一種替度魯肽的聚乙二醇偶合物及其固相制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及多肽合成領(lǐng)域，特別涉及一種替度魯肽的聚乙二醇偶合物及其固相制備方法。本發(fā)明通過固相合成方法替度魯肽對定點的PEG修飾，從而改變替度魯肽的性質(zhì)。其主要優(yōu)點是可以延長蛋白質(zhì)（多肽）在體內(nèi)的半衰期，降低免疫原性和抗原性。
【專利說明】一種替度魯肽的聚乙二醇偶合物及其固相制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及多肽合成領(lǐng)域，特別涉及一種替度魯肽的聚乙二醇偶合物及其固相制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]短腸綜合征(SBS)是指由于嚴重小腸疾病或外科手術(shù)切除大部分小腸導(dǎo)致機體無法正常吸收營養(yǎng)而引發(fā)一系列綜合征。SBS降低了患者攝取液體和營養(yǎng)物質(zhì)的能力，導(dǎo)致他們脫水和營養(yǎng)不良。而腸外營養(yǎng)支持治療又將增加全身感染和其他長期并發(fā)癥的風(fēng)險，迄今為止尚無藥物可以治療短腸綜合征。
[0003]替度魯肽(teduglutide)是一種胰高血糖素樣肽2 (GLP-2)類似物，是一種天然生成的激素，可減少胃排空和分泌，并調(diào)節(jié)小腸內(nèi)膜細胞的生長、增殖和修復(fù)。替度魯肽于2001年被定性為孤兒藥。臨床試驗表明，該藥能夠降低短腸綜合征患者對胃腸外營養(yǎng)的需求。
[0004]常規(guī)的替度魯肽含有蛋白質(zhì)(多肽)類藥物常有的弊病。例如半衰期短，有免疫原性，易被蛋白水解酶降解，溶解性差等。傳統(tǒng)的PEG修飾多為隨機修飾，存在修飾劑呈現(xiàn)多種聚合度、選擇性不夠高、修飾后的蛋白質(zhì)分子Mr分布寬、活性降低、穩(wěn)定性有時不夠理想等突出問題。因此，提供一種替度魯肽的聚乙二醇偶合物及其固相制備方法具有現(xiàn)實意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]有鑒于此，本發(fā)明提供一種替度魯肽的聚乙二醇偶合物及其固相制備方法。本發(fā)明通過固相合成方法替度魯肽對定點的PEG修飾，從而改變替度魯肽的性質(zhì)。其主要優(yōu)點是可以延長蛋白質(zhì)(多肽)在體內(nèi)的半衰期，降低免疫原性和抗原性。
[0006]為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案:
[0007]本發(fā)明提供了一種替度魯肽的聚乙二醇偶合物，其N端氨基和/或Lys側(cè)鏈氨基通過酰胺鍵與單甲氧基PEG衍生物偶聯(lián)。
[0008]在本發(fā)明的一些實施例中，單甲氧基PEG衍生物的分子量為1000~40000Da。
[0009]在本發(fā)明的另一些實施例中，單甲氧基PEG衍生物的分子量為2000~20000Da。
[0010]在本發(fā)明的另一些實施例中，單甲氧基PEG衍生物的分子量為5000~lOOOODa。[0011 ] 在本發(fā)明的一些實施例中，單甲氧基PEG衍生物為直鏈型或支鏈型。
[0012]在本發(fā)明的一些實施例中，單甲氧基PEG衍生物選自mPEG琥珀酰亞胺丙酸酯(mPEG-SPA)、mPEG琥珀酰亞胺丁酸酯(mPEG_SBA)或mPEG-琥珀酰亞胺碳酸酯(mPEG_SC)。本發(fā)明在此不作限定。
[0013]在本發(fā)明的另一些實施例中，單甲氧基PEG衍生物選自Lys-HiPEG2 *Tris_mPEG3。
[0014]本發(fā)明還提供了一種替度魯肽的聚乙二醇偶合物的固相制備方法，包括如下步驟:
[0015]步驟1、取Asp與固相載體偶聯(lián),獲得固相載體-Asp ；
[0016]步驟2、取固相載體-Asp逐步偶聯(lián)氨基酸，獲得固相載體-多肽，多肽的序列如SEQID N0.1 所示；
[0017]步驟3、脫除固相載體-多肽的N端氨基的保護基團和/或Lys側(cè)鏈氨基的保護基團后，單甲氧基PEG衍生物通過酰胺鍵與N端氨基和/或Lys側(cè)鏈氨基偶聯(lián)，裂解、純化后，即得。
[0018]本發(fā)明提供的一種替度魯肽的聚乙二醇偶合物的固相制備方法中，單甲氧基PEG衍生物是指通過酰胺鍵與N端氨基或賴氨酸側(cè)鏈氨基偶聯(lián)的任何活化PEG衍生物。本發(fā)明在此不作限定。
[0019]在本發(fā)明的一些實施例中，單甲氧基PEG衍生物的分子量為1000~40000Da。
