專利名稱：黃(嘌呤核)苷多晶型物的制備及其使用方法
本申請是1987年5月15日提交的申請?zhí)枮镹o，“黃苷多晶型物的制備及其使用方法”申請案的部分連續(xù)申請。也請注意申請?zhí)枮镹o.申請日為1987年5月26日，名稱為“肌苷多晶型物的制備及其使用方法”的申請人的同時待批專利申請。
同一種物質(zhì)的幾種晶態(tài)形式的現(xiàn)象稱之為晶體的多晶型現(xiàn)象。各種晶體的多晶型物在化學(xué)上是等同的，但具有不同的晶體結(jié)構(gòu)和物理-化學(xué)性質(zhì)。
黃苷的兩種晶體的多晶型物已為人們公知。兩種多晶型物之一是二水合態(tài)黃苷。使用于制備這種形態(tài)的黃苷的最后的結(jié)晶步驟中包括加熱含有2%的黃苷的懸浮水溶液，直至于約100℃時生成肌苷溶液。緊接步驟是沉淀和收集黃苷。所制備的晶體呈長棱柱形，該晶體加熱后分解並且沒有非常確定的融點(diǎn)范圍。本文中所定義的“標(biāo)準(zhǔn)黃苷”是黃苷的二水合物，它是使用這種結(jié)晶步驟作為最后步驟而制備的。
除二水合黃苷形式外，第二種黃苷多晶型物是已知的無水形式。這種形式的黃苷由酒精中結(jié)晶，形成粘結(jié)的團(tuán)(瘤)。它也在加熱后分解並且沒有明確的融點(diǎn)范圍。
從能量角度考慮，溶液狀態(tài)的多晶型物長期以來認(rèn)為是不容許的。一般假設(shè)認(rèn)為在一種溶劑的分子並不知其初始態(tài)，一種化合物的所有晶體的多晶型物得到的溶液具有相同的性質(zhì)。這一結(jié)論是基于以下假設(shè)晶體所有分子間固態(tài)鍵起始就不能釋放為形成溶液狀態(tài)所必需的潛能?；镜娜芤哼^程可能就是隨后溶質(zhì)的聚結(jié)，而已假設(shè)溶質(zhì)的各種聚結(jié)態(tài)之間并不存在能壘。確實(shí)，核苷，例如黃苷，在水溶液中聚結(jié)的趨向已被人們公知多年了。據(jù)報道，這種締合基本上只有通過垂直基底的堆積產(chǎn)生。然而，已做出假設(shè)認(rèn)為溶液中核苷分子的各種聚結(jié)形態(tài)間并不存在能壘，而單體是在溶液中最常見的核苷形式。
此外，盡管單體嘌呤核苷可以大概地假設(shè)由于自發(fā)的鍵旋轉(zhuǎn)而有20～26種不同的空間構(gòu)象，但已假定在水溶液中這些形式是在瞬時地變換著。鄰接構(gòu)象間的能壘認(rèn)為是不重要的，因?yàn)榕c上述的基底的堆積不同、假設(shè)能壘是來自溶劑和溶質(zhì)之間的一個氫鍵能，溶質(zhì)間不是締合形式，並且對嘌呤核苷來說氫鍵是人們已預(yù)期到的。
Agafonov，Leonidov和Kobzareva〔ZhurnalObshcheiKhimii，50，166(1980)〕(以下寫成Agafonov)指出，通過兩種不同的有機(jī)溶劑重結(jié)晶所制備的兩種已知形態(tài)的脫氫皮醇是晶體的多晶型物，它們具有不同的物理-化學(xué)性質(zhì)，包括不同的溶解速率和不同的溶解度。Agafonov進(jìn)一步指出這兩種脫氫皮醇的晶體多晶型物在乙醇的溶液中顯示出不同的旋光色散(ORD)譜圖。盡管作者已指出兩種多晶型物旋光色散(ORD)譜圖的差異並不能作為構(gòu)象分析的標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)橛泻芨叩谋尘白x數(shù)，但他們推測這種差別確實(shí)反映出兩種溶質(zhì)的晶體多晶型物的不同構(gòu)象，並且這些構(gòu)象差異導(dǎo)致生物可及性(進(jìn)入動物生物流質(zhì)的速率)的差異和脫氫皮醇兩種多晶形式的活性差異。
Leonidov〔RussianJournalofPhysicalChemistry，59，760(1985)〕(以下寫成Leonidov)指出某些有機(jī)化合物(5，5-二乙基巴比妥酸、對氨基苯磺胺、脫氫可地松、咖啡堿和L-樟腦(L-Camphor)的晶體多晶型物當(dāng)放入特定的有機(jī)溶劑的溶液中(三氯甲烷、乙醇和二甲基甲酰胺)顯示出不同的折射系數(shù)和折射率橢球數(shù)值。Leonidov所報道的這兩種光學(xué)性質(zhì)的差別非常小(折射系數(shù)偏差約0.01～0.07%，折射率橢球偏差為0.04～0.21%)。Leonidov提出，一種化合物的多晶型物的變型在晶態(tài)結(jié)構(gòu)方面有差別，而當(dāng)進(jìn)入溶液后是相同的這一原則，最終也許不適用于有機(jī)物質(zhì)，所報道的某些藥物的生物活性的差異，可由溶液中化合物的不同晶體多晶型物的變型而得以解釋。
然而，Leonidov和Agafonov報道的所有光學(xué)性質(zhì)的變化僅在有機(jī)溶劑中觀察到。這兩種刊物都未報道多晶型物在水溶液中光學(xué)性質(zhì)的變化。水是生物學(xué)中的重要溶劑，具有根本不同于其他液體的性質(zhì)。由Leonidov和Agafonov所報道的結(jié)果中完全不可預(yù)測到是否溶質(zhì)的多晶型物可用水作為溶劑而得到。此外，Leonidov和Agafonov僅僅是推測相同化合物的多晶型物可能具有不同的生物活性，但未給出數(shù)據(jù)支持這一理論。
盡管他們並未論及多晶型物現(xiàn)象，但美國專利3，646，007，3，728，450，3，857，940和4，512，981卻公開了肌苷和具有下式的低烷基氨基醇的復(fù)合物
其中，R1和R2是低級烷基，n是2-4的正數(shù)。該復(fù)合物是通過在室溫下以1∶1～10∶1的比率將肌苷和烷基氨基醇混合而制得。復(fù)合物也可在上述的比例和室溫下，通過混合肌苷和烷基氨基醇的鹽類制得，烷基氨基醇的鹽類是由烷基氨基醇與藥理學(xué)可接受的酸反應(yīng)而形成。在復(fù)合物形成過程中，不用加熱，也無中和或其他化學(xué)反應(yīng)發(fā)生或復(fù)合物的形成不需加熱。這些復(fù)合物具有藥理作用，包括抗病毒、消炎和免疫調(diào)節(jié)作用以及恢復(fù)損壞的學(xué)習(xí)和記憶行為的能力。
按照本發(fā)明的一個方面，提供了一種制備黃苷鹽晶體多晶型物的方法，該方法包括提供一種溶劑;
將一定量的黃苷加入溶劑中;
將等摩爾量的一種強(qiáng)堿加入黃苷中;
以預(yù)定的速率加熱溶劑、堿和黃苷到足以使黃苷進(jìn)入溶液並足以克服阻止黃苷由一種多晶型物構(gòu)型轉(zhuǎn)變成變一種構(gòu)型的能壘的溫度;
沉淀黃苷鹽;
以預(yù)定的速率在預(yù)定的時間內(nèi)冷卻該鹽並完全冷凍干燥以產(chǎn)生黃苷鹽的晶體多晶型物。
本發(fā)明也包括一種等同于上述方法的合成黃苷晶體多晶型物的方法，所不同的是，不加額外的熱量，單由中和反應(yīng)所產(chǎn)生的熱量使溫度上升到足以克服由一種黃苷多晶型物構(gòu)型轉(zhuǎn)變到另一種的能壘所需溫度。在這兩種方法的某些合成條件下，黃苷鹽的沉淀是自發(fā)的，而在另外一些條件下，需采用外加的步驟使之沉淀。特別優(yōu)選的堿是堿金屬氫氧化物和烷基氨基醇類例如膽堿和二甲氨基異丙醇。
由這些方法所制備的晶體多晶型物也是本發(fā)明的部分內(nèi)容。
