989，28，153-156)所述合成的E-1，5-雙(4′-羥苯基)戊-4-烯-1-炔相比較，考慮到保留時間和光譜特性的一致性(見圖23-24)，證實化合物Ⅱ中二對位羥基的存在。
化合物(Ⅲ+Ⅳ)的保留時間居于化合物Ⅰ和Ⅱ的中間意味著有三個羥基，可能的結(jié)構(gòu)可由化合物Ⅲ和Ⅳ來代表，但還未在色譜上辨別(見圖2)。這種由Hypoxisrooperi衍生的三羥基化合物最可能的構(gòu)型會是化合物Ⅲ的那一種構(gòu)型，因Drewes等人在Phytochemistry，1989，28，153-156中給出了很好的證據(jù)，即當(dāng)化合物由Hypoxisrooperi衍生時烯烴一側(cè)的酚環(huán)是個兒茶酚。
在圖14-22中分別說明的化合物Ⅰ-Ⅷ的光譜特性與一般的中央部位戊-4-烯-1-炔結(jié)構(gòu)相一致。
比較光譜表明(見圖20-22)，通常的分析條件去糖苷會導(dǎo)至譜線向較短波長位移。
由水解帶來的保留位移和這些化學(xué)衍生物的羥基化程度可依據(jù)反相色譜保留機理來推斷。
化合物Ⅸ、Ⅹ和(Ⅺ+Ⅻ)的定性(見圖25-26)化合物Ⅴ-Ⅷ的部分硫酸化會導(dǎo)致大量的羥基硫酸化物，給出復(fù)雜的洗脫圖。然而在全部硫酸化的情況下，可以期待每種化合物具有充分確定三個洗脫峰。明顯的三峰圖樣確實在圖25中顯而易見，因此化合物Ⅸ、Ⅹ和(Ⅺ+Ⅻ)可認(rèn)為分別是化合物Ⅴ、Ⅵ和(Ⅶ+Ⅷ)的十-、八-和九-硫酸化物。然而部分硫酸化產(chǎn)物通過降低關(guān)于被硫酸化的化合物的硫酸化試劑的摩爾比制備，可觀察到如所予料的復(fù)雜洗脫圖樣。
化合物Ⅸ、Ⅹ和(Ⅺ+Ⅻ)不易根據(jù)它們的色譜或光譜性質(zhì)區(qū)分，這些化合物的混和物的定性反映在圖25和26中。這些化合物的初期洗脫與其增強的水溶性相關(guān)，同時它們保留了化合物Ⅴ-Ⅷ的光譜特性?？梢灶A(yù)料，按實施例6方法制備的化合物Ⅹ和(Ⅺ+Ⅻ)將具有類似于化合物Ⅸ的硫酸化程度。
化合物ⅩⅢ-ⅩⅩⅧ的定性(見圖3-12和27-32)化合物Ⅷ-ⅩⅩⅧ表示化合物Ⅴ-Ⅷ的生體轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。它們被發(fā)現(xiàn)于攝入了化合物Ⅴ-Ⅷ后人體治療體的血清和尿中(見圖4-6)。能夠從下列觀察中注意到一定質(zhì)量和數(shù)量的生化作用和活體內(nèi)形成的結(jié)合化合物ⅩⅢ-ⅩⅩⅧ有關(guān)。這與通過合成和特定的酶水解證實結(jié)合物類型的方式合在一起，將有助于鑒別和定性這些化合物。
化合物Ⅴ-Ⅷ已表明在人體治療體腸道內(nèi)被水解成化合物Ⅰ-Ⅳ，因為這些糖苷配基可在人的面容上檢測出來。因此化合物Ⅰ-Ⅳ自腸道吸收后可能是化合物ⅩⅢ-ⅩⅩⅧ的代謝前體。
從圖3和27中應(yīng)注意到化合物Ⅴ-Ⅷ的相對量代表了它們水解產(chǎn)物即化合物Ⅰ-Ⅳ的相對量。示于圖27中化合物Ⅰ-Ⅳ的相對量則代表這些對腸吸收有用的糖苷配基的相對量。
以HPLC法將尿代謝物分離成餾分A、B和C已在圖6中說明，化合物Ⅰ-Ⅷ的吸收光譜特征保留在代謝物的餾分中(圖7-9)。這就證明尿代謝物的餾分A、B和C有個共同的來源，即化合物Ⅰ、Ⅱ和(Ⅲ+Ⅳ)。
代謝物餾分A、B和C在PH＝5.5時用β-D-葡糖苷酸酶和芳基硫酸酯酶完全水解產(chǎn)生了它們的結(jié)合物的圖形(見圖10-12)。化合物Ⅰ、Ⅱ和(Ⅲ+Ⅳ)的保留時間和吸收光譜依然不變，不管其是植物提取物的水解產(chǎn)物還是代謝物提取物的水解產(chǎn)物。這可再次確定結(jié)合物基團的類型植物配基的β-D-葡糖醛酸和硫酸化物，即化合物Ⅰ、Ⅱ和(Ⅲ+Ⅳ)。
餾分A、B和C的選擇性酶水解(見圖6)意示(ⅰ)餾分A主要含有化合物Ⅰ-Ⅳ的二-β-D-葡糖苷酸，即分別是化合物ⅩⅢ-ⅩⅥ。
(ⅱ)餾分B主要含有化合物Ⅰ-Ⅳ單硫酸化物-單-β-D-葡糖苷酸，即分別是化合物ⅩⅪ-ⅩⅩⅣ。
(ⅲ)餾分C主要含有化合物Ⅰ-Ⅳ的二硫酸化物，即分別是化合物XⅦ-XX。
因此，結(jié)合物基團的類型似乎在反相色譜中是代謝物保留時間的主要決定因素。因而餾分B，化合物Ⅰ、Ⅱ和(Ⅲ+Ⅳ)的混和結(jié)合物(為單-β-D-葡糖醛酸單硫酸化物)在保留時間方面居于它們的二-β-D-葡糖醛酸(餾分A)和它們的二硫酸化物(餾分C)的中間是合適的。