[0020]在本發(fā)明的另一些實施例中，單甲氧基PEG衍生物的分子量為2000~20000Da。
[0021]在本發(fā)明的另一些實施例中，單甲氧基PEG衍生物的分子量為5000~lOOOODa。
[0022]在本發(fā)明的一些實施例中，單甲氧基PEG衍生物為直鏈型或支鏈型。
[0023]在本發(fā)明的一些實施例中，單甲氧基PEG衍生物選自mPEG琥珀酰亞胺丙酸酯(mPEG-SPA)、mPEG琥珀酰亞胺丁酸酯(mPEG_SBA)或mPEG-琥珀酰亞胺碳酸酯(mPEG_SC)。
[0024]在本發(fā)明的另一些實施例中，單甲氧基PEG衍生物選自Lys-HiPEG2 *Tris_mPEG3。
[0025]在本發(fā)明的一些實施例中，N端氨基的保護基團為Fmoc。
[0026]在本發(fā)明的一些實施例中，Lys側(cè)鏈氨基的保護基團為mmt，mtt, Alloc或Trt。
[0027]作為優(yōu)選，Trt側(cè)鏈保護基只在PEG單修飾N端氨基酸時使用。
[0028]在本發(fā)明的一些實施例中，N端氨基的保護基團的脫除劑為20%哌啶/DMF溶液。
[0029]在本發(fā)明的另一些實施例中，Lys側(cè)鏈氨基的保護基團的脫除劑為TFA或四三苯基勝鈕/苯硅烷。
[0030]作為優(yōu)選，選擇性脫除mmt或mtt采用TFA，選擇性脫除Alloc采用四三苯基膦鈀
/苯硅烷。
[0031]本發(fā)明還提供了上述固相制備方法獲得的替度魯肽的聚乙二醇偶合物。
[0032]本發(fā)明提供一種替度魯肽的聚乙二醇偶合物及其固相制備方法。本發(fā)明通過固相合成方法替度魯肽對定點的PEG修飾，從而改變替度魯肽的性質(zhì)。其主要優(yōu)點是可以延長蛋白質(zhì)(多肽)在體內(nèi)的半衰期，降低免疫原性和抗原性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1示替度魯肽及本發(fā)明提供的替度魯肽的聚乙二醇偶合物的藥代試驗結(jié)果；其中，線I示替度魯肽，線2示實施例12制備的PEG2000修飾的替度魯肽，線3示實施例15制備的PEG5000修飾的替度魯肽，線4示實施例21制備的PEG10000修飾的替度魯肽，線5示實施例19制備的PEG20000修飾的替度魯肽；
[0034]圖2示替度魯肽及本發(fā)明提供的替度魯肽的聚乙二醇偶合物對小鼠體重修復(fù)的影響；其中，線I示替度魯肽，線2示實施例12制備的PEG2000修飾的替度魯肽，線3示實施例15制備的PEG5000修飾的替度魯肽，線4示實施例21制備的PEG10000修飾的替度魯肽，線5示實施例19制備的PEG20000修飾的替度魯肽。

【具體實施方式】
[0035]本發(fā)明公開了一種替度魯肽的聚乙二醇偶合物及其固相制備方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0036]本發(fā)明提供的替度魯肽的聚乙二醇偶合物及其固相制備方法中所用原料及制劑均可由市場購得。
[0037]
縮寫及英文含義
mmt4-曱氧基三苯曱基
mtt曱基三苯曱基
Trt三苯甲基
Fmoc9-茍甲氧羰基
DIPCDI二異丙基碳二亞胺 HOBt1-羥基苯并三唑 DMFN,N-二曱基甲酰胺
DCM二氯曱烷
TFA三氟乙酸
Alloc烯丙氧羰基
mPEG-SC曱氧基聚乙二醇琥珀酖亞胺碳酸酯
[0038]
mPEG-SBA曱氧基聚乙二醇琥珀酖亞胺丁酸酯
mPEG-SPA曱氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺丙酸酯
[0039]下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明:
[0040]實施例1:替代度為0.lmmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-Wang樹脂的合成
[0041]稱取替代度為1.0mmol/g的Wang樹脂40g，加入到固相反應(yīng)柱中，用DMF洗滌2次，用 DMF溶脹樹脂 30 分鐘。稱取 4.94g Fmoc-Asp (OtBu) _0H( 12mmol )、1.95g HOBtC 14.4mmol)和0.15g DMAP (1.2mmol)溶于體積比為1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入2.25mlDIC (14.4mmol)活化3min后加入固相反應(yīng)柱中，室溫反應(yīng)2小時。用DMF洗滌3次，加入70ml封閉液(吡啶/乙酸酐=1: l，400mmol:400mmol)封閉8小時(樹脂若未完全擴散加DCM作為溶劑)。用DMF洗滌4次，DCM洗4次，甲醇收縮抽干，得到Fmoc-Asp (OtBu) -Wang樹脂。檢測替代度為0.098mmol/go
