Deae柱層析提純尿促性素的技術方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了采用DEAE柱層析提純尿促性素的技術方法，其特征是絕經(jīng)期婦女的尿液通過高嶺土吸附、乙酸銨鹽溶、協(xié)和樹脂吸附得到尿促性素協(xié)和品，然后將尿促性素協(xié)和干粉按比例溶于配好的緩沖液中，通過DEAE樹脂吸附的方法對尿促性素進一步純化。具體步驟包括緩沖液配制、DEAE吸附、洗滌、洗脫、沉淀、干燥得尿促性素。此技術通過DEAE柱層析法提純得到的尿促性素，其效價能夠達到350iu/mg。
【專利說明】DEAE柱層析提純尿促性素的技術方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術領域】，利用柱層析可將混合物中各組分分離的特性，將絕經(jīng)期婦女尿液經(jīng)過高嶺土吸附、乙酸銨鹽溶、協(xié)和樹脂吸附得到的尿促性素協(xié)和品，再經(jīng)過上樣、洗滌、洗脫、沉淀、干燥等步驟提純得到尿促性素柱分離中間品。
【背景技術】
[0002]尿促性素(HMG)是由人腦下垂體前葉部分分泌的一種糖蛋白促性腺激素，一般是從絕經(jīng)期或絕經(jīng)期后婦女的尿液中經(jīng)提取純化而制得。婦女在行經(jīng)期間HMG的含量有所波動，但較低，只有婦女進入絕經(jīng)期或之后的十幾年中，其尿中HMG的含量方達到高峰(60-100iu/L尿)，并能維持在一個穩(wěn)定的水平上，HMG含有卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)，其所含比例近似1:1。臨床主要用于治療婦女因功能性不排卵所致的不育癥；男性因激素水平低下所引起的精子過少或活力不足。另外，還用于治療諸如婦女閉經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)、男女性機能失調(diào)等癥。
[0003]1928年Ascbheim首先報道了從更年期婦女尿液中發(fā)現(xiàn)了活性物質(zhì)，之后報道雖不少，但真正對HMG的了解和制備，是從20世紀60年代的Donimi開始，并逐漸形成比較規(guī)范化的工藝來制備的。我國從20世紀70年代開始研究，80年代正式進入臨床試驗階段，90年代開始大量生產(chǎn)。
[0004]在實際生產(chǎn)中，由于尿促性素協(xié)和干粉中組分較多，利用柱層析可將雜質(zhì)成分去除，保留有效組分。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提出的DEAE柱層析提純尿促性素的具體方法，包括以下步驟:
[0006]1、溶液的配制:
[0007]①0.02-0.09mol/L Tris-HCl 緩沖液(ρΗ7.5):稱取 Tri s-HCl，量取純化水，攪拌溶解，用鹽酸調(diào)PH7.5 ;
[0008]②0.1-0.5mol/L Tris-HCl 洗脫液(ρΗ7.5):稱取 Tris-HCl，量取純化水，攪拌溶解，用鹽酸調(diào)PH7.5。
[0009]2、DEAE-Cellulose 樹脂處理；
[0010]①將DEAE-Cellulose樹脂用純化水反沖下來,裝入桶中，用純化水浸沒攪勻,靜止I小時，傾去上清液及細小顆粒，反復三次，純化水浸沒過夜；
[0011]②將DEAE-Cellulose樹脂濾干，用少量純化水洗滌，濾干后，裝入桶中，用0.5mol/L HCl浸沒，攪拌I小時，過濾，用純化水洗至中性，再用0.5mol/L NaOH浸泡，攪拌I小時，過濾，再用純化水洗至中性；
[0012]③將樹脂濾干，用0.02-0.09mol/L Tris-HCl緩沖液(ρΗ7.5)反復平衡到ρΗ7.5
后，用緩沖液浸沒，待用；
[0013]④將上述平衡好的樹脂裝入柱內(nèi)，柱裝好后，再用0.02-0.09mol/LTris-HCl (pH7.5)緩沖液走柱，以流出液的pH近7.5為標準
[0014]3、上樣:
[0015]在2-15°C條件下，將尿促性素協(xié)和干粉按1-3 =100-300倍比例(Kg:L)溶解于0.02-0.09mol/L的Tris-HCl緩沖液中攪拌溶解；上樣:流速控制在50_55ml/min。
[0016]4、洗滌:
[0017]上樣結(jié)束后，用0.02-0.09mol/L Tris-HCl (pH7.5)緩沖液洗滌至流出液OD值(375nm處，紫外吸光光度值)在0.25以下，流速控制在60ml/min左右。