尿餾分A、B和C(見圖10-12)的結(jié)合物圖形并不含有作為攝入物質(zhì)的相同相對量的化合物Ⅰ-Ⅴ(見圖3和27)，這就意示化合物Ⅱ和(Ⅲ+Ⅳ)的選擇性吸收超過化合物Ⅰ，和/或意示化合物Ⅰ生體轉(zhuǎn)化成化合物(Ⅲ+Ⅳ)，然后隨著后來的結(jié)合作用生體轉(zhuǎn)化成化合物Ⅱ。
化合物Ⅰ(見圖28-29)、化合物Ⅱ(見圖30-31)和二硫酸化的化合物Ⅰ-Ⅳ的混和物(見圖32)的化學(xué)硫酸化作用產(chǎn)物產(chǎn)物的保留時間在尿代謝物餾分C(見圖6)的保留時間區(qū)域內(nèi)，這一點由芳基硫酸酯酶使得主要含有化合物Ⅰ-Ⅳ的二硫酸化物的作用來表明。
芳基硫酸酯酶的化學(xué)合成二硫酸化物的水解產(chǎn)生它們各自的結(jié)合物，化合物Ⅰ、Ⅱ和(Ⅲ+Ⅳ)。
化合物Ⅰ的化學(xué)葡糖苷酸作用(見圖13)產(chǎn)生兩種產(chǎn)物，其保留時間和吸收光譜相應(yīng)于餾分A的兩個尿代謝物(吸收)峰(見圖5-6)?；衔铫竦陌牒铣善咸擒账峥杀沪?D-葡糖苷酸水解。兩個化合物Ⅰ的葡糖醛酸產(chǎn)物可以代表或者間位或者對位的葡糖苷酸化作用，這點未經(jīng)檢驗。
化合物Ⅰ、Ⅱ和(Ⅲ+Ⅳ)的所有結(jié)合物在它們的吸收光譜上與它們的結(jié)合物在通常分析參數(shù)條件下相比較顯示出向較低波長的位移。這一點，與它們是否是葡糖苷，葡糖苷酸或硫酸化物無關(guān)，也與是否為半合成或生物衍生無關(guān)。這些對照光譜可見于圖20-22，29和31。
化合物Ⅰ和(Ⅲ+Ⅳ)的代謝的和/或合成的結(jié)合作用發(fā)生在苯環(huán)間位的羥基上，導(dǎo)至更加多的結(jié)合產(chǎn)物的結(jié)合。然而可以確信，由于化學(xué)縮合作用，對位取代是優(yōu)選的。
實施例9使化合物Ⅰ-XXⅧ經(jīng)受體外試驗，用來抑制人體免疫缺乏1型病毒(HIV-1)增生，具體如下取血庫中健康志愿者的血液經(jīng)密度梯度離心沉淀得到人體外周血液淋巴細胞(PBL′s)，將它積存并用來體外繁殖HIV-1。
用植物凝血素(PHA)將PBL′s多克隆激活并使其經(jīng)受質(zhì)量控制，從而可用錐蟲蘭排除法和活化抗原的表達來檢驗它們的生存性，CD4+和CD25+用免疫熒光來測量。加入試驗物質(zhì)之前，活化的PBL′s要接觸校準(zhǔn)滴定度的HIV-1病毒液，培育60分鐘后洗滌細胞兩次并以2×106細胞/井的濃度鋪入微量滴定板。第4天介質(zhì)含有中間白細胞-2并且在對比井內(nèi)產(chǎn)生的病毒在50-100ng/ml的P24核心蛋白之間。將試驗物質(zhì)根據(jù)其溶解特性或在水中或在二甲亞砜(DMSO)中加到這些培養(yǎng)體內(nèi)。如用DMSO其最終的濃度總是1%V/V。
HIV復(fù)制的測量在第2、3和4天或第3、4、5和6天P24核心蛋白和HIVRNA的產(chǎn)生時進行。核心蛋白P24的測量用SandwichELISA技術(shù)，其中尤其使用抗P24核心蛋白的單克隆抗體。HIVRNA的測量使用特性標(biāo)記的抗HIVRNA的DNA探針和雜交工藝。
結(jié)果以第3、4或第6天抑制HIV-1P24核心蛋白生成或RNA生成的百分?jǐn)?shù)來表達。
試驗物質(zhì)可能的毒性作用在實驗開始后第4天或第6天以用錐蟲蘭的生存性測試或用3-(4，5-二甲噻唑-2-基)-2，5-二苯基-2H-四唑鎓溴化物(MTT)的增生試驗來測量(Borenfreund等人Toxicol.lnVitro，1988，2，1-6)。
應(yīng)當(dāng)注意，以1%V/V的DMSO的劑量不能抑制HIV-1的復(fù)制。
藥物的毒性通過以MTT測量并與接受病毒但無藥物的對照組進行比較而表達為抑制淋巴細胞增生的百分?jǐn)?shù)。
在每個試驗里，細胞也要接觸HIV-1和3′-疊氮基-3′-脫氧胸苷(也叫作Zidovudine或AZT)，其濃度為100、10、1和0.1ng/ml。這是個陽性對照物并且試驗的化合物要和10ng/mlAZT的抑制作用相比較。
下列所有表格中，抑制百分?jǐn)?shù)指的是相比于感染的對照物時對P24核心蛋白生成和HIVRNA生成的抑制。AZT抑制百分?jǐn)?shù)指的是在實驗結(jié)束時即大約4或6天后以10ng/mlAZT所造成的抑制。