[0042]實施例2:替代度為0.19mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-Wang樹脂的合成
[0043]稱取替代度為1.0mmol/g的Wang樹脂40g，加入到固相反應(yīng)柱中，用DMF洗滌2次，用 DMF 溶脹樹脂 30 分鐘。稱取 9.38g Fmoc-Asp (OtBu)-OH (22.8mmol )、3.70g HOBt(27.4mmol)和0.28g DMAPC0.23mmol)溶于體積比為1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入4.28ml DIC(27.4mmol)活化3min后加入固相反應(yīng)柱中，室溫反應(yīng)2小時。用DMF洗滌3次，加入70ml封閉液(吡啶/乙酸酐=1:1，400mmol:400mmol)封閉8小時(樹脂若未完全擴散加DCM作為溶劑)。用DMF洗滌4次，DCM洗4次，甲醇收縮抽干，得到Fmoc-Asp (OtBu) -Wang樹脂。檢測替代度為0.192mmol/go
[0044]實施例3:替代度為0.15mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-Wang樹脂的合成
[0045]稱取替代度為1.0mmol/g的Wang樹脂40g，加入到固相反應(yīng)柱中，用DMF洗滌2次，用 DMF溶脹樹脂 30 分鐘。稱取 7.42g Fmoc-Asp (OtBu) _0H( 18mmol )、2.92g H0Bt( 21.6mmol)和0.22g DMAP (1.8mmol)溶于體積比為1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入3.38mlDIC (21.6mmol)活化3min后加入固相反應(yīng)柱中，室溫反應(yīng)2小時。用DMF洗滌3次，加入70ml封閉液(吡啶/乙酸酐=1: l，400mmol:400mmol)封閉8小時(樹脂若未完全擴散加DCM作為溶劑)。用DMF洗滌4次，DCM洗4次，甲醇收縮抽干，得到Fmoc-Asp (OtBu) -Wang樹脂。檢測替代度為0.150mmol/go
[0046]實施例4:氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示的替度魯肽肽樹脂的制備
[0047]稱取替代度為0.150mmol/g 的 Fmoc-Asp(OtBu)-Wang 樹脂 33.3g (5mmol),加入到固相反應(yīng)柱中，用DMF洗滌2次，用DMF溶脹樹脂30分鐘。用DBLK脫除Fmoc保護，然后用DMF洗滌6次，用茚三酮法檢測樹脂顏色，樹脂有顏色，表示Fmoc已脫除。取5.97gFmoc-Thr (tBu) -OH (15mmol), 2.43g HOBt (18mmol )，溶于體積比為 1:1 的 DCM 和 DMF 混合溶液，冰水浴下加入2.82ml DIC (18mmol)活化3min后加入固相反應(yīng)柱中，室溫反應(yīng)2小時。以茚三酮法檢測判斷反應(yīng)終點，如果樹脂無色透明，則表示反應(yīng)完全；樹脂顯色，則表示反應(yīng)不完全，需再偶聯(lián)反應(yīng)I小時，此判斷標準適用于后續(xù)內(nèi)容中以茚三酮法檢測判斷反應(yīng)終點。重復(fù)上述脫除Fmoc保護和加入相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)的步驟，按照替度魯肽主鏈肽序順序偶聯(lián)。其中偶聯(lián)Lys的原料為Fmoc-Lys (mmt)-OH。偶聯(lián)完最后一個氨基酸His后不需要脫除Fmoc。反應(yīng)結(jié)束后用甲醇收縮，樹脂真空干燥過夜，稱重得到Fmoc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-1le-Leu-Asp (OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp (OtBu)-Phe-1le-Asn(Trt)-Trp(Boc) -Leu-1le-Gln (Trt) -Thr-Lys (mmt) -1le-Thr (tBu) -Asp (OtBu) -Wang Resin 樹脂。
