專(zhuān)利名稱(chēng)：治療慢性乙型肝炎病毒感染的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療慢性乙型肝炎病毒(“HBV”)感染和疾病的免疫治療劑。
背景技術(shù)：
85％以上兒童HBV感染變成慢性。成人中1-5％急性HBV感染不能治愈，也變?yōu)槁愿腥?。慢性感染可?dǎo)致慢性活動(dòng)性肝炎(20-50％的病例)、肝硬化或甚至肝功能衰竭(10-20％的病例)，在某些情況下導(dǎo)致肝癌(1-3％的病例)。肝臟損傷主要是對(duì)感染的肝細(xì)胞的細(xì)胞免疫應(yīng)答引起的。
僅在美國(guó)就有約一百萬(wàn)HBV的慢性攜帶者。全世界有300,000,000以上的慢性攜帶者。許多慢性攜帶者在泛太平洋地區(qū)(即臺(tái)灣、日本、南亞)和非洲。
引起慢性HBV感染的機(jī)制尚不清楚。乙型肝炎e-抗原(“HBeAg”或“HBe”，前核心多肽)的存在與活動(dòng)性病毒復(fù)制有關(guān)，是感染性增加和嚴(yán)重性的指標(biāo)。雖然如果患者是抗-HBe陽(yáng)性預(yù)后較好，但是急性和慢性感染的恢復(fù)都與產(chǎn)生針對(duì)乙肝表面抗原(“HBsAg”或“HBs”)的抗體有關(guān)。隨著中和性抗-HBs抗體的出現(xiàn)，HBsAg消失是感染清除的指標(biāo)。然而，對(duì)抗HBs的自發(fā)性血清轉(zhuǎn)化現(xiàn)象極其罕見(jiàn)。雖然每年有10％的患者經(jīng)歷了HBeAg到抗-HBe的自發(fā)血清轉(zhuǎn)化，但是由HBs血清轉(zhuǎn)化成抗HBs每年僅發(fā)生在約1％的患者中。
雖然已有治療慢性HBV的療法，但是大多數(shù)范圍和效力都有限。干擾素治療僅在3-5％患者中導(dǎo)致抗HBs血清轉(zhuǎn)化。另外，干擾素治療非常昂貴，可能具有嚴(yán)重的副作用，而且必須每日皮下注射。
更新的抗病毒藥物，如拉米夫定可減少病毒負(fù)荷，但僅在少數(shù)病人中導(dǎo)致抗HBs血清轉(zhuǎn)化。另外，它們必須長(zhǎng)期使用-中斷會(huì)導(dǎo)致病毒重新出現(xiàn)，使得可能需要終生治療-而且可能出現(xiàn)耐藥性突變株。
也已有免疫療法。一些免疫療法基于抗體的施用。當(dāng)單獨(dú)使用抗HBs抗體(“HBIG”)時(shí)，可具有治療作用，如肝臟移植對(duì)HBV感染所證明的那樣。蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)室(Protein Design Labs)正致力于使用人源化抗HBs抗體作Ig灌注治療。
其他免疫療法基于抗原施用。一種基于抗原的免疫療法利用了酵母表達(dá)的HBsAg和油/水乳液加RIBI和QS-21(SmithKline Beecham)。目前正在進(jìn)行慢性感染的二期試驗(yàn)。另一種利用PreS1+PreS2+S/明礬(Medeva)。還有另一種(現(xiàn)在正進(jìn)行150個(gè)病人的免疫療法試驗(yàn))使用PreS2+S/明礬(Institut Pateur)。另一種基于抗原的免疫療法利用核心蛋白衍生的肽，用于誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答(Cytel)。
仍然需要能改善慢性HBV感染的強(qiáng)效免疫療法。
發(fā)明簡(jiǎn)述在一方面，本發(fā)明涉及治療慢性HBV感染的方法，包括施用一種組合物，該組合物含有HBsAg的重組PreS2+S蛋白質(zhì)和一種可代謝的油佐劑，和可任選的抗病毒藥物或化合物。
另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種免疫治療藥盒，它包括HBsAg的PreS2+S蛋白質(zhì)、一種可代謝的油佐劑和可任選的抗病毒藥物或化合物。
附圖簡(jiǎn)述

圖1描述了具有感興趣的限制性位點(diǎn)的HBV基因組和用于制備表達(dá)質(zhì)粒的接頭。
圖2示意性描述了該克隆策略。
圖3a-b、4a-b和5a-b描述了三個(gè)病人的HBe/抗HBe(a)和血清ALT/HBV DNA(b)結(jié)果，第二個(gè)病人顯示短時(shí)突發(fā)加劇。
發(fā)明詳述本發(fā)明的實(shí)施可采用(除非另外說(shuō)明)病毒學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)的常規(guī)方法和本領(lǐng)域的重組DNA技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中已有全面論述，見(jiàn)例如Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual(第二版，1989)；DNAcloningA Practical Approach，卷I&II(D.Glover編)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan編，Academic Press，Inc.)；Handbook of ExperimentalImmunology，卷I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell編，Blackwell ScientificPublications)和Fundamental Virology，第二版，卷I&II(B.N.Fields和D.M.Knipe編)。
本發(fā)明涉及基于抗原的免疫療法，用于治療慢性HBV感染。如本文所用的“治療”包括改善和/或消除HBV感染，并刺激對(duì)其的免疫應(yīng)答，優(yōu)選抗-HBsAg或抗-HBe應(yīng)答。人HBV是感染鳥(niǎo)類(lèi)和哺乳類(lèi)物種的嗜肝性DNA病毒的嗜肝DNA病毒科的成員。外膜相關(guān)抗原HBsAg可誘導(dǎo)中和性保護(hù)抗體應(yīng)答。HBsAg由三種相關(guān)蛋白質(zhì)組成，它們具有共同的氨基酸序列-S、preS2+S和preS1+PreS2+S。