粗提取物將Hypoxisrooperi的無水甲醇提取物(見圖1)溶于二甲亞砜并加到試驗細胞中，其最終濃度為70μg/ml(DMSO的最終濃度是1%V/V)。培育4天后，P24核心蛋白的生成被100%的抑制而HIVRNA的生成則抑制85%。細胞增生在對比物的76%。10ng/ml的AZT使得P24核心蛋白的生成100%地抑制，而HIVRNA的生成則96%地抑制。
純化的化合物Ⅴ為了證實粗甲醇提取物的哪一成分參與了HIV-1增生的抑制，將HPLC提純的hypoxoside(見圖3)自身溶在水中進行試驗。下列結(jié)果是6天后用標(biāo)準(zhǔn)的HIV-1滴定度所獲得的表2
10ng/mlAZT對P24核心蛋白的生成抑制20%而對HIV-RNA的生成抑制68%。
使用同樣化合物Ⅴ樣品但將病毒滴定度降低十倍得到下列結(jié)果表3
10ng/mlAZT對P24核心蛋白和HIV-RNA的生成抑制99%。
化合物Ⅴ-Ⅷ在另個試驗中，使由Hypoxislatifolia分離的化合物Ⅴ-Ⅷ(見圖2)溶于水后進行試驗，培育3天和6天后所得結(jié)果如下表4(三天后)
10ng/mlAZT使P24核心蛋白的生成抑制50%而使HIV-RNA的生成抑制46%。
表5(6天后)
10ng/mlAZT對P24核心蛋白的生成抑制50%而對HIV-RNA的生成抑制46%。
化合物Ⅸ-ⅫHypoxoside(化合物Ⅴ)和它的結(jié)構(gòu)相關(guān)化合物經(jīng)硫酸化得化合物Ⅸ-Ⅻ，(見圖25)，試驗其抑制HIV-1的增生，6天后得結(jié)果如下表6(標(biāo)準(zhǔn)病毒滴定度)
10ng/mlAZT造成20%地抑制P24核心蛋白的生成且68%地抑制HIV-RNA的生成。
表7(稀釋10倍的標(biāo)準(zhǔn)病毒滴定度)
10ng/mlAZT造成99%地抑制P24核心蛋白和HIV-RNA的生成。
化合物ⅩⅦ化合物Ⅰ經(jīng)硫酸化得化合物ⅩⅦ(見圖28-29)，試驗其對HIV-1體外增生的抑制，得如下結(jié)果表8(培育3天)
10ng/mlAZT造成5%地抑制P24核心蛋白生成且46%地抑制HIV-RNA生成。
續(xù)表8(培育6天)
10ng/mlAZT造成96%地抑制P24核心蛋白生成且96%地抑制HIV-RNA生成。
化合物Ⅰ-Ⅳ的混和物經(jīng)硫酸化分別得化合物XⅦ-ⅩⅩ(見圖32)并將其培育6天得如下結(jié)果。
表9
10ng/mlAZT造成96%地抑制P24核心蛋白生成且92%地抑制HIV-RNA生成。
化合物ⅩⅧ化合物Ⅱ硫酸化得出化合物ⅩⅧ(見圖30-31)6天后得出如下結(jié)果。
表10
10ng/mlAZT造成96%地抑制P24核心蛋白生成且92%地抑制HIV-RNA生成。
活體內(nèi)產(chǎn)生的化合物Ⅴ-Ⅷ的代謝產(chǎn)物口服攝入的Hypoxide(化合物Ⅴ)在大腸內(nèi)被細菌的β-葡糖苷酶轉(zhuǎn)換成化合物Ⅰ?；衔铫衽判乖诩S便里并也被吸收及由Ⅱ相型生體轉(zhuǎn)化成為硫酸化物和葡糖醛酸結(jié)合物(圖6中的餾分A、B和C)。餾分A主要含化合物Ⅰ-Ⅳ的二葡苷酸化物，即化合物Ⅷ-XVI，得出如下結(jié)果表11
10ng/mlAZT造成100%地抑制P24核心蛋白生成且97%地抑制HIV-RNA生成。
餾分A-C對化合物Ⅴ-Ⅷ的尿代謝物的餾分A，B和C(即化合物ⅩⅢ-ⅩⅥ(餾分A);化合物ⅩⅪ-ⅩⅩⅧ(餾分B)和化合物ⅩⅦ-ⅩⅩ(餾分C)(見圖5-6)進行試驗，得到培育三天后的如下結(jié)果。
表12
10%ng/mlAZT造成50%地抑制P24核心蛋白的生成且46%地抑制HIV-RNA生成。
化合物Ⅴ-Ⅷ的尿代謝物餾分B(見圖6)被細分餾成兩個餾分。餾分V1是餾分B的上行半部而餾分V2是餾分B的下行半部。對這些餾分分別進行抑制HIV復(fù)制的測試，得到經(jīng)4天和6天培育的如下結(jié)果。
表13
(ND＝未測定)10%ng/mlAZT抑制P24核心蛋白生成和HIV-RNA生成在4天和6天后為100%。
實施例10物料和方法治療體加入此項研究的所有治療體都呈HIV陽性，這是以通用的酶連接免疫吸附劑試驗(ELISA)所測定的，且其ELISA陽性結(jié)果已經(jīng)過Western印跡技術(shù)證實。
