專利名稱：一種共分離制備雞蛋清溶菌酶與活性蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物、醫(yī)藥及食品工業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種從雞蛋清中共分離制備溶菌酶和其它活性蛋白的方法。
背景技術(shù)：
雞蛋清中含有溶菌酶、卵白蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵類粘蛋白、卵粘蛋白和其它多種球蛋白。其中，溶菌酶(Lysozyme)可以選擇性水解細(xì)菌細(xì)胞壁的N-乙酰葡萄糖胺與N-乙酰胞壁酸之間的β_1，4糖苷鍵，是一種安全高效的天然抗菌劑，可用于海產(chǎn)品、水產(chǎn)品、肉制品、乳酪制品、低度酒、糕點等多種食品的防腐保鮮，用于基因工程中提取細(xì)菌體內(nèi)的活性物質(zhì)，用于制備口腔藥片或漱口液，用于治療副鼻竇炎、口腔潰瘍和滲出性中耳炎等疾病。卵白蛋白可用于制備酶解卵白蛋白，發(fā)揮抑制細(xì)胞病變，增強(qiáng)人體免疫力，清除對人體有害的自由基，改善新陳代謝的作用。卵轉(zhuǎn)鐵蛋白具有抗菌與抗病毒活性，在提高機(jī)體的免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體抗病防病能力，防治貧血方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
當(dāng)前所用的溶菌酶制備方法有直接結(jié)晶法、親和色譜法、超濾法、反膠團(tuán)萃取法與離子交換法等。這些方法有的雖然操作簡單，成本較低，但是生產(chǎn)周期長，收率不高，純度較低；有的成本較高，操作難度較大，限制了在工業(yè)上的大規(guī)模應(yīng)用。同時上述方法都不利于共分離制備雞蛋清中的卵白蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白等其它活性蛋白。
我國目前已經(jīng)成為世界上鮮蛋生產(chǎn)第一大國，但鮮蛋基本作為初級食品食用，深加工程度明顯落后于發(fā)達(dá)國家40%以上的鮮蛋加工率。如何更加有效地從雞蛋清中分離獲取溶菌酶及卵白蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白等其它活性蛋白是當(dāng)今深受關(guān)注的課題。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種共分離制備雞蛋清溶菌酶和其它活性蛋白的方法。該方法所用工藝簡單快捷，條件溫和，無需復(fù)雜設(shè)備，可以獲得高純度與高生物活性的溶菌酶，可以克服現(xiàn)有溶菌酶制備工藝的缺點。本發(fā)明在實施制備溶菌酶的同時還可以獲得較高純度的其它活性蛋白。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施: O室溫下取新鮮雞蛋，收集雞蛋清，按照雞蛋清與新鮮去離子水體積比為1:2的比例進(jìn)行稀釋，隨后用IM鹽酸調(diào)至pH 5.5左右，均勻攪拌I小時，SOOOrpm離心去除沉淀，收集上清液A。
2)向所得上清液A中加入分子量介于200-20000的聚乙二醇，至聚乙二醇的質(zhì)量濃度達(dá)10-30%，再攪拌I小時，8000rpm離心，收集上清液B。
3)向所得上清液B中加入飽和硫酸銨溶液，至硫酸銨的質(zhì)量濃度達(dá)到15%，混勻后于6000rpm離心,分別收集上層清液C與下層清液D。
4)對所得上層清液C，以膜截留分子量為3000_5000Da的超濾膜進(jìn)行超濾，或者進(jìn)行透析處理，對超濾或者透析處理所得溶液進(jìn)行真空冷凍干燥，得到白色粉末，即為溶菌酶。
5)對所得下層清液D，以膜截留分子量為3000_5000Da的超濾膜進(jìn)行超濾，或者進(jìn)行透析處理，對超濾或者透析處理所得溶液進(jìn)行真空冷凍干燥，得到白色粉末，即為卵白蛋白與卵轉(zhuǎn)鐵蛋白為主的較高純度的其它活性蛋白。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點: I本發(fā)明涉及的提取原料雞蛋清來源廣泛，價格低廉； 2本發(fā)明所用工藝操作簡單易行，生產(chǎn)周期短，無需復(fù)雜設(shè)備，易于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)； 3本發(fā)明所用工藝未使用任何有毒有害化學(xué)物質(zhì)，確保產(chǎn)品質(zhì)量的安全性； 4本發(fā)明所用分離步驟中無相變發(fā)生，有利于保護(hù)溶菌酶與其它蛋白的生物學(xué)活性； 5本發(fā)明從雞蛋清中提取溶菌酶的同時還可以獲取卵白蛋白與卵轉(zhuǎn)鐵蛋白為主的較高純度的其它活性蛋白，顯著提高生產(chǎn)工藝的經(jīng)濟(jì)效益。


圖1為一種共分離制備雞蛋清溶菌酶和其它活性蛋白的方法的工藝流程示意圖。
