專利名稱：減毒腸毒素c2超抗原突變蛋白及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體的說是一種減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
超抗原(superantigen, SAg)是一組由細菌或病毒編碼的，并在極低濃度下對人體或其他哺乳動物T淋巴細胞產(chǎn)生極強免疫刺激活性的蛋白質(zhì)分子。不像傳統(tǒng)的抗原，超抗原不需要抗原遞呈細胞的加工處理，在抗原遞呈細胞外側(cè)的抗原結(jié)合區(qū)與MHC II (組織相容性復(fù)合物)分子和T細胞V β區(qū)結(jié)合形成復(fù)合物，從而激發(fā)大量的T淋巴細胞增殖，進而導(dǎo)致在體外或體內(nèi)釋放產(chǎn)生大量的細胞因子和其它效應(yīng)分子。正因為超級抗原存在這種特殊的生物活性和作用機理，所以致使其可以作為一種臨床上的免疫調(diào)節(jié)劑和抗腫瘤藥物，用于表達MHC II分子的腫瘤治療。金黃色葡萄球菌腸毒素C2 (Staphylococcal enterotoxin C2, SEC2)是一類具有代表性的微生物外毒素。由于其極強的T細胞激活功能，成為一類典型微生物超抗原，近年來受到人們的廣泛關(guān)注。但是，由于腸毒素C2超抗原的作用必須依賴于與免疫系統(tǒng)中的MHC II分子相結(jié)合，這必然會導(dǎo)致其在人體中可能與來自正常組織或細胞的MHC II分子的結(jié)合，從而對正常細胞也產(chǎn)生一定的毒性作用；此外，由于金黃色葡萄球菌腸毒素是一種細菌外毒素，因此在對人體會產(chǎn)生一定的毒素綜合癥(TSS)和食物中毒癥狀，并在臨床上表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉、以及致熱等癥狀，因此限制了其臨床應(yīng)用和治療可得效果。

因此,為減少腸毒素C2作為細菌外毒素所帶來的邊際效應(yīng)和對人體的毒副作用，進而提高腸毒素C2在未來抗腫瘤方面的開發(fā)潛力，本發(fā)明通過基因定點突變技術(shù)對SEC2中與毒性相關(guān)的位點進行突變，從而達到減毒的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白及其制備方法和應(yīng)用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白:所述減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白具有序列表SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:11、SEQID NO: 13或SEQ ID NO: 15中堿基序列。所述減毒腸毒素C2超抗原突變編碼蛋白具有序列表SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14 或 SEQ ID NO:16中氨基酸序列。減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白的制備方法:以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物對sec2-F:5’-CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3’ 和 sec2 (C93A) -R: 5’ -GATGAAAAATATG CGTTTACATAG-3’ ; sec2 (C93A) _F: 5’ -ATGTAAACGCATATTTTTCATCCAA-3’ 和 sec2_R:5’ -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTT GTTG-3’ 分別擴增獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，采用上述獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進行PCR擴增擴得具有序列表SEQ ID NO:1中堿基序列sec2(C93A)突變基因；以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物對sec2-F:5’-CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3 ’和 sec2(D83A)-R:5 ’-TCCATACACAGCA ACTACTTCATCT-3 ’；sec2(D83A)-F:5 ’-GATGAAGTAGTTGCTGTGTATGGAT CAAAT-3’ 和 sec2_R:5’ -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’ 分別擴增獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，采用上述獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進行PCR擴增擴得具有序列表SEQ ID NO: 3中堿基序列sec2(D83A)突變基因；以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物對sec2-F:5’-CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3，和 sec2(H47A)-R:5，-GTTATAAATTAA ATCTGCTGCCAAA-3，；sec2(H47A)-F:5，-TTTGGCAGCAGATTTAATTTATA AC-3’ 和 sec2_R:5’ -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’ 分別擴增獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，采用上述獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進行PCR擴增擴得具有序列表SEQ ID NO: 5中堿基序列Sec2(H47A)突變基因；以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物對sec2-F: 5’-CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3’和 