本發(fā)明中所用的含抗原的組合物含有HBV的PreS2+S抗原和一種可代謝性油佐劑。在一個(gè)實(shí)施例中，PreS2+S抗原是在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中重組產(chǎn)生的。在另一個(gè)優(yōu)選例中，該可代謝性油佐劑是下文所述的佐劑MF59。
在本發(fā)明的方法中，將上述組合物施給個(gè)體。可任選的，在施用該含抗原的組合物之前、同時(shí)或之后施用一種抗病毒藥物。在含抗原的組合物之前施用抗病毒藥物的時(shí)間可從1個(gè)月到24個(gè)月之間。慢性HBV患者中有大群感染的肝細(xì)胞。由于肝臟損傷主要是由于對(duì)受感染肝細(xì)胞的細(xì)胞免疫應(yīng)答引起的，已建議在其他治療前延長(zhǎng)抗病毒治療，以減少受感染肝細(xì)胞的數(shù)量(Genome，J.Clin.Invest.102(5)867-868，1988年9月)。另外，用抗病毒藥物降低循環(huán)性HBsAg的水平可通過(guò)減少游離抗原量，來(lái)減少免疫治療開(kāi)始后抗原-抗體復(fù)合物沉積的可能性。
可對(duì)存在慢性HBV感染的個(gè)體施用有效量的前述組合物。本文所用的術(shù)語(yǔ)“有效量”指實(shí)現(xiàn)治療所要的目的，而沒(méi)有不良副作用(如中毒、刺激或過(guò)敏反應(yīng))所需的量。雖然個(gè)體的需要可能不同，確定制劑有效量的最佳范圍是在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)的。人用劑量也不難從動(dòng)物研究中推導(dǎo)出(Katocs等，第27章于Remington’s Pharmaceutical Sciences，18版，Gennaro編，Mack PublishingCo.Easton，PA，1990)。通常，提供有效量的制劑所需的劑量(可由本領(lǐng)域技術(shù)人員調(diào)節(jié))隨幾種因素而變化，包括年齡、健康、生理狀況、體重、接受者所患疾病或異常的種類(lèi)或程度、治療頻率、同時(shí)治療(如果需要)的性質(zhì)、所需效果的性質(zhì)和范圍(Nies等，第三章于Goodman&Gilman’s The Pharmaceutical Basis ofTherapeutics，第9版，Hardman等編，McGraw-Hill，New York，NY，1996)?？紤]的劑量范圍為大約5-100微克。
還應(yīng)考慮可能需要多次施用該組合物。給藥之間的時(shí)間由給藥數(shù)量而定。例如，如果給藥兩次，第一次可在第0月，第二次分別在第1、2或6月。另外，可間隔一月給藥。多次給藥之間的時(shí)間不難由本領(lǐng)域技術(shù)人員決定。在一個(gè)實(shí)施例中給藥8次。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“給藥”包括但不限于透皮、胃腸道外、皮下、肌肉內(nèi)、口腔和局部遞送。任何途徑給藥的共同要求是有效且傳遞方便。在一個(gè)優(yōu)選例中，肌肉內(nèi)施用該組合物。
公開(kāi)本發(fā)明方法的目的是改善慢性HBV感染。這種改善可通過(guò)例如用核酸試驗(yàn)測(cè)定血液中HBV DNA的減少；用常規(guī)試驗(yàn)測(cè)定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)的減少；或用常規(guī)試驗(yàn)測(cè)定轉(zhuǎn)胺酶的短期突發(fā)增高。優(yōu)選本發(fā)明的治療將導(dǎo)致抗-HBe的出現(xiàn)和HBsAg的同時(shí)下降/消失，更優(yōu)選的是出現(xiàn)抗HBs同時(shí)伴有HBs的下降/消失。所有這些都可用常規(guī)免疫試驗(yàn)測(cè)定。對(duì)于本發(fā)明而言，正常ALT水平定為女性約6-34IU/L，男性約6-43IU/L。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“可代謝性油佐劑”指含有對(duì)所施用的個(gè)體無(wú)毒，且可被個(gè)體代謝的油性佐劑，該油優(yōu)選約6-30個(gè)碳原子，包括但不限于烷烴、烯烴、炔烴及其對(duì)應(yīng)的酸和醇、醚或酯，及其混合物。該油可以是任何可被宿主動(dòng)物機(jī)體代謝的植物油、魚(yú)油、動(dòng)物油或合成制備的油，它們可被施用的宿主動(dòng)物的身體代謝，對(duì)個(gè)體無(wú)毒。宿主動(dòng)物通常是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選是人。礦物油和類(lèi)似的有毒石油餾出油明確的排除在本發(fā)明之外。
植物油的示范性來(lái)源包括堅(jiān)果、種子和谷物?；ㄉ汀⒍褂?、椰子油、橄欖油這些最常見(jiàn)的油是堅(jiān)果油的例子。種子油包括紅花油、棉籽油、葵花子油、芝麻油等。在谷物類(lèi)中，玉米油是最容易得到的，但也可用其他谷物油如小麥、燕麥、黑麥、稻、畫(huà)眉草、黑小麥等。
獲得植物油的技術(shù)已得到了良好開(kāi)發(fā)并且是熟知的。這些和其他類(lèi)似的油的組分可在例如Merck Index和關(guān)于食物、營(yíng)養(yǎng)和食品技術(shù)的原材料中找到。
雖然6-10個(gè)碳的甘油和1，2-丙二醇的脂肪酸酯在種子油中天然不存在，但它們可通過(guò)水解、分離和酯化合適的來(lái)自堅(jiān)果和種子油的起始材料制備。這些產(chǎn)品可以NEOBEE(PVO International INc.，Chemical Specialties Division，416Division Street，Boongon，NJ)的商品名和其他廠商購(gòu)得。
還可在本發(fā)明的佐劑和免疫原性組合物中使用來(lái)自任何動(dòng)物來(lái)源的油。動(dòng)物油和脂肪通常在生理溫度下是固態(tài)的，因?yàn)樗鼈円愿视腿バ问酱嬖?，而且比魚(yú)或植物油的飽和度高。然而，可從動(dòng)物脂肪通過(guò)部分或完全皂化甘油三酯(其提供了游離脂肪酸)獲得脂肪酸。哺乳動(dòng)物奶的脂肪和油是可代謝的，因此可用于本發(fā)明的實(shí)施。從動(dòng)物來(lái)源獲得純油所需的分離、純化、皂化和其他方法是本領(lǐng)域熟知的。
