蘆葦高蛋氨酸基因LwHM1及其編碼蛋白的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種編蘆葦高蛋氨酸基因LwHM1及其編碼蛋白的應(yīng)用。本發(fā)明所涉及的高蛋氨酸表達(dá)基因能促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，降低非蛋白氮含量，不僅促進(jìn)作物生長(zhǎng)，而且提高農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】蘆葦高蛋氨酸基因 LwHM1及其編碼蛋白的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一個(gè)編碼蘆葦高蛋氨酸蛋白的基因 LwHMl，它的遺傳學(xué)定位以及該基 因在不同物種間同源基因的同源程度分析，以探索利用該基因進(jìn)行植物營(yíng)養(yǎng)基因工程提高 大豆等作物或牧草的蛋氨酸含量以適應(yīng)人類和動(dòng)物對(duì)蛋氨酸營(yíng)養(yǎng)需求。

【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白短缺包括蛋白含量短缺和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)低下，是21世紀(jì)全球性的嚴(yán)重問(wèn)題，在盡 快提高作物品種的蛋白質(zhì)含量的同時(shí)，積極改善蛋白質(zhì)的氨基酸組成，提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，具有 重要意義。植物種子儲(chǔ)藏了豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂類，其中貯藏于蛋白質(zhì)體內(nèi)的貯 藏蛋白是植物種子的主要成分，其功能不僅局限于為種子的正常萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng) 供給，而且也參與了種子萌發(fā)和發(fā)育過(guò)程的調(diào)控。此外，種子貯臧蛋白也具有防御病原體侵 染和動(dòng)物攻擊的生理功能（Maur' cio P S，2000)。
[0003] 硫是僅次于氮、磷、鉀的植物必需的第4大營(yíng)養(yǎng)元素，缺硫時(shí)蛋白質(zhì)合成受阻，導(dǎo) 致非蛋白氮累積，不僅影響作物生長(zhǎng)，而且降低農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)；植物含硫量為〇. 1%?〇. 5%， 其變幅明顯受植物種類、品種、器官和生育期的影響。十字花科植物需硫最多，豆科、百合 科植物次之，禾本科植物較少（陸景陵，1994)。含硫氨基酸如甲硫氨酸（也稱為蛋氨酸， methionine, Met)、胱氨酸、半胱氨酸（cysteine, Cys)等是合成蛋白質(zhì)的重要氨基酸；蛋白 質(zhì)中含硫氨基酸的含量與種子萌發(fā)、生長(zhǎng)和作物品質(zhì)均有密切關(guān)系。其中，Met作為人體和 單瘤胃動(dòng)物的必需氨基酸之一，在水稻、小麥、大麥、養(yǎng)麥，尤其是豆類和花生等主要的糧食 作物和經(jīng)濟(jì)作物中含量極低，是主要的限制性氨基酸，因此提高這些作物的Met含量顯得 尤為重要（趙文明，1995 ;Miintz K，1998)。
[0004] 隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)擴(kuò)大篩選獲得更多高含硫氨基酸的目的基因，利 用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法揭示高M(jìn)et種子貯臧蛋白新的功能（王文軍等，2005)，結(jié)合植物基因 工程的手段改良作物品質(zhì)、調(diào)節(jié)種子生長(zhǎng)發(fā)育等將更具實(shí)際意義（Haft B K，2005)。
[0005] 植物基因工程中核心的一環(huán)是得到目的基因。目前國(guó)際上已經(jīng)分離出來(lái)可供 用來(lái)提高作物Met含量的高M(jìn)et植物種子貯藏蛋白基因?yàn)閿?shù)不多，其主要來(lái)源是玉米 (Altenbach S B，1990)和水稻（Masumura T，1989)，此外還有少部分來(lái)自巴西栗（Saalbach I，1994)、花生（BashaSM，1994)等，我國(guó)尤其落后，因而充分利用我國(guó)豐富的種質(zhì)資源，合 理與有效的發(fā)掘和利用植物資源，分離提取有價(jià)值的高M(jìn)et植物種子貯藏蛋白基因是以提 高作物Met含量為目的品質(zhì)改良基因工程領(lǐng)域迫切需要的基礎(chǔ)性工作，也將為高M(jìn)et植物 種子貯藏蛋白的研究開(kāi)辟新的領(lǐng)域。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供一種表達(dá)高蛋氨酸蛋白的蘆葦基因 LwHMl及其編碼高蛋氨酸蛋白的 應(yīng)用；該基因能提高高蛋氨酸蛋白的表達(dá)，尤其是能夠提高蘆葦中蛋氨酸的含量。
[0007] 本發(fā)明通過(guò)設(shè)計(jì)出引物，以蘆葦RNA為模板，PCR擴(kuò)增得到該基因全長(zhǎng)序列，經(jīng)T載 體克隆并測(cè)序，表明這是一條編碼高蛋氨酸蛋白的基因，再轉(zhuǎn)入大豆進(jìn)行強(qiáng)表達(dá)，以提高大 豆蛋氨酸含量。該基因編碼區(qū)為420bp，編碼139個(gè)氨基酸，其中含有21個(gè)蛋氨酸，并且在 該蛋白中蛋氨酸的摩爾百分含量達(dá)到15. 11%。