被研究的人員包括18名兩種性別的治療體，其中7名志愿者作為處置組(Hypoxis物種提取物處置，見實施例2)，而其余11名治療體作為對比的非處置組。研究中的任何治療體皆不使用其他的抗反轉(zhuǎn)病毒試劑。在(為基準(zhǔn)的)初診時抽取靜脈血樣(凝塊和全血EDTA)并以一個月的間隔再次抽取。
膠囊每個膠囊含200mg的Hypoxis種提取物(大約100mg的化合物Ⅴ-Ⅷ)并告知患者吞服這種膠囊每天三次每次兩個，即吞服總量為1200mg/天的提取物。
血液分析凝血用這種血樣借助通常的捕獲ELISA藥具來定量血清HIV抗原血癥。所用培育條件包括用甘氨酸-鹽酸緩沖液對每種血清樣品進行予處理，以便分離免疫復(fù)體。這就保證了所謂的總P24核心蛋白的測量。且使不僅是留在循環(huán)中的該核心蛋白因抗P24核心蛋白抗體而不呈復(fù)合態(tài)。結(jié)果以按照校準(zhǔn)曲線確定的絕對值Pg/ml血清來表達。EDTA全血全血被用來通過單克隆抗體識別和定量淋巴細胞亞群。簡而言之，用單克隆抗體的混和物培育100μl血液，該抗體以如下所示的不同熒光染料標(biāo)記CD3-FITC/CD4-PECD3-FITC/CD8-PECD3-FITC/CD19-PECD3-FITC/CD16+CD56-PECD8-FITC/HLA-Dr-PE這些混和物檢測下列細胞亞群名為T-輔助細胞;T-抑制因子;B-細胞;NK-細胞和激活的抑制因子細胞。
培育20分鐘后用溶胞溶液(FACS溶胞緩沖液)對血紅細胞溶胞，將細胞聚成球粒并用磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)洗滌一次。細胞凝固在含0.5%V/V甲醛的500μlPBS內(nèi)。
使用FACS筒形血細胞計數(shù)器評定細胞熒光。用530/30nm通頻濾光器測量FL1(熒光素)并且用585/42nm通頻濾光器測FL2(藻紅素)。使用Simulset軟件程序進行分析，該程序從分析門排除粒性細胞和單核細胞而自動設(shè)定淋巴細胞門。
所有結(jié)果皆以陽性淋巴細胞(即CD3和CD4或CD3和CD8共同表達的細胞)的百分?jǐn)?shù)來表示。在這種方式中，CD4陽性單核細胞被排除在CD4+T-細胞的計算之外。同樣，CD8+天然殺傷(NK)細胞被排除在CD3+，CD8+T-抑制因子亞群之外。
絕對細胞數(shù)是根據(jù)用于全血的等分試樣的基礎(chǔ)血液學(xué)來進行計數(shù)的。從淋巴細胞不同計數(shù)的百分?jǐn)?shù)中可計算陽性細胞的絕對值。這樣進行所有亞群的分析。
對這些亞群的基準(zhǔn)值和接續(xù)值之間觀察到的變化可以如下方式分析患者的特殊亞群的絕對值為基線值＝X，測量同樣參數(shù)的第一個接續(xù)值＝X1，因此在這個參數(shù)的變化＝X1-X。
X1-X為正值表示所測參數(shù)增加。反之負(fù)值表示該參數(shù)在接續(xù)值和基線之間是減少。
計算兩個組內(nèi)所有治療體的這個參數(shù)的平均變化，其結(jié)果或以平均絕對變化值或以相對于基線值的平均變化值百分?jǐn)?shù)來表達。
結(jié)果血清病毒抗原血癥(P24核心蛋白含量)血清P24核心蛋白的測定揭示出和經(jīng)同樣的一個月周期時其平均P24核心蛋白含量升高17.9Pg/ml的對照組即未處置群體(n＝11)相比較，處置組(n＝7)顯示平均降低為-13.8Pg/ml。與之類似，分析2個月接續(xù)的P24核心蛋白含量時，處置組(n＝6)顯示平均增加2.5Pg/ml，這與非處置組(n＝4)平均增加31.4Pg/ml形成了有利的對比。這些結(jié)果以繪圖方式表現(xiàn)在圖33中。
應(yīng)當(dāng)注意，在處置持續(xù)較長周期的四個患者中采用該方法未檢測到P24核心蛋白含量，與此同時在未處置的任何治療體中這種降低或轉(zhuǎn)成負(fù)值的現(xiàn)象也不明顯。與此相反，未處置治療體顯現(xiàn)P24核心蛋白含量隨時間不斷增長。