許多魚(yú)含有不難回收的可代謝油。例如，鱈魚(yú)肝油、鯊魚(yú)肝油和鯨油如鯨蠟是幾種可在本文中使用的魚(yú)油的例子?？梢?碳異戊二烯單元生物化學(xué)方法合成許多支鏈油，通常稱(chēng)作萜。鯊魚(yú)肝油含有分枝的不飽和萜，稱(chēng)作鯊烯，2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳己烷，在本文中是特別優(yōu)選的。角鯊烯(鯊烯的飽和類(lèi)似物)也是特別優(yōu)選的油。魚(yú)油(包括鯊烯和角鯊烯)不難從商品來(lái)源獲得，或可用本領(lǐng)域已知的方法獲得。
這些佐劑和免疫原性組合物的油組分將以約0.5％-20％體積，優(yōu)選不大于約15％，特別是約1％-12％的量存在。最優(yōu)選的是采用約1％-4％油。
EP 0 399 843 B1描述了本文所考慮的可代謝性油佐劑，在此引入以供參考。優(yōu)選佐劑是比專(zhuān)利中和Ott等“MF59，人用疫苗的明智和強(qiáng)大的佐劑的設(shè)計(jì)和評(píng)價(jià)”第10章，pp.277-296，Vaccine DesignThe Subunit and Adjuvant Approach，Michael F.Powell和Mark J.Newman編，Plenum Press，New York，1995(在此引入以供參考)描述的MF59。特別是，MF59如下配制4.3％w/v的鯊烯、0.5％w/v的Tween 80、0.5％Span 85和400微克/毫升的MTP-PE(N-乙酰基胞壁?；?L-丙氨?；?D-異谷氨?；?L-丙氨酸-2-[1，2-二棕櫚基-錫-甘油酯-3-3(羥基磷酰氧基)]乙酰胺)。MF59的作用機(jī)制似乎是產(chǎn)生強(qiáng)CD4+T細(xì)胞應(yīng)答。
該佐劑還可以含有乳化和/或免疫刺激劑。在藥物科學(xué)中通常使用許多數(shù)量的乳化和懸浮劑。這些包括天然衍生的物質(zhì)如樹(shù)膠、植物蛋白質(zhì)、基于糖的聚合物如海藻酸鹽和纖維素等。某些在碳骨架上具有羥基或其他親水取代基的氧聚合物或聚合物具有表面活性，如聚乙烯吡啶酮、聚乙烯醇和甘油醚基的單或多功能化合物。長(zhǎng)鏈脂肪酸衍生的化合物形成可用于本發(fā)明的第三組乳化和懸浮劑。只要無(wú)毒，可用前述任何一種表面活性劑。
示范性免疫刺激劑包括能提高宿主免疫力的合成性佐劑，如左旋咪唑和異丙肌苷。左旋咪唑是四咪唑的左旋異構(gòu)體，其通過(guò)T-細(xì)胞依賴(lài)性機(jī)制加強(qiáng)體液和細(xì)胞免疫力。異丙肌苷，一種含有肌苷、腺嘌呤核苷和鳥(niǎo)嘌呤核苷的嘌呤前體的復(fù)合物，能促進(jìn)T細(xì)胞有絲分裂。促吞噬肽(Tuftsin)，一種4個(gè)氨基酸的肽(Thr-Lys-Pro-Arg)與免疫球蛋白(Ig)重鏈中的一序列同源，主要刺激巨噬細(xì)胞。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“個(gè)體”指動(dòng)物，通常是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“約”指±10％。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“一個(gè)”和“該”指單個(gè)或多個(gè)。
本文所用的“慢性HBV感染”通常指已持續(xù)超過(guò)急性階段的HBV感染。慢性感染可能是兒童或成年期內(nèi)獲得的慢性疾病引起的。疾病引起的慢性感染通?？赏ㄟ^(guò)HBSAg的存在和ALT水平的異常，以及伴有或不伴有可檢測(cè)水平的HBeAg來(lái)鑒定。正常的ALT水平通常范圍是10-32U/L(女性9-24U/L，嬰兒的正常范圍是成人的兩倍)(網(wǎng)頁(yè)On Hepatitis C International，“實(shí)驗(yàn)室血液檢測(cè)”7/10/98修改)。然而慢性感染還包括具有正常ALT的無(wú)癥狀的攜帶者；開(kāi)始用抗病毒藥物，如干擾素治療，使病毒降低到可檢測(cè)水平以下的病人；和肝臟移植后的病人，他們正在繼續(xù)抗病毒治療或接受Ig灌注。急性感染后持續(xù)超過(guò)6個(gè)月的HBsAg是慢性感染的特點(diǎn)。已在慢性感染的病人中記錄到有抗病毒T細(xì)胞應(yīng)答缺陷(Boni等，J.Clin.Invest.，102(5)968-975，1998年9月)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗病毒劑”或“抗病毒化合物”包括但不限于干擾素和核苷類(lèi)似物，包括拉米夫定。拉米夫定已被用于減少慢性HBV導(dǎo)致的肝臟損傷，可以每個(gè)病人可每天口服25-300毫克劑量，直到1年。然而合適的抗病毒藥物的劑量將具體取決于如藥劑和病人。
已顯示含有重組HBV PreS2+S抗原(10微克)和可代謝性水包油佐劑MF59的疫苗能增強(qiáng)其在成年人中的免疫原性(Poland等，37屆ICAAC，p.216，1997年9月28日-10月1日)。施用一劑疫苗后，89％測(cè)試個(gè)體產(chǎn)生了血清保護(hù)性抗HBs滴度。100％的測(cè)試個(gè)體在兩次注射后受到保護(hù)。另外，PreS2+S/MF59疫苗的幾何平均抗體滴度比含有鋁作為佐劑的對(duì)照疫苗高100倍(Poland等，見(jiàn)上)。本發(fā)明人預(yù)測(cè)可用相似的組合物作為免疫治療劑治療慢性HBV感染。
實(shí)施例1制備了含有重組PreS2+S和水包油佐劑MF59的組合物。如下制備了重組PreS2+S。Hyclone提供了全部培養(yǎng)液和補(bǔ)充劑。