[0048]實施例5:氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示的替度魯肽肽樹脂的制備
[0049]稱取替代度為0.150mmol/g 的 Fmoc-Asp(OtBu)-Wang 樹脂 33.3g(5mmol),加入到固相反應(yīng)柱中，用DMF洗滌2次，用DMF溶脹樹脂30分鐘。
[0050]用DBLK脫除Fmoc保護，然后用DMF洗滌6次，用茚三酮法檢測樹脂顏色，樹脂有顏色，表不 Fmoc 已脫除。取 5.97g Fmoc-Thr (tBu) -OH (1 Smmol ), 2.43g HOBt (18mmol),溶于體積比為1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入2.82ml DIC (18mmol)活化3min后加入固相反應(yīng)柱中，室溫反應(yīng)2小時。以茚三酮法檢測判斷反應(yīng)終點，如果樹脂無色透明，則表示反應(yīng)完全；樹脂顯色，則表示反應(yīng)不完全，需再偶聯(lián)反應(yīng)I小時，此判斷標準適用于后續(xù)內(nèi)容中以茚三酮法檢測判斷反應(yīng)終點。重復(fù)上述脫除Fmoc保護和加入相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)的步驟，按照替度魯肽主鏈肽序順序偶聯(lián)。其中偶聯(lián)Lys的原料為Fmoc-Lys (mtt)-OH。偶聯(lián)完最后一個氨基酸His后不需要脫除Fmoc。反應(yīng)結(jié)束后用甲醇收縮，樹脂真空干燥過夜，稱重得到 Fmoc-His (Trt) -Gly-Asp (OtBu) -Gly-Ser (tBu) -Phe-Ser (tBu) -Asp (OtBu) -Glu (OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-1le-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-AIa-Arg(pbf)-Asp (OtBu)-Phe-1le-Asn (Trt)-Trp (Boc)-Leu-1le-Gln (Trt)-Thr-Lys(mtt)-1le-Thr(tBu) -Asp (OtBu) -Wang Resin 樹脂。
[0051]實施例6:氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示的替度魯肽肽樹脂的制備
[0052]稱取替代度為0.150mmol/g 的 Fmoc-Asp(OtBu)-Wang 樹脂 33.3g(5mmol),加入到固相反應(yīng)柱中，用DMF洗滌2次，用DMF溶脹樹脂30分鐘。
[0053]用DBLK脫除Fmoc保護，然后用DMF洗滌6次，用茚三酮法檢測樹脂顏色，樹脂有顏色，表不 Fmoc 已脫除。取 5.97g Fmoc-Thr (tBu) -OH (1 Smmol ), 2.43g HOBt (18mmol),溶于體積比為1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入2.82ml DIC (18mmol)活化3min后加入固相反應(yīng)柱中，室溫反應(yīng)2小時。以茚三酮法檢測判斷反應(yīng)終點，如果樹脂無色透明，則表示反應(yīng)完全；樹脂顯色，則表示反應(yīng)不完全，需再偶聯(lián)反應(yīng)I小時，此判斷標準適用于后續(xù)內(nèi)容中以茚三酮法檢測判斷反應(yīng)終點。重復(fù)上述脫除Fmoc保護和加入相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)的步驟，按照替度魯肽主鏈肽序順序偶聯(lián)。其中偶聯(lián)Lys的原料為Fmoc-Lys (Alloc)-OH。偶聯(lián)完最后一個氨基酸His后不需要脫除Fmoc。反應(yīng)結(jié)束后用甲醇收縮，樹脂真空干燥過夜，得到 Fmoc-His (Trt) -Gly-Asp (OtBu) -Gly-Ser (tBu) -Phe-Ser (tBu) -Asp (OtBu) -Glu (OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-1le-Leu-Asp (OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-1le-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-1le-Gln(Trt)-Thr-Lys(Alloc)-1le-Thr(tBu)-Asp (OtBu) -ffang Resin 樹脂。