[0008] 因此，本發(fā)明第一目的是提供一種表達(dá)高蛋氨酸蛋白的蘆葦基因 LWHM1，其屬于新 的表達(dá)高蛋氨酸蛋白基因，具有或選自SEQ ID N0 :1的序列。
[0009] 本發(fā)明第二目的是提供所述基因所表達(dá)的功能蛋白，其具有或選自SEQ ID N0:2 的蛋白序列，或具有或選自SEQ ID NO :1的基因序列所表達(dá)的蛋白序列。
[0010] 本發(fā)明第三目的是提供所述基因或功能蛋白，在調(diào)控蘆葦高蛋氨酸蛋白表達(dá)中的 用途；利用該基因，開(kāi)發(fā)更高效、無(wú)毒的蘆葦來(lái)源的具有高蛋氨酸蛋白的功能型食用蛋白乃 至保健品。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1為PCR基因擴(kuò)增結(jié)果（1為蘆葦PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，Μ為DNAMarker)。
[0012] 圖2為酶切結(jié)果（1為提取的重組質(zhì)粒，2為重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物，Μ為DNA Marker)。
[0013] 圖 3pCAMBIA1390 重組質(zhì)粒中連接不意圖（L. Japonicus Ubiquitin promoter PCAMBIA1390)，其中BARM為稗草高蛋氨酸基因。
[0014] 技術(shù)效果
[0015] 1、利用本發(fā)明的LwHMl基因表達(dá)得到含有21個(gè)蛋氨酸的蛋白質(zhì)，有助于蛋氨酸在 大豆中的含量。
[0016] 2、利用本發(fā)明的LwHMl基因和蛋白，可用于已有商蛋氣酸蛋白的研究和應(yīng)用中， 以及開(kāi)發(fā)高效、無(wú)毒的高蛋氨酸蛋白的功能型的蛋白質(zhì)乃至保健品。

【具體實(shí)施方式】
[0017] 在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，所用的實(shí)驗(yàn)材料均為蘆華（Phragmites australis)。
[0018] 實(shí)施例1、蘆葦總RNA
[0019] 利用RNA提取分離試劑盒（Invitrogen公司提供）提取蘆葦苞片中總RNA，其具體 方法是：收集蘆葦苞片l〇〇mg，立即置于液氮中研磨，加入lml Trizol試劑，充分混勻；室溫 放置5min ;加入0. 2ml新鮮氯仿，劇烈振搖15s，室溫溫育3min ;4°C，12000g離心15min ;上 清水相轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1. 5ml離心管中，加入0. 5ml異丙醇沉淀RNA ;RNA沉淀用lml75% 乙醇洗滌后溶于適量DEPC處理過(guò)的水中，-70°C保存?zhèn)溆谩?br> [0020] 實(shí)施例2、蘆葦總RNA純化
[0021] 依據(jù)DNase I試劑盒（Thermo Scientific公司提供）依次向?qū)嵤├?獲得的蘆華 總 RNA 中加入 6 μ 1 DEPC 處理水、10 μ 1 RNA、2 μ 1 DNase I Buffer、2 μ 1 DNase I，混合均勻 后，37°C 30min，加入 EDTA2y 1，65°C 10min。
[0022] 實(shí)施例3、蘆葦RNA逆轉(zhuǎn)錄
[0023] 第一鏈合成：依據(jù) Plant RT-PCR Kit2. 01 (TaKaRa，Japan)的用戶手冊(cè)進(jìn)行。 l-2ng總RNA (大約1-2 μ 1)，和Kit的各種反轉(zhuǎn)錄試劑混合（MgCl24 μ 1 ; 10X RNA PCR Buffer2 μ 1 ；RNase InhibitorO. 5 μ 1 ；RNase free Water8. 5 μ 1 ；dNTP Mixture2 μ 1 ； Reverse Transcriptasel μ 1 ;01igo dT-Adaptorl μ 1) 〇 混勻后，42 〇C 30min ;99 〇C 5min ; 5° °C5min，完成反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
[0024] 第二鏈合成：根據(jù)生物信息學(xué)提供的序列資料設(shè)計(jì)以下引物：
[0025] 5'端引物（SEQ ID NO :3) :5，-CGGGATCCCGATGGCAGCCAAGATGCTTGC-3;；
[0026] 3'端引物（SEQ ID NO :4) :5' -CGAGCTCGCTAGAATGCAGCACCAACAAAGGG-3;。
[0027] 吸取1 μ 1反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，作為模板與DNA Taq酶混合（反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μ 1，上游引 物（SEQ ID NO :3)0. 5μ 1，下游引物（SEQ ID NO :4)0. 5μ 1，TaqO. 5μ 1，10Χ Buffer2y μ 1， Mg2+0. 5μ 1，(ΜΗ2015μ 1)進(jìn)行 PCR 反應(yīng)：94°C 5min 后進(jìn)入擴(kuò)增程序：94°C lmin、57°C lmin、 72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)后，72°C 5min。