sec2(H118A)-R:5’-GGTTTCCTTCAGC TTTTGTTATTCC3’；sec2(H118A)_F:5’_GGAATAACAAAAGCTGAAGGAAAC CAC-3’ 和 sec2_R:5’ -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’ 分別擴增獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，采用上述獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進行PCR擴增擴得具有序列表SEQ ID NO: 7中堿基序列sec2(H118A)突變基因；以具有序列表SEQ ID N0:1中堿基序列sec2(C93A)突變基因為模板，采用引物對 sec2-F:5，-CGGAA TTCGAGAGTCAACCAGA-3，和 sec2 (C93A/C110A)-R:5，-CCTCCATACATAGCAGTTTTACCAC-3’ ； sec2 (C93A/C110A)_F:5，-TGGTAAAACTGCTA TGTATGGAGGA-3，和sec2-R:5’ -TCGCTCGAGT TATCCATTCTTTGTTG-3’分別擴增獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2_R為引物，采用上述獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進行PCR擴增擴得具有序列表SEQ IDNO: 9中堿基序列sec2 (C93A/C110A)突變基因;以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物對sec2-F: 5’CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3’ 和 sec2(H122A)-R:5’-CCATTATCAAAGGCGTT TCCTTC-3’ ;sec2(H122A)_F:5’-GGAAACgCCTTTGATAATGGGAAC-3’ 和 sec2_R:5’ -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’ 分別擴增獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，采用上述獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進行PCR擴增擴得具有序列表SEQ ID NO: 11中堿基序列Sec2(H122A)突變 基因；
以SEQ ID N0:7中堿基序列Sec2(H118A)突變基因為模板，采用引物對sec2-F:5’ -CGGAA TTCGAGAGTCAACCAGA-3’ 和 sec2 (H118A/H122A)-R: 5’ -CCATTATCAAAGGCGTTTCCTTC-3，；sec2(H118A/H122A)-F:5，-GGAAACGCCTTTGATAATGGGAAC-3J 和 sec2_R:5，-TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’分別擴增獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，采用上述獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進行PCR擴增擴得具有序列表SEQ ID NO: 13中堿基序列sec2 (H118A/H122A)突變基因；以序列表SEQ ID NO: 13中堿基序列sec2 (H118A/H122A)突變基因為模板，采用引物對 sec2-F:5，-CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3，和 sec2 (H47A)-R: 5，-GTTATAAATTAAATCT GCTGCCAAA-3，； sec2 (H47A) -F: 5，-TTTGGCAGCAGATTTAATTTATAAC-3，和 sec2_R: 5，-TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’分別擴增獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2_F和sec2-R為引物，采用上述獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進行PCR擴增擴得具有序列表SEQ ID NO: 15中堿基序列sec2 (H47A/H118A/H122A)突變基因；而后將具有序列表SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQID NO:9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID N0:13和SEQ ID NO: 15中堿基序列中的堿基序列分別克隆入表達載體pET-28a，以大腸桿菌BL21 (DE3)為宿主菌，分別構(gòu)建成異源表達減毒腸毒素C2突變蛋白的基因工程菌，經(jīng)誘導(dǎo)后在培養(yǎng)基中異源表達得具有序列表SEQ ID NO:2, SEQID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO: 16中氨基酸序列中的堿基序列的減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白。所述的誘導(dǎo)方法 是通過以IPTG為誘導(dǎo)物進行誘導(dǎo)表達。所述將所得蛋白分離純化的純蛋白。所述離純化方法為Ni親和層析法，所用的介質(zhì)為瓊脂糖凝膠樹脂。減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白的應(yīng)用:具有序列表SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13 或 SEQ ID NO: 15中堿基序列的減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白可作為抗腫瘤免疫的藥物或作為防止催吐、腹瀉的藥物。本發(fā)明所具有如下優(yōu)點:1.本發(fā)明為人工構(gòu)建的系列編碼超抗原突變蛋白的核苷酸序列，獲知其基因全序列的組成。2.