專利名稱：：治療病毒感染的方法及其藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體而言，本發(fā)明涉及治療病毒感染的方法及其中所用的藥物。更特別地，本發(fā)明涉及治療肝炎病毒或免疫缺陷病毒感染的方法以及其中所用的核酸、疫苗、融合蛋白、載體或細(xì)胞。
背景技術(shù)：
：治療或預(yù)防病毒感染是當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究的重要而熱門的課題。其中，病毒的免疫耐受性為治療或預(yù)防病毒感染帶來了很大的困難。免疫耐受性以病毒的持續(xù)存在、B細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生抗體和細(xì)胞免疫的能力下降或消失為特征，使得病毒可有效的逃逸機(jī)體免疫，引起免疫耐受，使人體的免疫機(jī)制不再對抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答，使病毒在體內(nèi)長期存在。例如，乙型肝炎病毒(HBV)是最典型的免疫耐受性病毒，染病母親所產(chǎn)90%新生兒成為病毒攜帶者，部分成人HBV患者也會形成乙肝的慢性感染。HBV的持續(xù)性感染和抗原的過量表達(dá)以及病毒的變異往往導(dǎo)致患者體內(nèi)持續(xù)的病毒復(fù)制、胸腺中病毒特異的與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的Thl類細(xì)胞被克隆剔除、外周血和肝臟中與病毒清除和感染細(xì)胞裂解相關(guān)的CTL反應(yīng)能力下降、消失或者克隆剔除。HBV的持續(xù)性感染以及與之相關(guān)的肝硬化和肝癌對患者對社會造成了極大的經(jīng)濟(jì)和社會壓力。HBV的主要結(jié)構(gòu)抗原包括表面抗原S，(包括糖基化的大抗原S1S2S，中抗原S2S和小抗原S)和核心蛋白C，此外還有聚合酶P和調(diào)節(jié)蛋白e和x。S和C抗原可以引起中和抗體的產(chǎn)生。核心蛋白C相對保守，它產(chǎn)生的特異的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)對病毒清除具有重要意義。然而對HBV來說，e抗原的大量表達(dá)能夠使得Thl類細(xì)胞受到抑制，表面抗原的大量表達(dá)使得免疫系統(tǒng)枯竭(exhausted)。丙型肝炎病毒(HCV)的免疫耐受機(jī)制與HBV不同，HCV多為低水平感染，不易產(chǎn)生活躍的免疫應(yīng)答，此外HCV基因極易產(chǎn)生變異，造成免疫逃逸，產(chǎn)生持續(xù)性感染和免疫耐受。HCV多蛋白N末端191個氨基酸為核心蛋白,是病毒核衣殼的主要成分。核心蛋白的N末端富含堿性氨基酸且高度保守。核心蛋白后是病毒的包膜蛋白E1，E2，是高度糖基化的I型跨膜蛋白。在所有HCV蛋白中，E2的保守性最弱，是免疫反應(yīng)的主要目標(biāo)。大多數(shù)的HCV非結(jié)構(gòu)蛋白(NS2-NS5B)為病毒基因組復(fù)制所必需。HCV是一種高度變異的病毒，這種變異使得HCV在感染者體內(nèi)形成復(fù)雜多樣的HCV準(zhǔn)種群，有可能對機(jī)體抗病毒免疫應(yīng)答產(chǎn)生影響。免疫逃避株的形成則可能與病毒持續(xù)感染有關(guān)。免疫逃避的兩種可能機(jī)制(l)HCV對IFN應(yīng)答的主動拮抗作用，如HCVNS3/4絲氨酸蛋白酶可以阻斷干擾素調(diào)節(jié)因子3的磷酸化和活性；E2和NS5蛋白能夠抑制RNA依賴性蛋白激酶的功能，從而影響IFN的抗病毒效應(yīng)。(2)HCV蛋白上B淋巴細(xì)胞或者T淋巴細(xì)胞抗原表位在機(jī)體免疫力下發(fā)生被動變異，從而逃避適應(yīng)性免疫應(yīng)答的攻擊。免疫缺陷病毒的典型代表是人免疫缺陷病毒(HIV)。HIV通過感染CD4T細(xì)胞，導(dǎo)致CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量不斷下降。另外，HIV感染還引起B(yǎng)-細(xì)胞功能失調(diào)和NK細(xì)胞的細(xì)胞毒功能下降，使具有免疫功能的樹突狀細(xì)胞(DC)的數(shù)量在血液中和組織中的分布和數(shù)量改變。HIV感染還可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及胃腸道等器官產(chǎn)生病變。由于免疫功能下降，患者并發(fā)各種癌癥和傳染病的可能性大增，并最終導(dǎo)致獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)。HIV的結(jié)構(gòu)基因包括gag(P55、P17、P24)、Pol和env。Pol基因編碼聚合酶前體蛋白(P34)，經(jīng)切割形成蛋白酶、整合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H，均為病毒增殖所必需。env基因編碼約863個氨基酸的前體蛋白，經(jīng)糖基化形成gp160，gpl20和gp41。gpl20含有中和抗原決定簇，已證明HIV中和抗原表位在gpl20V3環(huán)上，V3環(huán)區(qū)是囊膜蛋白的重要功能區(qū)，在病毒與細(xì)胞融合中起重要作用。gpl20與跨膜蛋白gp41以非共價鍵相連。gp41參與靶細(xì)胞融合，促使病毒侵染細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)表明gp41亦有較強(qiáng)抗原性，能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體反應(yīng)。HIV的調(diào)控基因至少包括Tat、Rev、Nef、Vif、Vpu、Vpr。HIV的免疫治療應(yīng)該建立阻斷病毒持續(xù)侵染CD4+T細(xì)胞的機(jī)制，抑制感染細(xì)胞內(nèi)部HIV的持續(xù)復(fù)制并產(chǎn)生中和抗體和CTL反應(yīng)。為了治療或預(yù)防病毒感染，人們已經(jīng)開發(fā)了多種治療或預(yù)防病毒感染的疫苗。例如，對于HBV，HBV的預(yù)防性表面抗原疫苗得到了廣泛的應(yīng)用并在很大程度上降低了HBV的感染，但此種疫苗卻不能治療HBV的慢性感染。傳統(tǒng)治療HBV感染的方法包括a-IFN以及化學(xué)藥物，它們在控制病毒的復(fù)制方面具有重要的作用，但是卻不能有效地清除病毒(SeegerandMason2000)。單一策略的DNA疫苗雖然因?yàn)槟軌蛘T發(fā)細(xì)胞和體液免疫而受到重視，但是DNA疫苗在小動物實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果卻不能在大動物身上實(shí)現(xiàn)(Payetteetal.2006;Zhaoetal.2006)。隨著對HBV以及其誘發(fā)疾病研究的深入，已經(jīng)有部分的臨床實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)藥物和蛋白疫苗結(jié)合的綜合性療法，雖取得了一定的成果(Yang,Leeetal.2006)，但傳統(tǒng)藥物在克服病毒變異造成的免疫逃逸、降低病毒復(fù)制和恢復(fù)機(jī)體的CTL反應(yīng)能力方面還沒有樂觀的報道。至今尚無被批準(zhǔn)的HBV治療性疫苗問世。對于HCV，HCV引起的丙型肝炎，其感染的慢性化率高達(dá)60-80%，并導(dǎo)致肝硬化和肝癌。HCV主要通過輸血傳染，血液的嚴(yán)格檢查可控制HCV新感染的發(fā)生率，根據(jù)上述情況，HCV的疫苗研究主要是針對治療性疫苗的研究。由于HCV基因高度可變，又缺乏合適的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和小動物模型，有效的重組疫苗研發(fā)受到阻礙.盡管如此，基因疫苗，多肽和蛋白質(zhì)疫苗，基于DC細(xì)胞的疫苗和類病毒顆粒疫苗等研究都被廣泛關(guān)注(Mannsetal.2001)。丙型肝炎的實(shí)驗(yàn)疫苗起步時，不外乎傳統(tǒng)意義上的疫苗策略，即尋找特異的抗原成分，來免疫宿主以期獲得中和性或保護(hù)性抗體。在研究中，以重組E1/E2蛋白免疫猩猩能誘導(dǎo)高滴度抗膜蛋白(anti-envelope)抗體產(chǎn)生但只能保護(hù)動物免受低價病毒侵害(Fomsetal,1998;Zhoueta1.2000;Leeetal1998)?；蛞呙缬?992年首先報道，近來發(fā)展迅速，該技術(shù)將編碼抗原的DNA直接注射到宿主肌肉或皮內(nèi)，能誘導(dǎo)特異性體液免疫以及更廣譜的細(xì)胞免疫應(yīng)答，HCV全基因組序列的測序使得HCV基因疫苗的研究逐步深入(Jiaoetal.2004)，但重組DNA疫苗的應(yīng)用同樣受到載體特征的限制。HCV疫苗面臨的挑戰(zhàn)，仍然是病毒蛋白的高變性，尤其是包膜蛋白的變異更為主要，而與HCV相關(guān)的LDL蛋白又使得大部分病毒顆粒具有不可中和性，成為疫苗研究的挑戰(zhàn)。由于HCV中和抗體的弱保護(hù)活性、病毒的高度變異性以及機(jī)體免疫功能的破壞，單一策略的疫苗研究思路在HCV的免疫治療中不能產(chǎn)生重要的治療作用(Inchauspeetal.2003)。HCV臨床研究的現(xiàn)狀迫切需要人們確立一種按照病毒侵染過程和機(jī)體免疫反應(yīng)為特征的綜合性治療策略。對于HIV，自20世紀(jì)80年代初發(fā)現(xiàn)艾滋病之后，人們早在1986年即開始嘗試HIV的預(yù)防和治療性疫苗。主要的疫苗策略包括HIV的滅活疫苗、減毒活疫苗，這些通過對病毒的處理而獲得的疫苗雖可持續(xù)產(chǎn)生抗體和CTL免疫反應(yīng)，并可保護(hù)試驗(yàn)成年恒河猴降低SIV感染，但這些猴子最終還是發(fā)展成艾滋病(BabaTWetal.，1999)，因此人們對滅活或減毒活疫苗在人體中的應(yīng)用持保守態(tài)度。對HIV重組亞單位疫苗的研究也沒有獲得可應(yīng)用的成果，如美國首次進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)的HIV膜蛋白gpl60抗原疫苗，雖然gpl20能結(jié)合到CD4細(xì)胞上并在一定程度上阻斷HIV的入侵，但由于HIV具有其它途徑與細(xì)胞表面的病毒受體結(jié)合，此種亞單位疫苗應(yīng)用人體后既不能誘發(fā)CTL也不能產(chǎn)生中和抗體，在美國和泰國進(jìn)行的III期臨床實(shí)驗(yàn)以失敗告終(DennisRBetal.,2004)。HIV病毒樣顆粒疫苗是應(yīng)用部分HIVDNA感染后產(chǎn)生的病毒蛋白組裝成顆粒樣結(jié)構(gòu)的一種疫苗。由于它在靈長類動物中具有很強(qiáng)的免疫原性而受到重視。我國肖瑤等(肖瑤等，2000)研制的Gag和GagV3基因的病毒樣顆粒在小鼠模型上可誘導(dǎo)體液免疫和一定程度的細(xì)胞免疫，但未見在靈長類動物上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。重組DNA疫苗是把HIV外源基因插入活的病毒載體，通過病毒使外源基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)，由此產(chǎn)生更廣的宿主免疫應(yīng)答。這些載體增加了疫苗安全性而不減弱其免疫活性(BruynGeta1.,2004)。為進(jìn)一步增加疫苗的安全性，研制減毒痘苗病毒載體已有進(jìn)展(QingF,eta1.,2005)。DNA疫苗用含HIV基因的質(zhì)粒免疫動物，可誘導(dǎo)特異性抗體產(chǎn)生，同時還觀察到特異性T淋巴細(xì)胞的CTL應(yīng)答。質(zhì)粒DNA疫苗在恒河猴能誘導(dǎo)SIV特異性CTL，這種疫苗誘導(dǎo)的免疫能促進(jìn)第二次CTL應(yīng)答的產(chǎn)生，并能控制隨后的致病性SIV感染后的病毒復(fù)制(EganMA,et2000)。采用質(zhì)粒DNA免疫原作為HIV候選疫苗的人體早期實(shí)驗(yàn)研究已在進(jìn)行中。迄今全球艾滋病疫苗進(jìn)行了廣泛的臨床前實(shí)驗(yàn)研究，以及近百次的艾滋病疫苗I期臨床實(shí)驗(yàn)，少數(shù)疫苗已完成或正在進(jìn)行n期臨床實(shí)驗(yàn)。但目前尚無在臨床實(shí)驗(yàn)中顯示能提供確切保護(hù)作用的疫苗，已完成的兩個艾滋病疫苗III期臨床實(shí)驗(yàn)均宣告失敗。另外，通過直接干擾病毒基因表達(dá)的技術(shù)也能夠抑制病毒的復(fù)制。例如，PCT申請WO2004070002A公開了多種可供干擾的病毒基因耙位。干擾病毒基因靶位的技術(shù)有許多，其中近些年來發(fā)展起來的RNA干涉(RNAi)技術(shù)己經(jīng)有報道開始應(yīng)用于治療或預(yù)防諸如HBV、HCV、HIV等病毒的感染中了。例如，美國專利申請US20060293271A、US20060292691A、US20060275903A公開了大量能介導(dǎo)RNA干涉病毒靶核酸的序列。然而，至今還沒有報道單獨(dú)利用這種RNA干涉技術(shù)來成功地預(yù)防或治療病毒感染。還有，對于HIV，人們也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了通過HIV的gp41上的七肽重復(fù)(HR)區(qū)域(如HR1和HR2)來抑制病毒囊膜與細(xì)胞膜的融合，阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞，從而阻斷病毒侵染細(xì)胞(如參見美國專利US5464933A、US5656480A)。然而，不同HR部分及其組合構(gòu)成的融合蛋白阻斷病毒侵染細(xì)胞的效力是不同的，甚至有數(shù)量級水平的差異。盡管PCT申請WO2004029073A公開了可以用至少一個HR1和至少一個HR2構(gòu)成的融合蛋白，但是其中沒有提示包含HR1和至少兩個HR2的融合蛋白可以顯著提高阻斷病毒侵染細(xì)胞的效力。根據(jù)上述研究結(jié)果以及國內(nèi)外對免疫耐受性和免疫缺陷性病毒藥物尚未取得突破性進(jìn)展，并面臨嚴(yán)峻的社會需求和技術(shù)性挑戰(zhàn)的現(xiàn)狀，我們及時提出一種新的藥物研制策略，即組合(本文中也稱為"雞尾酒")式抗免疫耐受和免疫缺陷性病毒研制新策略，其要點(diǎn)是根據(jù)病毒感染的特征和機(jī)體的應(yīng)答特征，將多種抗病毒元件結(jié)合在一個藥物或用藥療程中。我們構(gòu)建的雞尾酒藥物經(jīng)證實(shí)比單一組份的疫苗有更大的免疫活性，并可在多個層面上抑制病毒的感染、復(fù)制以及造成的免疫損傷，尤其是組合使用抑制病毒復(fù)制、引發(fā)針對病毒的免疫應(yīng)答和/或阻斷病毒侵染細(xì)胞的藥物。另外，我們還優(yōu)化了各層面上所使用的藥物，提供了有效的抑制病毒復(fù)制的核酸、引發(fā)針對病毒的免疫應(yīng)答的疫苗、阻斷病毒侵染細(xì)胞的融合蛋白等藥物。