圖2為十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測聚乙二醇200處理蛋清所得結(jié)果。其中，泳道1:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道2:所用雞蛋清原料；泳道3:質(zhì)量濃度為10%的聚乙二醇200處理后雞蛋清；泳道4:質(zhì)量濃度為15%的硫酸銨處理后所得上相溶液；泳道5:質(zhì)量濃度為15%的硫酸銨處理后所得下相溶液。
圖3為十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測聚乙二醇200處理蛋清所得結(jié)果。其中，泳道1:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道2:所用雞蛋清原料；泳道3:質(zhì)量濃度為30%的聚乙二醇200處理后雞蛋清；泳道4:質(zhì)量濃度為15%的硫酸銨處理后所得上相溶液；泳道5:質(zhì)量濃度為15%的硫酸銨處理后所得下相溶液。
圖4為十二烷基 磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測聚乙二醇20000處理蛋清所得結(jié)果。其中，泳道1:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道2:所用雞蛋清原料；泳道3:質(zhì)量濃度為10%的聚乙二醇20000處理后雞蛋清；泳道4:質(zhì)量濃度為15%的硫酸銨處理后所得上相溶液；泳道5:質(zhì)量濃度為15%的硫酸銨處理后所得下相溶液。
圖5為十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測聚乙二醇20000處理蛋清所得結(jié)果。其中，泳道1:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道2:所用雞蛋清原料；泳道3:質(zhì)量濃度為30%的聚乙二醇20000處理后雞蛋清；泳道4:質(zhì)量濃度為15%的硫酸銨處理后所得上相溶液；泳道5:質(zhì)量濃度為15%的硫酸銨處理后所得下相溶液。
具體實施方式
以下通過實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述: 實施例1 新鮮雞蛋清100ml，加入200ml新鮮去離子水，用IM鹽酸調(diào)pH至5.5左右，攪拌I小時，8000rpm離心30min除去沉淀。離心獲取的上清液，加聚乙二醇200，至聚乙二醇的質(zhì)量濃度為10%，攪拌均勻，室溫放置I小時，8000rpm離心30min，除去沉淀。離心獲取的上清液中加入飽和硫酸銨溶液，至硫酸銨的質(zhì)量濃度為15%，攪拌均勻，室溫放置I小時，6000rpm離心30min，分別吸取上層清液與下層清液。上層清液以膜截留分子量為3000-5000Da的超濾膜在室溫下進(jìn)行超濾，對超濾液進(jìn)行真空冷凍干燥，所得白色粉末即為溶菌酶，得率為80%。下層清液以膜截留分子量為3000-5000Da的超濾膜在室溫下進(jìn)行超濾，對超濾液進(jìn)行真空冷凍干燥，所得白色粉末即為卵白蛋白與卵轉(zhuǎn)鐵蛋白為主的其它活性蛋白，得率為75%。所得溶菌酶經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測為單一條帶，酶活可達(dá)到25000U/mg。所得其它活性蛋白經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測表明卵白蛋白與卵轉(zhuǎn)鐵蛋白為主要成分，分別占總蛋白的50%與30%，可以直接應(yīng)用于食品工業(yè)或者進(jìn)一步精制分離(見圖2)。
實施例2 新鮮雞蛋清100ml，加入200ml新鮮去離子水，用IM鹽酸調(diào)pH至5.5左右，攪拌I小時，8000rpm離心30min除去沉淀。離心獲取的上清液，加聚乙二醇200，至聚乙二醇的質(zhì)量濃度為30%，攪拌均勻，室溫放置I小時，8000rpm離心30min，除去沉淀。離心獲取的上清液中加入飽和硫酸銨溶液，至硫酸銨的質(zhì)量濃度為15%，攪拌均勻，室溫放置I小時，6000rpm離心30min，分別吸取上層清液與下層清液。上層清液以膜截留分子量為3000-5000Da的超濾膜在室溫下進(jìn)行超濾，對超濾液進(jìn)行真空冷凍干燥，所得白色粉末即為溶菌酶，得率為70%。下層清液以膜截留分子量為3000-5000Da的超濾膜在室溫下進(jìn)行超濾，對超濾液進(jìn)行真空冷凍干燥，所得白色粉末即為卵白蛋白與卵轉(zhuǎn)鐵蛋白為主的其它活性蛋白，得率為65%。所得溶菌酶經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測為單一條帶，酶活可達(dá)到25000U/mg。所得其它活性蛋白經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測表明卵白蛋白與卵轉(zhuǎn)鐵蛋白為主要成分，分別占總蛋白的50%與25%，可以直接應(yīng)用于食品工業(yè)或者進(jìn)一步精制分尚(見圖3)。