按照本發(fā)明的另一個方面，提供了黃苷鹽類的溶質(zhì)多晶型物。將一種與另一種以及與標(biāo)準(zhǔn)黃苷溶質(zhì)形態(tài)相比較，這些多晶型物表現(xiàn)出具有不同的物理-化學(xué)性質(zhì)，這些性質(zhì)反映他們不同的構(gòu)型。與標(biāo)準(zhǔn)黃苷相比較，本發(fā)明的這些溶質(zhì)多晶型物也表現(xiàn)出極為不同的生物活性。
本發(fā)明也提供了一種制備黃苷鹽溶質(zhì)多晶型物的方法，該方法包括提供一種溶劑;
將一定量的黃苷加入溶劑中;
將等摩爾量的一種強(qiáng)堿加入黃苷中;
以預(yù)定的速率加熱溶劑、堿和黃苷到溫度足以使黃苷進(jìn)入溶液並足以克服阻止黃苷轉(zhuǎn)變成另一種多晶型構(gòu)型的能壘，然后以預(yù)定的速率在預(yù)定的時間內(nèi)冷卻該溶液。
本發(fā)明也包括一種與上述方法相同的制備黃苷溶質(zhì)多晶型物的方法，不同的是不用加入額外的熱量，由中和反應(yīng)所產(chǎn)生的熱使溫度上升到足以克服使黃苷由一種多晶型物構(gòu)型轉(zhuǎn)變成另一種的能壘的溫度。黃苷鹽類的溶質(zhì)多晶型物進(jìn)而可通過將上述本發(fā)明的黃苷晶體多晶型物溶解在一種溶劑中而制得。
按照本發(fā)明的另一個方面，提供了黃苷的晶體和溶質(zhì)多晶型物。
按照本發(fā)明的再一方面，提供了具有下列結(jié)構(gòu)式的新型黃苷鹽類(Xs)-(CB)+式中，Xs是黃苷鹽離子，CB是強(qiáng)堿陽離子。
最后，提供了(1)調(diào)節(jié)動物免疫反應(yīng)的方法，該方法包括給動物服用一種組合物，該組合物含有一種藥理上可接受的溶劑或載體和一種有效量的黃苷的溶質(zhì)或晶體多晶型物，或一種黃苷鹽的溶質(zhì)或晶體多晶型物;以及(2)用于這一方法的組合物。
本文中所使用的術(shù)語“構(gòu)象”指黃苷或黃苷鹽單體單元結(jié)構(gòu)上的區(qū)別，例如核糖環(huán)由椅式向船式轉(zhuǎn)變。本文所用術(shù)語“構(gòu)型”指與黃苷或黃苷鹽單體單元之間締合的不同類型相關(guān)的構(gòu)象上的差別。
本文所使用的“黃苷”指所有形式的黃苷，包括已知的黃苷晶體多晶型物和本發(fā)明的新型晶體和溶質(zhì)多晶型物。然而，申請人並不想把已知黃苷晶體多晶型物作為本發(fā)明的部分內(nèi)容，這部分特別聲明放棄要求保護(hù)。
本文使用的“黃苷鹽”(Xanthosinate)或“黃苷鹽”(XanthosineSalt)是指由黃苷與一種強(qiáng)堿中和反應(yīng)制備的所有黃苷鹽類。
本文所定義的“標(biāo)準(zhǔn)黃苷鹽”是指通過在低濃度(1毫克/毫升)水溶液中，加入等量摩爾的氫氧化鈉在攪拌下但不加熱也無熱量產(chǎn)生，中和三小時以上的標(biāo)準(zhǔn)黃苷。


圖1是條線圖，該圖示出當(dāng)鹽濃度由2.7×10-4摩爾到0.4摩爾變化時，某些鹽類的pH值提高。
圖2是黃苷鹽和三種溶質(zhì)黃苷鹽多晶型物的濃度與相對消光系數(shù)關(guān)系的曲線圖，該圖示出由這些化合物造成的對比爾定律的偏離。
圖3是標(biāo)準(zhǔn)黃苷的X-射線粉末衍射花樣。
圖4是晶體黃苷鹽多晶型物NaXs-Ⅰ的X-射線粉末衍射花樣。
圖5是晶體黃苷鹽多晶型物NaXs-Ⅱ的X-射線粉末衍射花樣。
圖6是晶體黃苷鹽多晶型物ChXs-Ⅰ的X-射線粉末衍射花樣。
圖7是晶體黃苷鹽多晶型物ChXs-Ⅱ的X-射線粉末衍射花樣。
圖8表示黃苷鹽多晶型物ChXs-Ⅰ、ChXs-Ⅱ、NaXs-Ⅰ和DMAIPXs水溶液的旋光色散譜圖。
圖9是在用幾種黃苷鹽溶質(zhì)多晶型物處理過的小鼠經(jīng)過致死輻照后，死亡率和時間關(guān)系曲線圖。
圖10示出使用不同劑量的黃苷鹽溶質(zhì)多晶型物ChXs-Ⅰ、ChXs-Ⅱ以及氯化膽堿和標(biāo)準(zhǔn)黃苷的混合物對胰蛋白酶爪墊水腫的抑制作用。
本發(fā)明包括新型黃苷溶質(zhì)和晶體多晶型物以及新型黃苷鹽溶質(zhì)和晶體多晶型物。用本發(fā)明方法所產(chǎn)生的變化只可能是立體化學(xué)性質(zhì)的，即只是對形成黃苷的同分異構(gòu)、互變異構(gòu)和旋光異構(gòu)系統(tǒng)有作用的官能團(tuán)和其他化學(xué)基團(tuán)空間位置的變化。
Ludemann及其合作者們研究了在液氨中這些立體化學(xué)構(gòu)象之間的相互關(guān)系及其轉(zhuǎn)化的關(guān)系〔Eur.J.Biochem，49，143(1974)〕。黃苷在這種溶劑中可以完全溶解形成0.6摩爾溶液，而不產(chǎn)生如在水溶液中那樣的配位作用。在氨中，黃苷的各種立體化學(xué)形式的能壘是很低的，大約為單個氫鍵的能量。因此，達(dá)到平衡所需時間大大小于一秒鐘。
如果本發(fā)明的不同制備方法僅導(dǎo)致黃苷單體可能的空間形式的不同分布，那么當(dāng)這些單體放于溶液中時，則無論開始的分布情況如何，所有不同的分布將在不到一秒鐘全部消失。然而，情況並非如此。本發(fā)明的黃苷及黃苷鹽的多晶型物在溶液中保持其物理和化學(xué)特性長達(dá)幾天。多晶型物溶液間的多晶型構(gòu)型的這種差異的保持性僅能用單體之間的相互作用(即聚結(jié))加以解釋。由于聚結(jié)能級的能量而提高了單體形式間的能壘。
下列幾個變量在本發(fā)明的新型黃苷鹽多晶型物(包括晶體和溶質(zhì)的多晶型物)的合成中是重要的
1.溶劑.黃苷完全不溶于非極性溶劑中。因而，必須使用極性溶劑。適宜的極性溶劑包括水、二甲基甲酰胺、氨和低烷基醇類如乙醇、甲醇、丙醇和丁醇。
在形成本發(fā)明的晶體和溶質(zhì)多晶型物之前，溶劑與黃苷所生成的鍵的種類是多晶型物形成的重要因素。采用一種相對于另一種的極性溶劑，根據(jù)各種極性溶劑的給予和接受質(zhì)子的能力導(dǎo)致形成黃苷鹽的不同多晶型物構(gòu)型。
2.溫度.升高溫度是形成黃苷鹽多晶型物所必須的。必須升高到足夠溫度以使黃苷成為溶液並使克服阻止黃苷由一種多晶型構(gòu)型轉(zhuǎn)變成另一種之間的能壘。由黃苷和強(qiáng)堿中和作用產(chǎn)生的熱足以克服這些能壘。然而，通過施加外界熱量以加熱黃苷和強(qiáng)堿到較高的溫度則可進(jìn)一步促使多晶型物的形成和影響最后多晶型物的特性。產(chǎn)生能壘的力的種類還未被人們所認(rèn)識，但是通過必須利用提高溫度以達(dá)到形成本發(fā)明的晶體和溶質(zhì)多晶型物的事實(shí)，表明了它們的存在。此外，在加熱和冷卻的循環(huán)中溫度隨時間的變化影響著黃苷鹽多晶形物的生長和最終形成的黃苷多晶型物的性質(zhì)。
3.濃度.所采用的黃苷濃度也是形成本發(fā)明新型黃苷鹽多晶型物的關(guān)鍵。進(jìn)一步來說，在黃苷鹽形成過程中，較高濃度的黃苷進(jìn)入溶液，由于生成的鹽大量地溶解于極性溶劑中，因而促進(jìn)了多晶型物的形成。
濃度是重要的，因?yàn)槿苜|(zhì)分子間的接觸對分子的聚結(jié)是必須的。作為一個重要原則，當(dāng)濃度升高時，接觸和聚結(jié)變得更加可能。然而，如果所討論的分子具有彼此吸引的范圍，並具有自然排斥的確定電荷，這就不一定確切。中和反應(yīng)后的黃苷鹽的陰離子基團(tuán)使黃苷鹽歸入這類分子。然而，相同符號的離子間確實(shí)形成聚結(jié)體。吸引和排斥間相互作用的能力，尤其是存在相反離子時〔例如(膽堿)+，Na+〕使黃苷鹽離子間的締合結(jié)合出乎預(yù)料。