本發(fā)明利用基因工程技術(shù)，突變構(gòu)建了一系列編碼減毒超抗原突變蛋白的核苷酸基因，并在大腸桿菌中表達，表達獲得的一系列超抗原突變蛋白經(jīng)檢驗具有超抗原活性(如圖3和圖4所示)。3.本發(fā)明構(gòu)建并獲得的系列超抗原突變蛋白由于顯著降低了其催吐、腹瀉活性，因此更適合用于將來的臨床免疫治療；此外突變位點還涉及到MHC II結(jié)合區(qū)，因此降低了其對人體表達MHC II分子的正常組織的毒性，從而降低了其對人體的毒副作用。4.本發(fā)明提供的表達及制備大量減毒超抗原腸毒素C2突變蛋白的方法能使該系列蛋白達到高效表達及純化，能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。5.本發(fā)明通過基因工程技術(shù)對野生型SEC2進行定點改造，并結(jié)合細胞生物學(xué)實驗和體內(nèi)動物試驗篩選獲得具有超抗原活性，并且毒性作用降低的腸毒素C2突變蛋白，使其有可能開發(fā)為一種新的臨床抗腫瘤藥物。


圖1為本發(fā)明野生型SEC2和八種腸毒素C2突變蛋白基因的PCR產(chǎn)物核酸電泳圖譜(其中M代表DL2000marker，1、2、3、4、5、6、7、8、9依次代表野生型SEC2基因和序列表SEQID NO: 1、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO:1USEQ IDNO: 13、SEQ ID NO: 15八種突變基因的PCR產(chǎn)物)。圖2為本發(fā)明野生型SEC2和八種突變蛋白基因編碼蛋白純品的電泳圖譜(其中M代表蛋白marker, 1、2、3、4、5、6、7、8、9依次代表野生型SEC2和具有序列表SEQ ID NO:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO:16序列的八種編碼蛋白)。圖3為本發(fā)明八種超抗原SEC2突變蛋白基因編碼蛋白的超抗原活性檢測實驗結(jié)果圖(其中圖3.A為與二硫環(huán)相關(guān)的兩種突變蛋白SEC2(C93A)和SEC2 (C93A/C110A)與野生型SEC2刺激小鼠T淋巴細胞結(jié)果比較圖(其中橫坐標(biāo)為本發(fā)明活性檢測中超抗原突變蛋白的檢測劑量，縱坐標(biāo)為增值指數(shù))；其中圖3.B為與MHC II分子結(jié)合相關(guān)的六種突變蛋白 SEC2(H47A)、SEC2(D83A)、SEC2 (H118A)、SEC2 (H122A)、SEC2 (H118A/H122A)、SEC2(H47A/H118A/H122A)與野生型SEC2刺激小鼠T淋巴細胞結(jié)果比較圖(其中橫坐標(biāo)為本發(fā)明活性檢測中超抗原突變蛋白的檢測劑量，縱坐標(biāo)為增值指數(shù)。))。圖4為本發(fā)明八種超抗原SEC2突變蛋白基因編碼蛋白的抑瘤活性檢測結(jié)果圖。(其中縱坐標(biāo)為陰性對照牛血清白 蛋白(BSA)、系列突變蛋白和陽性對照SEC2 ;橫坐標(biāo)為抑
瘤率。)。圖5A和B為本發(fā)明超抗原SEC2突變蛋白基因編碼蛋白的抑瘤活性檢測結(jié)果圖。
具體實施例方式實施例1具有序列表SEQID NO: USEQ ID NO: 3,SEQ ID NO: 5,SEQ ID NO: 7,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 15中堿基序列的八種減毒超抗原突變蛋白基因序列和具有序列表 SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 16氨基酸序列的八種減毒超抗原突變蛋白基(參見序列表):具有序列表SEQ ID NO:1堿基序列的超抗原突變蛋白基因:OOlgagagtcaac cagaccctac gccagatgag ttgcacaaat caagtgagtt051tactggtacg atgggtaata tgaaatattt atatgatgat cattatgtatIOlcagcaactaa agttatgtct gtagataaat ttttggcaca tgatttaatt15ltataacatta gtgataaaaa actaaaaaat tatgacaaag tgaaaacaga201gttattaaat gaagatttag caaagaagta caaagatgaa gtagttgatg251tgtatggatc aaattactat gtaaacgcct atttttcatc caaagataat301gtaggtaaag ttacaggtgg taaaacttgt atgtatggag gaataacaaa35lacatgaagga aaccactttg ataatgggaa cttacaaaat gtacttataa401gagtttatga aaataaaaga aacacaattt cttttgaagt gcaaactgat45laagaaaagtg taacagctca agaactagac ataaaagcta ggaatttttt
501aattaataaa aaaaatttgt atgagtttaa cagttcacca tatgaaacag551gatatataaa atttattgaa aataacggca atactttttg gtatgatatg601atgcctgcac caggcgataa gtttgaccaa tctaaatatt taatgatgta651caacgacaat aaaacggttg attctaaaag tgtgaagata gaagtccacc70lttacaacaaa gaatggaSEQ ID N0.1的信息(參見序列表)(a)序列特征:*長度:717堿基對*類型:核酸*鏈型:雙鏈*拓撲結(jié)構(gòu):線性(b)分子類型:cDNA(C)假設(shè):否(d)反義:否(e)最初來源:金 黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有序列表SEQ ID N0:3堿基序列的超抗原突變蛋白基因:OOlgagagtcaac cagaccctac gccagatgag ttgcacaaat caagtgagtt051tactggtacg atgggtaata tgaaatattt atatgatgat cattatgtatIOlcagcaactaa agttatgtct gtagataaat ttttggcaca tgatttaatt151tataacatta gtgataaaaa actaaaaaat tatgacaaag tgaaaacaga201gttattaaat gaagatttag