淋巴細胞亞群照圖1所示，處置組患者(n＝7)的所分析的所有淋巴細胞亞群顯出非常有利的增加。確實，一個月后淋巴細胞總數(shù)的平均增加伴隨有下列細胞的一般性增加CD3+細胞(T細胞)，T-輔助細胞(CD4+)，T-抑制因子細胞(CD8+)，B細胞和NK細胞，以及表達細胞活性標(biāo)記物的CD8+細胞(CD8+Dr細胞)餾分。在細胞亞群測量中的平均增加量有利地與用其他諸如AZT(在實施例9中陳述)和Didanosine的抗反轉(zhuǎn)病毒劑進行臨床診斷公布的結(jié)果形成比較。確實，F(xiàn)iscd等人(NewEng.J.Med.1990，323，1009-1014)報導(dǎo)在他們用標(biāo)準(zhǔn)劑量(250mg/4hr)和減少劑量(100mg/4hr)的AZT處置30個月的處置組中，暫時平均增加25CD4+細胞/mm3血液。
另一方面，未處置組(n＝11)經(jīng)同樣時期顯示了惡化的免疫參數(shù)(表14)。顯然可見，持續(xù)一個月后顯出絕大多數(shù)細胞亞群減少，這似乎是證實，這些患者的免疫狀態(tài)隨著如上報導(dǎo)的P24核心蛋白含量的明顯化而衰退。
表14持續(xù)1月后細胞亞群中平均絕對改變(對照各組)該值以絕對細胞/μl血液來表示。
正值結(jié)果表示相對基線值是增加的，而負(fù)值表示相對基線值是減少的。
組間差別不僅明顯地發(fā)生在比較平均絕對變化的時候，也反映了相對于基線值平均百分比的變化。為容易比較，這些數(shù)據(jù)列在圖34中。
用2個月持續(xù)的參數(shù)可以得類似結(jié)果。如從表15中所見，未處置組(n＝4)總是顯示CD4+、B細胞和NK細胞數(shù)的減少。其他細胞亞群稍示增加。然而在處置組，測量的所有參數(shù)在平均絕對變化以及平均百分比變化兩個方面都顯示恒定的顯著的增大(表15)。再者，在我們的處置組觀察到的平均絕對值變化可有利地與用AZT進行的其他臨床診斷所公開的數(shù)據(jù)形成對比。
表15持續(xù)2月后比較各組間細胞亞群的平均絕對變化該值以絕對細胞/μl血液來表示。
正值表示相對于基線值的增加，而負(fù)值表示相對于起始值的減少。
從實施例10中已顯出來自Hypoxis物種的提取物有抗HIV的體外活性，其可抑制HIV復(fù)制(P24核心蛋白生成)和HIV-RNA生成。
患者每日吞服1200mg的Hypoxis物種提取物，處置一個月以及兩個月后顯示出改進的免疫狀態(tài)，這個結(jié)果是大有希望的。所測量的免疫參數(shù)包括T-細胞(T-輔助細胞和T-抑制因子細胞兩者)，B-細胞和NK細胞增大的數(shù)目。與此同時，治療體血清中測量的P24核心蛋白的生成發(fā)生遲滯以及明顯減少。
另一方面，經(jīng)相同時期的對照的未處置的治療體表現(xiàn)出總是惡化的免疫參數(shù)和P24核心蛋白血清含量的增大。這些治療體的CD4+細胞以及其他細胞亞群呈現(xiàn)持續(xù)減少，如同在其他抗HIV臨床診斷的表現(xiàn)一樣(Foulds等人，Drugs，1992，44，94-116和Prince等人;J.Acq.Immuno.Def.，1991，4，1227-1232)。
實施例11化合物ⅩⅧ抑制呼吸道融合病毒(RSV)將化合物ⅩⅧ加到在塑料管內(nèi)以傾斜培養(yǎng)生長的Hep-2細胞中，分別獲得的最終濃度是50、100和200μg/ml。然后將培養(yǎng)液分別用高標(biāo)準(zhǔn)病毒劑量，十分之一的所說標(biāo)準(zhǔn)劑量，以及百分之一的所說標(biāo)準(zhǔn)劑量的呼吸道融合病毒(RSV)來接種。于33℃培育4天后用反相反差顯微鏡視覺觀測細胞，并記錄合胞體生成的程度，即含有三個或多個細胞核的單個細胞，其表示如下a＝0-25%，b＝25-50%，c＝50-75%和d＝75-100%的細胞含有三個或多個細胞核。
所得結(jié)果列于下面的表16中
表16存在和不存在化合物ⅩⅦ培育4天后合胞體生成程度
實施例12化合物ⅩⅦ對細胞巨化病毒(CMV)的作用將化合物ⅩⅦ加到初級胎兒纖維細胞的組織培養(yǎng)液中，分別獲得的最終濃度為50、100和200μg/ml。然后分別用高的標(biāo)準(zhǔn)病毒劑量的、十分之一所說標(biāo)準(zhǔn)劑量的和五十分之一所說標(biāo)準(zhǔn)劑量的細胞巨化病毒(CMV)接種這些培養(yǎng)液并培育4天。