通過(guò)用兩個(gè)接頭插入S+PreS2基因，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pKSVAdPreS-BglII(圖1-2)。構(gòu)建該重組表達(dá)系統(tǒng)中使用的克隆載體是Pharmacia的pKSV-10。pKSV-10載體長(zhǎng)7.2kb，克隆位點(diǎn)是BglII。如Valenzuela等，Nature，280815-819，1979年8月30日(在此引入以供參考)所述，分離得到病毒DNA。用HhaI部分消化病毒基因組DNA的約1880個(gè)bp的EcoRI/BglII片段，分離得到1230bp的EcoRI/HhaI片段。設(shè)計(jì)了接頭與EcoRI/HhaI片段連接，形成BglII/BglII片段，用于克隆入pKSV-10。然后將pKSV-10/BglII與Pre S BglII/BglII片段連接，得到DNA質(zhì)粒載體pKSVAdPreS-BglII。然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞HB101。篩選得到轉(zhuǎn)化株，進(jìn)行大量制備。
將dhfr序列插入pSV7d構(gòu)建了克隆載體pSV7d/AML-dhfr(Stibbe等，Virology，123436-442，1989，在此引入以供參考)。用pKSVAPres-BglII和pAML/dhfr共轉(zhuǎn)染DG44(dhgr-)CHO細(xì)胞(Urlaub等，PNAS USA，774216-4220，1980，從Chiron的Dr.Leslie Rall于1985年9月以傳代數(shù)約100獲得)。然后，在24孔微量滴定板中培養(yǎng)48個(gè)克隆。用Abbott ELISA法篩選克隆，用氨甲蝶呤選擇擴(kuò)增命名為PKSVAdPres 16的高產(chǎn)克隆，最終得到克隆PKSVAdPreS 16-12-80-30(縮寫(xiě)為HEP 30細(xì)胞)。擴(kuò)增HEP 30細(xì)胞，制備主/工作(Master/Working)細(xì)胞庫(kù)，命名為HBV B30細(xì)胞。
克隆HBV B30主細(xì)胞庫(kù)的細(xì)胞，在補(bǔ)充了6％透析的FBS和50μM氨甲蝶呤(MTX)的DME/F12培養(yǎng)液中擴(kuò)增。擴(kuò)增后通過(guò)幾步(在3升旋轉(zhuǎn)燒瓶中FBS濃度從6％到2％逐步下降)使細(xì)胞適應(yīng)MTX-DMEM/F12培養(yǎng)液。適應(yīng)后，將細(xì)胞接種在3L的攪拌灌流容器中，用DMEM/F12，2％FBS灌流。
然后將一些灌流細(xì)胞在50μM MTX的存在下亞克隆培養(yǎng)于DMEM/F12 10％FBS培養(yǎng)液中，在2％FBS和2μM MTX存在下通過(guò)多次振搖燒瓶傳代，使其適應(yīng)于HBV生產(chǎn)培養(yǎng)液。在第14代，測(cè)試亞克隆的生產(chǎn)性，以親本培養(yǎng)物小試管凍存(保藏在Chiron細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，編號(hào)為CMCC11336)。將這些細(xì)胞中的一些在DM122培養(yǎng)液中融化，然后在補(bǔ)充了200mM L-谷氨酰胺、1mM(1∶500)MTX的DM122培養(yǎng)液中擴(kuò)增。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到4.0-8.0×105活細(xì)胞/毫升時(shí)，將細(xì)胞在DM122、含10％人血清蛋白(w/v)+7.5％(v/v)DMSO中濃縮到1.0×109，等分到1毫升/試管，產(chǎn)生新的HBV Master細(xì)胞庫(kù)(MBVMK001)。以1℃/分鐘將這些細(xì)胞冷凍到-96℃，然后儲(chǔ)藏在≤-176℃。
如Ott等(見(jiàn)上，在此引入以供參考)所述，制備了作為無(wú)菌水包油乳液的MF59。將0.25毫升體積抗原中的10微克PreS2+S與0.25毫升MF59混合，最終劑量是0.5毫升。下文表1和2列出了該疫苗的成分。
表1HBV抗原組合物成分每最終劑量中的量PreS2+S抗原 0.02毫克氯化鈉，USP 3.80毫克檸檬酸鈉，二水合物，USP 2.15毫克檸檬酸，一水合物，USP 0.04毫克聚山梨醇酯80(Tween 80TM) 0.01毫克注射用水足量pH范圍6.0-7.0表2MF59佐劑組合物成分每最終劑量中的量鯊烯9.75毫克聚山梨醇酯80(Tween 80TM) 1.18毫克三油酸山梨醇酯(Span 85TM) 1.18毫克二水檸檬酸鈉，USP 2.15毫克一水檸檬酸，USP 0.04毫克注射用水足量pH6.4實(shí)施例2將500微升實(shí)施例1所述組合物肌肉內(nèi)注射到13個(gè)病人的三角肌中，這些病人通過(guò)持續(xù)存在HBsAg6個(gè)月以上而確定患有慢性HBV。8個(gè)病人HBe陽(yáng)性。全部13個(gè)病人血清ALT升高(高于1.2×ULN，即正常上限)，沒(méi)有代償失調(diào)的肝臟疾病證據(jù)。在第0、1、2和6個(gè)月給藥。通過(guò)測(cè)定HBV DNA、血清ALT水平降低，HBeAg水平降低，以及第二次給藥一個(gè)月后出現(xiàn)抗-HBe抗體而確定有效。用bDNA法測(cè)定了HBV DNA(Chiron和Chen等，J.Virol.Methods，53(1)131-7，1995年5月，在此完整引入以供參考)。用如下的化學(xué)發(fā)光免疫試驗(yàn)測(cè)量了HBeAg、抗-HBe、HBsAg和抗HBs水平。另見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,395,752，在此引入以供參考。以光密度單位(s/co)報(bào)道了結(jié)果。
為了測(cè)定HBeAg，將100微升血清人抗-HBe的乳液100微升偶聯(lián)有乳磁性顆粒(600微克/毫升)的混合，37℃培育18分鐘。加入100微升與DMAE(二甲基吖啶酯，300 30,000,000相對(duì)光單位，“RLU”每毫升)偶聯(lián)的人抗-HBe，37℃培育18分鐘。用緩沖液洗滌該顆粒3次，然后測(cè)定化學(xué)發(fā)光。所用的緩沖液具有下列成分50mM TRIS，pH8.0；500mM氯化鉀；0.09％疊氮化鈉；1mM EDTA；0.05％Tween20；和1.75％BSA，巰基修飾，用MILLIPAK-60 0.22微米濾器單位過(guò)濾。
