Orexin-A聚乙二醇化修飾物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種通過orexin-A的N末端氨基共價鍵與聚乙二醇相連接的orexin-A聚乙二醇化修飾物，其制備方法為：將摩爾比為1:5-1:50的orexin-A與單甲氧基聚乙二醇丙醛或單氧基聚乙二醇琥珀酰胺碳酸脂在pH為4-9、溫度為4-37℃條件下反應(yīng)0.5-24小時后，加入小分子氨基酸終止反應(yīng)；將第一步驟得到的反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過SepHadex?G-50色譜柱除鹽，將除鹽后收集的蛋白上樣于QAE-SepHadex?A-50陰離子交換柱，用10mM?PB緩沖液洗脫，收集洗脫峰，濃縮并冷凍干燥，即得orexin-A聚乙二醇化修飾物。所述的修飾物穩(wěn)定性好，半衰期長，毒副作用小。
【專利說明】Orexin-A聚乙二醇化修飾物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用聚乙二醇修飾orexin-A的修飾產(chǎn)物及其制備方法，屬于醫(yī)藥化學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)和多肽類藥物聚乙二醇(PEG)化技術(shù)是指利用聚乙二醇衍生物對蛋白和多肽類藥物進(jìn)行化學(xué)修飾的一項熱門技術(shù)。隨著現(xiàn)代基因工程手段的使用，人們能夠大量獲取所需的蛋白質(zhì)，但由于天然或重組的未經(jīng)任何修飾的蛋白質(zhì)類藥物易引起免疫反應(yīng)，以及其在體內(nèi)半衰期較短等原因而減弱了臨床效果，也大大限制了它們的使用。相比之下，部分聚乙二醇修飾的蛋白質(zhì)包括聚乙二醇與蛋白質(zhì)和多肽類藥物的物理結(jié)合物和化學(xué)修飾物，可改變蛋白質(zhì)藥物的一些性質(zhì)，如:①增加此類藥物的溶解度和穩(wěn)定性。=>減少或消除免疫原性，抗原性和毒性。③改善藥物體內(nèi)的藥動學(xué)性質(zhì)，增加藥物在體內(nèi)的半衰期。④增加藥物的治療指數(shù)，擴(kuò)大臨床使用等。因此，近年來有越來越多的聚乙二醇修飾化蛋白藥物上市或者進(jìn)入臨床。例如Enzon公司開發(fā)的治療免疫缺陷性疾病的腺苷脫胺酶，治療白血病、惡性黑色素瘤的PEG化天冬酰胺酶、PEG化干擾素a -2b，羅氏的PEG化干擾素a _2b等。
[0003]Orexin-A是存在于下丘腦的一種神經(jīng)多肽，參與調(diào)節(jié)飲食，睡眠_(dá)覺醒周期、生殖、體溫、血壓、激素分泌和感覺等生理功能，研究發(fā)現(xiàn)orexin-A具有促覺醒和抗腦缺血損傷的作用。然而，orexin-A很不穩(wěn)定，已報道的體內(nèi)半衰期只有半小時左右，這大大限制了orexin-A的開發(fā)應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種穩(wěn)定性好，體內(nèi)半衰期長和安全性好的orexin-A修飾物，以克服orexin-A的上述不足，其修飾后產(chǎn)物對原有蛋白活性影響較小，未改變原有蛋白的功能；
本發(fā)明另一目的在于提供上述修飾物的制備方法，其產(chǎn)物均一性好、分離純化簡單。
[0005]本發(fā)明實現(xiàn)過程如下:
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種orexin-A的聚乙二醇化修飾物，所述修飾物是由orexin-A的N末端氨鍵以共價鍵與聚乙二醇分子相連接。具體來說，與orexin-A的N末端氨鍵相連接的聚乙二醇為烷基化或?；膯渭籽趸垡叶?。烷基化或?；木垡叶汲Ｓ糜诘鞍踪|(zhì)氨基的修飾，而單甲氧基聚乙二醇分子一端的羥基被甲氧基封閉，只有一端可以與orexin-A連接,不會產(chǎn)生多個orexin-A交聯(lián)的形式,從而防止了多個orexin-A交聯(lián)凝聚而變性。