[0018]5、洗脫:
[0019]用0.1-0.5mol/L Tris-HCl 緩沖液(pH7.5)洗脫，流速控制在 70ml/min 左右，洗脫至流出OD值(375nm處，紫外吸光光度值)在0.35以上，滴加乙醇變渾濁后，開始收集流出液，直到OD值(375nm處，紫外吸光光度值)在0.35以下，停止收集流出液。
[0020]6、沉淀:
[0021]計量流出收集液體積，轉(zhuǎn)入不銹鋼桶內(nèi)，加入5倍量(V/V)95%冷乙醇，用攪拌棒攪拌均勻，然后置低溫間沉淀過夜。
[0022]7、干燥:
[0023]棄去桶內(nèi)的上清液，沉淀物置入離心機中離心30分鐘，棄去上清液；沉淀物用適量的無水乙醇脫水，離心棄去上清液，重復兩次；最后，將沉淀物置于五氧化二磷做吸水劑的真空干燥箱內(nèi)干燥，干燥后得柱分離干燥品。
[0024]本發(fā)明公開了采用DEAE柱層析提純尿促性素的技術方法，其特征是經(jīng)過將處理的DEAE-Cellulose樹脂裝入柱子內(nèi)，然后將尿促性素協(xié)和干粉按比例溶于配好的緩沖液中，然后經(jīng)過上樣、洗滌、洗脫、沉淀、干燥得柱分離干燥品。此技術通過柱層析將尿促性素中間品各組分分離開來，從而去除雜質(zhì)，達到純化尿促性素的目的。
【具體實施方式】
[0025]實施例1
[0026]1、溶液的配制:
[0027]①0.05mo 1/L Tris-HCl緩沖液(pH7.5):稱取Tris-HCl，量取純化水，攪拌溶解，用鹽酸調(diào)PH7.5。
[0028]②0.2mol/L Tris-HCl洗脫液(pH7.5):稱取Tris-HCl，量取純化水，攪拌溶解，用鹽酸調(diào)PH7.5。
[0029]2、DEAE-Cellulose 樹脂處理；
[0030]①將DEAE-Cellulose樹脂用純化水反沖下來，裝入桶中，用純化水浸沒攪勻，靜止I小時，傾去上清液及細小顆粒，反復三次，純化水浸沒過夜。
[0031]②將DEAE-Cellulose樹脂濾干，用少量純化水洗滌，濾干后，裝入桶中，用
0.5mol/L HCl浸沒，攪拌I小時，過濾，用純化水洗至中性，再分別用0.5mol/L NaOH浸泡，攪拌I小時，過濾，再用純化水洗至中性。
[0032]③將樹脂濾干，用0.05mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.5)反復平衡到pH7.5后，用緩沖液浸沒，待用；
[0033]④將上述平衡好的樹脂裝入柱內(nèi)，柱裝好后，再用0.05mol Tris-HCl (pH7.5)緩沖液走柱，以流出液的pH近7.5為標準[0034]3、上樣
[0035]在8-10°C條件下，將尿促性素協(xié)和干燥品18g溶于1800ml的0.05mol/LTris-HCl緩沖液(PH7.5)中，攪拌使其溶解；上樣，流速控制在50-55ml/min。
[0036]4、洗滌
[0037]上樣結(jié)束后，用0.05mol Tris-HCl (ρΗ7.5)緩沖液洗滌至流出液OD值(375nm處，紫外吸光光度值)在0.25，流速控制在60ml/min。
[0038]5、洗脫
[0039]用0.2mol/L Tris-HCl緩沖液(ρΗ7.5)洗脫，流速控制在70ml/min，洗脫至流出OD值(375nm處，紫外吸光光度值)在0.37，滴加乙醇變渾濁后，開始收集流出液，直到OD值(375nm處，紫外吸光光度值)在0.34，停止收集流出液。
[0040]6、沉淀
[0041]量出流出收集液體積，轉(zhuǎn)入不銹鋼桶內(nèi)，加入5倍量(V/V)的95%冷乙醇，用玻璃棒攪拌沉淀，然后置冷庫沉淀過夜。
[0042]7、干燥
[0043]次日，棄去桶內(nèi)的上清液，然后離心30分鐘，棄去上清液；再用少量的無水乙醇洗滌，研磨，離心棄去上清液，重復兩次；最后，將沉淀物置于用五氧化二磷做吸水劑的真空干燥箱內(nèi)干燥，干燥后得柱分離干燥品9.0g。
[0044]經(jīng)檢測，最后得到的尿促性素柱分離干燥品效價為356iu/mg。