4.冷凍干燥.盡管冷凍干燥並不是多晶型物形成所必要的，而使用凍干代替其他晶體分離方法，例如吸濾和空氣干燥，有助于最終的晶體多晶型物和溶質(zhì)多晶型物的性質(zhì)，后一種是晶體多晶型物溶解于溶劑中而形成的。
5.堿.用于中和黃苷的強(qiáng)堿也影響所形成的多晶型物最終的結(jié)果。
例1在一個600毫升VirTis凍干瓶中加入0.4摩爾標(biāo)準(zhǔn)黃苷(得自PharmaWaldhof的黃苷二水合物)和0.4摩爾溶于甲醇的膽堿〔110毫升45%(重量/體積)膽堿溶液〕。將瓶及其中物料一起加熱并攪拌，在20分鐘內(nèi)使其溫度從室溫上升至80℃。在加熱過程中，黃苷溶解，但當(dāng)溫度在75℃～80℃范圍時，突然的沉淀現(xiàn)象產(chǎn)生。沉淀物料呈牛奶蛋糊狀，粘結(jié)在一起，並粘附在瓶的玻璃壁上達(dá)到當(dāng)?shù)怪闷繒r，不會溢出的程度。
接著將該瓶從加熱器和攪拌器移走，使其在室溫下冷卻30分鐘。冷卻后，用玻璃棒將瓶中物料攪拌成漿糊狀。然后，將瓶放置于VirTis冷凍干燥器中(型號Freeze-mobile12)，將物料冷凍干燥48小時，在這段時間內(nèi)，冷凍干燥完成。將瓶子從冷凍干燥器中取走，收集所得的冷凍干燥物料並研磨成細(xì)粉末。所得粉末是略呈灰白色的粉末。經(jīng)證實(shí)，這種粉末不具有普通膽堿鹽，例如氯化膽堿所具有的吸濕性。然而，粉末還應(yīng)按常規(guī)保存在真空干燥器內(nèi)。這種黃苷鹽在下文中稱之為ChXs-Ⅰ。
例2在600毫升VirTis凍干瓶中加0.4摩爾標(biāo)準(zhǔn)黃苷(得自PharmaWaldHof的二水合黃苷)和0.4摩爾溶于甲醇的膽堿〔110毫升45%(重量/體積)膽堿溶液〕。在室溫條件下，不加熱劇烈攪拌瓶內(nèi)物料45分鐘。
大約攪拌40分鐘后，出現(xiàn)微小的沉淀，但反應(yīng)混合物仍呈流體狀並可傾瀉。經(jīng)45分鐘后攪拌中止，將反應(yīng)混合物在室溫下再放置20～30分鐘。
然后，將瓶放置于VirTis冷凍干燥瓶中經(jīng)48小時，在這段時間內(nèi)，冷凍干燥完成。將冷凍干燥所得物料收集並研磨成細(xì)粉末，粉末顏色略呈灰白，類似于例1所得的物料，無普通膽堿鹽的吸濕性。這種黃苷鹽在下文中稱為ChXs-Ⅱ。
例3在600毫升VisTis凍干瓶中加入0.4摩爾標(biāo)準(zhǔn)黃苷(得自PharmaWaldHof的二水合黃苷)，0.4摩爾重蒸餾的二甲氨基異丙醇和51毫升甲醇。將瓶中物料攪拌並在20分鐘內(nèi)逐漸由室溫加熱到80℃。對于溶解過程的重要現(xiàn)象，沉淀和沉淀物的粗大外觀與例1中所描述的一樣，所制得的粉末呈灰白色，缺乏吸濕性。這種黃苷鹽下文中稱為DMAIPXs。
例4在600毫升VisTis凍干瓶中加入0.4摩爾標(biāo)準(zhǔn)黃苷(得自PharmaWaldhof的黃苷二水合物)，0.4摩爾丸狀氫氧化鈉和160毫升水。將瓶中物料攪拌並于30分鐘內(nèi)逐漸由室溫加熱到80℃。無沉淀產(chǎn)生。
然后，在繼續(xù)加熱和攪拌的同時，將200毫升甲醇加入瓶中。而后，產(chǎn)生性質(zhì)上類似于例1中所觀察到的明顯的沉淀。然后把凍干瓶移離熱源，在室溫下再靜置45分鐘。瓶中物料冷凍干燥48小時，這段時間內(nèi)，冷凍干燥完成。所得冷凍干燥物料是無吸濕性白色粉末。這種黃苷鹽下文中稱為NaXs-Ⅰ。
例5按照例4所述的步驟制備另一種黃苷鹽，所不同的是組分不加熱。在加入甲醇前，組分只攪拌30分鐘。所制得的凍干物料是一種白色、無吸濕性粉末。這種黃苷鹽下文中稱為NaXs-Ⅱ。
例6按照例4中的步驟制備另一種黃苷鹽，不同的是使用160毫升而不是200毫升甲醇。使用較小量的甲醇結(jié)果形成細(xì)小的沉淀，但這種沉淀隨后被重新溶解。因此，置于冷凍干燥器的瓶內(nèi)含有的是溶液而不是固體。在冷凍干燥階段，形成固體。
將瓶中的溶液冷凍干燥48小時，在此期間，冷凍干燥完成。然后，將瓶子移離冷凍干燥器，將冷凍干燥物料研磨成粉末。所制得的白色粉末是非吸濕性的。這種黃苷鹽下文中稱為NaXs-Ⅲ。
例7按照例5的步驟制備另一種黃苷鹽，不同的是僅加160毫升甲醇。結(jié)果，沉淀產(chǎn)生，但沉淀并不持續(xù)存在。放置于冷凍干燥器中的物料是溶液。沉淀在冷凍干燥過程中產(chǎn)生。冷凍干燥獲得的產(chǎn)品是白色無吸濕性粉末。這種黃苷鹽下文中稱為NaXs-Ⅳ。
例8按照例6的步驟制備另一種黃苷鹽，不同的是在加入160毫升甲醇之前，將反應(yīng)混合物置于冰浴中冷卻至20℃。因此，加熱階段之后，在加入醇前，隨之冷卻。正如例6中那樣，沉淀物在加入甲醇后形成。沉淀物又隨后被重新溶解並將溶液放置于冷凍干燥器中。冷凍干燥后制得的產(chǎn)品是一種白色非吸濕性粉末，在下文中將這種物料稱為NaXs-Ⅴ。
例9按照上述例4的步驟制備另一種黃苷鹽，不同的是僅加100毫升水。隨后的攪拌和加熱產(chǎn)生一種活性的、永久性的沉淀。這一沉淀在開始加熱后接近20分鐘時出現(xiàn)，這時反應(yīng)混合物的溫度約為70℃。將該沉淀冷凍干燥。冷凍干燥后所制得的產(chǎn)品是一種白色非吸濕性粉末。這種黃苷鹽在下文中稱為NaXs-Ⅵ。
黃苷多晶型物的合成和上述生成黃苷鹽多晶型物的相同變量對于合成本發(fā)明的新型黃苷晶體和溶質(zhì)多晶型物也是重要的。相對于濃度而言由于黃苷是非離子化的，因而相同電荷的離子間的相互排斥力并不起作用。
物理和化學(xué)性質(zhì)黃苷鹽多晶型物的多晶型構(gòu)型的存在已由這些多晶型物具有下述性質(zhì)的事實(shí)而得以證實(shí)。
(1)高濃度時的不同水解程度，從而濃水溶液的不同pH值;
(2)在丁醇-一種相對憎水溶劑中和在重水-一種高氫鍵能的溶劑中不同的溶解度;
(3)對比爾定律的異常偏離;
(4)不同的X射線衍射花樣和(5)不同的旋光色散(ORD)譜圖。
1.水解核苷黃苷是一種有機(jī)酸，準(zhǔn)確地說是一種弱有機(jī)酸，其pKa(半游離pH值)在各種文獻(xiàn)中確定為5.5或5.7，黃苷鹽可以通過黃苷和強(qiáng)堿反應(yīng)生成。黃苷的中和反應(yīng)按下式反應(yīng)進(jìn)行(黃苷)+OH-+(強(qiáng)堿陽離子)+-(黃苷鹽)-+H2O+(強(qiáng)堿陽離子)+。黃苷鹽和水隨后進(jìn)行水解，結(jié)果提高了溶液的pH值。這種相互作用對由弱酸和強(qiáng)堿生成的鹽類是典型的並且這一相互作用的產(chǎn)生是因?yàn)檫@些鹽的陰離子與水中氫離子結(jié)合的趨勢遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其陽離子與氫氧根結(jié)合的趨勢。當(dāng)然，氫離子和氫氧根離子是由水本身根據(jù)離解常數(shù)H2O＝H++OH-，K＝10-10所提供的。水解過程按下式進(jìn)行(黃苷鹽)-+H+＝(黃苷)，K＝105.6并且是由黃苷的“弱酸”強(qiáng)度或黃苷的pKa和黃苷鹽陰離子濃度來控制。