[0054]實施例7:氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示的替度魯肽肽樹脂的制備
[0055]稱取替代度為0.150mmol/g 的 Fmoc-Asp(OtBu)-Wang 樹脂 33.3g (5mmol),加入到固相反應(yīng)柱中，用DMF洗滌2次，用DMF溶脹樹脂30分鐘。用DBLK脫除Fmoc保護，然后用DMF洗滌6次，用茚三酮法檢測樹脂顏色，樹脂有顏色，表示Fmoc已脫除。取5.97gFmoc-Thr (tBu) -OH (15mmol), 2.43g HOBt (18mmol )，溶于體積比為 1:1 的 DCM 和 DMF 混合溶液，冰水浴下加入2.82ml DIC (18mmol)活化3min后加入固相反應(yīng)柱中，室溫反應(yīng)2小時。以茚三酮法檢測判斷反應(yīng)終點，如果樹脂無色透明，則表示反應(yīng)完全；樹脂顯色，則表示反應(yīng)不完全，需再偶聯(lián)反應(yīng)I小時，此判斷標準適用于后續(xù)內(nèi)容中以茚三酮法檢測判斷反應(yīng)終點。重復(fù)上述脫除Fmoc保護和加入相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)的步驟，按照替度魯肽主鏈肽序順序偶聯(lián)。其中偶聯(lián)Lys的原料為Fmoc-Lys (Trt)-OH。偶聯(lián)完最后一個氨基酸His后不需要脫除Fmoc。反應(yīng)結(jié)束后用甲醇收縮，樹脂真空干燥過夜，得到Fmoc-His (Trt)-Gly-Asp (OtBu)-Gly-Ser (tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-1le-Leu-Asp (OtBu)-Asn (Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp (OtBu)-Phe-1le-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-1le-Gln (Trt) -Thr-Lys (Trt) -1le-Thr (tBu) -Asp (OtBu) -ffang Resin 樹脂。
[0056]實施例8:替度魯肽賴氨酸側(cè)鏈保護基的選擇性脫除
[0057] 將實施例4或?qū)嵤├?中的肽樹脂加入到固相反應(yīng)柱中，用DCM洗滌2次，用DCM溶脹樹脂30分鐘，抽干DCM。加入5%TFA/DCM溶液300ml，室溫反應(yīng)2h。以茚三酮法檢測判斷反應(yīng)終點，如果樹脂顯色，說明Lys側(cè)鏈保護已經(jīng)脫除。反應(yīng)結(jié)束后用甲醇收縮，樹脂真空干燥過夜，得到 Fmoc-His (Trt) -Gly-Asp (OtBu) -Gly-Ser (tBu) -Phe-Ser (tBu) -Asp (OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-1le-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp (OtBu)-Phe-1le-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-1le-Gln(Trt)-Thr-Lys-1Ie-Thr (tBu)-Asp (OtBu) -ffang Resin 妝樹脂。
[0058]實施例9:替度魯肽賴氨酸側(cè)鏈保護基的選擇性脫除
[0059]將實施例6中的肽樹脂加入到固相反應(yīng)柱中，用DCM洗滌2次，用DCM溶脹樹脂30分鐘，抽干DCM。加入300mlDCM做為溶劑，再加入7.40ml苯基硅烷(60mmol )，反應(yīng)3分鐘，再加入1.56g Pd (PPh3) 4( 1.35mmol)，室溫反應(yīng)45分鐘，抽掉反應(yīng)液，茚三酮檢測樹脂顏色，樹脂有顏色，表示Fmoc已脫除。反應(yīng)結(jié)束后用甲醇收縮，樹脂真空干燥過夜，得到Fmoc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn (Trt)-Thr (tBu)-1le-Leu-Asp (OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp (OtBu)-Phe-1le-Asn (Trt)-Trp(Boc)-Leu-1le-Gln(Trt)-Thr-Lys-1le-Thr(tBu)-Asp (OtBu)-ffang Resin肽樹脂。