caaagaagta caaagatgaa gtagttgctg251tgtatggatc aaattactat gtaaactgct atttttcatc caaagataat301gtaggtaaag ttacaggtgg taaaacttgt atgtatggag gaataacaaa351acatgaagga aaccactttg ataatgggaa cttacaaaat gtacttataa401gagtttatga aaataaaaga aacacaattt cttttgaagt gcaaactgat45laagaaaagtg taacagctca agaactagac ataaaagcta ggaatttttt501aattaataaa aaaaatttgt atgagtttaa cagttcacca tatgaaacag551gatatataaa atttattgaa aataacggca atactttttg gtatgatatg601atgcctgcac caggcgataa gtttgaccaa tctaaatatt taatgatgta651caacgacaat aaaacggttg attctaaaag tgtgaagata gaagtccacc70lttacaacaaa gaatggaSEQ ID N0.3的信息(參見序列表)(a)序列特征:*長度:717堿基對*類型:核酸*鏈型:雙鏈*拓撲結(jié)構(gòu):線性(b)分子類型:cDNA(C)假設(shè):否
(d)反義:否(e)最初來源:金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有序列表SEQ ID NO:5堿基序列的超抗原突變蛋白基因:OOlgagagtcaac cagaccctacgccagatgag ttgcacaaatcaagtgagtt051tactggtacg atgggtaatatgaaatattt atatgatgatcattatgtatIOlcagcaactaa agttatgtctgtagataaat ttttggcagcagatttaatt151tataacatta gtgataaaaaactaaaaaat tatgacaaagtgaaaacaga201gttattaaat gaagatttagcaaagaagta caaagatgaagtagttgatg251tgtatggatc aaattactatgtaaactgct atttttcatccaaagataat301gtaggtaaag ttacaggtggtaaaacttgt atgtatggaggaataacaaa351acatgaagga aaccactttgataatgggaa cttacaaaatgtacttataa401gagtttatga aaataaaagaaacacaattt cttttgaagtgcaaactgat
45laagaaaagtg taacagctcaagaactagac ataaaagctaggaatttttt
501aattaataaa aaaaatttgtatgagtttaa cagttcaccatatgaaacag551gatatataaa atttattgaaaataacggca atactttttggtatgatatg601atgcctgcac caggcgataagtttgaccaa tctaaatatttaatgatgta651caacgacaat aaaacggttgattctaaaag tgtgaagatagaagtccacc70lttacaacaaa gaatggaSEQ ID N0.5的信息(參見序列表)(a)序列特征:*長度:717堿基對*類型:核酸*鏈型:雙鏈*拓撲結(jié)構(gòu):線性(b)分子類型:cDNA(C)假設(shè):否(d)反義:否(e)最初來源:金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有序列表SEQ ID N0:7堿基序列的超抗原突變蛋白基因:OOlgagagtcaac cagaccctacgccagatgag ttgcacaaatcaagtgagtt051tactggtacg atgggtaatatgaaatattt atatgatgatcattatgtatIOlcagcaactaa agttatgtctgtagataaat ttttggcacatgatttaatt151tataacatta gtgataaaaaactaaaaaat tatgacaaagtgaaaacaga201gttattaaat gaagatttagcaaagaagta caaagatgaagtagttgatg251tgtatggatc aaattactatgtaaactgct atttttcatccaaagataat301gtaggtaaag ttacaggtggtaaaacttgt atgtatggaggaataacaaa351agctgaagga aaccactttgataatgggaa cttacaaaatgtacttataa401gagtttatga aaataaaagaaacacaattt cttttgaagtgcaaactgat45laagaaaagtg taacagctcaagaactagac ataaaagctaggaatttttt
501aattaataaa aaaaatttgt atgagtttaa cagttcacca tatgaaacag551gatatataaa atttattgaa aataacggca atactttttg gtatgatatg601atgcctgcac caggcgataa gtttgaccaa tctaaatatt taatgatgta651caacgacaat aaaacggttg attctaaaag tgtgaagata gaagtccacc70lttacaacaaa gaatggaSEQ ID N0.7的信息(參見序列表)(a)序列特征:*長度:717堿基對*類型:核酸*鏈型:雙鏈*拓撲結(jié)構(gòu):線性(b)分子類型:cDNA(C)假設(shè):否(d)反義:否(e)最初來源 :金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有序列表SEQ ID N0:9堿基序列的超抗原突變蛋白基因:OOlgagagtcaac cagaccctac gccagatgag ttgcacaaat caagtgagtt051tactggtacg atgggtaata tgaaatattt atatgatgat cattatgtatIOlcagcaactaa agttatgtct gtagataaat ttttggcaca tgatttaatt151tataacatta