[0045]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非是對本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術人員可能利用上述揭示的技術內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術方案內(nèi)容、依據(jù)本發(fā)明的技術實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術方案的保護范圍。
【權利要求】
1.DEAE-Cellulose柱層析提純尿促性素的技術方法，其特征在于，絕經(jīng)期婦女的尿液經(jīng)過高嶺土吸附、乙酸銨鹽溶、協(xié)和樹脂吸附得到尿促性素協(xié)和品，將尿促性素協(xié)和品干粉溶解于配好的緩沖液中，經(jīng)DEAE吸附、洗滌、洗脫、沉淀、干燥得尿促性素。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)溶液的配制；
(2)DEAE-Cellulose 樹脂處理； (3)DEAE樹脂吸附:絕經(jīng)期婦女的尿液經(jīng)過高嶺土吸附、乙酸銨鹽溶、協(xié)和樹脂吸附，得到的尿促性素協(xié)和品，溶解于0.02-0.09mol/L Tris-HCl (pH7.5)緩沖液，流經(jīng)裝有DEAE樹脂柱，吸附； (4)吸附結(jié)束后，用0.02-0.09mol/L Tris-HCl (pH7.5)緩沖液洗滌樹脂柱； (5)用0.1-0.5mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.5)緩沖液洗脫，收集脫附液； (6)脫附液用乙醇沉淀； (7)離心、無水乙醇脫水，干燥即得。
3.根據(jù)權利要求書2(1)所述的方法，其特征在于，0.02-0.09mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.5):稱取Tris-HCl，量取純化水，攪拌溶解，用鹽酸調(diào)pH7.5 ；0.1-0.5mol/L Tris-HCl洗脫液(pH7.5):稱取Tris-HCl，量取純化水，攪拌溶解，用鹽酸調(diào)pH7.5。
4.根據(jù)權利要求書`2(2)所述的方法，其特征在于，①將柱內(nèi)DEAE-Cellulose樹脂用純化水反沖下來，裝入桶中，用純化水浸沒攪勻，靜止I小時，傾去上清液及細小顆粒，反復三次，用純化水浸沒過夜； ②將DEAE-Cellulose樹脂濾干，用少量純化水洗滌，濾干后，裝入桶中，用0.5mol/LHCl浸沒，攪拌I小時，過濾，用純化水洗至中性，再分別用0.5mol/L NaOH浸泡，攪拌I小時，過濾，再用純化水洗至中性； ③將樹脂濾干，用0.02-0.09mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.5)反復平衡到pH7.5后，用緩沖液浸沒，待用； ④將上述平衡好的樹脂裝入柱內(nèi)，柱裝好后，再用0.02-0.09mol/LTris-HCl (pH7.5)緩沖液走柱，以流出液的pH近7.5為標準。
5.根據(jù)權利要求書2(3)所述的方法，其特征在于，在2-15°C條件下，將尿促性素協(xié)和品按1-3:100-300倍比例(Kg:L)溶解于0.02-0.09mol/L的Tris-HCl緩沖液中；流經(jīng)0￡八￡樹脂柱進行吸附。
6.根據(jù)權利要求書2(4)所述的方法，其特征在于，吸附結(jié)束后，用0.02-0.09mol/LTris-HCl (pH7.5)緩沖液洗滌至流出液OD值(375nm處，紫外吸光光度值)在0.25以下。
7.根據(jù)權利要求書2(5)所述的方法，其特征在于，用0.1-0.5mol/LTris-HCl緩沖液(pH7.5)洗脫，洗脫至流出OD值(375nm處，紫外吸光光度值)在0.35以上，開始收集洗脫液，直到OD值(375nm處，紫外吸光光度值)在0.35以下，停止收集洗脫液。
8.根據(jù)權利要求書2(6)所述的方法，其特征在于，計量洗脫液體積，加入5倍量的95%冷乙醇沉淀。
9.根據(jù)權利要求書2(7)所述的方法，其特征在于，離心后，沉淀物用適量的無水乙醇脫水兩次，真空干燥得尿促性素。
【文檔編號】C07K14/59GK103665146SQ201310648024
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月27日 優(yōu)先權日:2013年11月27日
【發(fā)明者】劉乃山, 劉君, 葛翠鳳, 劉翠珍 申請人:青島康原藥業(yè)有限公司