[0060]實施例10:替度魯肽賴氨酸側(cè)鏈單PEG修飾的制備
[0061 ] 將實施例8或9中的肽樹脂(5mmol)加入到固相反應(yīng)柱中，用DCM洗滌2次，用DMF溶脹樹脂30分鐘，抽干DMF。以400mlDMF為溶劑，稱取1g直鏈mPEG (1000) _SC( 1mmol )，加入上述溶液中，適當搖勻使PEG溶解并與肽樹脂混合均勻，在室溫條件下反應(yīng)2h，茚三酮檢測無色透明，說明賴氨酸側(cè)鏈氨基已與mPEG偶合，抽干反應(yīng)液，DMF洗滌6次。用DBLK脫除N端Fmoc保護，然后用DMF洗滌6次。反應(yīng)結(jié)束后用甲醇收縮，樹脂真空干燥過夜，得到H-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr (tBu)-1le-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp (OtBu)-Phe-1le-Asn(Trt)-Trp(B oc)-Leu-1le-Gln (Trt)-Thr-Lys (mPEG (1000))-1le-Thr (tBu)-Asp (OtBu) -ffang Resin 妝樹脂。
[0062]將肽樹脂置于反應(yīng)燒瓶中。以10ml/g樹脂的比例加入裂解試劑(TFA:苯甲硫醚:乙二硫醇:苯甲醚=90:5:3:2(V:V)，室溫攪拌2h。反應(yīng)物用砂芯漏斗過濾，收集濾液，樹脂再用少量TFA洗滌3次，合并濾液。加入冰凍的無水乙醚沉淀(無水乙醚用量為100ml/g樹脂)，將沉淀離心，用無水乙醚洗滌3次，真空干燥得到白色粉末固體。
[0063]離子交換層析和反相高效液相色譜純化后得到結(jié)構(gòu)為H-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser—Asp-Glu-Met-Asn-Thr—IIe-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-1le—Asn—Trp-Leu-1le-Gln-Thr-Lys (mPEG (1000))-1le-Thr-Asp-OH 的精肽 3.26g。純度為 98.6%。
[0064]實施例11:替度魯肽賴氨酸側(cè)鏈單PEG修飾的制備
[0065]將實施例8或9中的肽樹脂(5mmol)加入到固相反應(yīng)柱中，用DCM洗滌2次，用DMF溶脹樹脂30分鐘，抽干DMF。以400mlDMF為溶劑，
[0066]稱取400g直鏈mPEG (40000) _SC( 1mmol )，加入上述溶液中，適當搖勻使PEG溶解并與肽樹脂混合均勻，在室溫條件下反應(yīng)2h，茚三酮檢測無色透明，說明賴氨酸側(cè)鏈氨基已與mPEG偶合，抽干反應(yīng)液，DMF洗滌6次。用DBLK脫除N端Fmoc保護，然后用DMF洗滌6次。反應(yīng)結(jié)束后用甲醇收縮，樹脂真空干燥過夜，得到H-His (Trt) -Gly-Asp (OtBu) -Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr (tBu)-1le-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp (OtBu)-Phe-1le-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-1le-Gln (Trt) -Thr-Lys (mPEG (40000)) -1le-Thr (tBu) -Asp (OtBu) -ffang Resin 妝樹脂。
[0067]將肽樹脂置于反應(yīng)燒瓶中。以10ml/g樹脂的比例加入裂解試劑(TFA:苯甲硫醚:乙二硫醇:苯甲醚=90:5:3:2(V:V)，室溫攪拌2h。反應(yīng)物用砂芯漏斗過濾，收集濾液，樹脂再用少量TFA洗滌3次，合并濾液。加入冰凍的無水乙醚沉淀(無水乙醚用量為100ml/g樹脂)，將沉淀離心，用無水乙醚洗滌3次，真空干燥得到白色粉末固體。