gtgataaaaa actaaaaaat tatgacaaag tgaaaacaga201gttattaaat gaagatttag caaagaagta caaagatgaa gtagttgatg251tgtatggatc aaattactat gtaaacgcct atttttcatc caaagataat301gtaggtaaag ttacaggtgg taaaactgct atgtatggag gaataacaaa351acatgaagga aaccactttg ataatgggaa cttacaaaat gtacttataa401gagtttatga aaataaaaga aacacaattt cttttgaagt gcaaactgat45laagaaaagtg taacagctca agaactagac ataaaagcta ggaatttttt501aattaataaa aaaaatttgt atgagtttaa cagttcacca tatgaaacag551gatatataaa atttattgaa aataacggca atactttttg gtatgatatg601atgcctgcac caggcgataa gtttgaccaa tctaaatatt taatgatgta651caacgacaat aaaacggttg attctaaaag tgtgaagata gaagtccacc70lttacaacaaa gaatggaSEQ ID N0.9的信息(參見序列表)(a)序列特征:*長度:717堿基對*類型:核酸*鏈型:雙鏈*拓撲結(jié)構(gòu):線性(b)分子類型:cDNA(C)假設(shè):否
(d)反義:否(e)最初來源:金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有序列表SEQ ID NO: 11堿基序列的超抗原突變蛋白基因:OOlgagagtcaac cagaccctacgccagatgag ttgcacaaatcaagtgagtt051tactggtacg atgggtaatatgaaatattt atatgatgatcattatgtatIOlcagcaactaa agttatgtctgtagataaat ttttggcacatgatttaatt151tataacatta gtgataaaaaactaaaaaat tatgacaaagtgaaaacaga201gttattaaat gaagatttagcaaagaagta caaagatgaagtagttgatg251tgtatggatc aaattactatgtaaactgct atttttcatccaaagataat301gtaggtaa ag ttacaggtggtaaaacttgt atgtatggaggaataacaaa351acatgaagga aacgcctttgataatgggaa cttacaaaatgtacttataa401gagtttatga aaataaaagaaacacaattt cttttgaagtgcaaactgat45laagaaaagtg taacagctcaagaactagac ataaaagctaggaatttttt501aattaataaa aaaaatttgtatgagtttaa cagttcaccatatgaaacag551gatatataaa atttattgaaaataacggca atactttttggtatgatatg601atgcctgcac caggcgataagtttgaccaa tctaaatatttaatgatgta651caacgacaat aaaacggttgattctaaaag tgtgaagatagaagtccacc70lttacaacaaa gaatggaSEQ ID N0.11的信息(參見序列表)(a)序列特征:*長度:717堿基對*類型:核酸*鏈型:雙鏈*拓撲結(jié)構(gòu):線性(b)分子類型:cDNA(C)假設(shè):否(d)反義:否(e)最初來源:金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有序列表SEQ ID NO: 13堿基序列的超抗原突變蛋白基因:OOlgagagtcaac cagaccctacgccagatgag ttgcacaaatcaagtgagtt051tactggtacg atgggtaatatgaaatattt atatgatgatcattatgtatIOlcagcaactaa agttatgtctgtagataaat ttttggcacatgatttaatt151tataacatta gtgataaaaaactaaaaaat tatgacaaagtgaaaacaga201gttattaaat gaagatttagcaaagaagta caaagatgaagtagttgatg251tgtatggatc aaattactatgtaaactgct atttttcatccaaagataat301gtaggtaaag ttacaggtggtaaaacttgt atgtatggaggaataacaaa351agctgaagga aacgcctttgataatgggaa cttacaaaatgtacttataa401gagtttatga aaataaaagaaacacaattt cttttgaagtgcaaactgat45laagaaaagtg taacagctcaagaactagac ataaaagctaggaatttttt
501aattaataaa aaaaatttgt atgagtttaa cagttcacca tatgaaacag551gatatataaa atttattgaa aataacggca atactttttg gtatgatatg601atgcctgcac caggcgataa gtttgaccaa tctaaatatt taatgatgta651caacgacaat aaaacggttg attctaaaag tgtgaagata gaagtccacc70lttacaacaaa gaatggaSEQ ID N0.13的信息(參見序列表)(a)序列特征:*長度:717堿基對*類型:核酸*鏈型:雙鏈*拓撲結(jié)構(gòu):線性(b)分子類型:cDNA(C)假設(shè):否Cd)反義:否(e)最初來源:金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有序列表SEQ ID NO: 15堿基序列的超抗原突變蛋白基因:OOlgagagtcaac cagaccctac gccagatgag ttgcacaaat caagtgagtt051tactggtacg atgggtaata tgaaatattt atatgatgat cattatgtatIOlcagcaactaa agttatgtct gtagataaat ttttggcagc agatttaatt151tataacatta gtgataaaaa actaaaaaat tatgacaaag tgaaaacaga201gttattaaat gaagatttag caaagaagta caaagatgaa gtagttgatg251tgtatggatc aaattactat gtaaactgct atttttcatc caaagataat301gtaggtaaag ttacaggtgg taaaacttgt atgtatggag gaataacaaa351agctgaagga aacgcctttg ataatgggaa cttacaaaat gtacttataa401gagtttatga aaataaaaga aacacaattt cttttgaagt gcaaactgat