以顯微鏡目視檢查培養(yǎng)液來測定CMV的細胞發(fā)病作用，根據(jù)是細胞全膨脹的程度，其中為a＝0-25%，b＝25-50%，c＝50-75%和d＝75-100%的受全膨脹影響的細胞。結(jié)果列于下面的表17。
表17培育4天后化合物ⅩⅦ對細胞巨化病毒的細胞治療效果程度的影響
在200μg/ml時8個培養(yǎng)液中有5個顯示了因化合物引起的毒性征候。
權(quán)利要求
1.在制備處置人或動物治療體病毒感染的物質(zhì)或組合物方面的一種化合物、物質(zhì)或組合物的用途，該物質(zhì)或組合物包含至少一種相應(yīng)于通式(1)的化合物
其中R1、R、R3和R4可相同或不同并且選自-H，-OH，A，B，C和D，而且其中A=
B=
(其中任意1-3個-OSOθ3基團可選地用-OH取代)C=
和D=-OSOθ3，
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其特征在于每個所說的通式(1)化合物中的R2和R3選自-OH，-H和D。
3.按權(quán)利要求1或2的用途，其特征在于每個所說的通式(1)化合物中R1和R4選自-OH，A，B，C和D。
4.按權(quán)利要求1-3的任一項用途，其特征在于每個所說通式(1)的化合物選自化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ，其具有的R1，R2，R3和R4按前文表1中所述。
5.按權(quán)利要求1-4所包括的任一項用途，其特征在于至少一種所說通式(1)的化合物構(gòu)成至少一植物物種的提取物的一部分，該植物物種是仙茅科(Hypoxidaceae)植物成員。
6.按權(quán)利要求5的用途，其特征在于每個所說通式的(1)化合物構(gòu)成自為仙茅科植物成員的至少一種植物物種的提取物的一部分。
7.按權(quán)利要求5或6的用途，其特征在于提取物是來自至少一種植物物種，所說植物種為選自Hypoxis，Spiloxene，Curcuglio和Campynema植物屬的成員。
8.按權(quán)利要求7的用途，其特征在于提取物來自至少一種植物種，該植物種選自Hypoxisnitida，H.obtusa，H.rigidula，H.villosa，H.interjecta，H.multiceps，H.nyasicaH.rooperiH.acuminata，H.latifolia，Spiloxeneschlechteri和其雜交物。
9.按權(quán)利要求5-8之任一用途，其特征在于每個通式(1)的化合物選自化合物Ⅴ-Ⅷ，其中的R1、R2、R3、R4列于上文的表1。
10.按權(quán)利要求4的用途，其特征在于每個通式(1)的化合物選自化合物Ⅰ-Ⅳ，其中的R1、R2、R3和R4列于上文表1。
11.按權(quán)利要求4的用途，其特征在于每個通式(1)的化合物選自化合物Ⅴ-Ⅷ，其中R1、R2、R3和R4列于上文表1。
12.根據(jù)權(quán)利要求4的用途，其特征在于每個通式(1)的化合物選自化合物Ⅸ-ⅩⅩⅧ。其中R1、R2、R3和R4列于上文表1。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12的任一項用途，其特征在于病毒感染選自人體免疫缺乏癥病毒(HIV)感染，呼吸道融合病毒(RSV)感染和細胞巨化病毒(CMV)感染。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的用途，其特征在于病毒感染是HIV感染。
15.一種用于處置人或動物治療體病毒感染的化合物、物質(zhì)或組合物，該化合物、物質(zhì)或組合物的特征是其包括至少一種按照通式(1)的化合物
其中R1、R2、R3和R4可相同或不同并選自-H，-OH，A，B，C和D，其中A ＝
B ＝
(其中任意1-3個-OSO
基團可選地用-OH取代)C ＝
;以及D ＝-OSO
16.根據(jù)權(quán)利要求15的化合物、物質(zhì)或組合物，其特征在于其包括的至少一種化合物選自化合物Ⅰ-XXⅧ，其中的R1、R2、R3和R4列于上文表1。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的化合物、物質(zhì)或組合物，其特征在于其包括的至少一種化合物選自化合物Ⅸ-XXⅧ，其中的R1、R2、R3和R4列于上文表1。