[0068]離子交換層析和反相高效液相色譜純化后得到結(jié)構(gòu)為H-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser—Asp-Glu-Met-Asn-Thr—IIe-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-1le—Asn—Trp-Leu-1le-Gln-Thr-Lys (mPEG (40000))-1le-Thr-Asp-OH 的精肽 21.77g，純度為 97.6%。
[0069]實施例12:替度魯肽賴氨酸側(cè)鏈單PEG修飾的制備
[0070]將實施例8或9中的肽樹脂(5mmol)加入到固相反應(yīng)柱中，用DCM洗滌2次，用DMF溶脹樹脂30分鐘，抽干DMF。以400mlDMF為溶劑，稱取20g直鏈mPEG (2000) -SBA( 1mmol )，加入上述溶液中，適當搖勻使PEG溶解并與肽樹脂混合均勻，在室溫條件下反應(yīng)2h，茚三酮檢測無色透明，說明賴氨酸側(cè)鏈氨基已與mPEG偶合，抽干反應(yīng)液，DMF洗滌6次。用DBLK脫除N端Fmoc保護，然后用DMF洗滌6次。反應(yīng)結(jié)束后用甲醇收縮，樹脂真空干燥過夜，得到H-His (Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn (Trt)-Thr (tBu)-1le-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp (OtBu)-Phe-1le-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-1le-Gln(Trt)-Thr-Lys(mPEG(2000))-1le-Thr(tBu)-Asp(OtBu) -ffang Resin 妝樹脂。
[0071]將肽樹脂置于反應(yīng)燒瓶中。以10ml/g樹脂的比例加入裂解試劑(TFA:苯甲硫醚:乙二硫醇:苯甲醚=90:5:3:2(V:V)，室溫攪拌2h。反應(yīng)物用砂芯漏斗過濾，收集濾液，樹脂再用少量TFA洗滌3次，合并濾液。加入冰凍的無水乙醚沉淀(無水乙醚用量為100ml/g樹脂)，將沉淀離心，用無水乙醚洗滌3次，真空干燥得到白色粉末固體。
[0072]離子交換層析和反相高效液相色譜純化后得到結(jié)構(gòu)為H-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser—Asp-Glu-Met-Asn-Thr—IIe-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-1le—Asn—Trp-Leu-1le-Gln-Thr-Lys (mPEG (2000))-1le-Thr-Asp-OH 的精肽 3.74g，純度為 97.9%。
[0073]實施例13:替度魯肽賴氨酸側(cè)鏈單PEG修飾的制備
[0074]將實施例8或9中的肽樹脂(5mmol)加入到固相反應(yīng)柱中，用DCM洗滌2次，用DMF溶脹樹脂30分鐘，抽干DMF。以400mlDMF為溶劑，稱取40g直鏈mPEG (4000) -SPA( 1mmol )，加入上述溶液中，適當搖勻使PEG溶解并與肽樹脂混合均勻，在室溫條件下反應(yīng)2h，茚三酮檢測無色透明，說明賴氨酸側(cè)鏈氨基已與mPEG偶合，抽干反應(yīng)液，DMF洗滌6次。用DBLK脫除N端Fmoc保護，然后用DMF洗滌6次。反應(yīng)結(jié)束后用甲醇收縮，樹脂真空干燥過夜，得到H-His (Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn (Trt)-Thr(tBu)-1le-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp (OtBu)-Phe-1le-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-1le-Gln(Trt)-Thr-Lys(mPEG(4000))-1le-Thr(tBu)-Asp(OtBu) -ffang Resin 妝樹脂。
[0075]將肽樹脂置于反應(yīng)燒瓶中。以10ml/g樹脂的比例加入裂解試劑(TFA:苯甲硫醚:乙二硫醇:苯甲醚=90:5:3:2(V:V)，室溫攪拌2h。反應(yīng)物用砂芯漏斗過濾，收集濾液，樹脂再用少量TFA洗滌3次，合并濾液。加入冰凍的無水乙醚沉淀(無水乙醚用量為100ml/g樹脂)，將沉淀離心，用無水乙醚洗滌3次，真空干燥得到白色粉末固體。