發(fā)明內(nèi)容在本發(fā)明中，本發(fā)明人提出了一種新的制備疫苗的策略。我們按照病毒侵染細(xì)胞的過程和造成的機(jī)體免疫反應(yīng)的特點(diǎn)，設(shè)計了針對病毒不同侵染階段的包含多個抗病毒元件的藥物。由它們的不同組合所構(gòu)建的雞尾酒藥物中的多種成分可在不同層面上治療或預(yù)防病毒感染，例如包含HR1和HR2的融合蛋白可以在病毒入侵細(xì)胞時進(jìn)行阻斷；針對病毒變異的特征設(shè)計的RNA干擾序列和序列庫可有效抑制病毒核酸復(fù)制和變異的機(jī)率；使用熱休克蛋白gp96作為免疫佐劑能增強(qiáng)免疫活性并活化抗病毒的天然免疫和適應(yīng)性免疫能力；從病毒抗原的多個變異序列中的保守序列設(shè)計具有廣泛交叉反應(yīng)活性的重組疫苗；采用重組DNA載體免疫和病毒載體免疫的方式能最有效的發(fā)揮抗病毒免疫作用。這種雞尾酒藥物具有單一成份的疫苗所不具備的整體優(yōu)勢。本發(fā)明的目的在于提供治療或預(yù)防病毒感染的方法及其中所用的藥物，例如提供治療或預(yù)防肝炎病毒或免疫缺陷病毒感染的方法以及其中所用的核酸、疫苗、融合蛋白、載體或細(xì)胞等。具體而言，在第一個方面，本發(fā)明提供了治療病毒感染的方法，其包括，a)給藥抑制病毒復(fù)制的核酸，通過RNA干涉來抑制病毒復(fù)制，所述核酸包含編碼RNA干涉序列的核酸序列；和b)給藥引發(fā)針對病毒的免疫應(yīng)答的疫苗，由此清除病毒，所述疫苗包含病毒抗原、病毒抗原表位或編碼其的核酸序列。本發(fā)明可以在兩個層次上消除病毒感染給藥抑制病毒復(fù)制的核酸，通過RNA干涉的機(jī)理來減少病毒的數(shù)量；給藥疫苗，通過機(jī)體免疫系統(tǒng)來清除病毒。給藥可通過所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方式來進(jìn)行給藥，例如胃腸道外給藥、口服、直腸、舌下、肺部、透皮、離子透入、陰道及鼻內(nèi)給藥。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選胃腸道外給藥，如皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射。給藥劑量根據(jù)制劑形式和期望的作用時間以及治療對象的情況而有所變化，實(shí)際治療所需的量可以由醫(yī)師根據(jù)實(shí)際情況(如，病人的病情、體重等)而方便地確定。對于一般的成人，給藥的劑量可以是每kg成人體重lng-10g。對于注射給藥模式來說，優(yōu)選的劑量是每kg體重100ngii-lOmg，更優(yōu)選的是每kg體重l嗎-lmg，最優(yōu)選的是每kg體重IO嗎-IOO嗎。在本發(fā)明的第一個方面，不同的藥物可以同時或按順序給藥。同時給藥指在同一時間向受試者給藥各種不同藥物。按順序給藥指向依次給藥各種不同藥物，給藥不同藥物之間有時間間隔。例如，在給藥核酸后約3個月、約2個月、約1個月、約2周、約1周、約3天、約2天、約l天、約12小時、約6小時、約3小時或約0.5小時再給藥疫苗；反之亦然。本發(fā)明的方法可以治療病毒的感染，尤其是治療具有免疫耐受性的病毒的感染，優(yōu)選治療肝炎病毒，例如是HBV、HCV;也優(yōu)選治療免疫缺陷病毒，例如HIV-1。特別對于治療免疫缺陷病毒，本發(fā)明的方法可以進(jìn)一步包括給藥阻斷病毒侵染細(xì)胞的融合蛋白來阻斷病毒侵染細(xì)胞，所述融合蛋白包含HR1和至少兩個HR2。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式中，本發(fā)明特別構(gòu)建了不同串聯(lián)形式的包含HR1和HR2的融合蛋白，其中以順序包含HR1、HR2和HR1的融合蛋白被稱為HR121，其中以順序包含HR2、HR1和HR2的融合蛋白被稱為HR212，其中以順序包含HR1、HR2、HR1、HR2和HR1的融合蛋白被稱為HR12121。結(jié)果表明HR2所占比重較高的HR12121和HR212阻斷病毒侵染的能力比HR121更高，尤其是HR2所占比重最高的HR212，其擁有最高的阻斷病毒侵染的能力。因此，優(yōu)選的融合蛋白如HR2-L1-HR1-L2-HR2，HR2-L1-HR2-L2-HR1和HR1-L1-HR2-L2-HR2，所示，其中Ll和L2分別獨(dú)立地為接頭肽。最優(yōu)選的融合蛋白如SeqlDNo:78所示。在本文中，接頭肽是起連接融合蛋白中各活性成分的不超過20個氨基酸殘基大小的肽，其本身并不具有融合蛋白中各活性成分的作用。優(yōu)選接頭肽不超過IO個氨基酸殘基大小。本發(fā)明可使用接頭肽連接在本發(fā)明中的各活性成分(如，HR1、HR2)之間，也可以不使用連接肽而讓上述活性成分連接。例如，本領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的接頭肽的序列有(1)、Alan,n=2-10(2)、Glyn,n=2-10;(3)、Glyn—Ser，n=2-10(4)、(Glyn-Ser)m，m=2-3;n=2-10(5)、Glyn-Ser-Glym，m=0-10;n=0-10(6)、Glyn-Pro-Glym，m=0-10;n=0-10(7)、(Ala-Gly)n,n=l~10;(8)、(Gly-Ala)n,n=l10;(9)、Glyn-Ala-Glym，m=0-10;n=0-10(10)、Alan-Gly-Alam，m=0-10;n=0-10(11)、上述序列的任意組合形式。在本文中，HR1和HR2是公知的囊膜病毒(HIV)的七肽重復(fù)區(qū)域的氨基酸序列。HRl的示例序列有SGIVQQQNNLLRA正AQQHLLQLTVWGIKQLQAR以及該序列插入、缺失或取代一個或幾個氨基酸(優(yōu)選一個至三個)殘基而得的、并保留該序列活性的氨基酸序列；HR2的示例序列有WMEWDREINNYTSLIHSL正ESQNQQEKNEQELL及該序列插入、缺失或取代一個或幾個氨基酸(優(yōu)選一個至三個)殘基而得的、并保留該序列活性的氨基酸序列。除了直接給藥融合蛋白，給藥阻斷病毒侵染細(xì)胞的融合蛋白也包括給藥能夠表達(dá)或產(chǎn)生該融合蛋白的核酸或表達(dá)載體或細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物，由此間接給藥融合蛋白。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式中，我們構(gòu)建了能夠表達(dá)HR212的載體pcDNA3.0-tPA-HR212和pSecTag2B-HR212，將這些載體分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，通過使用細(xì)胞培養(yǎng)上清來發(fā)揮HR212的作用。因此，本發(fā)明也包括編碼前述融合蛋白的核酸，優(yōu)選其核苷酸序列如SeqIDNo:79所示。在本文中，抑制病毒復(fù)制的核酸優(yōu)選包含編碼RNA干涉序列的單鏈正義核酸序列及其反義序列，所述正義核酸序列及其反義序列通過接頭核酸相連。接頭核酸是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，其能彎曲使得所述核酸序列與其反義序列配對結(jié)合形成雙鏈核酸，從而能夠通過RNA干涉的機(jī)制來抑制病毒復(fù)制，減少病毒數(shù)量。對于HBV、HCV和HIV來說，所述核酸中編碼RNA干涉序列的核酸序列優(yōu)選是衍生自乙型肝炎病毒的X抗原、S抗原、核心蛋白C或聚合酶P的RNA干涉序列的核酸序列，或是衍生自丙型肝炎病毒的5'UTR的RNA干涉序列的核酸序列，或是衍生自人免疫缺陷病毒的tat基因的RNA干涉序列的核酸序列。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，我們開發(fā)的最優(yōu)選的編碼RNA干涉序列的核酸序列如SeqIDNo:62-67、68和71之任一所示。由此構(gòu)成的最優(yōu)選的抑制病毒復(fù)制的核酸的核酸序列如SeqIDNo:20-21、22和23之任一所示。通過疫苗來清除病毒對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。在本文中，為了更有效地引發(fā)并保持免疫應(yīng)答，弓I發(fā)針對病毒的免疫應(yīng)答的疫苗優(yōu)選包含病毒抗原、病毒抗原表位或編碼其的核酸序列，并包含非特異性免疫刺激蛋白或編碼其的核酸序列。本發(fā)明中的疫苗優(yōu)選是DNA疫苗，即在DNA載體上克隆有編碼病毒抗原或病毒抗原表位的核酸序列，并克隆有編碼非特異性免疫刺激蛋白的核酸序列。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，優(yōu)選的DNA載體是pcDNA3.0載體。在另一方面，本發(fā)明中的疫苗優(yōu)選是重組病毒疫苗，更優(yōu)選是重組痘苗病毒疫苗，即在痘苗病毒上克隆有編碼病毒抗原或病毒抗原表位的核酸序列，并克隆有編碼非特異性免疫刺激蛋白的核酸序列。對于HBV、HCV和HIV來說，所述病毒抗原或病毒抗原表位優(yōu)選選自乙型肝炎病毒的核心抗原、膜抗原、T細(xì)胞表位，或選自丙型肝炎病毒的衣殼蛋白core、El、E2，或選自人免疫缺陷病毒的結(jié)構(gòu)抗原。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，我們開發(fā)的最優(yōu)選的病毒抗原或病毒抗原表位選自如SeqlDNo:4-6、72-76、58、69、70、59-61所示的序列或其編碼序列。非特異性免疫刺激蛋白優(yōu)選選自IFN、gp96、MHC-1類分子、(32-微球蛋白。最特別地，本發(fā)明尤其優(yōu)選編碼包含病毒抗原表位、和MHC-1類分子、P2-微球蛋白的單鏈三聚體(本文中簡稱為SCT)融合蛋白的DNA疫苗，即DNA載體(優(yōu)選是pcDNA3.0載體)上依次克隆有編碼病毒抗原表位、MHC-1類分子、(32-微球蛋白的核酸序列，其中病毒抗原表位、MHC-1類分子、(32-微球蛋白的核酸序列之間連接有編碼本文所述接頭肽的核酸序列。特別優(yōu)選該DNA疫苗中的單鏈三聚體序列如本申請的具體實(shí)施方式中所記載的。優(yōu)選本發(fā)明第一個方面的方法中還包括在給藥抑制病毒復(fù)制的核酸和給藥引發(fā)針對病毒的免疫應(yīng)答的疫苗之后，還包括給藥非特異性免疫刺激蛋白(如干擾素)來強(qiáng)化免疫。非特異性免疫刺激蛋白可以是直接給藥的，也可以是給藥能夠表達(dá)或產(chǎn)生該蛋白的核酸或表達(dá)載體或細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物，由此間接給藥蛋白。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式中，最后還給藥了表達(dá)干擾素的痘苗病毒。在第二個方面，本發(fā)明提供了抑制病毒復(fù)制的核酸和引發(fā)針對病毒的免疫應(yīng)答的疫苗的組合在制備治療或預(yù)防病毒感染的藥物中的應(yīng)用，其中所述核酸包含編碼RNA干涉序列的核酸序列，所述疫苗包含病毒抗原、病毒抗原表位或編碼其的核酸序列。制備組合(雞尾酒)藥物可以將各種不同的藥物混合在一起制成藥物組合物，也可以將它們分別獨(dú)立包裝然后裝在同一個藥劑盒中，或者結(jié)合上述兩種方式，將部分不同的藥物混合在一起并將部分藥物獨(dú)立包裝，然后將它們都裝在同一個藥劑盒中。本發(fā)明的應(yīng)用可以預(yù)防或治療病毒的感染，尤其是預(yù)防或治療具有免疫耐受性的病毒的感染，優(yōu)選預(yù)防或治療肝炎病毒，例如是HBV、HCV;也優(yōu)選預(yù)防或治療免疫缺陷病毒，例如HIV-1。特別對于預(yù)防或治療免疫缺陷病毒，本發(fā)明的應(yīng)用中，組合中可進(jìn)一步包括阻斷病毒侵染細(xì)胞的融合蛋白，所述融合蛋白包含HR1和至少兩個HR2。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式中，HR2所占比重較高的HR12121和HR212阻斷病毒侵染的能力比HR121更高，尤其是HR2所占比重最高的HR212，其擁有最高的阻斷病毒侵染的能力。因此，優(yōu)選的融合蛋白如HR2-L1-HR1-L2-HR2所示，其中L1和L2分別獨(dú)立地為接頭肽。最優(yōu)選的融合蛋白如S叫IDNo:78所示。除了直接將融合蛋白制成藥物，阻斷病毒侵染細(xì)胞的融合蛋白也包括能夠表達(dá)或產(chǎn)生該融合蛋白的核酸或表達(dá)載體或細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物，由此這些產(chǎn)品進(jìn)入機(jī)體內(nèi)可以間接給藥融合蛋白。因此，本發(fā)明也包括編碼前述融合蛋白的核酸，優(yōu)選其核苷酸序列如SeqIDNo:79所示;另外本發(fā)明也包括包含編碼前述融合蛋白的核酸的載體或細(xì)胞。抑制病毒復(fù)制的核酸優(yōu)選包含編碼RNA干涉序列的單鏈正義核酸序列及其反義序列，所述正義核酸序列及其反義序列通過接頭核酸相連。接頭核酸是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，其能彎曲使得所述核酸序列與其反義序列配對結(jié)合形成雙鏈核酸，從而能夠通過RNA干涉的機(jī)制來抑制病毒復(fù)制，減少病毒數(shù)量。對于HBV、HCV和HIV來說，所述核酸中編碼RNA干涉序列的核酸序列優(yōu)選是衍生自乙型肝炎病毒的X抗原、S抗原、核心蛋白C或聚合酶P的RNA干涉序列的核酸序列，或是衍生自丙型肝炎病毒的5，UTR的RNA干涉序列的核酸序列，或是衍生自人免疫缺陷病毒的tat基因的RNA干涉序列的核酸序列。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，我們開發(fā)的最優(yōu)選的編碼RNA干涉序列的核酸序列如SeqIDNo:62-67、68和71之任一所示。由此構(gòu)成的最優(yōu)選的抑制病毒復(fù)制的核酸的核酸序列如SeqlDNo:20陽21、22和23之任一所示。為了更有效地引發(fā)并保持免疫應(yīng)答，引發(fā)針對病毒的免疫應(yīng)答的疫苗優(yōu)選包含病毒抗原、病毒抗原表位或編碼其的核酸序列，并包含非特異性免疫刺激蛋白或編碼其的核酸序列。本發(fā)明中的疫苗優(yōu)選是DNA疫苗，即在DNA載體上克隆有編碼病毒抗原或病毒抗原表位的核酸序列，并克隆有編碼非特異性免疫刺激蛋白的核酸序列。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，優(yōu)選的DNA載體是pcDNA3.0載體。在另一方面，本發(fā)明中的疫苗優(yōu)選是重組病毒疫苗，更優(yōu)選是重組痘苗病毒疫苗，即在痘苗病毒上克隆有編碼病毒抗原或病毒抗原表位的核酸序列，并克隆有編碼非特異性免疫刺激蛋白的核酸序列。對于HBV、HCV和HIV來說，所述病毒抗原或病毒抗原表位優(yōu)選選自乙型肝炎病毒的核心抗原、膜抗原、T細(xì)胞表位，或選自丙型肝炎病毒的衣殼蛋白core、El、E2，或選自人免疫缺陷病毒的結(jié)構(gòu)抗原。