一種弱酸和一種強(qiáng)堿鹽的水解使溶液呈堿性。堿性的變化反映水解反應(yīng)的程度，並且又取決于溶質(zhì)陰離子pKa和溶質(zhì)陰離子濃度。在同一濃度范圍內(nèi)，種類不同的弱酸強(qiáng)堿型鹽類，在不存在締合和聚結(jié)情況下，由于水解而表現(xiàn)出幾乎相同的相對pH值的升高。
如圖1所示，當(dāng)二甲氨基異丙醇氯氫化物、磷酸二氫鈉、已在室溫下和氫氧化鈉中和的核苷或標(biāo)準(zhǔn)黃苷鹽的濃度由0.0027摩爾提高到0.4摩爾時，由于這些鹽的水解而致的pH值升高大約在1.50和1.75pH單位。另一方面，對黃苷鈉來說，類似的pH值增加為2.3～3.40pH單位(參見圖1)。本發(fā)明的黃苷鹽都顯示了比其他弱酸強(qiáng)堿鹽包括標(biāo)準(zhǔn)黃苷鹽更大程度的水解。所給出的pH值是自然對數(shù)值。氫氧根離子濃度相對變化的平均差值高達(dá)10～100倍。本發(fā)明的黃苷鹽，在低濃度下pH的差值幾乎不存在。
水解中造成的pH值升高是水的離解常數(shù)、溶質(zhì)陰離子濃度和溶質(zhì)陰離子pKa值的函數(shù)。這些變量之間的相互關(guān)系用Glasstone方程表達(dá)為pH＝1/2pKw+1/2pKa+1/2Log(濃度)。由于水的離解常數(shù)是恒定量，並且所有黃苷鹽的濃度是一樣的，唯一剩余的變量是pKa，酸性基團(tuán)的半游離pH值。
隨著濃度升高，本發(fā)明黃苷鹽的pKa值變?yōu)楠?dú)特的堿性。通常，一種酸性化合物的pKa反映離子化基團(tuán)的陰離子電荷密度，pKa值越高(堿性越大)，其極化的負(fù)電性越大。因此，當(dāng)黃苷鹽濃度提高時，所要求保護(hù)的黃苷鹽多晶型物的離子化基團(tuán)各具特色地發(fā)生相應(yīng)的變化。當(dāng)黃苷鹽濃度升高時，這種變化必定反映黃苷鹽分子間的聚結(jié)。由于游離位置的數(shù)目是恒定的，因而本發(fā)明的黃苷鹽的pKa值之間的差別必定反映這些位置的不同構(gòu)造，而且pKa值的提高必定反映本發(fā)明的黃苷鹽的構(gòu)型差別。
和堿金屬黃苷鹽比較，使用強(qiáng)堿膽堿完全改變了所形成的黃苷鹽的物理和化學(xué)性質(zhì)。于所考慮的濃度范圍下，膽堿黃苷鹽在水溶液中顯現(xiàn)出很小程度的水解。二種不同的研究方案也已經(jīng)證實(shí)，在水溶液中，膽堿在很大程度上仍與黃苷結(jié)合。由于這種離子對抵消了黃苷鹽的陰離子特性，膽堿黃苷鹽水解程度的降低可得到解釋。結(jié)果，濃的膽堿(以及相關(guān)的烷基氨基醇類)黃苷鹽溶液的pH並未上升到堿性范圍內(nèi)(8.5～10.5)，而保持在近中性范圍內(nèi)(7.5)。由于可以以高濃度在體內(nèi)使用它們而不導(dǎo)致傷害，這是黃苷的烷基氨基醇類的一個重要特征。
2.溶解度黃苷的膽堿和烷基氨基醇鹽類顯示出其它獨(dú)特的物理-化學(xué)性質(zhì)。因而，膽堿鹽類在正丁醇中的溶解度非常接近于不游離的黃苷而堿金屬鹽類在正丁醇中的溶解度大大低于不游離的黃苷，根據(jù)種類不同降低95.0～99.5%。這些結(jié)果列于表1表1化合物在正丁醇中與標(biāo)準(zhǔn)黃苷比較的相對溶解度標(biāo)準(zhǔn)黃苷1.00ChXs-Ⅰ0.93ChXs-Ⅱ0.67DMAIP-Xs0.20NaXs-Ⅰ0.047NaXs-Ⅱ0.013NaXs-Ⅲ0.004NaXs-Ⅳ0.015NaXs-Ⅴ0.045NaXs-Ⅵ0.005黃苷的烷基氨基醇鹽類在水溶液中的高溶解度也是很特殊的。烷基氨基醇鹽類約0.015摩爾開始沉淀，而黃苷的堿金屬鹽類溶解于水中高達(dá)約0.45摩爾。然而與堿金屬鹽類和大多數(shù)溶質(zhì)不同的是，烷基氨基醇鹽類的溶解度不能由一個簡單的溶解度關(guān)系來表述。
正常情況下，當(dāng)固態(tài)和溶液中是同一種類分子時，溶質(zhì)溶解直至超過飽和濃度;這時添加更多的溶質(zhì)不能提高進(jìn)入溶液的量。在固體分子和溶液中分子間存在著平衡。
然而，盡管黃苷的烷基氨基醇鹽類在低達(dá)0.015摩爾或約6毫克/毫升時開始沉淀，但繼續(xù)加入溶質(zhì)的確提高進(jìn)入溶液的量。隨著進(jìn)一步添加，事實(shí)上可以制得250毫克/毫升的溶液，盡管超過6毫克/毫升的20～25%的所有溶質(zhì)并不被溶解。
為了這一現(xiàn)象產(chǎn)生，溶解度規(guī)律要求多種溶質(zhì)種類彼此存在平衡，這些溶質(zhì)種類中的一種與固態(tài)中相同種類一致並與其平衡。這種情況由于烷基氨基醇陽離子參與和黃苷鹽陽離子形成離子對的傾向而變得容易了。
3.比耳定律紫外光譜對于確定在溶質(zhì)低濃度下多晶型物構(gòu)型作出了重大貢獻(xiàn)。吸收峰和肩的移動顯示了新的電子狀態(tài)。
當(dāng)溶質(zhì)分子間相互作用產(chǎn)生時，溶液的紫外吸收也可顯示出偏離比爾定律。比耳定律指出在溶液中溶質(zhì)的每個分子對單色光的吸收是一個常數(shù)。不存在溶質(zhì)一溶質(zhì)的相互作用時，水溶液中溶質(zhì)的濃度提高一倍，使所吸收的輻射能量增加一倍。
然而，由于溶液中溶質(zhì)分子間相互作用的結(jié)果，例如通過聚結(jié)，光吸收與溶質(zhì)濃度的關(guān)系偏離比耳定律。因此，由于濃度的增加，每個分子的吸光量可能下降。這是減色性的一個例子。減色性是高度活體DNA和RNA吸收的特征，該特征反映相鄰的核苷酸分子間的絡(luò)合。
對于另一些化合物而言，當(dāng)濃度升高時，每個分子的吸光量增加，此為增光性的一個例子。盡管這可能在締合破壞時出現(xiàn)，也就是減光性的逆過程，但也可由于化合物與水相互作用增強(qiáng)的結(jié)果產(chǎn)生。也就是說，隨著濃度升高，其電子擔(dān)負(fù)著吸收相應(yīng)質(zhì)子的溶質(zhì)分子中的組分更易接近水或被水所包圍，每個分子吸收單色光量可能增加。這些結(jié)果的產(chǎn)生是由于聚結(jié)作用促使空間結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的結(jié)果。增光性也可由于聚結(jié)，接著有電子傳遞的結(jié)果產(chǎn)生。這是一種共享可隨聚結(jié)產(chǎn)生的游離電子的獨(dú)特方式。
使用日立公司雙光束記錄分光光度計，在一定濃度范圍和游離及不游離狀態(tài)產(chǎn)生的pH值條件下，對烷基氨基醇和堿金屬黃苷鹽類的紫外光譜進(jìn)行檢驗(yàn)。游離作用過程產(chǎn)生特征的紫外光譜的肩和峰。此外，發(fā)現(xiàn)了每種鹽對比耳定律的獨(dú)特的偏離。當(dāng)濃度升高時，所有鹽類都比標(biāo)準(zhǔn)黃苷鹽減色性大，因此，這是較大程度聚結(jié)的反映。
標(biāo)準(zhǔn)黃苷鹽、NaXs-Ⅰ、NaXs-Ⅱ和ChXs-Ⅰ的相對消光系數(shù)列于表2。圖2是這些化合物濃度與相對消光系數(shù)曲線圖。表2和圖2都顯示本發(fā)明的黃苷鹽多晶型物偏離比耳定律的現(xiàn)象。將多晶型物相互以及與標(biāo)準(zhǔn)黃苷鹽相比較，也得出對比耳定律的不同偏差，這表明，本發(fā)明的多晶型物，彼此間及與標(biāo)準(zhǔn)黃苷鹽比較，具有不同的聚結(jié)類型，即具有不同的多晶型物構(gòu)型。