[0076]離子交換層析和反相高效液相色譜純化后得到結(jié)構(gòu)為H-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser—Asp-Glu-Met-Asn-Thr—IIe-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-1le—Asn—Trp-Leu-1le-Gln-Thr-Lys (mPEG (4000))-1le-Thr-Asp-OH 的精肽 5.26g，純度為 98.1%。
[0077]其中，mPEG-SPA為甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺丙酸酯，結(jié)構(gòu)如式I所示:
[0078]

【權(quán)利要求】
1.一種替度魯肽的聚乙二醇偶合物，其特征在于，其N端氨基和/或Lys側(cè)鏈氨基通過酰胺鍵與單甲氧基PEG衍生物偶聯(lián)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的替度魯肽的聚乙二醇偶合物，其特征在于，所述單甲氧基PEG衍生物選自mPEG琥珀酰亞胺丙酸酯、mPEG琥珀酰亞胺丁酸酯或mPEG-琥珀酰亞胺碳酸酯。
3.一種替度魯肽的聚乙二醇偶合物的固相制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟1、取Asp與固相載體偶聯(lián),獲得固相載體-Asp ； 步驟2、取所述固相載體-Asp逐步偶聯(lián)氨基酸，獲得固相載體-多肽，所述多肽的序列如 SEQ ID N0.1 所示； 步驟3、脫除所述固相載體-多肽的N端氨基的保護基團和/或Lys側(cè)鏈氨基的保護基團后，單甲氧基PEG衍生物通過酰胺鍵與所述N端氨基和/或所述Lys側(cè)鏈氨基偶聯(lián)，裂解、純化后，即得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固相制備方法，其特征在于，所述單甲氧基PEG衍生物的分子量為 1000 ~40000Da。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固相制備方法，其特征在于，所述單甲氧基PEG衍生物的分子量為 2000 ~20000Da。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固相制備方法，其特征在于，所述單甲氧基PEG衍生物的分子量為 5000 ~1000Da0
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固相制備方法，其特征在于，所述單甲氧基PEG衍生物為直鏈型或支鏈型。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固相制備方法，其特征在于，所述單甲氧基PEG衍生物選自mPEG琥拍酰亞胺丙酸酯、mPEG琥拍酰亞胺丁酸酯或mPEG-琥拍酰亞胺碳酸酯。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固相制備方法，其特征在于，所述單甲氧基PEG衍生物選自Lys-mPEG2 或 Tris-mPEG3。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固相制備方法，其特征在于，所述N端氨基的保護基團為Fmoc ο
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固相制備方法，其特征在于，Lys側(cè)鏈氨基的保護基團為mmt, mtt, Alloc 或 Trt0
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固相制備方法，其特征在于，所述N端氨基的保護基團的脫除劑為20%哌啶/DMF溶液。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固相制備方法，其特征在于，Lys側(cè)鏈氨基的保護基團的脫除劑為TFA或四三苯基膦鈀/苯硅烷。
14.根據(jù)權(quán)利要求3至13任一項所述的固相制備方法獲得的替度魯肽的聚乙二醇偶合物。
【文檔編號】C07K1/06GK104072604SQ201310102207
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2013年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月27日
【發(fā)明者】宓鵬程, 劉建, 潘俊鋒, 馬亞平, 袁建成 申請人:深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司