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，我們開發(fā)的最優(yōu)選的病毒抗原或病毒抗原表位選自如S叫IDNo:4-6、72-76、58、69、70、59-61所示的序列或其編碼序列。非特異性免疫刺激蛋白優(yōu)選選自IFN、gp96、MHC-1類分子、P2-微球蛋白。最特別地，本發(fā)明尤其優(yōu)選編碼包含病毒抗原表位、和MHC-1類分子、卩2-微球蛋白的單鏈三聚體(本文中簡稱為SCT)融合蛋白的DNA疫苗，即DNA載體(優(yōu)選是pcDNA3.0載體)上依次克隆有編碼病毒抗原表位、MHC-1類分子、|32-微球蛋白的核酸序列，其中病毒抗原表位、MHC-1類分子、|32-微球蛋白的核酸序列之間連接有編碼本文所述接頭肽的核酸序列。特別優(yōu)選該DNA疫苗中的單鏈三聚體序列如本申請的具體實(shí)施方式中所記載的。另外，本發(fā)明第二個方面的應(yīng)用中的組合還包括給藥非特異性免疫刺激蛋白(如干擾素)。通過這種非特異性免疫刺激蛋白可以強(qiáng)化免疫。非特異性免疫刺激蛋白可以是直接制成藥物，也可以是將能夠表達(dá)或產(chǎn)生該蛋白的核酸或表達(dá)載體或細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物制成藥物。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式中，治療中還包括了表達(dá)干擾素的痘苗病毒。在第三個方面，本發(fā)明提供了一種治療病毒感染的藥物組合物，其包括抑制病毒復(fù)制的核酸和引發(fā)針對病毒的免疫應(yīng)答的疫苗，其中所述核酸包含編碼RNA干涉序列的核酸序列，所述疫苗包含病毒抗原、病毒抗原表位或編碼其的核酸序列。對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，已經(jīng)有很多公知的方法能將核酸、多肽或疫苗等活性成分與藥學(xué)上可接受的載體制備成藥物組合物。本文中使用的藥學(xué)上可接受的載體指無毒的填充劑、稀釋劑、佐劑或其他制劑輔料。根據(jù)本領(lǐng)域的公知技術(shù)，可以根據(jù)治療目的、給藥途徑的需要將藥物組合物制成各種劑型，優(yōu)選該組合物為單位劑量形式，如片劑、膠囊、粉劑、乳液劑、注射劑、噴霧劑型或作為詞料添加劑的劑型。優(yōu)選本發(fā)明的藥物組合物為注射劑型。這些組合物包含不同緩沖液內(nèi)容(如磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液)、相應(yīng)的離子強(qiáng)度和pH值，以及其它物質(zhì)(如聚乳酸、甘露醇等)。在第四個方面，本發(fā)明提供了一種治療病毒感染的藥品，其包括，a)裝有抑制病毒復(fù)制的核酸的容器，所述核酸包含編碼RNA干涉序列的核酸序列；和b)裝有引發(fā)針對病毒的免疫應(yīng)答的疫苗的容器，所述疫苗包含病毒抗原、病毒抗原表位或編碼其的核酸序列。藥品對于大眾來說都是一種常見的產(chǎn)品。其中，容器可以是瓶、盒、注射器等能容納核酸、多肽、蛋白質(zhì)、疫苗或其藥物組合物、藥物制劑等的常用容器。藥品可以只包括一個容器，如可以將抑制病毒復(fù)制的核酸和引發(fā)針對病毒的免疫應(yīng)答的疫苗裝載同一個容器中；也可以包括多個容器，分別裝有不同核酸、多肽、蛋白質(zhì)、疫苗或其藥物組合物、藥物制劑等產(chǎn)品。通常，藥品包括標(biāo)簽。標(biāo)簽可以貼在上述容器上，或者直接打印到上述容器上，也可以以獨(dú)立的形式存在，如作為能裝上述容器的藥盒或直接提供的說明書。標(biāo)簽指示給藥的方法，如本發(fā)明第一方面的方法，其中可以包括給藥次序、時間、劑量、給藥方式等內(nèi)容。根據(jù)需要，如方便運(yùn)輸、存放，藥品可以進(jìn)一步包裝進(jìn)更大的包裝中，這也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。優(yōu)選在本發(fā)明的第三個方面或第四個方面中，對于用于治療免疫缺陷病毒的藥物組合物或藥品，其可進(jìn)一步包括阻斷病毒侵染細(xì)胞的融合蛋白或裝有該融合蛋白的容器，所述融合蛋白包含HR1和至少兩個HR2。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式中，HR2所占比重較高的HR12121和HR212阻斷病毒侵染的能力比HR121更高，尤其是HR2所占比重最高的HR212，其擁有最高的阻斷病毒侵染的能力。因此，優(yōu)選的融合蛋白如,丄1-HR1-L2-HR2所示，其中Ll和L2分別獨(dú)立地為接頭肽。最優(yōu)選的融合蛋白如SeqlDNo:78所示。除了直接將融合蛋白制成藥物，阻斷病毒侵染細(xì)胞的融合蛋白也包括能夠表達(dá)或產(chǎn)生該融合蛋白的核酸或表達(dá)載體或細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物，由此這些產(chǎn)品進(jìn)入機(jī)體內(nèi)可以間接給藥融合蛋白。因此，本發(fā)明的藥物組合物或藥品也包括編碼前述融合蛋白的核酸，優(yōu)選其核苷酸序列如SeqlDNo:79所示；另外本發(fā)明的藥物組合物或藥品也包括包含編碼前述融合蛋白的核酸的載體或細(xì)胞。在藥物組合物或藥品中，抑制病毒復(fù)制的核酸優(yōu)選包含編碼RNA干涉序列的單鏈正義核酸序列及其反義序列，所述正義核酸序列及其反義序列通過接頭核酸相連。接頭核酸是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，其能彎曲使得所述核酸序列與其反義序列配對結(jié)合形成雙鏈核酸，從而能夠通過RNA干涉的機(jī)制來抑制病毒復(fù)制，減少病毒數(shù)量。所述核酸中編碼RNA干涉序列的核酸序列優(yōu)選是衍生自乙型肝炎病毒的X抗原、S抗原、核心蛋白C或聚合酶P的RNA干涉序列的核酸序列，或是衍生自丙型肝炎病毒的5'UTR的RNA干涉序列的核酸序列，或是衍生自人免疫缺陷病毒的tat基因的RNA干涉序列的核酸序列。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，我們開發(fā)的最優(yōu)選的編碼RNA干涉序列的核酸序列如SeqIDNo:62-67、68和71之任一所示。由此構(gòu)成的最優(yōu)選的抑制病毒復(fù)制的核酸的核酸序列如SeqIDNo:20-21、22和23之任一所示。為了更有效地引發(fā)并保持免疫應(yīng)答，在藥物組合物或藥品中，引發(fā)針對病毒的免疫應(yīng)答的疫苗優(yōu)選包含病毒抗原、病毒抗原表位或編碼其的核酸序列，并包含非特異性免疫刺激蛋白或編碼其的核酸序列。本發(fā)明中的疫苗優(yōu)選是DNA疫苗，即在DNA載體上克隆有編碼病毒抗原或病毒抗原表位的核酸序列，并克隆有編碼非特異性免疫刺激蛋白的核酸序列。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，優(yōu)選的DNA載體是pcDNA3.0載體。在另一方面，本發(fā)明中的疫苗優(yōu)選是重組病毒疫苗，更優(yōu)選是重組痘苗病毒疫苗，即在痘苗病毒上克隆有編碼病毒抗原或病毒抗原表位的核酸序列，并克隆有編碼非特異性免疫刺激蛋白的核酸序列。所述病毒抗原或病毒抗原表位優(yōu)選選自乙型肝炎病毒的核心抗原、膜抗原、T細(xì)胞表位，或選自丙型肝炎病毒的衣殼蛋白core、El、E2，或選自人免疫缺陷病毒的結(jié)構(gòu)抗原。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，我們開發(fā)的最優(yōu)選的病毒抗原或病毒抗原表位選自如SeqlDNo:4-6、72-76、58、69、70、59-61所示的序列或其編碼序列。非特異性免疫刺激蛋白優(yōu)選選自IFN、gp96、MHC-1類分子、卩2-微球蛋白。最特別地，本發(fā)明尤其優(yōu)選編碼包含病毒抗原表位、和MHC-1類分子、{32-微球蛋白的單鏈三聚體(本文中簡稱為SCT)融合蛋白的DNA疫苗，即DNA載體(優(yōu)選是pcDNA3.0載體)上依次克隆有編碼病毒抗原表位、MHC-1類分子、p2-微球蛋白的核酸序列，其中病毒抗原表位、MHC-1類分子、p2-微球蛋白的核酸序列之間連接有編碼本文所述接頭肽的核酸序列。特別優(yōu)選該DNA疫苗中的單鏈三聚體序列如本申請的具體實(shí)施方式中所記載的。另外，本發(fā)明第三個方面的藥物組合物還包括非特異性免疫刺激蛋白(如干擾素)；本發(fā)明第四個方面的藥物組合物還包括裝有非特異性免疫刺激蛋白(如干擾素)的容器。通過這種非特異性免疫刺激蛋白可以強(qiáng)化免疫。非特異性免疫刺激蛋白可以是直接制成藥物組合物或藥品，也可以是將能夠表達(dá)或產(chǎn)生該蛋白的核酸或表達(dá)載體或細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物制成藥物或藥品。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式中，治療的藥品中還包括了表達(dá)干擾素的痘苗病毒。在第五個方面，本發(fā)明提供了一種抑制病毒復(fù)制的核酸，其包含編碼RNA干涉序列的單鏈正義核酸序列及其反義序列，所述正義核酸序列及其反義序列通過接頭核酸相連。接頭核酸是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，其能彎曲使得所述核酸序列與其反義序列配對結(jié)合形成雙鏈核酸，從而能夠通過RNA干涉的機(jī)制來抑制病毒復(fù)制，減少病毒數(shù)量。對于HBV、HCV和HIV來說，所述核酸中編碼RNA干涉序列的核酸序列優(yōu)選是衍生自乙型肝炎病毒的X抗原、S抗原、核心蛋白C或聚合酶P的RNA干涉序列的核酸序列，或是衍生自丙型肝炎病毒的5'UTR的RNA干涉序列的核酸序列，或是衍生自人免疫缺陷病毒的tat基因的RNA干涉序列的核酸序列。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，我們開發(fā)的最優(yōu)選的編碼RNA干涉序列的核酸序列如SeqIDNo:62-67、68和71之任一所示。由此構(gòu)成的最優(yōu)選的抑制病毒復(fù)制的核酸的核酸序列如SeqlDNo:20-21、22和23之任一所示。在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供了包含第五個方面的抑制病毒復(fù)制的核酸的載體。合適的載體例如有在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中所用的腺病毒載體。在本文中，這種載體可以替換相應(yīng)的抑制病毒復(fù)制的核酸來使用。在第六個方面，本發(fā)明提供了一種引發(fā)針對病毒的免疫應(yīng)答的疫苗，其包含病毒抗原、病毒抗原表位或編碼其的核酸序列，并包含非特異性免疫刺激蛋白或編碼其的核酸序列。本發(fā)明中的疫苗優(yōu)選是DNA疫苗，即在DNA載體上克隆有編碼病毒抗原或病毒抗原表位的核酸序列，并克隆有編碼非特異性免疫刺激蛋白的核酸序列。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，優(yōu)選的DNA載體是pcDNA3.0載體。在另一方面，本發(fā)明中的疫苗優(yōu)選是重組病毒疫苗，更優(yōu)選是重組痘苗病毒疫苗，即在痘苗病毒上克隆有編碼病毒抗原或病毒抗原表位的核酸序列，并克隆有編碼非特異性免疫刺激蛋白的核酸序列。所述病毒抗原或病毒抗原表位優(yōu)選選自乙型肝炎病毒的核心抗原、膜抗原、T細(xì)胞表位，或選自丙型肝炎病毒的衣殼蛋白core、El、E2，或選自人免疫缺陷病毒的結(jié)構(gòu)抗原。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，我們開發(fā)的最優(yōu)選的病毒抗原或病毒抗原表位選自如S叫IDNo:4-6、72-76、58、69、70、59-61所示的序列或其編碼序列。非特異性免疫刺激蛋白優(yōu)選選自IFN、gp96、MHC-1類分子、j32-微球蛋白。最特別地，本發(fā)明尤其優(yōu)選編碼包含病毒抗原表位、和MHC-1類分子、P2-微球蛋白的單鏈三聚體(本文中簡稱為SCT)融合蛋白的DNA疫苗，即DNA載體(優(yōu)選是pcDNA3.0載體)上依次克隆有編碼病毒抗原表位、MHC-1類分子、卩2-微球蛋白的核酸序列，其中病毒抗原表位、MHC-1類分子、卩2-微球蛋白的核酸序列之間連接有編碼本文所述接頭肽的核酸序列。特別優(yōu)選該DNA疫苗中的單鏈三聚體序列如本申請的具體實(shí)施方式中所記載的。在第七個方面，本發(fā)明提供了一種阻斷HIV侵染細(xì)胞的融合蛋白，其包含HR1和至少兩個HR2。通過本發(fā)明的研究，在構(gòu)建了的不同串聯(lián)形式的包含HR1和HR2的融合蛋白中，以順序包含HR1、HR2和HR1的融合蛋白被稱為HR121，其中以順序包含HR2、HR1和HR2的融合蛋白被稱為HR212，其中以順序包含HR1、HR2、HR1、HR2和HR1的融合蛋白被稱為HR12121,其中HR2所占比重較高的HR12121和HR212阻斷病毒侵染的能力比HR121更高，尤其是HR2所占比重最高的HR212，其擁有最高的阻斷病毒侵染的能力。因此，優(yōu)選的融合蛋白如HR2-L1-HR1-L2-HR2所示，其中Ll和L2分別獨(dú)立地為接頭肽。最優(yōu)選的融合蛋白如SeqlDNo:78所示。盡管并不優(yōu)選，但是如SeqIDNo:82所示的HR12121也包括在本發(fā)明的該方面中。在本文中，接頭肽是起連接融合蛋白中各活性成分的不超過20個氨基酸殘基大小的肽，其本身并不具有融合蛋白中各活性成分的作用。優(yōu)選接頭肽不超過IO個氨基酸殘基大小。本發(fā)明可使用接頭肽連接在本發(fā)明中的各活性成分(如，HR1、HR2)之間，也可以不使用連接肽而讓上述活性成分連接。例如，本領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的接頭肽的序列有(1)、Alan,n=2-10(2)、Glyn,n=2-10;(3)、Glyn—Ser，n=2-10(4)、(Glyn-Ser)m，m=2-3;n=2-10(5)、Glyn-Ser-Glym，m=0-10;n=0-10(6)、Glyn-Pro-Glym，m=0-10;n=0-10(7)、(Ala-Gly)n，n=l~10;(8)、(Gly-Ala)n,n=l~10;(9)、Glyn-Ala-Glym，m=0-10;n=0-10(10)、Alan-Gly-Alam，m=0-10;n=0-10(11)、上述序列的任意組合形式。在本文中，HR1和HR2是公知的囊膜病毒(HIV)的七肽重復(fù)區(qū)域的氨基酸序列。HR1的示例序列有SGIVQQQ麗LLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQAR以及該序列插入、缺失或取代一個或幾個氨基酸(優(yōu)選一個至三個)殘基而得的、并保留該序列活性的氨基酸序列；HR2的示例序列有WMEWDREINNYTSLIHSL正ESQNQQEKNEQELL及該序列插入、缺失或取代一個或幾個氨基酸(優(yōu)選一個至三個)殘基而得的、并保留該序列活性的氨基酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，通過改變已知多肽的編碼基因序列并將其導(dǎo)入表達(dá)載體，可以制備出取代、插入或添加了氨基酸殘基的多肽，這些方法廣泛記載于《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(北京科學(xué)出版社，2002年)等本領(lǐng)域公知的文獻(xiàn)中。