表2相對消光系數(shù)濃度比耳定律標(biāo)準(zhǔn)黃苷鹽NaXs-ⅠNaXs-ⅡChXs-Ⅰ3.0×10-6M 1.00 1.00 1.00 1.00 1.006.0×10-6M 1.00 1.09 0.87 1.06 1.0412.0×10-6M 1.00 1.17 0.79 0.97 0.8230.0×10-6M 1.00 1.23 0.76 0.96 1.0660.0×10-6M 1.00 1.26 0.75 0.95 0.83
4.X-射線粉末衍射使用與VAX11/730計算機(jī)聯(lián)機(jī)的Enraf-NoniusCAD4單晶衍射儀對幾種晶體黃苷鹽多晶型物測定X-射線粉末衍射花樣。所測結(jié)果示于圖3～7。由此可見，標(biāo)準(zhǔn)黃苷鹽NaXs-Ⅰ、NaXs-Ⅱ的譜圖是完全非晶態(tài)的(圖3、4和5)。黃苷膽堿鹽則顯示一定程度的結(jié)晶度，這在標(biāo)準(zhǔn)黃苷鹽、NaXs-Ⅰ、NaXs-Ⅱ(圖6和圖7)中並未發(fā)現(xiàn)。進(jìn)而，ChXs-Ⅰ譜圖不同于ChXs-Ⅱ(比較圖6和圖7)。
5.ORD法使用Cary分光偏振計測定ChXs-Ⅰ、ChXs-Ⅱ、NaXs-Ⅱ和DMAIPXs水溶液ORD光譜。結(jié)果示于圖8。這些曲線是三次測試的平均值，曲線的標(biāo)準(zhǔn)誤差實(shí)際是0。由圖8可見，每種多晶型物得到不同的ORD光譜，這是多晶型物在不同構(gòu)象的證據(jù)，也是溶質(zhì)多晶型現(xiàn)象的證據(jù)。
生物鑒定表明所發(fā)明的黃苷鹽類是多晶型物的另一個證據(jù)就是它們顯示了未預(yù)料到的和顯著不同的生物活性。人們不知道黃苷具有任何生物活性，但本發(fā)明的黃苷鹽多晶型物是免疫調(diào)節(jié)劑。在一個標(biāo)準(zhǔn)小鼠接觸過敏體系中，這些多晶型物可以調(diào)節(jié)無論是在免疫作用期間或是抗原激活后單獨(dú)得到的細(xì)胞免疫反應(yīng)強(qiáng)度。此外，當(dāng)免疫反應(yīng)自發(fā)抑止時，黃苷鹽多晶型物可以加強(qiáng)免疫反應(yīng);而當(dāng)反應(yīng)非常活躍時，可以降低反應(yīng)。然而，這種緩沖免疫反應(yīng)的能力並非所有種類的黃苷多晶型物都具有，這在以下的例中可見。
例10通過將弗羅因德氏完全佐劑注射入麻醉的大鼠爪墊內(nèi)使120克雄性Spraque-Dawlay大鼠體內(nèi)(購自Harlan，Spraque Dawley，Indina，)誘導(dǎo)佐劑關(guān)節(jié)炎。同時也注射1.25×1010熱致死H.Pertusis菌于爪墊中以進(jìn)一步刺激其炎癥反應(yīng)。在注射后第四天，在注射的爪墊部位發(fā)生初次炎癥，並在注射后持續(xù)了35天。在注射后第十天，二次(自體免疫)炎癥在其余足肢出現(xiàn)，並在注射后持續(xù)了35天。這些大鼠都有體重下降、關(guān)節(jié)腫脹和關(guān)節(jié)活動抑止現(xiàn)象。
如上述處理三組各九只大鼠，在爪墊注射后第十天開始，每天在腹膜內(nèi)注射生理鹽水、0.079毫克/公斤NaXs-Ⅰ或0.079毫克/公斤NaXs-Ⅱ中的一種。用標(biāo)準(zhǔn)劃痕系統(tǒng)每天定量測定后足的第二次關(guān)節(jié)腫脹，這在Pearson和Wood的ArthritisandRheumatism，2，440(1959)中論述過，此處作為參考將其引入本文。其結(jié)果示于表3。
表3處理二次炎癥指數(shù)對照(生理鹽水)4.00±0.28NaXs-Ⅰ2.06±0.70NaXs-Ⅱ4.17±0.39由表3可見，NaXs-Ⅰ明顯地降低了二次炎癥指數(shù)(P＜0.02)。用NaXs-Ⅰ處理的動物二次炎癥指數(shù)也大大小于用NaXs-Ⅱ處理的動物的二次炎癥指數(shù)(P＜0.01)。該結(jié)果表明在這種疾病類型中NaXs-Ⅰ是消炎的，而NaXs-Ⅱ不是。實(shí)際上NaXs-Ⅱ略為增強(qiáng)二次炎癥。這些結(jié)果是有意義的，因?yàn)樵谶@一例中所述的炎癥疾病類型是人體中抗關(guān)節(jié)炎活性的一個預(yù)兆。
例11在Balb/C小鼠(雄性，4-5周)身上通過注射一種不適合人體的柯薩奇(Coxsackie)(B3Nancy菌株)病毒使產(chǎn)生心肌炎。使用含有1.75×108班點(diǎn)單位/毫升的原種，其稀釋度在1∶50和1∶400之間。將病毒原種在-70℃下冷凍，並在Hep-2細(xì)胞系統(tǒng)中進(jìn)行再增長並對所需原種強(qiáng)度進(jìn)行檢測滴定。
通過這種注射的小鼠中產(chǎn)生的疾病導(dǎo)致注射后7天開始死亡，在該時間內(nèi)可證明病毒已不在心臟，盡管心臟的炎癥在進(jìn)行。但這種炎癥被認(rèn)為同自身免疫特征一致。
小鼠注射病毒后7天開始用ChXs-Ⅰ處理。將濃度0.2毫克/毫升或0.4毫克/毫升的ChXs-Ⅰ添加到小鼠的飲用水中。
小鼠注射病毒后28天，為了組織病理學(xué)而放棄對照組和治療組的樣品動物。通過用兩種獨(dú)立的評價(每種都是盲目進(jìn)行)並且細(xì)胞滲出物和壞死參數(shù)分別按+1到+4來記錄由顯微鏡檢驗(yàn)測定評價下列疾病指數(shù)死亡速率、心肌炎細(xì)胞滲出物的強(qiáng)度和心肌壞死的強(qiáng)度。為了組織病理學(xué)也處理了24小時之內(nèi)死亡動物的心臟。表4示出該研究的結(jié)果。
表428天中的平均相對心臟相對心死亡率＊細(xì)胞滲出物臟壞死對照(僅用水)13/211.40±0.132.0±0.2ChXs-Ⅰ，0.2毫克/毫升 0/21＊＊＊1.21±0.11 0.8＊＊±0.1ChXs-Ⅱ，0.4毫克/毫升 0/21＊＊＊1.21±0.13 0.9＊＊±0.2＊所有死亡都出現(xiàn)在8和27天之間。
＊＊根據(jù)研究者t試驗(yàn)有意義的，P小于0.01。
＊＊＊根據(jù)X平方分析有意義的，P小于0.001。
例12暴露在吞噬細(xì)胞的刺激中引起嗜中性白細(xì)胞誘發(fā)細(xì)胞損傷、死亡和溶解，這些現(xiàn)象是借助于釋放出的超氧化物、過氧化物和游離羥基基團(tuán)的作用而發(fā)生的。在發(fā)炎位置，例如關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)處，可以設(shè)想這些現(xiàn)象有助于嗜中性白細(xì)胞短促的作用壽命，通過從分裂嗜中性白細(xì)胞酶的釋放使組織破壞加重，並通過增殖和建立趨藥性的過氧化及其它變形細(xì)胞碎片來維持炎癥反應(yīng)。
從志愿者身上獲得外周血液白血球(含70～90%嗜中性白細(xì)胞)，按照Salin和McCorcl方法，用3.5×107大腸桿菌培育22小時〔參閱“Free radicals in leukocyte metabolism and inflammation”(Superoxide and Superoxide Dismutases 257-270(Michelson and Fridovick，eds.1977)〕。大腸桿菌是巨噬細(xì)胞的一種刺激物。