45laagaaaagtg taacagctca agaactagac ataaaagcta ggaatttttt501aattaataaa aaaaatttgt atgagtttaa cagttcacca tatgaaacag551gatatataaa atttattgaa aataacggca atactttttg gtatgatatg601atgcctgcac caggcgataa gtttgaccaa tctaaatatt taatgatgta651caacgacaat aaaacggttg attctaaaag tgtgaagata gaagtccacc70lttacaacaaa gaatggaSEQ ID N0.15的信息(參見序列表)(a)序列特征:*長度:717堿基對*類型:核酸*鏈型:雙鏈*拓撲結(jié)構(gòu):線性(b)分子類型:cDNA(C)假設(shè):否
(d)反義:否(e)最初來源:金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有序列表SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:
10、SEQID NO:12, SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16中氨基酸序列的八種減毒超抗原突變蛋白基因編碼蛋白:
具有序列表SEQ ID NO:2氨基酸序列的超抗原突變蛋白基因編碼蛋白:OOlesqpdptpde lhksseftgt mgnmkylydd hyvsatkvms vdkfIahdli051ynisdkklkn ydkvktelln edlakkykde vvdvygsnyy vnayfsskdnIOlvgkvtggktc myggitkheg nhfdngnlqn vlirvyenkr ntisfevqtd151kksvtaqeld ikarnflink knlyefnssp yetgyikfie nngntfwydm20lmpapgdkfdq skylmmyndn ktvdsksvki evhlttkngSEQ ID N0.2的信息(參見序列表)(a)序列特征:
*長度:239個氨基酸*類型:肽鏈*鏈型:單鏈(b)分子類型:成熟肽鏈(C)假設(shè):否(d)反義:否(e)最初來源:金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有序列表SEQ ID N0:4氨基酸序列的超抗原突變蛋白基因編碼蛋白:OOlesqpdptpde lhksseftgt mgnmkylydd hyvsatkvms vdkfIahdli051ynisdkklkn ydkvktelln edlakkykde vvavygsnyy vncyfsskdnIOlvgkvtggktc myggitkheg nhfdngnlqn vlirvyenkr ntisfevqtd151kksvtaqeld ikarnflink knlyefnssp yetgyikfie nngntfwydm20lmpapgdkfdq skylmmyndn ktvdsksvki evhlttkngSEQ ID N0.4的信息(參見序列表)(a)序列特征:*長度:239個氨基酸*類型:肽鏈*鏈型:單鏈(b)分子類型:成熟肽鏈(C)假設(shè):否(d)反義:否(e)最初來源:金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有序列表SEQ ID N0:6氨基酸序列的超抗原突變蛋白基因編碼蛋白:OOlesqpdptpde lhksseftgt mgnmkylydd hyvsatkvms vdkfIaadli051ynisdkklkn ydkvktelln edlakkykde vvdvygsnyy vncyfsskdnIOlvgkvtggktc myggitkheg nhfdngnlqn vlirvyenkr ntisfevqtd
151kksvtaqeld ikarnflink knlyefnssp yetgyikfie nngntfwydm20lmpapgdkfdq skylmmyndn ktvdsksvki evhlttkngSEQ ID N0.6的信息(參見序列表)(a)序列特征:*長度:239個氨基酸*類型:肽鏈*鏈型:單鏈(b)分子類型:成熟肽鏈(C)假設(shè):否(d)反義:否(e)最初來源:金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有序列表SEQ ID N0:8氨基酸序列的超抗原突變蛋白基因編碼蛋白:OOlesqpdptpde lhksseftgt mgnmkylydd hyvsatkvms vdkfIahdli051ynisdkklkn ydkvktelln edlakkykde vvdvygsnyy vncyfsskdnIOlvgkvtggktc myggitkaeg nhfdngnlqn vlirvyenkr ntisfevqtd151kksvtaqeld ikarnflink knlyefnssp yetgyikfie nngntfwydm20lmpapgdkfdq skylmmyndn ktvdsksvki evhlttkngSEQ ID N0.8的信息(參見序列表)(a)序列特征:*長度:239個氨基酸*類型:肽鏈*鏈型:單鏈(b)分子類型:成熟肽鏈(C)假設(shè):否(d)反義:否具有序列表SEQ ID NO: 10氨基酸序列的超抗原突變蛋白基因編碼蛋白:OOlesqpdptpde lhksseftgt mgnmkylydd hyvsatkvms vdkfIahdli051ynisdkklkn ydkvktelln edlakkykde vvdvygsnyy vnayfsskdnIOlvgkvtggkta myggitkheg nhfdngnlqn vlirvyenkr ntisfevqtd151kksvtaqeld ikarnflink knlyefnssp yetgyikfie nngntfwydm20lmpapgdkfdq skylmmyndn ktvdsksvki evhlttkngSEQ ID N0.10的信息(參見序列表)(a)序列特征:*長度:239個氨基酸*類型:肽鏈*鏈型:單鏈(b)分子類型:成熟肽鏈(C)假設(shè):否(d)反義 :否