在變異的氨基酸殘基中，優(yōu)選變異為與原氨基酸殘基側(cè)鏈性質(zhì)相似的其他氨基酸，從而更得以保持原有功能活性。側(cè)鏈性質(zhì)相似的氨基酸分別有疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、親水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、脂肪族側(cè)鏈的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、含羥基側(cè)鏈的氨基酸(S、T、Y)、含硫原子側(cè)鏈的氨基酸(C、M)、含羧酸和酰胺側(cè)鏈的氨基酸(D、N、E、Q)、含堿性基團(tuán)側(cè)鏈的氨基酸(R、K、H)、含芳香族側(cè)鏈的氨基酸(H、F、Y、W)。除了直接給藥融合蛋白，給藥阻斷病毒侵染細(xì)胞的融合蛋白也包括給藥能夠表達(dá)或產(chǎn)生該融合蛋白的核酸或表達(dá)載體或細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物，由此間接給藥融合蛋白。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式中，我們構(gòu)建了能夠表達(dá)HR212的載體pcDNA3.04PA-HR212和pSecTag2B-HR212，將這些載體分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，通過使用細(xì)胞培養(yǎng)上清來發(fā)揮HR212的作用。因此，在另一個方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明第七個方面所述的融合蛋白的核酸，一種包含該核酸的載體，以及一種細(xì)胞，其包含該載體，或轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化有該核酸。其中，特別優(yōu)選的核酸是核苷酸序列如SeqIDNo:79所示的核酸。在另一方面，由于前述多個方面中的核酸可以以載體的形式存在，因此本發(fā)明提供了一種載體，其包含前述多個方面之任一所述的核酸。載體在本文中是指本領(lǐng)域中常用的細(xì)菌質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、動物病毒及其它各種病毒載體。本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細(xì)菌中表達(dá)用的載體(原核表達(dá)載體)、在酵母中表達(dá)用的載體(如畢赤酵母載體、漢遜酵母載體等)、在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的桿狀病毒載體、在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)用的載體(痘苗病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴病毒載體等)、在植物中表達(dá)用的植物病毒載體以及在哺乳動物乳腺中表達(dá)用的各種載體。總之，只要能在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定復(fù)制，任何質(zhì)粒和載體都可使用。優(yōu)選表達(dá)載體包含選擇標(biāo)記基因，如細(xì)菌的氨芐青霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因、卡那霉素抗性基因、鏈霉素抗性基因、氯霉素抗性基因；酵母菌的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因，酵母菌的缺陷選擇標(biāo)志，如His,Leu,Trp等；真核細(xì)胞的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因、二氫葉酸還原酶基因及熒光蛋白標(biāo)記基因等。本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用DNA重組技術(shù)等一系列技術(shù)，構(gòu)建含本發(fā)明所述編碼融合蛋白的DNA序列、合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列、啟動子及選擇性標(biāo)記基因等特定元件的表達(dá)載體。上述載體可用來轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染合適的宿主細(xì)胞，以便獲得所需要的融合蛋白。在另一方面，本發(fā)明還提供了一種細(xì)胞，其包含前述多個方面之任一所述的載體，或轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化有前述多個方面之任一所述的核酸。細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，也可以是真核細(xì)胞，如，細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞等。宿主細(xì)胞在轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染含本發(fā)明所述編碼融合蛋白的基因序列后，即構(gòu)成工程化細(xì)胞或細(xì)胞株，可用于生產(chǎn)所需融合蛋白，或?qū)⒃撃芴峁┫鄳?yīng)融合蛋白的細(xì)胞直接用于給藥。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠恰當(dāng)?shù)剡x擇適當(dāng)?shù)妮d體、宿主細(xì)胞，并熟知如何將載體高效地轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中，所用方法包括但不限于氯化鈣法、電穿孔法用于細(xì)菌細(xì)胞，電穿孔法和原生質(zhì)體融合法用于酵母細(xì)胞，脂質(zhì)體包裹、磷酸鈣共沉淀、電融合法以及顯微注射法用于哺乳動物細(xì)胞等真核細(xì)胞。由于在前述多個方面中的產(chǎn)品也可以單獨(dú)使用，因此在另一方面，本發(fā)明還提供了治療病毒感染的方法，其包括給藥前述多個方面之任一所述的核酸、疫苗、融合蛋白、載體或細(xì)胞，優(yōu)選其中病毒是肝炎病毒或免疫缺陷病毒，優(yōu)選是HBV、HCV或HIV-1;本發(fā)明還提供了前述多個方面之任一所述的核酸、疫苗、融合蛋白、載體或細(xì)胞在制備治療或預(yù)防病毒感染的藥物中的應(yīng)用，優(yōu)選其中病毒是肝炎病毒或免疫缺陷病毒，優(yōu)選是HBV、HCV或HIV-1。另外，本發(fā)明還提供了用于治療病毒感染的藥物組合物，其包括前述多個方面之任一所述的核酸、疫苗、融合蛋白、載體或細(xì)胞；本發(fā)明還提供了用于治療或預(yù)防病毒感染的藥品，其包括裝有前述多個方面之任一所述的核酸、疫苗、融合蛋白、載體或細(xì)胞的容器。為了便于理解，以下將通過具體的附圖、實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說明書的論述，本發(fā)明的許多變化、改變對所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見的。另外，本發(fā)明引用了公開文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本文進(jìn)行參考，就好像它們的全文已經(jīng)在本文中重復(fù)敘述過一樣。圖1:本發(fā)明的組合式抗免疫耐受和免疫缺陷性病毒研制新策略多載體雞尾酒疫苗的載體的治療策略。其中組分I是攜帶單個或多個RNA干涉元件的腺病毒載體，也可以是攜帶多種RNA干涉元件的多種腺病毒的組合(如，其中A、B、C、D表示不同的RNA干涉元件)；組分I可以單獨(dú)給藥，或可以是組合治療劑中的一種組分。組分II是DNA載體，其攜帶病毒的結(jié)構(gòu)抗原基因、或由結(jié)構(gòu)抗原與非特異性免疫刺激蛋白融合的核酸、或由多個或單個表位與非特異性免疫刺激蛋白融合的核酸；組分II可以單獨(dú)給藥，或可以是組合治療劑中的一種組分。組分m包括細(xì)胞因子編碼序列并任選帶有組分II基因，其中A、B、C、D分別表示組分m所攜帶的不同元件；組分m可以單獨(dú)給藥，或可以是組合治療劑中的一種組分。圖2:攜帶RNA干涉元件的重組腺病毒載體。其中，A:細(xì)胞內(nèi)形成的針對HBV的siRNA的DNA模板。它們是根據(jù)HBV的序列設(shè)計出互補(bǔ)的sense和antisenseoligos，退火可形成雙鏈。為方便與Sall/Xbal消化載體pAVU6+27相連，在DNAoligos的5'末端加了Sall，3'端加了Xbal酶切位點(diǎn)，中間灰色部分為轉(zhuǎn)錄后預(yù)期形成的環(huán)結(jié)構(gòu)，為使翻譯有效終止，在末端設(shè)計了終止信號dT(5)。B:Northern雜交檢測HepG2.2.15細(xì)胞中HBVmRNA的水平提取HepG2.2.15細(xì)胞的RNA，以HBVDNA為探針進(jìn)行Northern雜交，并且以GAPDH作為內(nèi)對照。磷屏分析結(jié)果表明，與對照相比，轉(zhuǎn)染了siHBVl(Pl)或siHBV2(P2)重組腺病毒的2215細(xì)胞中，3.5Kb和2.4Kb24/2.1Kb的mRNA水平明顯減少。在對照組中，轉(zhuǎn)染了與HBV基因無關(guān)的重組病毒U6(mock)或siEGFP(針對EGFP的RNA干擾序列)(E)的細(xì)胞中，其mRNA水平與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(C)中的mRNA水平相當(dāng)，表明對照基因siEGFP不會影響HBVmRNA水平，顯示了siRNA作用的特異性。C代表未轉(zhuǎn)染的2215細(xì)胞；mock，E，Pl，P2分別代表轉(zhuǎn)染了含有U6+27，U6+27-s正GFP，U6+27-siHBVl，U6+27-siHBV2重組腺病毒的2215細(xì)胞。C:ELISA法檢測2215細(xì)胞中HBsAg和HBeAg的表達(dá)水平(與對照相比的百分比)取2215細(xì)胞的上清，用ELISA檢測試劑盒檢測細(xì)胞上清中的HBsAg、HBeAg水平。結(jié)果顯示與對照細(xì)胞(C)相比，轉(zhuǎn)染了siHBVl(Pl)或siHBV2(P2)重組腺病毒的細(xì)胞中HBsAg、HBeAg蛋白水平被明顯抑帝U。轉(zhuǎn)染了siHBVl重組病毒的細(xì)胞，其HBsAg下降了90.6士0.5%(P=0.00226)，HBeAg下降了88.4±0.9%(P=0.00011);轉(zhuǎn)染了siHBV2重組質(zhì)粒的細(xì)胞，其HBsAg下降了92.9±0.6%(P=0.00216)，HBeAg下降了89.7±1.0%(P=0.0001)，數(shù)據(jù)顯示HBsAg的下降幅度略大于HBeAg。表明此干擾系統(tǒng)對HBV基因抑制的效果很好。C代表未轉(zhuǎn)染的2215細(xì)胞；mock,E，Pl，P2分別代表轉(zhuǎn)染了含有U6+27，U6+27-siEGFP，U6+27-siHBVl，U6+27-siHBV2重組腺病毒的2215細(xì)胞。D:RealtimePCR檢測HBVDNA含量取2215細(xì)胞的上清，對其中的病毒DNA進(jìn)行realtimePCR分析。為定量HBVDNA的拷貝數(shù)，同時擴(kuò)增了已知濃度的并且經(jīng)過系列稀釋的t叩o-HBV質(zhì)粒，制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和測得的HBVDNA的Ct值計算出HBVDNA的拷貝數(shù)。結(jié)果表明，含有siHBVl(Pl)禾口siHBV2(P2)的腺病毒感染的細(xì)胞，其上清中的HBVDNA水平與對照(14.48士2.15xlO、叩ys/mL)相比分別下降了3.7倍(3,91士0.72xl()4copys/mL;P^.00821)和3.3倍(4,41士0.85x104copys/mL;P=0,00780)。圖3:攜帶結(jié)構(gòu)抗原的重組DNA載體。其中，A:融合基因的構(gòu)建體草圖。(A)融合基因構(gòu)建示意圖。基因在pcDNA3的CMV啟動子下。在融合基因中引入柔性的連接子"GGSGG"保證各基因的正確表達(dá)和維持正常功能。N355w代指鼠或人的gp96N端的355個氨基酸。(B)免疫印跡雜交分析。構(gòu)建的克隆經(jīng)磷酸鈣方法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，兩天后，收集細(xì)胞，細(xì)胞裂解物經(jīng)免疫沉淀后進(jìn)行檢測。HBcAg(SEQIDNO:4)，HBsAg(SEQIDNO:5)，N355(SEQIDNO:2,3)，CN355(HBV核心抗原與N355的融合基因)(SEQIDNO:7)，SN355m(HBV的表面抗原S與鼠gp96N端N355的融合基因)(SEQIDNO:8)，SN355h(是HBV的表面抗原S與人gp96N端N355的融合基因)(SEQIDNO:9)，S2S(SEQIDNO:6)，S2SN355(HBV的表面抗原S2S與gp96N端N355的融合基因)(SEQIDNO:10)和N355S2S(HBV的表面抗原S2S與gp96N端N355的融合基因)(SEQIDNO:ll)，等基因產(chǎn)物的分子量分別為17kDa，24kDa，45kDa，62kDa，69kDa，69kDa，31kDa，76kDa和76kDa。(a)抗小鼠的核心抗原單抗檢測截短的核心抗原及其與N355的融合產(chǎn)物。(b,c，d)抗小鼠的表面抗原單抗檢測乙肝膜抗原的S和M蛋白及其與N355的融合產(chǎn)物。非糖基化(小帶)和糖基化(大帶)的帶都能夠檢測出來。B:DNA免疫BALB/c鼠和HLA/A2轉(zhuǎn)基因鼠后體液免疫反應(yīng)的檢測。共免疫三次，每組5只鼠，每次肌肉注射100嗎質(zhì)粒。對于共免疫組，注射前將兩種質(zhì)粒各50嗎混合。最后一次免疫后10天眼眶取血，ELISA系列稀釋法測抗體效價。結(jié)果以光吸收平均值(A柳肌)士SD表示。(A)BALB/c鼠血清1/1000稀釋后的表面抗體，(B)Anti-HBsinHLA/A2轉(zhuǎn)基因鼠血清1/1000稀釋后的表面抗體，(C)和(D)分別是BALB/c鼠和HLA/A2轉(zhuǎn)基因鼠血清1/10000稀釋后的核心抗體，(E)BALB/c鼠和HLA/A2轉(zhuǎn)基因鼠血清1/100稀釋后N355抗體(IgG)。所有數(shù)據(jù)均為三次不同實(shí)驗(yàn)的一個代表值。C:ELISPOT檢測HBV特異細(xì)胞反應(yīng)。DNA疫苗免疫BALB/c鼠和HLA/A2轉(zhuǎn)基因鼠三次，每組5只鼠，每次肌肉注射100ng質(zhì)粒。