[0028] 實(shí)施例4、TA克隆
[0029] 將實(shí)施例3中所獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖電泳（圖2)分離目的DNA片段， 采用膠回收DNA試劑盒回收DNA片段，取上述回收的第二鏈合成產(chǎn)物與DNA克隆試劑混合 (第二鏈產(chǎn)物 6 μ 1，PEG40001 μ 1，T 載體 1 μ 1，10X ligation bufferl μ 1，ligasel μ 1)，于 16 °C連接過(guò)夜。
[0030] 實(shí)施例5、轉(zhuǎn)化大腸桿菌和目的DNA片段測(cè)序
[0031] 取連接產(chǎn)物5 μ 1與200 μ 1大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞（購(gòu)自上海生工生物工程 有限公司）混勻，冰上放置30min，42°C 90s，冰浴1-2分鐘，加入800 μ 1 LB培養(yǎng)基，于37°C， 250rpm 震蕩培養(yǎng) 45min，4000rpm 離心 5min，上清留下約 150 μ 1，加入 7 μ 1 IPTG，40 μ 1 x-gal混合均勻，涂布于預(yù)先加入Amp (氨芐青霉素）的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜，挑取白 色菌落于加有Amp的LB液體培養(yǎng)基中震蕩過(guò)夜，取lml菌液送至上海生工生物工程有限公 司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明：擴(kuò)增得到的序列SEQ ID N0 :1自起始密碼子到終止密碼子總長(zhǎng)420 堿基，編碼139個(gè)氨基酸，推測(cè)分子量為15. 6kD，等電點(diǎn)5. 96,編碼蛋氨酸21個(gè)，蛋氨酸的 百分摩爾含量為15. 11%。
[0032] 實(shí)施例6、將目的DNA片段導(dǎo)入大豆中進(jìn)行強(qiáng)表達(dá)
[0033] 從上述含有BARM基因的菌液中提取質(zhì)粒，用Xba I和BamH I進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn) 物經(jīng)回收后，與同樣經(jīng)Xba I和BamH I雙酶切回收的pCAMBIA1390質(zhì)粒進(jìn)行連接，構(gòu)建重組 質(zhì)粒，（如圖3所示）；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌AGL1，通過(guò)Kan和Rif篩選出轉(zhuǎn)化成功 的AGL1菌株，并將其侵染大豆（購(gòu)自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家大豆種質(zhì)資源中心）子葉節(jié)，利用 潮霉素篩選獲得LwHMl基因基因轉(zhuǎn)染成功的大豆幼苗，并經(jīng)培養(yǎng)獲得大豆種子，通過(guò)氨基 酸分析儀檢測(cè)大豆種子Met含量，發(fā)現(xiàn)其Met含量由對(duì)照的0· 351 %提高至4. 355%，表明 LwHMl基因在大豆中得到了強(qiáng)表達(dá)。
[0034] SEQ ID NO ： 1基因序列表如下：
[0035] atggcagcca agatgcttgc cttgtttgct ttcattgctc tttgtgcaag tgccactact 60 gccaccgtat taccgcagta ctacccaacg acgatggcaa tgggcgccat gaacccatgt 120 ttgcaatact gcatgataca gcaagcgttc gccatgggca gcttggcctc gccggccatg 180 atgatgctgc agcaacagtt ggccttaccg tttcagcagt attggaagcc aatgatgacg 240 ccggacatga tgatgctgcc gcaatgccac tgtgatgcca tctggcaggt ggtgcagcaa 300 cagcagcata tgaggatgat ggctgagatg gcgatacagc tgccattcat gttcgacccg 360 gtggccatgg caacctcgcc tgtgttcttc cagcaaccct ttgttggtgc tgcattct 418
[0036] SEQ ID NO :2氨基酸序列表如下：
[0037] Met Ala Ala Lys Met Leu Ala Leu Phe Ala Phe lie Ala Leu Cys Ala Ser 15 10 15 Ala Thr Thr Ala Thr Val Leu Pro Gin Tyr Tyr Pro Thr Thr Met Ala 20 25 30 Met Gly Ala Met Asn Pro Cys Leu Gin Tyr Cys Met lie Gin Gin Ala 35 40 45 Phe Ala Met Gly Ser Leu Ala Ser Pro Ala Met Met Met Leu Gin Gin Gin Leu 50 55 60 65 Ala Leu Pro Phe Gin Gin Tyr Trp Lys Pro Met Met Thr Pro Asp Met Met 70 75 80 Met Leu Pro Gin Cys His Cys Asp Ala lie Trp Gin Val Val Gin Gin Gin Gin 85 90 95 100 His Met Arg Met Met Ala Glu Met Ala lie Gin Leu Pro Phe Met Phe Asp 105 110 115 Pro Val Ala Met Ala Thr Ser Pro Val Phe Phe Gin Gin Pro Phe Val Gly 120 125 130 135 Ala Ala Phe