18.根據(jù)權(quán)利要求15-17的化合物、物質(zhì)或組合物，其特征在于其中的病毒感染選自人體免疫缺乏癥病毒(HIV)感染，呼吸道融合病毒(RSV)感染和細胞巨化病毒(CMV)感染。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的化合物、物質(zhì)或組合物，其特征在于病毒感染是HIV感染。
20.一種用作藥劑或藥品處置人或動物治療體病毒感染的化合物、物質(zhì)或組合物，其特征在于其包括至少一種按通式(1)的化合物
其中R1、R2、R3和R4可相同或不同且選自-H，-OH，A，B，C和D，而其中
B ＝
(其中任意1-3個-OSO
基團可選地用-OH取代)C ＝
;以及D ＝ -OSO
21.根據(jù)權(quán)利要求20的化合物、物質(zhì)或組合物，其特征在于其包括的至少一種通式(1)的化合物選自化合物Ⅰ-XXⅧ，其中的R1、R2、R3和R4列于上文的表1。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的化合物、物質(zhì)或組合物，其特征在于其包括的至少一種化合物選自化合物Ⅸ-XXⅧ，其中的R1、R2、R3和R4列于上文表1。
23.根據(jù)權(quán)利要求20-22之任一項的化合物、物質(zhì)或組合物，其特征在于該病毒感染選自人體免疫缺乏病毒(HIV)感染，呼吸道融合病毒(RSV)感染和細胞巨化病毒(CMV)感染。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的化合物、物質(zhì)或組合物，其特征在于病毒感染是HIV感染。
25.一種用作活性治療劑處置人或動物治療體病毒感染的化合物、物質(zhì)或組合物，其特征在于其包括至少一種按照通式(1)的化合物
其中R1、R2、R3和R4可相同或不同且選自-H，-OH，A，B，C和D，而其中A ＝
B ＝
(其中任意1-3個-OSO
基團可選地用-OH取代)C ＝
以及D ＝ -OSO
26.根據(jù)權(quán)利要求25的化合物、物質(zhì)或組合物，其特征在于它包括的至少一種通式(1)的化合物選自化合物Ⅰ-XXⅧ，其中的R1、R2、R3和R4列于上文的表1。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的化合物、物質(zhì)或組合物，其特征在于它包括的至少一種化合物選自化合物Ⅸ-XXⅧ，其中的R1、R2、R3和R4列于上文表1。
28.根據(jù)權(quán)利要求25-27之任一項的化合物、物質(zhì)或組合物，其特征在于所說病毒感染選自人體免疫缺乏病毒(HIV)感染，呼吸道融合病毒(RSV)感染和細胞巨化病毒(CMV)感染。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的化合物、物質(zhì)或組合物，其特征在于病毒感染是HIV感染。
30.一種用于制備組合物、藥品或藥劑來處置人或動物治療體病毒感染的化合物、物質(zhì)或組合物，其特征在于它包括至少一種相應(yīng)于通式(1)的化合物
其中R1、R2、R3和R4可相同或不同且選自-H，-OH，A，B，C和D，而其中A ＝
B ＝
(其中任意1-3個-OSO
基團可選地用-OH取代)C ＝
;以及D ＝ -OSO
31.根據(jù)權(quán)利要求28的化合物、物質(zhì)或組合物，其特征在于它包括的至少一種通式(1)的化合物選自化合物Ⅰ-XXⅧ，其中R1、R2、R3和R4列于上文表1。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的化合物、物質(zhì)或組合物，其特征在于它包括的至少一種化合物選自化合物Ⅸ-XXⅧ，其中R1、R2、R3和R4列于上文表1。
33.根據(jù)權(quán)利要求30-32之任一項的化合物、物質(zhì)或組合物，其特征在于所說病毒感染選自人體免疫缺乏病毒(HIV)感染，呼吸道融合病毒(RSV)感染和細胞巨化病毒(CMV)感染。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的化合物、物質(zhì)或組合物，其特征在于該病毒感染是HIV感染。
35.一種化合物，具有如下通式(1)