將白血球的等分試樣暴露在錐蟲蘭染料中並在血細(xì)胞計數(shù)器的計數(shù)室中，在0時間對所有細(xì)胞(一般達(dá)5×106嗜中性白細(xì)胞/毫升)進(jìn)行顯微鏡檢驗(yàn)?；罴?xì)胞排斥錐蟲蘭。發(fā)現(xiàn)白血球試樣90%是活的。
在Hank平衡鹽溶液(HBSS)中(總培育體積1毫升)，該溶液含加入的同種血清、大腸桿菌及不同量的ChXs-Ⅰ、標(biāo)準(zhǔn)黃苷鹽、氯化膽堿(ChCl)或過氧化物歧化酶(SOD)，培育白細(xì)胞。
培育開始后22小時進(jìn)行定量評價活的、全部死的和分解的(不存在)細(xì)胞。然后將數(shù)據(jù)換算，以便將所有處理組以對照百分?jǐn)?shù)表示。三個嗜中性細(xì)胞分析換算數(shù)據(jù)平均值和一個淋巴細(xì)胞分析結(jié)果列于表5。可觀察到用ChXs-Ⅰ和用活性氧凈化劑SOD能抑止細(xì)胞死亡和溶解，但是只用標(biāo)準(zhǔn)黃苷和ChCl的沒有觀察到。
表5嗜中性白細(xì)胞淋巴細(xì)胞處理死亡總數(shù)分解的死亡總數(shù)對照---ChXs-Ⅰ25微克/毫升10695762.5微克/毫升8269510.25微克/毫升5743760.025微克/毫升5555630.0025微克/毫升818178標(biāo)準(zhǔn)黃苷鹽0.20微克/毫升110102106ChCl0.07微克/毫升10098104SOD100微克/毫升5964未測出例13將一滴在丙酮油中的0.5%二硝基氟苯(DNFB)散布在雄性CD-1小鼠刮過毛的腹部，使他們免疫。4或5天后在乙醚麻醉下用0.2%DNFB在雙耳上對小鼠注射。耳朵注射后立即和耳朵注射后的當(dāng)天就在小鼠腹膜內(nèi)注射0.079毫克/公斤NaXs-Ⅰ和NaXs-Ⅳ。
在注射前和注射后24小時在乙醚麻醉下用測微卡尺測量耳朵厚度。該測量反映局部細(xì)胞免疫反應(yīng)。
在每組16只動物中，選擇8只反應(yīng)最低的動物供分析，以便能研究弱免疫反應(yīng)。表6中數(shù)據(jù)表明，NaXs-Ⅰ提高這種最低的免疫反應(yīng)，而NaXs-Ⅳ不提高。這種提高在統(tǒng)計學(xué)上是有意義的。
表6處理耳朵厚度(單位0.1毫米)對照2.30±0.45NaXs-Ⅰ5.03±0.39NaXs-Ⅳ1.40±0.31例14在伴刀豆球蛋白A、異丙肌昔、ChXs-Ⅰ和ChXs-Ⅱ在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)中對小鼠抑止基因細(xì)胞的效果進(jìn)行比較。使用BALB/C(H-2d)雌性小鼠作為反應(yīng)者和抑止者的種群源。使用雄性C57BL/6(CH-2b)小鼠作為刺激者的種群源。自始至終所使用的培養(yǎng)介質(zhì)是補(bǔ)給5%熱失活胎牛犢血清(FCS)、青霉素(100U/毫升)、鏈霉素(微克/毫升)和真菌體(fungisome)的RPMI-1460Hepes。
在玻璃試管內(nèi)，在ConA的無菌過濾溶液(3.0微克/毫升，Sigma)，異丙肌苷(1.0微克/毫升)、各種濃度的ChXs-Ⅰ或ChXs-Ⅱ存在下，培養(yǎng)1×107Balb/C的脾細(xì)胞三天獲得活化的抑止基因細(xì)胞。培養(yǎng)3天后用巴士德吸管收集細(xì)胞。然后用0.3摩爾無菌甲基甘露糖苷(Sigma)溶液洗滌ConA處理的細(xì)胞，用50微克/毫升絲裂霉素C(Sigma)在37℃處理30分鐘，用甲基甘露糖苷補(bǔ)充洗滌二次。用培養(yǎng)介質(zhì)洗滌一次。其它抑止基因細(xì)胞種群在收集后用無菌HBSS洗滌，如上所述的絲裂霉素處理，用HBSS補(bǔ)充洗滌二次，用培養(yǎng)介質(zhì)洗滌一次。
用1×106反應(yīng)者BALB/C的脾細(xì)胞、1×106絲裂霉素C處理的C57BL/6刺激者的脾細(xì)胞和2×105的ConA、ChXs-Ⅰ或ChXs-Ⅱ之一處理的細(xì)胞進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。每種培養(yǎng)基的體積為0.2毫升。在培養(yǎng)開始后56小時用1微居里氚化胸苷(放射性比度6.7居里/毫摩爾)激發(fā)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)，並在培養(yǎng)開始后72小時收集。每一實(shí)驗(yàn)都以一式5份進(jìn)行。
表7所列的該實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均計數(shù)/分鐘(Cpm)±平均標(biāo)準(zhǔn)誤差(S.E.M)表示。添加同基因ConA激活的和絲裂霉素C處理的細(xì)胞導(dǎo)致在MLR系統(tǒng)中69%氚化胸苷抑止，這是在沒有任何分裂素的情況下與經(jīng)培養(yǎng)3天的BALB/C淋巴細(xì)胞中自發(fā)存在的抑止基因細(xì)胞活性相比較時得到的。最佳劑量的ChXs-Ⅰ與如上所述在無分裂素情況下培養(yǎng)3天的BALB/C淋巴細(xì)胞中自發(fā)誘出的，誘導(dǎo)抑制細(xì)胞活性中的ConA同樣有效。ChXs-Ⅰ的抑止基因細(xì)胞活性增強(qiáng)作用在整個所研究的劑量范圍內(nèi)隨劑量逐漸增高。異丙肌苷對抑止基因細(xì)胞活性的增強(qiáng)作用也是明顯的，盡管在允許比較的劑量上它與ChXs-Ⅰ的作用非常相似。
BALB＝BALB/C小鼠;B6＝C57BL/6小鼠。
＊下標(biāo)m表示絲裂霉素C處理的培養(yǎng)物+ConA，3微克/毫升，添加到脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中++異丙肌苷，1.0微克/毫升，添加到脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中△ChXs-Ⅰ，如表所示添加0.01、0.03、1.00或3.00微克/毫升到1.0×107脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中§為16小時標(biāo)記時間后在72小時收集的每組5種培養(yǎng)物的C.P.M±平均標(biāo)準(zhǔn)誤差 高度有意義的抑止效果，抑止效果與對照組相比P小于0.01表8比較異丙肌苷、ChXs-Ⅰ和ChXs-Ⅱ在誘導(dǎo)脾抑止基因淋巴細(xì)胞中的效果。在誘導(dǎo)抑止基因淋巴細(xì)胞時ChXs-Ⅰ和ChXs-Ⅱ都比異丙肌苷更有效。ChXs-Ⅰ的劑量反應(yīng)曲線是直線形的，而ChXs-Ⅱ的劑量反應(yīng)曲線是鐘形。因此，ChXs-Ⅰ和ChXs-Ⅱ在小鼠身上都刺激淋巴細(xì)胞抑止基因細(xì)胞活性。
表8劑量摻3H-胸苷§ 抑止化合物微克/毫升(C.P.M±S.E.M)%無0.0067994±2517ChXs-Ⅰ0.0159577±2911-12ChXs-Ⅰ0.0328552±2245-58ChXs-Ⅰ1.0025900±906-62ChXs-Ⅰ3.0019915±784-71ChXs-Ⅱ0.0145110±1495-33ChXs-Ⅱ0.0352246±2551-23ChXs-Ⅱ1.0012382±321-82ChXs-Ⅱ3.0043796±4195-35異丙肌苷1.0049546±1775-24§為16小時標(biāo)記時間后在72小時收集的每組3～5個培養(yǎng)物的每分鐘計數(shù)±平均標(biāo)準(zhǔn)誤差