對于共免疫組，注射前將兩種質(zhì)粒各50昭混合。最后一次免疫后10天取小鼠脾臟細(xì)胞進(jìn)行分析。HBV特異的IFN-Y和CD8+雙陽性細(xì)胞形成的斑點(diǎn)數(shù)以5xl05脾臟細(xì)胞計算。每組斑點(diǎn)數(shù)(減去沒有多肽剌激的對照斑點(diǎn))以三個數(shù)的均值±標(biāo)準(zhǔn)方差表示，所有數(shù)據(jù)均為三次不同實(shí)驗(yàn)的一個代表值。(A)表位HBs362-371和Ld28-39用BALB/c鼠分析，表位HBs348-357用于HLA/A2轉(zhuǎn)基因鼠分析。(B)表位HBc87-95用于BALB/c鼠分析，表位HBcl8-27用于HLA/A2轉(zhuǎn)基因鼠分析。圖4:攜帶抗原表位、MHC-I類分子和(32-微球蛋白的SCT重組DNA載體的構(gòu)建和免疫效果。SCT是通過將抗原表位、MHC-I類分子和P2-微球蛋白通過15個氨基酸的GS連接子連接而構(gòu)建的融合基因，其結(jié)構(gòu)如圖A所示。圖4B顯示，SCT可以有效地將抗原表位呈遞在細(xì)胞表面。圖4C顯示，用SCT重組DNA載體免疫HLA-A2轉(zhuǎn)基因鼠可以產(chǎn)生特異的CTL。圖4D顯示，SCT具有抑制H印G2.2.15細(xì)胞中HBV復(fù)制的能力。圖5:單獨(dú)或聯(lián)合使用治療劑的小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中，A:注射RNA干擾載體或者是DNA疫苗或者是痘病毒疫苗3周后小鼠血清中HBsAg和HBeAg的表達(dá)水平(用與對照相比的百分比表示)B:注射RNA干擾載體或者是DNA疫苗或者是痘病毒疫苗3周后小鼠血清中HBV-DNA的拷貝數(shù)C:三次免疫后小鼠血清中HBsAg和HBeAg的表達(dá)水平(用與對照相比的百分比表示)D:三次免疫后小鼠血清中HBV-DNA的拷貝數(shù)E:三次免疫轉(zhuǎn)基因老鼠免疫后小鼠脾臟細(xì)胞的ELISPOT結(jié)果圖6:重組痘苗病毒和多載體治療性HBV和HIV疫苗免疫產(chǎn)生的CTL。用實(shí)施例一載體2B中的HBV核心抗原-SCT重組DNA和如圖A所示的重組痘苗構(gòu)成的多載體HBV治療性疫苗免疫HLA-A2轉(zhuǎn)基因鼠可以高效的誘發(fā)HBV核心抗原相關(guān)的CTL水平。用HIV的gag表位具有一致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖6A，重組痘苗病毒的構(gòu)建形式之一。圖6B，用含SCT的重組DAN載體和重組痘苗病毒免疫HLA-A2轉(zhuǎn)基因鼠可以高效產(chǎn)生HBV核心抗原和HIVgag抗原特異的CTL。在本實(shí)施例中，載體上的A是y-IFN，B是S2SN355，C是HLA-A2畫SCT-C18。圖7:真核分泌表達(dá)的囊膜病毒膜融合抑制基因的構(gòu)建圖。其中，A帶tPA信號肽的膜融合抑制劑的構(gòu)建。B帶IgG信號肽的膜融合抑制劑的構(gòu)建。圖8:其他HBV的RNA干涉序列。其中，A:與HBVX抗原對應(yīng)的干涉RNA序列轉(zhuǎn)化成的插入到pAVU6+27載體上的序列。B:與HBVS抗原對應(yīng)的干涉RNA序列轉(zhuǎn)化成的插入到pAVU6+27載體上的序列。C:與HBVC抗原對應(yīng)的干涉RNA序列轉(zhuǎn)化成的插入到pAVU6+27載體上的序列。D:與HBVP抗原對應(yīng)的干涉RNA序列轉(zhuǎn)化成的插入到pAVU6+27載體上的序列。具體實(shí)施例方式以下本文將通過具體的實(shí)施例來描述發(fā)明。如未特別指明之處，可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)(科學(xué)出版社，北京，中國，2002年)、《細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南》(科學(xué)出版社，北京，中國，2001年)、《RNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊》(科學(xué)出版社,北京,中國,2004年)、《免疫檢測技術(shù)》(科學(xué)出版社,北京,中國,1991)等實(shí)驗(yàn)手冊以及本文所引用的參考文獻(xiàn)中所列的方法來實(shí)施。實(shí)施例一.治療HBV感染的雞尾酒療法1.對HBV產(chǎn)生RNA干擾的重組腺病毒1.1構(gòu)建針對HBV單個抗原(X抗原)靶位的RNA干擾的腺病毒載體根據(jù)乙肝病毒(HBV)X抗原的mRNA序列，我們設(shè)計了2個siRNA序列(其相應(yīng)DNA序列為SEQIDNO:20、21)，并將其轉(zhuǎn)換成兩條雙鏈DNA序列(其序列如圖2A所示)，其中為了能連接表達(dá)載體pAVU6+27的U6+27啟動子之后，分別在DNA的5'末端加了&/I酶切位點(diǎn)，3'端加了1d酶切位點(diǎn)；而且為使翻譯有效終止，在末端設(shè)計了終止信號寡聚dT。上述DNA序列委托博亞公司(北京，中國)合成后，分別將互補(bǔ)序列混合溶解并于10(TC煮沸3分鐘，然后降溫至室溫從而退火形成如圖2A所示的雙鏈DNA，然后與經(jīng)Sall/Xbal消化的載體pAVU6+27(購自Clontech公司，美國)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株后，篩選出載體pAVU6+27上帶有siRNA序列的陽性克隆。經(jīng)測序確認(rèn)后，分別得到載有并能表達(dá)相應(yīng)siRNA的質(zhì)粒，分別命名為pAVU6+27-siHBVl(SEQIDNO:20)和pAVU6+27-siHBV2(SEQIDNO:21)。根據(jù)文獻(xiàn)(JingCeta1.selectiveinhibitionofhepatitisBvirusreplicationbyRNAinterference,BiochemBiophysResCommun.2003,309(2):482-4，分另U將pAVU6+27-siHBVl和pAVU6+27-siHBV2與pUC19-HBV1.3(購自MBI，美國)質(zhì)粒瞬時共轉(zhuǎn)染進(jìn)HepG2(購自ATCC,編號為HB8065)細(xì)胞中。根據(jù)廠商說明書，利用上海實(shí)業(yè)科華生物技術(shù)有限公司的乙肝病毒體外ELISA檢測試劑盒檢測乙肝相關(guān)S抗原和e抗原的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)pAVU6+27-siHBVl和pAVU6+27-siHBV2都能有效抑制HBV的S抗原(分別下降了92.9±0.6%(P=0.00216)，94.3士0.8%(P=0.00311))和e抗原(分別下降了82.6±0.5%(P=0.00202)，86.3±0.9%(P=0.000132))的表達(dá)。分別將載體pAVU6+27-siHBVl和pAVU6+27-siHBV2中含有siRNA的表達(dá)盒用/z/"^in切下，電泳后回收，將它們分別與經(jīng)歷'^mi酶切并去磷酸化的pshuttle(購自Stratagene,美國)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌種后，篩選出載體pshuttle上帶有siRNA序列的陽性克隆。經(jīng)測序確認(rèn)后，得到目的質(zhì)粒pshuttle-U6+27-siHBVl和pshuttle-U6+27-siHBV2。根據(jù)廠商說明書，分別將上述目的質(zhì)粒用pmel線性化，利用乙醇沉淀回收，與pA犯asy-l(購自Stratagene,美國)質(zhì)粒共同電轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞BJ5183(購自Stratagene,美國)中進(jìn)行同源重組，篩選得到含有各siRNA表達(dá)框的重組體。然后，分別將重組體利用；^cl線性化酶切，回收后轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞系GP-293(購自Clontech,PaloAlto，CA)，7-10天后，收集病毒，由此構(gòu)建了腺病毒載體，分別命名為腺病毒siHBVl(表達(dá)SEQIDNO:20)禾口siHBV2(表達(dá)SEQIDNO:21)。為了檢測上述腺病毒載體能否針對HBVX抗原進(jìn)行RNA干擾，進(jìn)行如下測試將GP-293細(xì)胞(購自Clontech，PaloAlto，CA)鋪成單層，按照梯度加入系列稀釋的病毒液，然后用1%半固體培養(yǎng)基(2xDMEM(6。/。FCS，雙抗):l。/。瓊脂4:l)培養(yǎng)培養(yǎng)48小時，計數(shù)形成的嗜斑數(shù)，根據(jù)病毒稀釋比例和嗜斑數(shù)確定重組腺病毒的滴度。按照0.1MOI的感染復(fù)數(shù)感染HepG2.2.15細(xì)胞(可購自ATCC)，其能穩(wěn)定表達(dá)HBV的各個抗原，并能包裝完整病毒顆粒)，72小時后用上海實(shí)業(yè)科華生物技術(shù)有限公司的乙肝病毒體外ELISA檢測試劑盒檢測HBV表面抗原S和e抗原的表達(dá)情況，其中對照細(xì)胞是未經(jīng)轉(zhuǎn)染的GP-293細(xì)胞。結(jié)果如圖2B所示，與對照細(xì)胞(C)相比，感染了siHBVl(Pl)或siHBV2(P2)重組病毒的細(xì)胞中S、e抗原的表達(dá)水平被明顯抑制。感染了siHBVl病毒的細(xì)胞，其S抗原的表達(dá)下降了90.6±0.5%(P=0.00226)，e抗原的表達(dá)下降了88.4±0.9%(P=0.00011);感染了siHBV2腺病毒的細(xì)胞，其S抗原下降了92.9±0.6%(P=0.00216)，e抗原下降了89.7±1.0%(P=0.0001)。提取HepG2.2.15細(xì)胞的總RNA進(jìn)行甲醛變性凝膠電泳，然后將變性的RNA從膠上轉(zhuǎn)移到纖維素膜上用探針進(jìn)行雜交。Northern雜交結(jié)果如圖2C所示，被病毒感染的細(xì)胞中，HBV3.5Kb和2.4Kb/2.1Kb的mRNA水平明顯降低。提取細(xì)胞總RNA，用AppliedBiosystemsSYBRgreenmastermix試劑盒在AppliedBiosystemsPrism7000儀器上進(jìn)行realtimePCR反應(yīng),熒光定量PCR檢測結(jié)果如圖2D所示，被siHBVl(PI)或siHBV2(P2)重組病毒感染的細(xì)胞，其上清中的HBVDNA水平與對照(14.48士2.15xl04拷貝/mL)相比分別下降了3.7倍(3.91士0.72xl()4拷貝/mL;P-0.00821)和3.3倍(4.41士0.85xl(^拷貝/mL;P-0.00780)。這些結(jié)果表明，上述構(gòu)建的腺病毒能夠介導(dǎo)特異靶向HBV基因的RNA干擾，可以有效抑制HepG2.2.15細(xì)胞中HBV基因的表達(dá)，并能有效抑制HBV的復(fù)制。1.2構(gòu)建針對HBV多個抗原靶位的RNA干擾的腺病毒載體利用l.l節(jié)中的方法，我們分別設(shè)計了下列針對HBV的S、X、C或者聚合酶P抗原的siRNA序列并構(gòu)建相應(yīng)的pAVU6+27載體針對X的干擾序列1:5'-GAGGACTCTTGGACTCTCA-3，(SEQIDNO:62);針對X的干擾序列2:5'-CCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTG陽3，(SEQIDNO:63);如圖8A所示，設(shè)計酶切位點(diǎn)和終止信號寡聚dT，經(jīng)化學(xué)合成后克隆入pAVU6+27中，分別形成質(zhì)粒pAVU6+27-siHBV-Xl和pAVU6+27-siHBV-X2;針對S的干擾序列1:5'-CATCACATCAGGATTCCTA-3，(SEQIDNO:64);針對S的干擾序列2:5'-CTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTC-3，(SEQIDNO:65);如圖8B所示，設(shè)計酶切位點(diǎn)和終止信號寡聚dT，經(jīng)化學(xué)合成后克隆入pAVU6+27中，分別形成質(zhì)粒pAVU6+27-siHBV-Sl和pAVU6+27-siHBV-S2;針對C的干擾序列5'-CATCACATCAGGATTCCTAAA-3，(SEQIDNO:66);如圖8C所示，設(shè)計酶切位點(diǎn)和終止信號寡聚dT，經(jīng)化學(xué)合成后克隆入pAVU6+27中，形成質(zhì)粒pAVU6+27-siHBV-C;針對P聚合酶的干擾序列5'-AGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTC-3'(SEQIDNO:67);如圖8D所示，設(shè)計酶切位點(diǎn)和終止信號寡聚dT，經(jīng)化學(xué)合成后克隆入pAVU6+27中，形成質(zhì)粒pAVU6+27-siHBV-P。如U節(jié)所述，也可以進(jìn)一步分別將構(gòu)建好的載體中的針對S、X、C或P的siRNA的表達(dá)框兩兩組合克隆到pshuttle載體中。例如，先利用///^ffll酶切下pAVU6+27-siHBV-Xl載體中的表達(dá)框，膠回收后連到pshuttle中，得到含有該干擾序列的pshuttle-siHBVl-Xl,進(jìn)一步將針對另一個抗原的pAVU6+27-siHBV-Sl的表達(dá)框用五CoRV和WzJ切下并回收，用ECoRV酶切pshuttle-siHBVl-Xl并且去磷酸化與用￡CoRV和Wwl切下的siRNA的表達(dá)框進(jìn)行平末端連接，這樣得到了一個pshuttle載體上連接有兩個siRNA的表達(dá)框。以次類推，這樣可以將所有得到的針對HBV的siRNA的表達(dá)框進(jìn)行兩兩組合，克隆進(jìn)腺病毒載體上。然后用相應(yīng)含有兩種分別針對不同蛋白的干擾序列的腺病毒感染HepG2.2.15細(xì)胞測試其針對HBV的抑制效率。2.含有HBV抗原的疫苗2.1含有HBV結(jié)構(gòu)抗原的重組DNA質(zhì)粒用下表2.1所述的引物對擴(kuò)增相應(yīng)的模板，分別得到帶有酶切位點(diǎn)的HBV的結(jié)構(gòu)蛋白核心抗原HBcAg編碼序列(SEQIDNO:4)(縮寫為C)、膜抗原的小蛋白HBsAg(SEQIDNO:5)(縮寫為S)、中蛋白S2S(SEQIDNO:6)、人及小鼠的gp96的N端355個氨基酸(成熟肽，不含信號肽)編碼序列N355h(SEQIDNO:2)以及N355m(SEQIDNO:l)、以及上述結(jié)構(gòu)蛋白和N355h或N355m構(gòu)建的融合基因(融合基因不同部分通過編碼接頭序列"GGSGG"的編碼序列"GGTTCCTCTGGAGGT"連接)。經(jīng)相應(yīng)的酶切后克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3(購自Invitrogen公司，美國)中CMV啟動子的下游，構(gòu)建成如下表2.1所命名的質(zhì)粒，各個質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖如圖3A所示。