[0006]上述聚乙二醇的分子量介于4000-30000Da，優(yōu)選為5000、10000、15000或20000Da ；
烷基化或?；膯渭籽趸垡叶挤肿觾?yōu)選為單甲氧基聚乙二醇丙醛或單氧基聚乙二醇琥珀酰胺碳酸脂。
[0007]本發(fā)明提供上述結(jié)構(gòu)的orexin-A修飾物的制備方法，包括以下步驟:
(1)將摩爾比為1:5-1:50的orexin-A與單甲氧基聚乙二醇丙醛或單氧基聚乙二醇琥珀酰胺碳酸脂在PH為4-9、溫度為4-37°C條件下反應(yīng)0.5-24小時后，加入小分子氨基酸終止反應(yīng)；
(2)將步驟(1)的反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過SepHadexG_50色譜柱除鹽，將除鹽后收集的蛋白上樣于QAE-S印Hadex A-50陰離子交換柱，用IOmM PB緩沖液洗脫，收集洗脫峰，濃縮并冷凍干燥，即得orexin-A聚乙二醇化修飾物。
[0008]上述反應(yīng)條件優(yōu)選為:摩爾比1:10-1:30，pH為6-8，溫度為20_25°C，反應(yīng)時間為4-6小時。
[0009]本發(fā)明制備的orexin-A聚乙二醇化修飾物可用于制備治療促覺醒和抗腦缺血損傷藥物。
[0010]本發(fā)明制備得到的orexin-A聚乙二醇化修飾物保留原有蛋白活性，未改變原有蛋白的功能，產(chǎn)物均一性好，分離純化簡單。
【具體實施方式】
[0011]本發(fā)明實施例所用原材料除單氧聚乙二醇丙醛和單氧基聚乙二醇琥珀酰胺碳酸脂購自美國Shearwater公司外,其余均為常規(guī)試劑，以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0012]實施例1
orexin-A聚乙二醇化修飾物的制備方法,包括下述步驟:
(1)稱取IOmg的orexin-A,溶于IOml的PB緩沖液(IOmM,pH=6),然后按摩爾比為1:10的比例加入單氧聚乙二醇丙醛(分子量:5000Da)并混勻，放置于25°C條件下反應(yīng)6小時后終止反應(yīng)；
(2)將步驟(1)的反應(yīng)液，過S印HadexG-25柱除鹽，將除鹽后收集到的蛋白上樣于QAE-SepHadex A-50陰離子交換柱，用IOmM PB緩沖液洗脫，收集洗脫峰，濃縮并冷凍干燥，即得orexin-A聚乙二醇化修飾物。
[0013]實施例2
orexin-A聚乙二醇化修飾物的制備方法,包括下述步驟:
(1)稱取IOmg的orexin-A,溶于IOml的PB緩沖液(IOmM,pH=7),然后按摩爾比為1:20的比例加入單氧聚乙二醇丙醛(分子量:5000Da)并混勻，放置于25°C條件下反應(yīng)5小時后終止反應(yīng)；
(2)將步驟(1)的反應(yīng)液，過S印HadexG-25柱除鹽，將除鹽后收集到的蛋白上樣于QAE-SepHadex A-50陰離子交換柱，用IOmM PB緩沖液洗脫，收集洗脫峰，濃縮并冷凍干燥，即得orexin-A聚乙二醇化修飾物。
[0014]實施例3
orexin-A聚乙二醇化修飾物的制備方法,包括下述步驟:
(I)稱取IOmg的orexin-A，溶于IOml的磷酸鹽緩沖液(IOmM, PH=8)，然后按摩爾比為1:30的比例加入單氧聚乙二醇丙醛(分子量:5000Da)并混勻，在25°C條件下避光反應(yīng)4小時后終止反應(yīng)；
(2)將步驟(1)的反應(yīng)液，過S印Hadex G-25柱除鹽，將除鹽后收集到的蛋白上樣于QAE-SepHadex A-50陰離子交換柱，用10 mM PB緩沖液洗脫，收集洗脫峰，濃縮并冷凍干燥，即得orexin-A聚乙二醇化修飾物。