實施例3 新鮮雞蛋清100ml，加入200ml新鮮去離子水，用IM鹽酸調(diào)pH至5.5左右，攪拌I小時，8000rpm離心30min除去沉淀。離心獲取的上清液,加聚乙二醇20000,至聚乙二醇的質(zhì)量濃度為10%，攪拌均勻，室溫放置I小時，8000rpm離心30min，除去沉淀。離心獲取的上清液中加入飽和硫酸銨溶液，至硫酸銨的質(zhì)量濃度為15%，攪拌均勻，室溫放置I小時，6000rpm離心30min，分別吸取上層清液與下層清液。上層清液以膜截留分子量為3000-5000Da的超濾膜在室溫下進(jìn)行超濾，對超濾液進(jìn)行真空冷凍干燥，所得白色粉末即為溶菌酶，得率為55%。下層清液以膜截留分子量為3000-5000Da的超濾膜在室溫下進(jìn)行超濾，對超濾液進(jìn)行真空冷凍干燥，所得白色粉末即為卵白蛋白與卵轉(zhuǎn)鐵蛋白為主的其它活性蛋白，得率為50%。所得溶菌酶經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測為單一條帶，酶活可達(dá)到25000U/mg。所得其它活性蛋白經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測表明卵白蛋白與卵轉(zhuǎn)鐵蛋白為主要成分，分別占總蛋白的25%與35%，可以直接應(yīng)用于食品工業(yè)或者進(jìn)一步精制分尚(見圖4)。
實施例4 新鮮雞蛋清100ml，加入200ml新鮮去離子水，用IM鹽酸調(diào)pH至5.5左右，攪拌I小時，8000rpm離心30min除去沉淀。離心獲取的上清液,加聚乙二醇20000,至聚乙二醇的質(zhì)量濃度為30%，攪拌均勻，室溫放置I小時，8000rpm離心30min，除去沉淀。離心獲取的上清液中加入飽和硫酸銨溶液，至硫酸銨的質(zhì)量濃度為15%，攪拌均勻，室溫放置I小時，6000rpm離心30min，分別吸取上層清液與下層清液。上層清液以膜截留分子量為3000-5000Da的超濾膜在室溫下進(jìn)行超濾，對超濾液進(jìn)行真空冷凍干燥，所得白色粉末即為溶菌酶，得率為35%。下層清液以膜截留分子量為3000-5000Da的超濾膜在室溫下進(jìn)行超濾，對超濾液進(jìn)行真空冷凍干燥，所得白色粉末即為卵白蛋白與卵轉(zhuǎn)鐵蛋白為主的其它活性蛋白，得率為40%。所得溶菌酶經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測為單一條帶，酶活可達(dá)到25000U/mg。所得其它活性蛋白經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測表明卵白蛋白與卵轉(zhuǎn)鐵蛋白為主要成分，分別占總蛋白的25%與30%，可以直接應(yīng)用于食品工業(yè)或者進(jìn)一步精制分尚(見圖5)。`
權(quán)利要求
1.一種共分離制備雞蛋清溶菌酶與活性蛋白的方法，按照下述步驟進(jìn)行: (1)室溫下取新鮮雞蛋，收集雞蛋清，按照雞蛋清與新鮮去離子水體積比為1:2的比例進(jìn)行稀釋，隨后用IM鹽酸調(diào)至pH 5.5左右，均勻攪拌I小時，SOOOrpm離心去除沉淀，收集上清液A ； (2)向所得上清液A中加入分子量介于200-20000的聚乙二醇，至聚乙二醇的質(zhì)量濃度達(dá)10-30%，再攪拌I小時，8000rpm離心，收集上清液B ； (3)向所得上清液B中加入飽和硫酸銨溶液，至硫酸銨的質(zhì)量濃度達(dá)到15%，混勻后于6000rpm離心,分別收集上層清液C與下層清液D ； (4)對所得上層清液C，以膜截留分子量為3000-5000Da的超濾膜進(jìn)行超濾，或者進(jìn)行透析處理，對超濾或者透析處理所得溶液進(jìn)行真空冷凍干燥，得到白色粉末，即為溶菌酶； (5)對所得下層清液D，以膜截留分子量為3000-5000Da的超濾膜進(jìn)行超濾，或者進(jìn)行透析處理，對超濾或者透析處理所得溶液進(jìn)行真空冷凍干燥，得到白色粉末，即為卵白蛋白與卵轉(zhuǎn)鐵蛋白為 主的較高純度的其它活性蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種共分離制備雞蛋清溶菌酶與活性蛋白的方法，步驟如下在室溫下收集雞蛋清，并調(diào)節(jié)pH至5.5左右，攪拌均勻后離心；向離心后得到的上清液中加入分子量介于200-20000的聚乙二醇，攪拌均勻后離心；向離心后得到的上清液中加入飽和硫酸銨溶液，混勻后離心；分別收集離心得到的上層清液和下層清液；對上層清液進(jìn)行超濾或者透析處理可以得到高純度的雞蛋清溶菌酶；對下層清液進(jìn)行超濾或者透析處理可以得到卵白蛋白與卵轉(zhuǎn)鐵蛋白為主的較高純度的其它活性蛋白。本發(fā)明簡單易行，成本低廉，條件溫和，可以很好地保持溶菌酶品質(zhì)，適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，同時還可以得到其它活性蛋白，進(jìn)一步提高生產(chǎn)效益。
文檔編號C07K14/79GK103160482SQ201310080459
公開日2013年6月19日 申請日期2013年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月14日
發(fā)明者聞崇煒, 寧德剛, 徐衛(wèi)東 申請人:江蘇大學(xué)