表1.2.1構(gòu)建HBV結(jié)構(gòu)基因以及融合基因疫苗的引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>其中，上表各引物序列編號與序列表的對照如下(a)為SEQIDNO:24;(b)為SEQIDNO:25;(c)為SEQIDNO:26;(d)為SEQIDNO:27;(e)為SEQIDNO:28;(f)為SEQIDNO:29;(g)為SEQIDNO:30;(h)為SEQIDNO:31;(i)為SEQIDNO:32;(j)為SEQIDNO:33;;(k)為SEQIDNO:35;(1)為SEQIDNO:39;(m)為SEQIDNO:40。獲得的質(zhì)粒作為DNA疫苗分別以肌肉注射的方式免疫BALB/c鼠以及HLA-A2轉(zhuǎn)基因鼠(購自JacksonLab)，免疫三次，每次間隔兩周，每次注射劑量為100pg/鼠。最后一次免疫的兩周后取鼠的外周血制備血清，根據(jù)文獻(xiàn)(DNA-MediatedImmunizationinaTransgenicMouseModeloftheHepatitisBSurfaceAntigenChronicCarrierStatePNAS,Vol.93，No.22，12496-12501)，采用serialend-pointdilutionmethod對血清進(jìn)行梯度稀釋，進(jìn)行ELISA檢測HBV中相關(guān)抗原的抗體滴度，結(jié)果如圖3B所示。同時，取鼠的脾臟細(xì)胞，根據(jù)ELISPOT酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測脾臟中產(chǎn)生的HBV抗原特異的CTL產(chǎn)生的水平，結(jié)果如圖3C中的A、B圖所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DNA疫苗免疫的形式可以產(chǎn)生明顯的抗體和CTL水平，尤其在與gp96的N端的融合的時候，產(chǎn)生Thl類的中和抗體，CTL的水平提高6陽8倍。2.2含有HBV抗原表位的重組DNA質(zhì)粒將HBV表位(HbcAg上第18-27位，或第107-116位)與MHC-I類分子(HLA-A2重鏈)和|32-微球蛋白融合成一個融合蛋白，形成包含以上三者的單鏈三聚體(本文簡稱為SCT),使用用如下引物，A2-SCT-ujA2-SCT-primer2:AATCAGCAAGCTTGGTACCGA(SEQIDNO:44)朋"g格"突,微.A2SCT-HBcAgl8-27-1(match1):AAAG(SEQIDNO:45)A2SCT-HBcAgl8-27-2(match2):TTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCTGTTGGAGGTGGGGGAGGCGGA(SEQIDNO:46)A2SCT-HBcAgl07-115-l(match1):(SEQIDNO:47)A2SCT-HBcAgl07陽115陽2(match2):TGTCTTACTTTTGGAAGAGAAACTGTTGGAGGTGGGGGAGGCGGA(SEQIDNO:48)用A2-SCT-upl引物與A2SCT-HBcAgl8-27-l(match1)、A2SCT-HBcAgl07-115-l(matchl)引物分別擴(kuò)增pKG-A2SCT-HIVgag載體(購自Invitrogen)得到SCT的前端片段；用A2-SCT-primer2引物與A2SCT-HBcAgl8-27-2(match2)或A2SCT-HBcAgl07-115-2(match2)引物分別擴(kuò)增pKG-A2SCT-HIVgag載體得到SCT的后端片段。將純化的前端片段和后端片段做模板，用A2-SCT-upl和A2-SCT-primer2作引物，擴(kuò)增得到SCT序列，并分別純化。將PCR獲得的SCT基因用XhoI、HindIII進(jìn)行雙酶切，然后與雙酶切的pcDNA3.0載體進(jìn)行連接，并鑒定重組體。這樣得到的SCT的重組體是反向插入pcDNA3.0載體的。重新設(shè)計N端和C端引物分別引入BamHl/Xho1酶切位點(diǎn)，序列如下SCT-5，-BamHl:TGAGGATCCGATATGTCTCGCTCCGTGSCT-3，陽Xhol:GAGCTCGAGTCACACTTTACAAGCTGTGAGAGAC，然后進(jìn)行PCR，經(jīng)酶切后插入經(jīng)BamHI/XhoI雙酶切的pcDNA3.0載體，獲得重組表達(dá)載體pcDNA3-SCT-cl8(或稱pcDNA-C18，含HbcAg上第18-27位，SEQIDNO:13)和pcDNA3陽SCT-cl07(或稱pcDNA-C107，含HbcAg上第107-116位，SEQIDNO:14)，測序正確(其結(jié)構(gòu)草圖和部分測序結(jié)果如圖4A所示)。另外，我們還構(gòu)建了pcDNA-SCT-gag(SEQIDNO:15)作為對照。用上述表達(dá)SCT的載體分別轉(zhuǎn)染NIH-3T3細(xì)胞(購自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞中心)，用流式細(xì)胞儀檢測SCT在細(xì)胞表面的表達(dá)情況，其結(jié)果如圖4B所示。用上述SCT重組DNA載體以肌肉注射的方式分別免疫HLA-A2轉(zhuǎn)基因鼠(100yg^Ej，發(fā)現(xiàn)可以有效產(chǎn)生特異的CTL，其結(jié)果如圖4C所示。用上述SCT重組DNA載體轉(zhuǎn)染HepG2,2.15細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其具有抑制HepG2.2.15細(xì)胞中HBV復(fù)制的能力，其結(jié)果如圖4D所示。2.3含有IFN-Y的重組痘苗病毒委托奧科生物技術(shù)公司，以全基因合成的方式按照NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation,http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)所公開的IFN-y(NM—000619,PRI15-APR-2007)所示的序列合成IFN-丫的全基因中的127-627位堿基，其中序列的5'端加入5'-GCGAAGCTTG-3，序列(SEQIDNO:49)，序列的3'端加入3'-ACTCGAGCAT-5'序列(SEQIDNO:50)。合成的基因插入pMD18T載體(可購自TAKARA，日本)，進(jìn)行序列測定，測序正確后寄回該pMDlST-IFN-y質(zhì)粒。用HindlII/XhoI進(jìn)行雙酶切pMD18T-IFN-y質(zhì)粒，然后將IFN-y核酸片段插入用同樣酶切的pcDNA3.0載體(購自Invitrogen，美國)中。將IFN-Y核酸片段插入痘病毒載體(武漢大學(xué))中，構(gòu)建重組痘病毒載體，通過酶切和測序的方式鑒定正確后，將野生痘苗病毒天壇株(O.IMOI)(該病毒在中國曾經(jīng)被廣泛用于接種預(yù)防天花，與同類病毒相比具有更明顯的弱毒性，購自中國CDC)感染Vero細(xì)胞(購自ATCC，CCL-81)吸附培養(yǎng)1.5小時，洗滌細(xì)胞后，利用脂質(zhì)體將之前獲得的重組痘病毒載體l嗎35轉(zhuǎn)染受感染vero細(xì)胞，在vero細(xì)胞內(nèi)，野生型的痘苗病毒基因組和重組痘病毒載體進(jìn)行同源重組，可形成重組痘苗病毒，24小時后通過EGFP的表達(dá)或者目的基因的表達(dá)篩選形成的重組病毒。重組病毒經(jīng)過六輪的單斑篩選進(jìn)行純化，純化的病毒在Vero細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，并用36%的蔗糖墊進(jìn)行純化。圖6A是包含多個元件的若干重組痘苗病毒載體的一個實(shí)例，圖6B是利用含有載體2和載體3的雞尾酒疫苗，取IOO昭的重組質(zhì)粒pcDNA3.0-SCT-C18肌肉注射免疫轉(zhuǎn)基因鼠，一周后用2xlO"PFU的重組病毒采用肌肉注射的方式進(jìn)行加強(qiáng)免疫，一周后取小鼠的脾臟細(xì)胞檢測小鼠所產(chǎn)生的CTL，其結(jié)果如圖6B所示。3.聯(lián)合治療HBV感染的小鼠的實(shí)例取HBV轉(zhuǎn)基因鼠(購自廣州空軍醫(yī)院)78只，隨機(jī)分成13組，具體分組如下表1.3.1所示表1.3.1動物實(shí)驗(yàn)分組及其中所使用的藥物<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>整個實(shí)驗(yàn)設(shè)置如上表中所列的對照實(shí)驗(yàn)A:0.9%生理鹽水，B(非特異性對照)siEGFP+0.9。/。生理鹽水，C:siHBV+0.9。/。生理鹽水，D、E、F、G為單獨(dú)注射DNA疫苗，H、I為單獨(dú)的痘病毒疫苗。其中si代表該基因的RNA干擾序列，S2S和HBcAg為HBV表面膜中蛋白基因及核心蛋白基因，S2SN355和CN355為S2S和HBcAg與gp96N短355個氨基酸殘基片段基因的融合蛋白基因，pcDNA3.0-S2S和pcDNA3.0-HBcAg是將S2S和HBcAg基因連入pcDNA3.0載體中構(gòu)建的DNA疫苗，AES2S禾口AEC(其中E代表EGFP基因)為將EGFP及S2S和HBcAg基因連入痘苗病毒空載體A2d并同源重組構(gòu)建的重組痘苗病毒。每次肌肉注射樣品100ul/只，質(zhì)粒劑量100ug/只，痘苗病毒劑量107pfUAR。各經(jīng)過三次免疫，免疫程序如下表1.3.2所示表1.3.2進(jìn)行免疫治療的程序<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明用重組腺病毒和重組腺病毒庫RNAi疫苗迸行初免后轉(zhuǎn)基因鼠體內(nèi)HBV滴度降低60。/。以上(圖5B)，血清中的表面抗原和核心抗原的含量也相應(yīng)的發(fā)生變化，HBsAg、HBeAg蛋白水平也被明顯抑制(圖5A)。第二次免疫一周后開始出現(xiàn)表面抗原和核心抗原特異的CTL反應(yīng)，并產(chǎn)生保護(hù)性的S抗體，HBV的滴度繼續(xù)降低。第三次用重組痘苗病毒(S抗原和C抗原基因)加強(qiáng)免疫后，血清中表面抗原和核心抗原對應(yīng)的抗體水平顯著提高。治療兩個月后，血清HBVDNA的拷貝數(shù)明顯降低(圖5C、圖5D、圖5E)。HBV轉(zhuǎn)基因鼠經(jīng)聯(lián)合治療后，產(chǎn)生明顯優(yōu)于單組分治療的綜合性治療效果。經(jīng)DNA疫苗和痘苗疫苗的聯(lián)合免疫，體內(nèi)產(chǎn)生顯著的多克隆CTL應(yīng)答，并產(chǎn)生記憶性T細(xì)胞克隆，從而進(jìn)一步清除了肝臟內(nèi)部痕量的感染細(xì)胞。由于保護(hù)性抗體以及多表位CTL和免疫記憶的產(chǎn)生，HBV轉(zhuǎn)基因鼠內(nèi)部的病毒顆粒得到了有效的清除。此外用痘苗病毒和腺病毒載體的交叉免疫方式可避免機(jī)體對同一種病毒載體再度免疫時所產(chǎn)生的中和作用。實(shí)施例二.對HCV產(chǎn)生RNA干擾的重組腺病毒我們根據(jù)丙型肝炎病毒(HCV)的5'UTR區(qū)域的序列，設(shè)計了siRNA序列(其相應(yīng)DNA序列為5'-CCCGCTCAATGCCTGGAG-3'，SEQIDNO:68),并如同實(shí)施例一1.1中那樣，為了能連接表達(dá)載體pAVU6+27的U6+27啟動子之后，分別在DNA的5'末端加了5WI酶切位點(diǎn)，3'端加了力d酶切位點(diǎn)；而且為使翻譯有效終止，在末端設(shè)計了終止信號寡聚dT。然后如同實(shí)施例一1.1中那樣，克隆到pAVU6+27載體上并通過載體pshuttle構(gòu)建了腺病毒載體，命名為腺病毒siHCV(表達(dá)SEQIDNO:68)。為了檢測上述腺病毒載體能否針對HCV進(jìn)行RNA干擾，進(jìn)行如下測試按照0.1MOI的感染復(fù)數(shù)感染Huh-mono細(xì)胞(購自ATCC)，其能穩(wěn)定表達(dá)B89/hyg-ubi/NS3-375.1HCV復(fù)制子，采用Northernblot及熒光定量PCR檢測HCV的拷貝數(shù)。提取細(xì)胞的總RNA進(jìn)行甲醛變性凝膠電泳，然后將變性的RNA從膠上轉(zhuǎn)移到纖維素膜上用探針進(jìn)行Northern雜交，并且提取細(xì)胞總RNA，用AppliedBiosystemsSYBRgreenmastermix試劑盒在AppliedBiosystemsPrism7000儀器上進(jìn)行realtimePCR反應(yīng)。結(jié)果表明被病毒感染的細(xì)胞中HCV的復(fù)制水平下降61.6±0.5%(PK).00116)，其中的一個重要蛋白HCV-NS5B的表達(dá)水平下降了72.6±0.8%(P=0.00237)。實(shí)施例三.治療HIV-I感染的療法1.對HIV-1產(chǎn)生RNA干擾的重組腺病毒我們根據(jù)HIV的tat基因的序列，設(shè)計了siRNA序列(其相應(yīng)DNA序列為5'-AAGTGTTGCTTTCATTGCCAAGTTTGTT-3，，SEQIDNO:71)，并如同實(shí)施例一1.1中那樣，為了能連接表達(dá)載體pAVU6+27的U6+27啟動子之后，分別在DNA的5'末端加了酶切位點(diǎn)，3'端加了酶切位點(diǎn)；而且為使翻譯有效終止，在末端設(shè)計了終止信號寡聚dT。然后如同實(shí)施例一1.1中那樣，克隆到pAVU6+27載體上并克隆到載體pshuttle上，得到了pshuttle—AVU6+27—siHIV。根據(jù)友誼中銀技術(shù)公司廠商說明書，將上述目的質(zhì)粒用pmel線性化，利用乙醇沉淀回收，與pAdEasy-1(購自Stratagene，美國)質(zhì)粒共同電轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞BJ5183(購自Stratagene,美國)中進(jìn)行同源重組，篩選得到含有siHIV表達(dá)框的重組體。然后，將重組體利用pMl線性化酶切，回收后轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞系GP-293(購自Clontch,PaloAlto,CA)，7-10天后，收集病毒，由此構(gòu)建了腺病毒載體，命名為腺病毒siHIV(表達(dá)SEQIDNO:71)。為了檢測上述腺病毒載體能否針對HIV進(jìn)行RNA干擾，進(jìn)行如下測試根據(jù)文獻(xiàn)(PRAlco-localizeswithenvelopebutdoesnotinfluenceprimatelentivirusproduction,infectivityorenvelopeincorporation.JournalofGeneralVirology(2005),86，1785—1790)，用HIVNL4.3質(zhì)粒(購自Clontech公司)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞(購自ATCC)，以產(chǎn)生HIV假病毒顆粒。