[0001] 說(shuō)明書(shū)核苷酸和氨基酸序列表 SEQUENCE LISTING <110>蘇州科技學(xué)院 <120>蘆葦高蛋氨酸基因 LwHMl及其編碼蛋ft的應(yīng)用 <130> 2014 <160> 3 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 418 <212> DNA <213>人I:合成序列 <400> 1 atggcagcca agatgcttgc cttgtttgct ttcattgctc tttgtgcaag tgccactact 60 gccaccgtat taccgcagta ctacccaacg acgatggcaa tgggcgccat gaacccatgt 120 ttgcaatact gcatgataca gcaagcgttc gccatgggca gcttggcctc gccggccatg 180 atgatgctgc agcaacagtt ggccttaccg tttcagcagt attggaagcc aatgatgacg 240 ccggacatga tgatgctgcc gcaatgccac tgtgatgcca tctggcaggt ggtgcagcaa 300 cagcagcata tgaggatgat ggctgagatg gcgatacagc tgccattcat gttcgacccg 360 gtggccatgg caacctcgcc tgtgttcttc cagcaaccct ttgttggtgc tgcattct 418 <210> 2 <211>139 <212>PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Ala Lys Met Leu Ala Leu Phe Ala Phe lie Ala Leu Cys Ala Ser 1 5 10 15 Ala Thr Thr Ala Thr Val Leu Pro Gin Tyr Tyr Pro Thr Thr Met Ala 20 25 30 Met Gly Ala Met Asn Pro Cys Leu Gin Tyr Cys Met lie Gin Gin Ala
[0002] 35 40 45 Phe Ala Met Gly Ser Leu Ala Ser Pro Ala Met Met Met Leu Gin Gin Gin Leu 50 55 60 65 Ala Leu Pro Phe Gin Gin Tyr Trp Lys Pro Met Met Thr Pro Asp Met Met 70 75 80 Met Leu Pro Gin Cys His Cys Asp Ala lie Trp Gin Val Val Gin Gin Gin Gin 85 90 95 100 His Met Arg Met Met Ala Glu Met Ala Me Gin Leu Pro Phe Met Phe Asp 105 110 115 Pro Val Ala Met Ala Thr Ser Pro Val Phe Phe Gin Gin Pro Phe Val Gly 120 125 130 135 Ala Ala Phe <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213>人丄合成序列 <400> 3 cgggatcccg atggcagcca agatgcttgc 30 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213>人「.合成序列 <400> 4 cgagctcgct agaatgcagc accaacaaag gg 32
【權(quán)利要求】
1. 一種表達(dá)高蛋氨酸蛋白的蘆葦基因 GTBM，其屬于新的表達(dá)高蛋氨酸蛋白基因，具有 或選自SEQ IDNO :1的序列。
2. 權(quán)利要求1所述基因所編碼的功能蛋白，其序列選自SEQ ID NO :2所不的蛋白序列。
3. 權(quán)利要求1所述基因，在調(diào)控蘆葦高蛋氨酸蛋白表達(dá)中的用途；利用該基因，開(kāi)發(fā)更 高效、無(wú)毒的蘆葦來(lái)源的具有高蛋氨酸蛋白的功能型食用蛋白乃至保健品。
4. 權(quán)利要求2所述的功能蛋白，在調(diào)控蘆葦高蛋氨酸蛋白表達(dá)中的用途；利用該基因， 開(kāi)發(fā)更高效、無(wú)毒的蘆葦來(lái)源的具有高蛋氨酸蛋白的功能型食用蛋白乃至保健品。
【文檔編號(hào)】C07K14/415GK104046632SQ201410227652
【公開(kāi)日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2014年5月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月28日
【發(fā)明者】陳宏偉, 邱業(yè)先, 錢(qián)瑋, 邱勁, 李良智, 扶教龍, 王桃云 申請(qǐng)人:蘇州科技學(xué)院