[0015]實施例4
orexin-A聚乙二醇化修飾物的制備方法,包括下述步驟:
(1)稱取IOmg的orexin-A,溶于IOml的PB緩沖液(IOmM,pH=6),然后按摩爾比為1:10的比例加入單氧聚乙二醇丙醛(分子量:10000Da)并混勻，在25°C條件下避光反應(yīng)6小時后終止反應(yīng)；
(2)將步驟(1)的反應(yīng)液，過S印HadexG-25柱除鹽，將除鹽后收集到的蛋白上樣于QAE-SepHadex A-50陰離子交換柱，用IOmM PB緩沖液洗脫，收集洗脫峰，濃縮并冷凍干燥，即得orexin-A聚乙二醇化修飾物。
[0016]實施例5
orexin-A聚乙二醇化修飾物的制備方法,包括下述步驟:
(1)稱取IOmg的orexin-A,溶于IOml的PB緩沖液(IOmM,pH=7),然后按摩爾比為1:20的比例加入單氧聚乙二醇 丙醛(分子量:10000Da)并混勻，在25°C條件下避光反應(yīng)5小時后終止反應(yīng)；
(2)將步驟(1)的反應(yīng)液，過S印HadexG-25柱除鹽，將除鹽后收集到的蛋白上樣于QAE-SepHadex A-50陰離子交換柱，用含用IOmM PB緩沖液洗脫，收集洗脫峰，濃縮并冷凍干燥，即得orexin-A聚乙二醇化修飾物。
[0017]實施例6
orexin-A聚乙二醇化修飾物的制備方法,包括下述步驟:
(1)稱取IOmg的orexin-A,溶于IOml的PB緩沖液(IOmM,pH=8),然后按摩爾比為1:30的比例加入單氧聚乙二醇丙醛(分子量:10000Da)并混勻，在25°C條件下避光反應(yīng)4小時后終止反應(yīng)；
(2)將步驟(1)的反應(yīng)液，過S印HadexG-25柱除鹽，將除鹽后收集到的蛋白上樣于QAE-SepHadex A-50陰離子交換柱，用IOmM PB緩沖液洗脫，收集洗脫峰，濃縮并冷凍干燥，即得orexin-A聚乙二醇化修飾物。
[0018]實施例7
orexin-A聚乙二醇化修飾物的制備方法,包括下述步驟:
(1)稱取IOmg的orexin-A,溶于IOml的PB緩沖液(IOmM,pH=6),然后按摩爾比為1:10的比例加入單氧聚乙二醇丙醛(分子量:20000Da)并混勻，在25°C條件下避光反應(yīng)6小時后終止反應(yīng)；
(2)將步驟(1)的反應(yīng)液，過S印HadexG-25柱除鹽，將除鹽后收集到的蛋白上樣于QAE-SepHadex A-50陰離子交換柱，用IOmM PB緩沖液洗脫，收集洗脫峰，濃縮并冷凍干燥，即得orexin-A聚乙二醇化修飾物。
[0019]實施例8
orexin-A聚乙二醇化修飾物的制備方法,包括下述步驟:
(I)稱取IOmg的orexin-A，溶于IOml的PB緩沖液(IOmM, PH=7)，然后按摩爾比為1:20的比例加入單氧聚乙二醇丙醛(分子量:20000Da)并混勻，在25°C條件下避光反應(yīng)5小時后終止反應(yīng)；
(2)將步驟(1)的反應(yīng)液，過S印Hadex G-25柱除鹽，將除鹽后收集到的蛋白上樣于QAE-SepHadex A-50陰離子交換柱，用IOmM PB緩沖液洗脫，收集洗脫峰，濃縮并冷凍干燥，即得orexin-A聚乙二醇化修飾物。
[0020]實施例9
orexin-A聚乙二醇化修飾物的制備方法,包括下述步驟:
(1)稱取IOmg的orexin-A,溶于IOml的PB緩沖液(IOmM,pH=8),然后按摩爾比為1:30的比例加入單氧聚乙二醇丙醛(分子量:20000Da)并混勻，在25°C條件下避光反應(yīng)4小時后終止反應(yīng)；
(2)將步驟(1)的反應(yīng)液，過S印HadexG-25柱除鹽，將除鹽后收集到的蛋白上樣于QAE-SepHadex A-50陰離子交換柱，用IOmM PB緩沖液洗脫，收集洗脫峰，濃縮并冷凍干燥，即得orexin-A聚乙二醇化修飾物。
[0021]實施例10
orexin-A聚乙二醇化修飾物的制備方法,包括下述步驟:
(1)稱取IOmg的orexin-A,溶于IOml的PB緩沖液(IOmM,pH=6),然后按摩爾比為1:10的比例加入單氧聚乙二醇琥珀亞酰胺碳酸脂(分子量:1000ODa)并混勻，在20°C條件下避光反應(yīng)6小時后終止反應(yīng) ；
(2)將步驟(1)的反應(yīng)液，過S印HadexG-25柱除鹽，將除鹽后收集到的蛋白上樣于QAE-SepHadex A-50陰離子交換柱，用IOmM PB緩沖液洗脫，收集洗脫峰，濃縮并冷凍干燥，即得orexin-A聚乙二醇化修飾物。
[0022]實施例11
orexin-A聚乙二醇化修飾物的制備方法,包括下述步驟:
(1)稱取IOmg的orexin-A,溶于IOml的PB緩沖液(IOmM,pH=7),然后按摩爾比為1:20的比例加入單氧聚乙二醇琥珀亞酰胺碳酸脂(分子量:1000ODa)并混勻，在20°C條件下避光反應(yīng)5小時后終止反應(yīng)；
(2)將步驟(1)的反應(yīng)液，過S印HadexG-25柱除鹽，將除鹽后收集到的蛋白上樣于QAE-SepHadex A-50陰離子交換柱，用IOmM PB緩沖液洗脫，收集洗脫峰，濃縮并冷凍干燥，即得orexin-A聚乙二醇化修飾物。
[0023]實施例12
orexin-A聚乙二醇化修飾物的制備方法,包括下述步驟:
(1)稱取IOmg的orexin-A,溶于IOml的PB緩沖液(IOmM,pH=8),然后按摩爾比為1:30的比例加入單氧聚乙二醇琥珀亞酰胺碳酸脂(分子量:1000ODa)并混勻，在20°C條件下避光反應(yīng)4小時后終止反應(yīng)；
(2)將步驟(1)的反應(yīng)液，過S印HadexG-25柱除鹽，將除鹽后收集到的蛋白上樣于QAE-SepHadex A-50陰離子交換柱，用IOmM PB緩沖液洗脫，收集洗脫峰，濃縮并冷凍干燥，即得orexin-A聚乙二醇化修飾物。
[0024]實施例13 orexin-A聚乙二醇化修飾物的制備方法，包括下述步驟:
(I)稱取IOmg的orexin-A,溶于IOml的PB緩沖液(IOmM,pH=6),然后按摩爾比為1:10的比例加入單氧聚乙二醇琥珀亞酰胺碳酸脂(分子量:20000Da)并混勻，在20°C條件下避光反應(yīng)6小時后終止反應(yīng)；
(2)將步驟(1)的反應(yīng)液，過S印Hadex G-25柱除鹽，將除鹽后收集到的蛋白上樣于QAE-SepHadex A-50陰離子交換柱，用IOmM PB緩沖液洗脫，收集洗脫峰，濃縮并冷凍干燥，即得orexin-A聚乙二醇化修飾物。
[0025]實施例14 orexin-A聚乙二醇化修飾物的制備方法，包括下述步驟:
(1)稱取IOmg的orexin-A,溶于IOml的PB緩沖液(IOmM,pH=7),然后按摩爾比為1:20的比例加入單氧聚乙二醇琥珀亞酰胺碳酸脂(分子量:20000Da)并混勻，在20°C條件下避光反應(yīng)5小時后終止反應(yīng)；
(2)將步驟(1)的反應(yīng)液，過S印HadexG-25柱除鹽，將除鹽后收集到的蛋白上樣于QAE-SepHadex A-50陰離子交換柱，用IOmM PB緩沖液洗脫，收集洗脫峰，濃縮并冷凍干燥，即得orexin-A聚乙二醇化修飾物。
[0026]實施例15 orexin-A聚乙二醇化修飾物的制備方法,包括下述步驟:
(1)稱取IOmg的orexin-A,溶于IOml的PB緩沖液(IOmM,pH=8),然后按摩爾比為1:30的比例加入單氧聚乙二醇琥珀亞酰胺碳酸脂(分子量:20000Da)并混勻，在20°C條件下避光反應(yīng)4小時后終止反應(yīng)；
(2)將步驟(1)的反應(yīng)液，過S印HadexG-25柱除鹽，將除鹽后收集到的蛋白上樣于QAE-SepHadex A-50陰離子交換柱，用IOmM PB緩沖液洗脫，收集洗脫峰，濃縮并冷凍干燥，即得orexin-A聚乙二醇化修飾物。
[0027]測試?yán)齀 orexin-A聚乙二醇化修飾物的純化