為了測(cè)定HBsAg，用上述緩沖液1/100稀釋100微升血清，將其與100微升偶聯(lián)于順磁顆粒(對(duì)于抗體濃度分別為280微克/毫升和150微克/毫升)的小鼠抗-HBs(特異性結(jié)合HBsAg的抗“a”中和表位)以及與小鼠抗-HBs(抗“a”，75.0納克/毫升)偶聯(lián)的(用上述緩沖液稀釋)50微升DMAE混合，37℃培育18分鐘。用緩沖液洗滌顆粒3次，然后測(cè)定化學(xué)發(fā)光。
為了測(cè)定抗-HBe，將50微升血清和100微升重組HBeAG SOD融合蛋白(50納克/毫升)(見(jiàn)例如Choo等，Science，1989，244，359-362，在此引入以供參考)以及100微升偶聯(lián)于乳膠磁性顆粒(600微克/毫升)的人抗HBe混合，37℃培育36分鐘。加入與DMAE(300×10E 6 RLU/毫升)偶聯(lián)的100微升人抗-HBe，37℃培育18分鐘。用緩沖液洗滌顆粒3次，然后測(cè)定化學(xué)發(fā)光。所用的緩沖液具有下列組分100mM硼酸緩沖液，pH8.9；0.09％疊氮化鈉；5mM EDTA；0.05％TWEEN 20；和0.2％明膠(魚(yú))，用MILLIPAK-60、0.22微米濾器單元過(guò)濾。
用標(biāo)準(zhǔn)酶免疫試驗(yàn)法測(cè)定抗-HBs(Abbott)。
在8個(gè)最初HBe陽(yáng)性的病人中，4個(gè)在3-4次注射后誘導(dǎo)了HBeAg水平的顯著下降和抗-HBe抗體的產(chǎn)生，伴有HBV DNA和血清ALT的下降。圖3a-b、圖4a-b和圖5a-b描述了3個(gè)病人的數(shù)據(jù)。還在幾個(gè)病人中誘導(dǎo)了抗-HBs抗體的顯著水平，包括最初不存在HBe的病人(見(jiàn)例如表3-5，抗-HBs欄)。8個(gè)病人中的兩個(gè)顯示血清ALT在研究過(guò)程中顯著增加。兩者都被治愈。
進(jìn)一步隨訪后，13個(gè)病人中過(guò)半產(chǎn)生了抗-HBsAg。4個(gè)病人的血清轉(zhuǎn)化成抗HBe，4個(gè)血清轉(zhuǎn)化病人中3個(gè)變成HBV DNA陰性。
實(shí)施例3將500微升實(shí)施例1所述的組合物和100毫克拉米夫定在0時(shí)施給病人。實(shí)施例所述的另500微升組合物和另100毫克拉米夫定在1個(gè)月時(shí)施用。測(cè)定抗HBs滴度，以及檢測(cè)第二次給藥1個(gè)月后HBs的存在，來(lái)確定效果。如果可檢測(cè)的HBs仍然存在，進(jìn)行第三次給藥。重復(fù)該過(guò)程，直到不再檢測(cè)到HBs。
實(shí)施例4將100毫克拉米夫定在0時(shí)開(kāi)始施給病人，并每日一劑連續(xù)給藥。將500微升實(shí)施例1所述的組合物在第1、2、3和7月肌肉內(nèi)注射給病人。測(cè)定HBeAg和抗HBe滴度，并在施用實(shí)施例1的組合物后1月檢測(cè)HBV DNA來(lái)確定效果。如果仍然存在可檢測(cè)的HBe，進(jìn)一步施用實(shí)施例1的組合物。如果在再一次給藥后1月仍可檢測(cè)到HBe的存在，進(jìn)行另一次給藥。重復(fù)該過(guò)程，直到檢測(cè)不到HBe。
實(shí)施例5將500微升實(shí)施例1所述的組合物在0時(shí)施給病人。1月時(shí)施給該病人100毫克拉米夫定。測(cè)定抗HBs滴度，并在施用實(shí)施例1的組合物后1月檢測(cè)HBs和HBe的存在，以確定效果。如果仍然存在可檢測(cè)的HBs，第二次施用實(shí)施例1的組合物。如果仍可檢測(cè)到HBs或HBe的存在，進(jìn)行第三次給藥。重復(fù)該過(guò)程，直到檢測(cè)不到HBs。
實(shí)施例6每日施用100毫克拉米夫定6個(gè)月。將500微升實(shí)施例1所述的組合物在第7、8、9和13月施給病人。如果存在可檢測(cè)的HBs或HBe，進(jìn)一步給藥。
實(shí)施例7材料ChironHBV/MF59抗原CHO細(xì)胞產(chǎn)生和純化的重組HBV PreS2+S(20微克/劑量)。佐劑MF59，顯微液化的水包油乳液。以分開(kāi)的小管提供抗原和MF59，在注射時(shí)混合。肌肉內(nèi)注射每劑總體積0.5毫升。時(shí)間表包括在0-、1-、2-和6-月施用4次(表6)。
拉米夫定(Epivir，Glaxo Wellcome)病人必須在開(kāi)始ChironHBV/MF59治療前已治療了至少1個(gè)月。拉米夫定此后(即第四次注射后1個(gè)月)以ChironHBV/MF59治療前的劑量水平(每日100毫克-300毫克)持續(xù)7個(gè)月。
效力測(cè)定在本研究結(jié)束時(shí)，測(cè)定具有下列參數(shù)的病人比例HBsAg消失或減少，HBeAg消失和抗HBs或抗HBe血清轉(zhuǎn)化。用ChironHBV/MF59預(yù)先治療后HBV DNA水平和血清ALT/AST的變化將在ChironHBV/MF59治療期間和之后進(jìn)行總結(jié)。對(duì)于本公開(kāi)內(nèi)容，所得到的效力數(shù)據(jù)限于所選的時(shí)間點(diǎn)，未進(jìn)行全面分析。
方法將含有重組PreS2+S抗原和MF59的組合物(一種水包油佐劑)，即ChironHBV/MF59)(表2)施給患有慢性HBV感染，接受拉米夫定的病人。病人在0、1、2、6月肌肉內(nèi)接受4次ChironHBV/MF59注射。病人在ChironHBV/MF59注射的6個(gè)月內(nèi)持續(xù)用拉米夫定治療，并在第四劑后再接受拉米夫定1個(gè)月，然后停用拉米夫定。
合格病人包括慢性HBV感染病人(通過(guò)至少6個(gè)月血清HBsAg陽(yáng)性和篩選檢測(cè)HBsAg陽(yáng)性的歷史確定)，其具有代償性肝臟疾病，正接受拉米夫定或是篩選時(shí)開(kāi)始拉米夫定治療的候選人。在篩選時(shí)用拉米夫定治療的病人在施用第一劑ChironHBV/MF59前至少接受了拉米夫定治療一個(gè)月。這些病人以其研究前的劑量繼續(xù)接受拉米夫定(100-300毫克/日)。篩選時(shí)未接受拉米夫定治療的病人開(kāi)始ChironHBV/MF59之前，至少治療至少一個(gè)月。這些病人以100毫克/日的批準(zhǔn)劑量接受拉米夫定。參與病人中排除了根據(jù)病史、體檢、臨床實(shí)驗(yàn)室評(píng)估或先前肝臟活體檢查有證據(jù)顯示患有代償性差或晚期肝臟疾病的所有病人。