6小時后轉(zhuǎn)染包裝好的腺病毒siHIV，72小時后檢測抑制的效果。收集細(xì)胞，一部分用來提取細(xì)胞總蛋白,利用P24蛋白和gag蛋白抗體(SantaCruZ)進(jìn)行Westernblotting檢測被抑制的效果。另一部分利用TriZol提取總RNA進(jìn)行甲醛變性凝膠電泳，然后將變性的RNA從膠上轉(zhuǎn)移到纖維素膜上用探針進(jìn)行雜交。Westernblotting結(jié)果顯示P24蛋白的表達(dá)被抑制掉73±0.5%(P=0.00127)，gag蛋白被抑制掉60.9±0.5%(P=0.00142)，Northernblotting表明HIV-RNA被抑制89±0.9%(P=0.00321)。說明腺病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)能有效的抑制HIV中重要蛋白的表達(dá)，并進(jìn)一步影響了病毒的復(fù)制。利用同樣的原理構(gòu)建的HIVgag表位相關(guān)的SCT重組DNA和痘苗病毒載體也可以高效的誘發(fā)HIV表位相關(guān)的CTL作用(ELISPOT和IFN-y結(jié)果見圖4C)。2.HR的DNA制劑對HIV病毒侵染的阻斷作用用pcDNA3.0(Invitrogen)，pSecTag2B(Invitrogen)兩個真核表達(dá)載體，構(gòu)建分別含有tPA(12誦0-tetradecanoylphorbol-13-acetate,tPA)和IgG信號肽序列的分泌表達(dá)載體。pcDNA3.0-tPA-HR212的構(gòu)建采用搭橋PCR的方式，引物序列分別為Up-tPA-pl:GTCTTCGTTTCGCCCAGCTGGATGGAGTGGGACAG(SEQIDNO:51)Up-tPA-p2:GCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGCCCA(SEQIDNO:52)Up-tPA-p3:GATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGC(SEQIDNO:53)Up誦tPA-p4:CGCAGGATCCGCCACCATGGATGCAATGAAGAGAG(SEQIDNO:54)Down-HR212-pl:CGCGCTCGAGCTACAATAATTCTTGTTCATTC(SEQIDNO:55)所構(gòu)建的基因結(jié)構(gòu)如圖7A所示，PCR所得到的基因命名為tPA-HR212，構(gòu)建入pcDNA3.0載體中，具體如下。pSecTag2B-HR212的引物序列如下，所構(gòu)建的基因結(jié)構(gòu)如圖7B所示。Up隱pSec-pl:CGCAGGATCCTGGATGGAGTGGGACAGAG(SEQIDNO:56)Down-HR212-pl:CTCTGTCCCACTCCATCCAGGATCCTGCG(SEQIDNO:57)PCR所得到的基因命名為HR212，構(gòu)建入pSecTag2B載體中，具體如下將上述PCR得到的基因tPA-HR212(SEQIDNO:19)和HR212用BamHl/Xho1進(jìn)行雙酶切，然后連入同樣酶切的真核表達(dá)載體pcDNA3.0和pSecTag2B中，構(gòu)建分泌表達(dá)的真核重組DNA，分別命名為pcDNA3.0-tPA-HR212和pSecTag2B-HR212。將所構(gòu)建的真核分泌表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞(購自ATCC)，培養(yǎng)48-72小時后收集上清，用millipore的離心濃縮管進(jìn)行濃縮。根據(jù)文獻(xiàn)(Expressioncloningofnewreceptorsusedbysimianandhumanimmunodeficiencyviruses.Nature1997M17;388(6639):296-300)包裝HIV的假病毒，具體操作方法為轉(zhuǎn)染前24h,消化293T細(xì)胞并傳至10cm皿中，濃度為4-5><106細(xì)胞/皿。24h后，細(xì)胞大約80%鋪滿。用磷酸鈣法將pNL43LucE-R(購自Invitrogen)禾QpMT3-HXB-2(購自Invitrogen)兩個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h后，細(xì)胞長滿變圓，離心(3000rpmxl0min)收獲含HIV-1假病毒上清液。對于pcDNA3.0-tPA-HR212組和pSecTag2B-HR212組，如下進(jìn)行進(jìn)行融合抑制實(shí)驗(yàn)前24小時，消化GHOST-CXCR4(可購自ATCC)細(xì)胞并傳至24孔板中，細(xì)胞濃度為8><104細(xì)胞/1。將真核分泌表達(dá)載體表達(dá)的上清與病毒按照1:1混合，然后將混合物接種到GHOST-CXCR4細(xì)胞(可購自ATCC)中，待病毒吸附細(xì)胞2h后，吸棄病毒混合物，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每個稀釋度做2個重復(fù)，48-72小時后收獲并裂解細(xì)胞，用熒光測試儀測定細(xì)胞上清中螢火蟲熒光酶的活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3.2所示:表3.2:HR212抑制HIV侵染靶細(xì)胞<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>3，HR融合蛋白對HIV病毒侵染的阻斷作用(1)不同串聯(lián)形式的HR融合蛋白編碼基因的構(gòu)建根據(jù)HIV-1的HR1和HR2的氨基酸序列HR1:SGIVQQQ麗LLRA正AQQHLLQLTVWGIKQLQARHR2:WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL設(shè)計了10條引物，即R1，Pl，A2，Bl，B2,Al，P2，R2，Dl和C2用于構(gòu)建三螺旋蛋白HR121和HR212的基因，以及五螺旋蛋白HR12121基因。其中Rl和R2分別是從長引物Pl和P2上截取的與HR基因無關(guān)的序列。Pl:5'CTGGGTACCTTGGAAGTTCTATTCCAGGGTCCAGAATTCTCTGGTATAGTGCAGCAG3，A2:5，ACCTCCAGAGGAACCTCTTGCCTGGAGCTGCTT3'B1:5，GGTTCCTCTGGAGGTTGGATGGAGTGGGACAGA3'B2:5，TCCACCAGAACCACCCAATAATTCTTGTTCATT3'Al:5'GGTGGTTCTGGTGGATCTGGTATAGTGCAGCAG3'P2:5，TGGTGATGGTGGTGATGCTCGAGTCACTCGAGCTATCTTGCCTGGAGCTGCTT3'Pl:5，CTGGGTACCTTGGAAGTTCTATTCCAGGGTCCAGAATTCTGGATGGAGTGGGACAGA3'C2:5，TGGTGATGGTGGTGATGCTCGAGTCACTCGAGCTACAATAATTCTTGTTCATT3'Rl:5，CTGGGTACCTTGGAAGTTCTATTCCAGGGTCCA3'R2:5，TGGTGATGGTGGTGATGCTCGAGTCA3'利用搭橋PCR方法擴(kuò)增HR121、HR212和HR12121基因。以P1、A2為引物，編碼HIV-1融合蛋白env的質(zhì)粒pMT3-HXB-2(該質(zhì)粒的構(gòu)建參照文獻(xiàn)Ferrer,"a/.Naturestructuralbiology,1999(6):953-960)為模板擴(kuò)增得到各個片段，并連接成添加了酶切位點(diǎn)的HR121(S叫IDNo:81，其編碼的多肽序列為SeqlDNo:80)、HR212(SeqlDNo:79，其編碼的多肽序列為SeqlDNo:78)和HR12121基因(S叫IDNo:83，其編碼的多月太序列為SeqlDNo:82)。其中，上述PCR擴(kuò)增的溫度條件為94°C,3分鐘，一個循環(huán)。94°C，1分鐘;60°C，1分鐘；72°C，2分鐘，30個循環(huán)。72°C，IO分鐘，一個循環(huán)。將所構(gòu)建的HR121，HR212,HR12121基因片段用EcoRI和XhoI雙酶切后無水乙醇沉淀回收，向酶切產(chǎn)物中加入1/10酶切產(chǎn)物體積的3mol/L醋酸鈉，2.5倍酶切產(chǎn)物體積的無水乙醇，-20°。沉淀30-60分鐘，12000rpm離心10分鐘，再用75%乙醇洗滌一次，12000rpm離心10分鐘，自然干燥，然后與相同的雙酶切后瓊脂糖電泳回收的pGEX-6p-l(AmershamBiosciences)載體連接，在16'C連接12h后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5cc感受態(tài)細(xì)胞；隨機(jī)挑選轉(zhuǎn)化菌單菌落接種液體培養(yǎng)基，提取質(zhì)粒用EcoRI和XhoI雙酶切鑒定，能夠獲得與目的片段分子量一致的質(zhì)粒為候選陽性克隆，對所得候選陽性質(zhì)粒進(jìn)行DNA測序篩選出陽性克隆含有HR121基因的pGEX-6p-l/HIV-1-HR121;含有HR212基因的pGEX-6p-l/HIV-l-HR212，該HR212基因具有序列表中序列13的核苷酸序列；含有HR12121基因的pGEX-6p-l/HIV-l-HR12121。(2)HR121、HR212、HR12121的表達(dá)將經(jīng)DNA測序的pGEX-6p-l/HIV-1-HR121，pGEX-6p-l/HIV-1-HR212和pGEX-6p-l/HIV-1-HR12121分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑選單克隆，接種含氨卞青霉素(10(Hig/ml)的2xYT液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨16g，酵母提取物10g，氯化鈉5g，水1000ml)中，37"C搖振培養(yǎng)12h作為種子液；將種子液按1/100(V/V)接種量接種新鮮2xYT液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨16g，酵母提取物10g，氯化鈉5g，水1000ml)，37。C搖振培養(yǎng)至OD600為0.8-1.0，加誘導(dǎo)物IPTG至終濃度lmM，37。C繼續(xù)培養(yǎng)4小時；5000ipm離心15分鐘收集菌體，用PBS緩沖液(140mMNaCl,2.7mMKC1,10mMNa2HP04,1.8mMKH2P04,pH7.3)懸浮菌體，超聲波裂解菌體，超聲波裂解后加入終濃度為1%的TritonX-lOO，冰浴30min，12000rpm，4。C離心15min，取上清；將超聲波裂解上清通過經(jīng)PBS平衡的谷胱甘肽4B親和層析柱(購自Pharmacia公司)，再用PBS洗滌親和柱至少十個柱體積；用至少三個柱體積的還原型谷胱甘肽reducedglutathione溶液(10mM還原型谷胱甘肽，50mMTris-HClpH8.0)洗脫，收集洗脫液得到HR121、HR212、HR12121與GST的融合蛋白，經(jīng)12%SDS-PAGE鑒定所得蛋白分子量與預(yù)期相符；用SuperdexG50脫鹽柱(Pharmacia公司)將融合蛋白溶解在酶切緩沖液(50mMTris-HCl，pH7.0;150mMNaCl;lmMDTT;1mMEDTA,pH8.0)，加入過量的PreScission蛋白酶(Pharmacia)5"C酶切16h;酶切產(chǎn)物再用谷胱甘肽4B親和層析柱親和除去酶切下的GST和PreScission,收集穿透液得到HR121、HR212、HR12121,用截流分子量為lOkDa的超濾管濃縮至適當(dāng)濃度，利用分子篩進(jìn)一步純化，-7(TC凍存?zhèn)溆?。所用蛋白樣品均?2%SDS-PAGE鑒定，蛋白濃度用Bio-RadDC蛋白試劑盒來確定(購自Pharmacia公司)。結(jié)果表明HR121的表達(dá)量為40mg/L培養(yǎng)液；HR212的表達(dá)量為50mg/L培養(yǎng)液；H12121的表達(dá)量為40mg/L培養(yǎng)液。將經(jīng)分子篩純化的HR121、HR212或HR12121蛋白用PBS緩沖液將蛋白濃度調(diào)整到約10nM。用JascoJ-715分光光度計進(jìn)行圓二色譜分析，結(jié)果表明這三種多螺旋蛋白均富含a螺旋結(jié)構(gòu)。(3)HR121、HR212和H12121抑制HIV-l假病毒感染細(xì)胞抑制活性的測定接毒前24小時，消化GH0ST-CXCR4細(xì)胞(MckessonBioServicesCorporation)并傳至24孔板中。將純化得到的HIV-1-HR121，HIV-1-HR212和HIV-1-HR12121分別溶于PBS緩沖液中，過濾除菌，5倍梯度稀釋后分別與等量的HIV-1假病毒(HIV-1假病毒的制備參照文獻(xiàn)Deng，da/.Nature,388(1997):296-300)混合。同時以GST作為陰性對照(購自Pharmacia公司)，以HIV-l-HR2-30a為陽性對照(購自Clontech公司))。然后將這種蛋白病毒混合物分別加入到細(xì)胞中(80%鋪滿)，待病毒吸附細(xì)胞2h后，吸棄病毒和蛋白的混合物，加入新鮮培養(yǎng)基(DMEM,90%;胎牛血清，10%;G418，500(xg/ml;潮霉素，100(ig/ml;嘌呤霉素，lfig/ml。其中的百分含量為質(zhì)量百分含量)繼續(xù)培養(yǎng)，每個稀釋度做8個重復(fù)，48-72后收獲并裂解細(xì)胞，根據(jù)promega公司的說明書，通過測定細(xì)胞上清中螢火蟲熒光酶的活性來計算這三種多螺旋蛋白阻斷HIV-1gp41介導(dǎo)的膜融合。結(jié)果表明，HIV-1的三種多螺旋蛋白均能夠在nM濃度范圍內(nèi)阻斷病毒進(jìn)入細(xì)胞。其中HR121、HR212和HR12121的半數(shù)抑制濃度分別是16.2±2.76,2.3±0.62和7.2±1.6nmol/L。參考文獻(xiàn)Payette,P.J.，X.Ma，etal.(2006)."TestingofCpG-optimizedproteinandDNAvaccinesagainstthehepatitisBvirusinchimpanzeesforimmunogenicityandprotectionfromchallenge."Intervirology49(3》144-51.Seeger，C.andW.S.Mason(2000》"HepatitisBvirusbiology."MicrobiolMolBiolRev64(1):51-68,Yang,S.H.，C.G.Lee,etal.(2006)."CorrelationofantiviralT響cellresponseswithsuppressionofviralreboundinchronichepatitisBcarriers:aproof-of-conceptstudy."GeneTher.Zhao,Y.G"B.Peng,etal.