隨機(jī)選取實施例1-15制備的樣品3例，采用DIONEX P680高效液相色譜儀分析，色譜柱(C4、5ym、4.6*250mm)，色譜條件為:流動相，A相:0.1%TFA B相:100%乙腈。檢測波長:215nm ;柱溫:35°C ;流速:1.000mL/min。樣品純度檢測結(jié)果如表1。
【權(quán)利要求】
1.一種orexin-A聚乙二醇化修飾物,其特征在于:orexin_A的N末端氨基以共價鍵與聚乙二醇連接。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的orexin-A聚乙二醇化修飾物,其特征在于:每個orexin-A分子通過N末端共價鍵連接一個聚乙二醇分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的orexin-A聚乙二醇化修飾物,其特征在于:所述的聚乙二醇為單甲氧基聚乙二醇，其分子量為4000-30000Da。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的orexin-A聚乙二醇化修飾物,其特征在于:與orexin-A的N末端氨鍵相連接的分子為烷基化或酰基化的單甲氧基聚乙二醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的orexin-A聚乙二醇化修飾物,其特征在于:與orexin-A的N末端氨鍵相連接的分子為單甲氧基聚乙二醇醛或單氧基聚乙二醇琥珀亞酰胺脂。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的orexin-A聚乙二醇化修飾物,其特征在于:與orexin-A的N末端氨鍵相連接的分子為單甲氧基聚乙二醇丙醛或單氧基聚乙二醇琥珀酰胺碳酸脂。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至5任意之一所述的orexin-A聚乙二醇化修飾物,其特征在于--與orexin-A的N末端氨鍵相連接的聚乙二醇分子量為5000、10000、15000或20000 Da。
8.權(quán)利要求6所述的orexin-A聚乙二醇化修飾物的制備方法,其特征在于包括以下步驟: (1)將摩爾比為1:5-1:50的orexin-A與單甲氧基聚乙二醇丙醛或單氧基聚乙二醇琥珀酰胺碳酸脂在PH為4-9、溫度為4-37°C條件下反應(yīng)0.5-24小時后，加入小分子氨基酸終止反應(yīng)； (2)將步驟(1)的反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過S^hadexG_50色譜柱除鹽，將除鹽后收集的蛋白上樣于QAE-S^hadex A-50陰離子交換柱，用IOmM PB緩沖液洗脫，收集洗脫峰，濃縮并冷凍干燥，即得orexin-A聚乙二醇化修飾物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的orexin-A聚乙二醇化修飾物的制備方法,其特征在于:步驟Cl)中，將摩爾比為1:10-1:30的orexin-A與單甲氧基聚乙二醇丙醛或單氧基聚乙二醇琥珀酰胺碳酸脂在PH為6-8、溫度為20-25°C條件下反應(yīng)4_6小時后，加入小分子氨基酸終止反應(yīng)。
10.權(quán)利要求1所述的orexin-A聚乙二醇化修飾物在制備治療促覺醒和抗腦缺血損傷藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C07K1/107GK103804483SQ201410089686
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月13日
【發(fā)明者】董海龍, 郭超, 吳畏 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)