其特征在于R1、R2、R3和R4相同或不同且選自-H，-OH，A，B，C及D，而其中
A＝
B ＝
(其中任意1-3個-OSO
基團可選地用-OH取代)C ＝
;以及D ＝ -OSO
條件是當(dāng)R2和R3兩者選自-OH和-H時，R1和R4不是兩個-OH且R1和R4不是兩個A。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的化合物，其特征在于R2和R3選自-OH，-H和D。
37.根據(jù)權(quán)利要求35或36的化合物，其特征在于R1和R4選自-OH，A，B，C和D。
38.根據(jù)權(quán)利要求35-37的化合物，其特征在于該化合物選自按照式(1)的化合物Ⅸ-XXⅧ，其中的R1，R2，R3和R4列于上文表1。
39.一種處置人或動物治療體病毒感染的藥品或藥劑，其特征在于它包括作為一種活性治療劑的至少一種如權(quán)利要求35-38之任一項所限定的化合物，與之一起的稀釋劑或載體。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的藥品或藥劑，其特征在于其存在的形式選自含有活性治療劑的片劑，粉劑，膠囊和液體，所述片劑和膠囊每個含20-50mg的活性治療劑，而粉劑和液體每劑含4-10mg/ml的活性治療劑。
41.一種通式(1)化合物的制備方法，該化合物選自化合物Ⅸ-Ⅻ且其中的R1、R2、R3和R4列于上文表1，該方法的特征是它包括從為仙茅科植物成員的至少一種植物種中提取選自化合物Ⅴ-Ⅷ的一種通式(1)的化合物，將提取的化合物過硫酸化，得到作為產(chǎn)品的所述的選自化合物Ⅸ-Ⅻ的化合物。
42.選自化合物ⅩⅦ-ⅩⅩ且其中R1、R2、R3和R4列于上文表1的通式(1)的化合物的一種制備方法，其特征在于它包括從為仙茅科植物成員的至少一種植物種中提取選自化合物Ⅴ-Ⅷ的一種通式(1)的化合物，將所述提取化合物進行酶水解，得到選自化合物Ⅰ-Ⅴ的一種化合物，該方法進而包括將選自化合物Ⅰ-Ⅳ的所說化合物進行硫酸化，得到作為產(chǎn)物的選自化合物ⅩⅦ-ⅩⅩ的所說化合物。
43.一種為化合物ⅩⅢ且其中R1、R2、R3和R4列于上文表1的通式(1)化合物的制備方法，其特征在于它包括從為仙茅科植物成員的至少一種植物種中提取具有通式(1)的化合物Ⅴ，將化合物Ⅴ進行酶水解得到化合物Ⅰ，將所說化合物Ⅰ進行葡糖苷酸化，得到作為產(chǎn)物的所說化合物ⅩⅢ。
44.選自化合物Ⅰ-Ⅳ和Ⅺ-XXⅧ且其中R1、R2、R3和R4列于上文表1的通式(1)的化合物的一種制備方法，其特征在于它包括從為仙茅科植物成員的至少一種植物種中提取選自化合物Ⅴ-Ⅷ的至少一種通式(1)化合物，使人或動物治療體攝入該提取的化合物，收集攝入后治療體的尿，該尿含有作為選自化合物Ⅴ-Ⅷ的代謝物的選自化合物Ⅰ-Ⅴ和ⅩⅢ-ⅩⅩⅧ的所說化合物，自尿中提取所述的代謝物作為產(chǎn)物化合物。
45.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，其特征在于所說產(chǎn)物化合物作為所說化合物Ⅸ-XXⅧ部分多元混合物從尿中提取，選自化合物Ⅴ-Ⅷ的化合物作為化合物Ⅴ-Ⅷ的部分混和物從植物物種中提取。
46.根據(jù)權(quán)利要求41-45之任一項的方法，其特征在于它包括每種產(chǎn)物化合物的分離和提純步驟。
47.一種選自化合物Ⅰ-Ⅳ和Ⅸ-XXⅧ且其中的R1、R2、R3和R4列于上文表1的通式(1)化合物，其特征在于該化合物是采用權(quán)利要求41-46之任何一個方法而得到的。
全文摘要
本發(fā)明提供處置人或動物治療體病毒感染的化合物、物質(zhì)和組合物，以及含有它們的藥品及藥劑。公開了處置這種病毒感染及用于制備處置病毒感染(特別是HIV感染)的物質(zhì)和組合物的這種化合物、物質(zhì)和組合物的用途。公開了新化合物，即1，5-雙取代的戊-4-烯-1-炔，其制備方法和用于處置人或動物治療體病毒感染的方法。該化合物可用通式(1)代表。
文檔編號C07H15/203GK1091291SQ93119070
公開日1994年8月31日 申請日期1993年9月7日 優(yōu)先權(quán)日1992年9月7日
發(fā)明者R·W·里賓堡, P·B·克魯格, P·J·D·布易克, C·F·迪沃斯阿爾布雷特 申請人:懷羅斯塔特(Na)有限公司