可能的病人在正式加入研究前1-8周內(nèi)經(jīng)歷了最初篩選，期間采取了他們的病歷、體格檢查和血和尿樣。在篩檢時(shí)獲得了下列HBV感染的血清學(xué)和病毒學(xué)參數(shù)(定性和定量測(cè)定)數(shù)據(jù)HBsAg、HBeAg、抗HBs和抗HBe。其他試驗(yàn)包括肝功能檢測(cè)(LFT)ALT、AST、堿性磷酸酶、膽紅素(總的和直接)、凝血酶原時(shí)間、總蛋白質(zhì)和白蛋白；全血計(jì)數(shù)(CBC)；和尿的蛋白質(zhì)、血液分析和糞便。用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)定量測(cè)定HBV DNA水平。如果有證據(jù)證明在篩選前或在篩選時(shí)(根據(jù)提高的HBV DNA水平)有拉米夫定耐藥性突變株，排除這類(lèi)病人。篩選調(diào)查時(shí)其他臨床實(shí)驗(yàn)室測(cè)試包括抗HCV抗體、抗HIV抗體和肝炎δ抗體。將這些抗體任一陽(yáng)性的病人從參加者中排除出去。
除了包括和排除的標(biāo)準(zhǔn)外，在本研究篩選調(diào)查時(shí)未接受拉米夫定治療的可能合格病人必須符合下列額外的標(biāo)準(zhǔn)才能合格血清ALT比正常上限高1.2倍，用bDNA試驗(yàn)測(cè)定HBV DNA高于0.7MEq/毫升。篩選調(diào)查時(shí)收集的血樣獲得了這些實(shí)驗(yàn)值。
符合所有包括標(biāo)準(zhǔn)并且無(wú)任何排除標(biāo)準(zhǔn)(包括臨床實(shí)驗(yàn)測(cè)試的結(jié)果)的病人回來(lái)接受其首次肌肉內(nèi)注射。每次注射后觀察30分鐘，觀察其是否有局部和全身反應(yīng)癥狀。他們填寫(xiě)日記卡片，描述注射后7日的局部(如注射部位疼痛、發(fā)熱、紅斑、硬化等)和全身(如疲勞、不舒服、發(fā)熱、發(fā)冷、肌肉疼痛、關(guān)節(jié)痛、惡心、頭痛、皮疹)反應(yīng)。病人保持記日記卡片，記錄醫(yī)療問(wèn)題和7日期間服的藥物。如果在實(shí)驗(yàn)中任何時(shí)間，病人經(jīng)歷任何可能與治療相關(guān)的不尋常、嚴(yán)重或重度不良事件，讓他們立即來(lái)診所就診。在第二、三和四次注射(如分別為1個(gè)月、2個(gè)月和6個(gè)月)前14日讓病人看醫(yī)生，以在接受下一次注射前進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)測(cè)試(LFT、尿分析、肌酸)檢查。
第一次注射ChironHBV/MF59七個(gè)月后停止施用拉米夫定。在7.5、8、9、10.5個(gè)月時(shí)病人回醫(yī)院作臨床和實(shí)驗(yàn)室隨訪。
在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中從ChironHBV/MF59開(kāi)始到最終訪問(wèn)監(jiān)測(cè)所有不良事件(AE)。記錄了整個(gè)實(shí)驗(yàn)中所用的全部處方藥物。
病人數(shù)量計(jì)劃和實(shí)際招募為24人。所有病人接受4次ChironHBV/MF59注射。
表6注射發(fā)生日免疫#1#免疫的 24(100％)免疫#2 第一次免疫接種后天數(shù)平均 31.7中位數(shù)28.0標(biāo)準(zhǔn)誤差 11.3最小 21最大 66數(shù)目 24免疫#3 第一次免疫接種后天數(shù)平均 60.7中位數(shù)56.0標(biāo)準(zhǔn)誤差 12.4最小51最大94數(shù)目24免疫#3第二次免疫接種后天數(shù)平均29.0中位數(shù) 28.0標(biāo)準(zhǔn)誤差3.2最小23最大39數(shù)目24免疫#4第一次免疫接種后天數(shù)平均180.0中位數(shù) 180.5標(biāo)準(zhǔn)誤差9.1最小168最大198數(shù)目24免疫#4第二次免疫接種后天數(shù)平均148.3中位數(shù) 148.0標(biāo)準(zhǔn)誤差11.4最小119最大168數(shù)目24免疫#4第三次免疫接種后天數(shù)平均119.3中位數(shù) 120.0標(biāo)準(zhǔn)誤差11.5最小表7篩選時(shí)病人統(tǒng)計(jì)和病人特征特征病人數(shù)目(總共24個(gè)病人)HBsAg陽(yáng)性24(100％)抗HBs陰性 20(83％)陽(yáng)性 4(17％)HBeAg陰性 9(38％)陽(yáng)性 14(58％)其他 1(4％)抗HBe陰性 15(65％)陽(yáng)性 8(33％)其他 1(4％)丙肝陰性 24(100％)肝炎δ感染陰性 24(100％)HIV感染無(wú)反應(yīng)性 24(100％)ALT(U/L)平均 69.5中位數(shù) 49.0標(biāo)準(zhǔn)誤差 64.7最小 17最大 276數(shù)目 24結(jié)果總結(jié)病人特征和統(tǒng)計(jì)病人平均年齡42歲(27-63歲)。24個(gè)病人中20人(83％)男性。13個(gè)病人(54％)是亞裔，9(38％)個(gè)是高加索人，1人是美國(guó)黑人，一人是混血兒。在招募時(shí)，14(58％)人HBeAg陽(yáng)性，而8(33％)人抗HBe陽(yáng)性(用EIA和Abbott檢測(cè))；一個(gè)病人的數(shù)據(jù)未得到，另一個(gè)病人兩者都是陰性。招募時(shí)平均血清ALT水平70IU/L(范圍17-276IU/L)(表7)。使用拉米夫定的平均持續(xù)時(shí)間在接受第一次注射ChironHBV/MF59之前是7.7個(gè)月(范圍1-33個(gè)月)(表7)。24個(gè)病人中16人在參加該試驗(yàn)前接受了拉米夫定外的其他治療。這些治療包括干擾素(包括干擾素-a和CIFN形式)、法昔洛韋(famciclovir)和乙肝疫苗(CV-1899)(表9)。