彼此及與對照物相比抑止作用是很顯著的，當(dāng)以相同劑量比較時，P小于0.02例15在上述例中，表明ChXs-Ⅰ在小鼠MLR中能顯著提高小鼠淋巴細(xì)胞抑止基因細(xì)胞活性。在該例中，檢驗(yàn)了ChXs-Ⅰ和DMAIPXs誘發(fā)抑止基因細(xì)胞的能力。
使用的方法與例14中應(yīng)用的相同。檢驗(yàn)抑止基因細(xì)胞種群作用的化合物是ConA(3微克/毫升)、異丙肌苷(ISO)(1.0微克/毫升)、ChXs-Ⅰ(0.01～1.00微克/毫升)和DMPAIPXs(0.01～1.00微克/毫升)。
結(jié)果示于表9。似乎是矛盾的是，在該實(shí)驗(yàn)中，ConA發(fā)揮一種促進(jìn)劑的作用，而不是誘發(fā)抑止基因細(xì)胞。異丙肌苷在1.0微克/毫升時，稍微但不顯著的提高抑止基因細(xì)胞活性。如同在例14一樣，ChXs-Ⅰ在所使用的所有劑量時，都提高抑止基因細(xì)胞活性。在0.03和1.0微克/毫升劑量時，在統(tǒng)計學(xué)上的效果是顯著的。0.1微克/毫升的DMAIPXs發(fā)揮一種顯著的促進(jìn)劑作用，但是在其它的試驗(yàn)劑量時，提高抑止基因細(xì)胞活性不顯著。
因此，在ConA發(fā)揮促進(jìn)劑作用而不是抑止增強(qiáng)劑作用的實(shí)驗(yàn)中，ChXs-Ⅰ在小鼠脾細(xì)胞中刺激抑止基因細(xì)胞活性。DMAIPXs不明顯刺激抑止基因但也起促進(jìn)劑作用。
例16在患者中，某些癌擴(kuò)散以及在骨髓移植之前可能實(shí)行全身幅射。發(fā)病常起因于產(chǎn)生紅細(xì)胞的造血器官、吞噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的缺損相關(guān)的過程。這導(dǎo)致各類血細(xì)胞減少癥。類似的副作用起因于用細(xì)胞毒素試劑治療。
如上例所述，ChXs-Ⅰ提高抑止細(xì)胞免疫反應(yīng)和促進(jìn)吞噬作用。由于在致死輻射之后，受體的防御系統(tǒng)出現(xiàn)多重缺損，就要判斷以確定，ChXs-Ⅰ是否能作用于幅射過程后期。
給21只Fisher種(180-200克)雄性大鼠750倫鈷源輻射。這一幅射劑量通常在5周造成該種類大鼠的死亡率為100%。
幅射后第一天開始，在整個研究過程中，給所有動物每天注射2毫克/公斤的抗菌素(慶大霉素)。動物從飲用水中也接受二種抗菌素。它們是新霉素(0.56微克/毫升)、復(fù)方新諾明(44微克/毫升三甲氧芐二氨嘧啶組分和222微克/毫升磺胺組分)。
幅射后第一天開始，將21只被幅射動物中的8只在腹膜內(nèi)注射28毫克/公斤ChXs-Ⅰ，每天一次注射14天。在第15天時，將ChXs-Ⅰ的劑量減少到0.1毫克/公斤。繼續(xù)治療和觀察經(jīng)35天。
為估計血細(xì)胞比容和白血球數(shù)(WBC)，在第4、7、10、14和21天取血液試樣。將計算中所包括的數(shù)據(jù)規(guī)定為死亡動物的WBC和血細(xì)胞比容值，以提供總的發(fā)病率指數(shù)。在這種情況下所規(guī)定的血細(xì)胞比容值為7.0%，WBC為1.0×103/毫米3。這些值是比存活動物中所發(fā)現(xiàn)的最低值還低的小增量。大鼠的正常WBC在7.0和11.0×103/毫米3之間。該種類大鼠正常的血細(xì)胞比容值在48和55%之間。
表10治療在幅射后的WBC計數(shù)4天7天10天14天21天對照平均0.900.881.162.383.12標(biāo)準(zhǔn)誤差0.060.060.150.220.93ChXs-Ⅰ 平均 0.71 1.04 1.80 3.36＊10.33＊＊標(biāo)準(zhǔn)誤差0.080.100.580.382.11＊與幅射的對照組顯著不同(P小于0.05)＊＊與幅射的對照組顯著不同(P小于0.22)表11治療幅射后血細(xì)胞比容4天7天10天14天21天對照平均58.6051.2636.2421.6018.86標(biāo)準(zhǔn)誤差0.581.872.412.293.67ChXs-Ⅰ 平均 56.90 47.83 27.21 17.66 29.71＊標(biāo)準(zhǔn)誤差0.651.822.241.632.58＊與幅射的對照組顯著不同(P小于0.05)在已知造成100%死亡率的幅射劑量后，在35天的最終死亡率是治療死亡對照5/5死亡ChXs-Ⅱ5/8死亡從而，用ChXs-Ⅰ的后幅射處理趨于抑止死亡率並顯著地促進(jìn)白血球和紅血球系列的恢復(fù)。
例17如例16所述進(jìn)行第二次幅射研究，不同的是大鼠僅受到650倫幅射。同樣，一組不受幅射的大鼠作為比較。
結(jié)果示于表12、13和14。ChXs-Ⅰ再次抑止幅照后的死亡率並促進(jìn)白血球和紅血球的恢復(fù)。
表14治療42天死亡率對照6/10死亡ChXs-Ⅰ 1/10死亡＊＊＊＊與對照組顯著不同(P小于0.02)例18如例16所述進(jìn)行第三次幅射研究，不同的是用C57BL/6小鼠代替大鼠。試驗(yàn)的物質(zhì)是ChXs-Ⅰ、DMAIPXs和氯化膽堿與等摩爾量的標(biāo)準(zhǔn)黃苷的混合物。小鼠接受0.1毫克/公斤這些物質(zhì)。也單獨(dú)試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)黃苷鹽(0.07毫克/公斤)。結(jié)果示于圖8。由此可見，ChXs-Ⅰ在各次后幅射試驗(yàn)的所有化合物中造成的死亡率最低。同樣，與對照組相比，所有化合物都提供某些對幅射作用的防護(hù)。
例19每組各為8只5-6周CD-1小鼠共10組(購自CharlesRiver)，使口服0.1毫升下列物質(zhì)處理1組普通生理鹽水。
2-4組等摩爾量的氯化膽堿和黃苷混合物的普通生理鹽水溶液。使用三種單獨(dú)的溶液，其濃度選擇為(在0.1毫升中)給2組25毫克/公斤，給3組1毫克/公斤，而給4組0.25毫克/公斤。
5-7組ChXs-Ⅰ的普通生理鹽水溶液。使用三種單獨(dú)的溶液，
其濃度選擇為(在0.1毫升中)給5組25毫克/公斤，給6組1毫克/公斤，給7組0.25毫克/公斤。
8-10組ChXs-Ⅱ的普通生理鹽水溶液。使用三種單獨(dú)的溶液，其濃度選擇為(在0.1毫升中)給8組25毫克/公斤，給9組1毫克/公斤，給10組0.25毫克/公斤。
口服處理后1小時，將溶有6.6微克胰蛋白酶的0.05毫升生理鹽水分別注射到每組小鼠的每只小鼠的背腹爪墊上。注射在乙醚麻醉下進(jìn)行。
正好在胰蛋白酶注射前和其后2小時，用Schnelltaster卡尺測量每組中每只小鼠的背腹爪墊直徑，精確到0.1毫米。同樣，通過在注射溶劑前和在注射后二小時測量一組小鼠的背腹爪墊，確定僅由注射溶劑造成的背腹爪墊直徑的增加。從注射胰蛋白酶誘發(fā)的腫大的平均值中減去這一非特殊的腫大(被動溶劑作用)得到作為胰蛋白酶本身炎癥反應(yīng)部分所形成的特殊腫大的度量。
這一試驗(yàn)的結(jié)果示于圖10。如圖所示，在0.25毫克/公斤和1毫克/公斤劑量處理二小時后，ChXs-Ⅰ顯著抑止特有的胰蛋白酶誘發(fā)的爪掌腫大。ChXs-Ⅱ和等摩爾氯化膽堿和黃苷的混合物在較高劑量時，實(shí)際上增加胰蛋白酶水腫。