(e)最初來源:金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有序列表SEQ ID NO: 12氨基酸序列的超抗原突變蛋白基因編碼蛋白:OOlesqpdptpde lhksseftgt mgnmkylydd hyvsatkvms vdkfIahdli051ynisdkklkn ydkvktelln edlakkykde vvdvygsnyy vncyfsskdnIOlvgkvtggktc myggitkheg nafdngnlqn vlirvyenkr ntisfevqtd151kksvtaqeld ikarnflink knlyefnssp yetgyikfie nngntfwydm20lmpapgdkfdq skylmmyndn ktvdsksvki evhlttkngSEQ ID N0.12的信息(參見序列表)(a)序列特征:*長度:239個氨基酸*類型:肽鏈*鏈型:單鏈(b)分子類型:成熟肽鏈(C)假設(shè):否(d)反義:否 (e)最初來源:金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有序列表SEQ ID NO: 14氨基酸序列的超抗原突變蛋白基因編碼蛋白:OOlesqpdptpde lhksseftgt mgnmkylydd hyvsatkvms vdkfIahdli051ynisdkklkn ydkvktelln edlakkykde vvdvygsnyy vncyfsskdnIOlvgkvtggktc myggitkaeg nafdngnlqn vlirvyenkr ntisfevqtd151kksvtaqeld ikarnflink knlyefnssp yetgyikfie nngntfwydm20lmpapgdkfdq skylmmyndn ktvdsksvki evhlttkngSEQ ID N0.14的信息(參見序列表)(a)序列特征:*長度:239個氨基酸
*類型:肽鏈*鏈型:單鏈(b)分子類型:成熟肽鏈(C)假設(shè):否(d)反義:否(e)最初來源:金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有序列表SEQ ID NO: 16氨基酸序列的超抗原突變蛋白基因編碼蛋白:OOlesqpdptpde lhksseftgt mgnmkylydd hyvsatkvms vdkfIaadli051ynisdkklkn ydkvktelln edlakkykde vvdvygsnyy vncyfsskdnIOlvgkvtggktc myggitkaeg nafdngnlqn vlirvyenkr ntisfevqtd151kksvtaqeld ikarnflink knlyefnssp yetgyikfie nngntfwydm20lmpapgdkfdq skylmmyndn ktvdsksvki evhlttkngSEQ ID N0.16的信息(參見序列表)(a)序列特征:
*長度:239個氨基酸*類型:肽鏈*鏈型:單鏈(b)分子類型:成熟肽鏈(C)假設(shè):否(d)反義:否(e)最初來源:金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)實施例2減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白的制備方法:①金黃色葡萄球菌基因組DNA的提取接種金黃色葡萄球菌單菌落于5ml液體LB培養(yǎng)基中，37°C搖床過夜培養(yǎng)，取1.5ml的培養(yǎng)物離心收集菌體 。提取金黃色葡萄球菌基因組DNA(基因組DNA提取操作按F.奧斯伯，R.布倫特，R.E.金斯頓，D.D.穆爾，J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉爾《精編分子生物學(xué)實驗指南》美國紐約John ffiley&Sons出版社1995年第三版P39-40)。②PCR引物設(shè)計及反應(yīng)條件:分別設(shè)計合成PCR引物用來擴增八種超抗原突變蛋白基因片斷，以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板；以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物對sec2_F: 5’_CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3’ 和 sec2 (C93A) -R: 5’ -GATGAAAAATATG CGTTTACATAG-3’ ; sec2 (C93A) _F: 5’ -ATGTAAACGCATATTTTTCATCCAA-3’ 和 sec2_R:5’ -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTT GTTG-3’ 分別擴增獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，采用上述獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進行PCR擴增擴得具有序列表SEQ ID NO:1中堿基序列sec2(C93A)突變基因；以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物對sec2-F: 5’-CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3，和 sec2 (D83A)-R:5，-TCCATACACAGCA ACTACTTCATCT-3，；sec2(D83A)-F:5，-GATGAAGTAGTTGCTGTGTATGGAT CAAAT-3’ 和 sec2_R:5’ -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’ 