在2000年1月1日，所有24名病人接受了全部4次ChironHBV/MF59注射。已跟蹤了22名病人中斷拉米夫定至少2個(gè)月。在這22個(gè)病人中，5個(gè)病人的數(shù)據(jù)收集至10.5個(gè)月，而兩個(gè)病人完成了整個(gè)研究(第12月)。
表8拉米夫定施用招募前拉米夫定持續(xù)時(shí)間月平均7.67中位數(shù) 5.35標(biāo)準(zhǔn)誤差7.78最小0.9最大33.3數(shù)目24使用拉米夫定的總持續(xù)時(shí)間 月平均14.46中位數(shù) 12.25標(biāo)準(zhǔn)誤差7.72最小7.6最大40.3數(shù)目24表9試驗(yàn)前除了拉米夫定外的肝炎治療治療病人干擾素 101，601，602干擾素α201，203，204，208，401，402，403，404，501干擾素(CIFN(共同序列干擾素))202法昔洛韋102，602乙肝疫苗(CV-1899) 101，207臨床實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)盡可能廣泛的收集了研究前血清ALT水平的歷史信息。每個(gè)病人所得數(shù)據(jù)的時(shí)間和數(shù)量不同。許多病人隨著時(shí)間變化ALT水平廣泛波動(dòng)，包括在接受拉米夫定前的研究中ALT水平顯著提高。在24個(gè)病人中，9個(gè)記錄有研究前肝炎突發(fā)加劇的癥狀，血清ALT水平峰值為700IU/L以上。這9個(gè)病人中的ALT水平峰值中位數(shù)是1035IU/L，范圍是782IU/L-3116IU/L。
血清ALT水平在大部分病人中，在篩選時(shí)或在參加研究的最初7個(gè)月中正?；蛏赃^(guò)高(小于正常上限的2倍)。這可預(yù)期到，因?yàn)樵诖似陂g所有病人都接受拉米夫定。在兩個(gè)病人(205和601)中，血清ALT水平持續(xù)不正常，研究中接受拉米夫定時(shí)記錄的最高ALT水平分別是112IU/L和119IU/L。兩個(gè)病人都在接受拉米夫定時(shí)用bDNA試驗(yàn)檢測(cè)到HBV DNA，病人601顯示接受拉米夫定時(shí)HBV DNA水平顯著升高，提示可能產(chǎn)生了拉米夫定耐藥性突變株。
表10和11總結(jié)了血清ALT水平的數(shù)據(jù)。表10顯示拉米夫定中斷后24個(gè)病人中22的最高ALT水平，其數(shù)據(jù)直到最近調(diào)查才得到。在10個(gè)病人中，最高ALT值低于50IU/L。6個(gè)病人的最高ALT值在50-100IU/L之間，5個(gè)病人的最高值在101-200IU/L之間，一個(gè)病人(502)具有峰ALT值＞200IU/L，峰水平為1870IU/L。在12個(gè)最高ALT水平大于50IU/L的病人中，中斷拉米夫定后最高的ALT值與招募入該研究之前記錄的最高歷史值相當(dāng)(表11)。除了一個(gè)病人(502)，所有病人在中斷拉米夫定后具有最高ALT水平，其比記錄的研究前最高值低(22個(gè)病人中的10個(gè))或相當(dāng)(22個(gè)病人中的1個(gè))。
病人502顯示拉米夫定中斷后早期病毒感染復(fù)發(fā)，在10.5個(gè)月時(shí)緩解。中斷拉米夫定治療后一個(gè)月(第8個(gè)月)，HBV DNA水平升高至511mEq/毫升，ALT水平升高至63IU/L，表明發(fā)生了早期病毒感染復(fù)發(fā)。中斷拉米夫定治療后兩個(gè)月(第9個(gè)月)，病人502的ALT水平峰值為1870IU/L，然而，HBV DNA的水平下降到118mEq/毫升。第9個(gè)月后，病人502的ALT水平在10.5個(gè)月時(shí)穩(wěn)定下降到46IU/L。
表10中斷拉米夫定后最高Alt水平最高ALT水平(拉米夫定治 病人數(shù) 病人編號(hào)療中斷后期間) (N＝22)≤50IU/L10101，102，201，202，203，207，403，404，505,60251IU/L-100IU/L 6204，206，401，501，503，601101IU/L-200IU/L5205，402，504，603，604＞200IU/L 1502表11拉米夫定治療中斷后最高ALT水平大于50IU/L的病人的研究前最高ALT水平和拉米夫定中斷后最高ALT水平病人編號(hào)研究前最高血清ALT水平拉米夫定治療中斷后隨訪期(N＝12) (IU/L) 間血清最高ALT水平(IU/L)204 342 54205 141 144206 271 52401 328 77402 400 125501 112 57502 810 1870503 62 53504 924 167601 339 69603 299 130604 285 155定量HBV DNA評(píng)價(jià)獲得有限數(shù)量時(shí)間點(diǎn)的定量HBV DNA水平數(shù)據(jù)。三個(gè)病人(402、504和601)在接受拉米夫定時(shí)HBV DNA顯著增加(＞100倍)。這種增加的可能原因是出現(xiàn)了對(duì)拉米夫定有耐藥性的HBV逃逸突變株。將進(jìn)行這些樣品的HBV基因定型。得到了16個(gè)于第8和第9月測(cè)定了HBV DNA水平的病人關(guān)于在拉米夫定中斷治療后病毒復(fù)發(fā)的早期信息。這16個(gè)病人中，七人(401、403、404、501、503、504、505)在第8或9個(gè)月(拉米夫定中斷后一或兩個(gè)月)的HBV DNA水平在bDNA試驗(yàn)檢測(cè)水平以下。其中一個(gè)病人(504)在拉米夫定治療同時(shí)可能產(chǎn)生了逃逸突變株(第7月時(shí)HBV DNA水平是577MEq/ml)，但是他在隨訪期間后來(lái)變成HBV DNA陰性。其余9個(gè)測(cè)定了HBV DNA的病人在中斷拉米夫定治療后具有可檢測(cè)的HBV DNA。