(2006)."Anti-HBVimmuneresponsesinrhesusmacaqueselicitedbyelectroporationmediatedDNAvaccination."Vaccine24(7):897-903.MannsMP,McHutchinsonJQGordonSC,etal.Peginterferonalpha-2bincombinationwithribavirincomparedwithinterferonalpha-2bplusribavirinforinitialtreatmentofchronichepatitisC:results.ofarandomizedtrial.Lancet,2001,358:958-965.LeeSW，ChoJH，SungYC.OptimalinductionofhepatitisCvirusenvelope-specificimmunity.JVirol，1998,72:8430-8436.FomsX，EmersonSU,TobinGJ,etal.DNAimmunizationofmiceandmacaqueswithplasmidsencodinghepatitisCvirusenvelopeE2proteinexpressedintracellularlyandonthecellsurface."Vaccine,1999,17:1992-2002.ZhouYH，ShimizuYK,EsumiM.Monoclonalantibodiestothehypervariableregion1ofhepatitisCviruscapturevirusandinhibitvirusadsorptiontosusceptiblecellsinvitro.Virology，2000,269(2):276-283JiaoX,WangRY,FengZ,etal.DNAimmunizationencodingthesecretednonstructuralprotein3(NS3)ofhepatitisCvirusandenhancingtheThltypeimmuneresponse.JViralHepat,2004，ll(l):18隱26.InchauspeG,FeinstoneS.DevelopmentofahepatitisCvirusvaccine.ClinLiverDis,2003,7:243陽259Baba,T.W"Liska，V"Khimani,A,H.,etal.Liveattenuated,multiplydeletedsimianimmunodeficiencyviruscausesAIDSininfantandadultmacaques.Nat.Med.,1999,5:194-203.Bruyn，G.,Rossini,A.J.，Chiu，Y丄,，etal.SafetyprofileofrecombinantcanarypoxHIVvaccines.Vaccine,2004,22(56):704713.Dennis,R.B.,Ronald,C.D.，Robert,W.D.，etal.Enhanced:AsoundrationaleneededforphaseIIIHIV-1vaccinetrials.Science,2004，303:316.Egan,M.A.,Charini,W.A.，Kuroda,M丄，etal.Simianimmunodeficiencyvirus(SIV)gagDNAvaccinatedrhesusmonkeysdevelopsecondarycytotoxicT-lymphocyteresponsesandcontrolviralreplicationafterpathogenicSIVinfection.J.Virol"2000,74:7485-7495.QingFang,LinYang,WeijunZhu,etal.Hostrange,growthproperty,andvirulenceofthesmallpoxvaccine:VacciniavirusTianTanstrain.Virology,2005，335:242-251.肖瑤，范秀娟.中國HIV-1B亞型P55和嵌合的P55-V3病毒樣顆粒候選疫苗免疫效果的研究.病毒學(xué)報，2000,16(4):313316.IB074015-序列表序列表〈110〉中國科學(xué)院微生物研究所<120>治療病毒感染的方法及其藥物<130>IB074015〈160>83〈170〉Patentlnversion3.1<210>1<211>1071<212〉腿<213〉小鼠<220><221>CDS<222〉(1)..(1071)<223><400〉1atggatgatgaagtcgacgtggatggcacagtggaagaggacctgggtaaaagccgagaa60ggctc卿gacagatgatgaagttgtgcagagagaggaagaagctattcagttggatggg120ttaaacgcataaaagttcgccttccaagct180ga.agtgaacaggatgatgaaacttatcatcaattctttgtat犯aaataaagagattttc240ctgagagaactgatttcaaatgcttctgatgctttagacaag由aggctcatctcccta300actgatgaaaatgcactcgctggaaatgaggagU犯cggtcaagattaagtgtgacaaa360ga.gaaaaacctgctgcatgtcacagacacgggtgtagg犯tgactagagaggagttggtt420a.aaaatctcggcaccatagcc犯aXctggaacaagcgagtttttaaacaaaatgacagaa480gctcaagaagatggtcagtcaacctctgaactgattggccagUtggtgtcggtttttat540tctgccttccttgtagcagagtcacatcgatgatacccag600cacatctgggaatcagactccaatgaattctctgtaattgctgacccaagaggaaacaca660ctaggtcgtggaacaacaattactcttgtcttaaaagaagaagcatctgattaccttgaa720ttggacacaatta犯犯tctcgtcaggaagtactctcagttcatcaactttcccatctac780gtgtggagtagcaagacagagactgttgaggagcccttggagcagcaaaa840gaagag犯3gaagaatctgatgatgaagctgcagtagaggaggaagaageiagaaaageiaai900ccaaa.a_a.ct3agaaagttgaaaaaactgtgtgggattggg犯cttatg犯tgatatcaaa960ccastatggcagagaccatcca犯gaagtagaagaagacgaatacaaa.gctttctacaaa1020tcattttc犯aggaaagtgatgaccccatggcttatatccacttcactta1071〈210>2<211〉1071<212〉DNA<213〉人<220>〈221〉CDS<222〉(1)..(1071)<223>〈婦2a.tggacgatgaagttgatgtggatggtacagtagaagaggatctgggtaaaagtagagaa60ggatcaaggacggatgatgaagtagtacagagagaggaagaagctattcagttggatgga120ttaaatgcatcacaaataagagaacttagag柳agtcggaaaagtttgccttccaagcc180gaagttaacaga.atgatgaaacttatcatcataaaaataaageigsttttc240ctgagagaactgatttcaa^tgcttctgatgctttagata.agataa.ggctaatatcactg300actgatgaaaa"tgctctttctggaaatgaggaactaacagtcaaaattaagtgtgataag360gagaagaacctgctgcatgtcacagacaccggtgtaggaatgaccagagaagagttggU420aaaaaccttggtaccatagccaaatctgggacaagcgagtttttaaacaaaatgactgaa480gcacagg犯gatggccagtcttgattggccagUtggtgtcggtttctat540tccgccttccttgtagcagataaggttattgtcacttcaaaacacsacaBcgatacccsg600cacatctgggagtctga.ctccaatga.attttctgtaa.ttgctgacccaagaggaaacact660ctaggacggggaacgacaattacccttgtcttaa.aagaagaagcatctgattaccttgaa720t"tgg3tacaacgtc犯aaaatattcacagttC3taaactttcctatttat780gmggagca.gcaagsctgaaiactgttgagg3gCCC3tggagga.aga柳840gaagagaa.ag犯gaatctgatgatgaagctgcagtagaggaagaagaagaagaaaagaaa900ccaaagactaaaaaagttgaaaaaactgtctgggactgggaact"tatgaatgatatcaaa960CC犯t3tggCagagaccatcaaaagaagtagaagaagatgaatacaaagctttctaca^a1020tcattttcaaaggaaagtgatgaccccatggcttatattcactttactta1071<210〉3<211>2352<212〉廳〈213>人<220〉〈221〉CDS<222〉(1).<223>.(2352)<400〉3atggacgatgaagttgatgtggatggtacagtagaagaggatctgggtaaaagtagagaa60ggatcaaggacggatgatgaagtagtacagagagagg犯gaagctattcagttggatgga120ttaaatgcatcacaaataagagaacttagagagaagtcggaa卿tttgccttccaagcc180gaagttsacagaatgatgaaacttatcatc犯ttC3ttgtata犯aataa240ctgagag犯ctgatttxaaatgcttctgatgctttagataagataaggctaatatcactg300a.ctgatgaaaatgctctttctgg犯atgaggaactaacagtca貼attaagtgtgataag360gagaagaacctgctgcatgtcaca_gaca_ccggtgtaggaatgaccagagaagagttggtt420aaaa.accttggtaccatagccaaatctgggacaagcgagtttttaaacaaaatgactgaa480atggcca.gtcaacttctgaattgattggccagtUggtgtcggtttctat540tccgccttccttgta.gcagatasggttattgtcacttcaaaacacaacaacgatacccag600cacatctgggagtctgact:ccaatgaattttctgtaattgctgacccaagaggaaacact660ctaggacggggaacgacaattacccttgtcttaaaagaagaagcatctgattaccttgaa720ttggatacaattaaaaatcttattcacagt"tcataaactttcctatttat780gtatggegcaaactgUgaggsgcccatggaggaagaagaagcagccaaa840ga卿gaaagaagaatctgatgatgaagctgcagtagaggaagaagaagaaga^aagaaa900ccaaaga.ctaaaaaagttgaaaaaactgtctgggactgggaacttatgaatgatatcaaa960ccaatatggcagagaccatcaasagaagtag犯gaagatgaatacaaagctttctacaaa1020tcattttcaaaggaaagtgatgaccccatggcttatattcactttactgctgaaggggaa1080gttaccttcaaatcaattttatttgtacccacatctgctccacgtggtctgtttgacgaa1140tatggatctaaaaagagcgattacattaagctctatgtgcgccgtgtattcatcacagac1200gacttccatgatatgatgcctaaatacctcaattttgtcaagggtgtggtggactcagat1260gatctccccttgaatgtttcccgcgagactcttcagcaacataaactgcttaaggtgatt1320agga柳agcttgttcgtaaaacgctggacatgatcaagaagattgctgatgataaatac1380tttggaaagaatttggtaccaacatcaagcttggtgtgattgaagaccac1440tcgaatcgaacacgtcttgctaaacttcttaggttccagtcttctcatcatccaactgac1500attactagcctagaccagtatgtggaaagaatgaaggaaaaacaagacaaaatctacttc15603tggctgggtccagcagaaaagaggctgaatcttxtccatttgttgagcgacttctgaaa1620aagggctatgaagttatttacctcacagaacctgtggatgaatactgtattcaggccctt1680cccgaatttgatgggaagaggttccagaatgttgccaaggaaggagtgaagttcgatgaa1740ctaaggagagtcgtgaagcagttgsgaaagaatttgagcctctgctgsat層Otggatgaaagataaagcccttaaggacaagattgaaaaggctgtggtgtctcagcgcctg1860acagaatctccgtgtgctUggtggccagccagtacggatggtctggcaacatggagaga1920atcatgaaagcacaagcgtaccaaacgggcaaggacatctctacaaattactatgcgagt1980cagaagaaaacatttgaaattaatcccagacacccgctgatcagagacatgcttcgacga2040attaaggaagatgaagatgataaaacagttttggatcttgctgtggttttgtttgaaaca2100gca.acgcttcggtcagggtatcttttaccagacactaaagcatatggagatagaatagaa2160agaatgcttcgcctcagtttgaacattgaccctgatgcaaaggtggaagaagagcccgaa2220gaaga.acctgaagagacagcagaagacacaacagaagacacagagcaagacgaagatgaa2280g犯atggatgtgggaacagatgaagaageteigaaacagcaaaggaatctacagctgaaaaa2340gatgaattgt2352<210>4〈211>450<212〉DNA<213>乙肝病毒<220〉<221>CDS<222〉(1)..(450)〈223〉<400>4atgcaactttttgaattctgcctaatcat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