權(quán)利要求
1.一種制備黃苷鹽晶體多晶型物的方法包括提供一種溶劑；將一定量的黃苷加入溶劑中；將等摩爾量的一種強(qiáng)堿加入黃苷中；以一預(yù)定的速率加熱溶劑、堿和黃苷到足以使黃苷進(jìn)入溶液並克服阻止黃苷由一種多晶型物構(gòu)型轉(zhuǎn)變成另一種構(gòu)型的能壘的溫度；沉淀黃苷鹽；以預(yù)定的速率和在預(yù)定的時間內(nèi)冷卻該鹽；完全冷凍干燥該鹽使產(chǎn)生黃苷鹽的晶體多晶型物。
2.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于溶劑是水。
3.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于溶劑是甲醇。
4.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于黃苷是標(biāo)準(zhǔn)黃苷。
5.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于通過添加甲醇使黃苷鹽沉淀。
6.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于沉淀是自發(fā)產(chǎn)生的。
7.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于堿選自烷基氨基醇類和堿金屬氫氧化物。
8.如權(quán)利要求7的方法，其特征在于堿是膽堿。
9.如權(quán)利要求7的方法，其特征在于堿是二甲氨基異丙醇。
10.如權(quán)利要求7的方法，其特征在于堿是氫氧化鈉。
11.一種制備黃苷鹽晶體多晶型物的方法包括提供一種溶劑;將一定量的黃苷加入溶劑中;將等摩爾量的一種強(qiáng)堿加入黃苷以中和黃苷，中和反應(yīng)產(chǎn)生足夠的熱，使溫度升高到足以使黃苷克服阻止黃苷由一種多晶型物構(gòu)型轉(zhuǎn)變成另一種構(gòu)型能壘的溫度;沉淀黃苷鹽;以預(yù)定的速率在預(yù)定的時間內(nèi)冷卻該鹽;完全冷凍干燥該鹽使產(chǎn)生黃苷鹽的晶體多晶型物。
12.如權(quán)利要求11的方法，其特征在于溶劑是水。
13.如權(quán)利要求11的方法，其特征在于溶劑是甲醇。
14.如權(quán)利要求11的方法，其特征在于黃苷是標(biāo)準(zhǔn)黃苷。
15.如權(quán)利要求11的方法，其特征在于通過添加甲醇使黃苷鹽沉淀。
16.如權(quán)利要求11的方法，其特征在于沉淀是自發(fā)產(chǎn)生的。
17.如權(quán)利要求11的方法，其特征在于堿是選自烷基氨基醇類和堿金屬氫氧化物。
18.如權(quán)利要求17的方法，其特征在于堿是膽堿。
19.如權(quán)利要求17的方法，其特征在于堿是二甲氨基異丙醇。
20.如權(quán)利要求17的方法，其特征在于堿是氫氧化鈉。
21.如權(quán)利要求1-20中任一種方法制得的黃苷鹽晶體多晶型物。
22.一種黃苷鹽的溶質(zhì)多晶型物。
23.一種黃苷膽堿鹽的溶質(zhì)多晶型物。
24.一種黃苷鈉的溶質(zhì)多晶型物。
25.一種黃苷二甲氨基異丙醇的溶質(zhì)多晶型物。
26.一種制備黃苷鹽的溶質(zhì)多晶型物的方法包括用溶劑溶解權(quán)利要求21的黃苷鹽晶體多晶型物。
27.一種制備黃苷鹽溶質(zhì)多晶型物的方法包括提供一種溶劑;將一定量的黃苷加入溶劑中;將等摩爾量的強(qiáng)堿加入黃苷中;以一預(yù)定的速率加熱溶劑、堿和黃苷到足以使黃苷進(jìn)入溶液和克服阻止黃苷由一種多晶型物構(gòu)型轉(zhuǎn)變成另一種構(gòu)型的能壘的溫度;以及以預(yù)定的速率在預(yù)定的時間內(nèi)冷卻該溶液。
28.一種制備黃苷鹽的溶質(zhì)多晶型物的方法，包括提供一種溶劑;將一定量的黃苷加入溶劑中;將等摩爾量的強(qiáng)堿加入黃苷中以中和黃苷，中和反應(yīng)產(chǎn)生足夠的熱，以使溫度升高到足以使黃苷克服阻止黃苷由一種多晶型物構(gòu)型轉(zhuǎn)變成另一種構(gòu)型的能壘的溫度;以預(yù)定的速率在預(yù)定的時間內(nèi)冷卻該溶液。
29.如權(quán)利要求27或28的方法，其特征在于黃苷是標(biāo)準(zhǔn)黃苷。
30.如權(quán)利要求27或28的方法，其特征在于溶劑是水，而堿是氫氧化鈉。
31.一種黃苷的晶體多晶型物。
32.一種黃苷的溶質(zhì)多晶型物。
33.一種黃苷的鹽，其結(jié)構(gòu)式為(Xs)-(CB)+，其中Xs是黃苷鹽離子，而CB是強(qiáng)堿的陽離子。
34.如權(quán)利要求33的鹽，其特征在于堿是選自烷基氨基醇類和堿金屬氫氧化物。
35.黃苷膽堿。
36.黃苷鈉。
37.黃苷二甲氨基異丙醇。
38.一種調(diào)節(jié)動物免疫反應(yīng)的組合物包含一種藥理學(xué)可接受的溶劑和一定量的調(diào)節(jié)動物免疫反應(yīng)有效的黃苷溶質(zhì)多晶型物。
39.一種調(diào)節(jié)動物免疫反應(yīng)的方法包括給動物服用一種組合物，該組合物包含一種藥理學(xué)可接受的溶劑和有效量的黃苷溶質(zhì)多晶型物。
40.一種調(diào)節(jié)動物免疫反應(yīng)的組合物包含一種藥理學(xué)可接受的載體和一定量的調(diào)節(jié)動物免疫反應(yīng)有效的黃苷晶體多晶型物。
41.一種調(diào)節(jié)動物免疫反應(yīng)的方法，包括給動物服用一種組合物，該組合物包含一種藥理學(xué)可接受的載體和有效量的黃苷晶體多晶型物。
42.一種調(diào)節(jié)動物免疫反應(yīng)的組合物包含一種藥理學(xué)可接受的載體和一定量調(diào)節(jié)動物免疫反應(yīng)有效的權(quán)利要求21的黃苷鹽晶體多晶型物。
43.一種調(diào)節(jié)動物免疫反應(yīng)的方法，包括給動物服用一種組合物，該組合物包含一種藥理學(xué)可接受的載體和有效量的權(quán)利要求21的黃苷鹽晶體多晶型物。
44.一種調(diào)節(jié)動物免疫反應(yīng)的組合物包含一種藥理學(xué)可接受的溶劑和一定量的調(diào)節(jié)動物免疫反應(yīng)有效的黃苷鹽溶質(zhì)多晶型物。
45.一種調(diào)節(jié)動物免疫反應(yīng)的方法，包括給動物服用一種組合物，該組合物包含一種藥理學(xué)可接受的溶劑和有效量的黃苷鹽溶質(zhì)多晶型物。
全文摘要
本發(fā)明包括新的黃嘌呤核苷鹽、結(jié)晶和黃嘌呤核苷的多晶型溶解物，和黃嘌呤核苷鹽的多晶型溶解物和結(jié)晶，也包括制造本發(fā)明的多晶型結(jié)晶和溶解物的方法。最后還包括用于調(diào)節(jié)動物的免疫應(yīng)答的組合物，該組合物含有黃嘌呤核苷的多晶型物或黃嘌呤核苷鹽的多晶型物，以及應(yīng)用這些組合物去調(diào)節(jié)動物的免疫應(yīng)答的方法。
文檔編號C07H19/16GK1031537SQ88103908
公開日1989年3月8日 申請日期1988年5月12日 優(yōu)先權(quán)日1987年5月15日
發(fā)明者保羅·戈登 申請人:保羅·戈登