表12研究前和末次注射后的最高HBeAg水平和抗HBe水平研究前最高水平 研究后最高水平病人HBeAg(IU/ml) 抗HBe(IU/ml) HBeAg(IU/ml) 抗HBe(IU/ml)10116.4 1.630.2 1.81020.2 9.9＜0.1 46.4201＜0.1 41.5 ＜0.1 47.0202＜0.1 36.9 ＜0.1 24.2203＜0.1 5.2＜0.1 5.72041.0 4.51.9 3.2205＜0.1 122.6 ＜0.1 137.32061.9 5.718.4 2.72079.7 2.918.9 2.42083.3 4.617.8 2.5401＜0.1 44.1 ＜0.1 68.84020.2 4.10.4 4.2403＜0.1 419.7 ＜0.1 355.54041.2 5.0＜0.1 4.5501＜0.1 261.9 ＜0.1 338.25021.4 4.313.0 2.85030.2 62.1 1.1 17.15041.9 3.83.8 2372.05053.1 4.4＜0.1 30.760114.7 1.817.6 1.86022.9 4.3＜0.1 5.2603＜0.1 274.2 ＜0.1 162.0604＜0.1 165.1 ＜0.1 205.5定量HBeAg和抗HBe評(píng)價(jià)評(píng)價(jià)了關(guān)于HBeAg和抗HBe水平量的改變的有限數(shù)據(jù)。用內(nèi)部EIA測(cè)定了HBeAg和抗HBe滴度。內(nèi)部HBeAg試驗(yàn)的檢測(cè)下限與商品EIA(Abbott)相等。在14個(gè)篩選時(shí)HBeAg陽(yáng)性的病人(即＞0.1)中，4個(gè)病人(102、404、505和602)在末次注射后HBeAg低于檢測(cè)極限。這4個(gè)病人中的兩個(gè)(102和505)抗HBe滴度也顯著增加(大于4倍)。
上述實(shí)施例是為了說(shuō)明本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到各修改都在如附加權(quán)利要求中舉例說(shuō)明的本發(fā)明精神和范圍內(nèi)。
全部參考文獻(xiàn)在此引入以供參考。
權(quán)利要求
1.一種治療慢性乙型肝炎病毒感染的方法，其特征在于，所述方法包括施給個(gè)體有效量的組合物，所述組合物含有PreS2+S抗原和可代謝性油佐劑。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，以每劑約5-100微克施用PreS2+S抗原。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，以每劑約20微克施用PreS2+S抗原。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，施用PreS2+S抗原1次以上。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，施用PreS2+S抗原8次。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，施用PreS2+S抗原4次。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，施用PreS2+S抗原直到HBV感染改善。
8.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，施用PreS2+S抗原直到HBV感染被消除。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，通過(guò)測(cè)定血清組分濃度的降低來(lái)確定HBV感染的改善，所述組分選自HBV DNA、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、HBsAg和HBeAg。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，通過(guò)測(cè)定血清組分濃度的增加來(lái)確定HBV感染的改善，所述組分選自抗HBs和抗HBe。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，通過(guò)測(cè)定血清ALT濃度降到正常水平來(lái)確定HBV感染的改善。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述PreS2+S抗原是在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中重組產(chǎn)生的。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述可代謝性油佐劑是MF59。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該方法還包括施用抗病毒藥物或化合物。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述抗病毒藥物是拉米夫定。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，每日施用拉米夫定約100-300毫克。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，每日施用拉米夫定約100毫克。
18.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述抗病毒藥物在施用PreS2+S抗原前至少施用一個(gè)月。
19.一種治療慢性乙型肝炎感染的藥盒，其特征在于，該藥盒包括一種含有重組PreS2+S抗原的組合物，所述藥盒還含有抗病毒藥物或化合物，和含有可代謝性油佐劑的組合物。
20.如權(quán)利要求20所述的藥盒，其特征在于，所述可代謝性油佐劑是MF59。
21.如權(quán)利要求19或20任一項(xiàng)所述的藥盒，其特征在于，重組PreS2+S抗原在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中產(chǎn)生。
全文摘要
描述了治療慢性HBV感染的方法和藥盒。使用了含有HBV的PreS2+S抗原,以及可代謝性油佐劑的組合物。
文檔編號(hào)A61K39/29GK1365286SQ00810900
公開(kāi)日2002年8月21日 申請(qǐng)日期2000年6月22日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月22日
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