分別擴增獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，采用上述獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進行PCR擴增擴得具有序列表SEQ ID NO: 3中堿基序列sec2(D83A)突變基因；以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物對sec2-F:5’-CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3，和 sec2(H47A)-R:5，-GTTATAAATTAA ATCTGCTGCCAAA-3，；sec2(H47A)-F:5，-TTTGGCAGCAGATTTAATTTATA AC-3’ 和 sec2_R:5’ -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’ 分別擴增獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，采用上述獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進行PCR擴增擴得具有序列表SEQ ID NO: 5中堿基序列Sec2(H47A)突變基因；以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物對sec2_F: 5’_CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3’和 sec2(H118A)-R:5’-GGTTTCCTTCAGC TTTTGTTATTCC3’；sec2(H118A)_F:5’_GGAATAACAAAAGCTGAAGGAAAC CAC-3’ 和 sec2_R:5’ -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’ 分別擴增獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，采用上述獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進行PCR擴增擴得具有序列表SEQ ID NO: 7中堿基序列sec2(H118A)突變基因；以具有序列表SEQ ID NO:1中堿基序列sec2 (C93A)突變基因為模板，采用引物對 sec2-F:5， -CGGAA TTCGAGAGTCAACCAGA-3，和 sec2(C93A/C110A)-R:5， -CCTCCATACATAGCAGTTTTACCAC-3’ ； sec2 (C93A/C110A)-F:5，-TGGTAAAACTGCTA TGTATGGAGGA-3，和sec2-R:5’ -TCGCTCGAGT TATCCATTCTTTGTTG-3’分別擴增獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2_R為引物，采用上述獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進行PCR擴增擴得具有序列表SEQ ID N0:9中堿基序列Sec2(C93A/C110A)突變基因；以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物對sec2_F: 5’CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3’ 和 sec2(H122A)-R:5’-CCATTATCAAAGGCGTT TCCTTC-3’ ;sec2(H122A)_F:5’-GGAAACgCCTTTGATAATGGGAAC-3’ 和 sec2_R:5’ -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’ 分別擴增獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，采用上述獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進行PCR擴增擴得具有序列表SEQ ID NO: 11中堿基序列Sec2(H122A)突變基因；以SEQ ID NO: 7中堿基序列sec2 (H118A)突變基因為模板，采用引物對sec2-F:5’ -CGGAA TTCGAGAGTCAACCAGA-3’ 和 sec2 (H118A/H122A)-R: 5’ -CCATTATCAAAGGCGTTTCCTTC-3， ；sec2(H118A/H122A)-F:5， -GGAAACGCCTTTGATAATGGGAAC-3，和 sec2_R:5， -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’分別擴增獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，采用上述獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進行PCR擴增擴得具有序列表SEQ ID NO: 13中堿基序列sec2 (H118A/H122A)突變基因；以序列表SEQ ID NO: 13中堿基序列sec2 (H118A/H122A)突變基因為模板，采用引物對 sec2-F:5 ，-CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3，和 sec2 (H47A)-R: 5，-GTTATAAATTAAATCT GCTGCCAAA-3，； sec2 (H47A) -F: 5，-TTTGGCAGCAGATTTAATTTATAAC-3，和 sec2_R: 5，-TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’分別擴增獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2_F和sec2-R為引物，采用上述獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進行PCR擴增擴得具有序列表SEQ ID NO: 15中堿基序列sec2 (H47A/H118A/H122A)突變基因；各基因片斷的PCR反應(yīng)體系均為:10XPfu DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液10 μ 1、dNTP8uL、上下游引物各20pmol、模板金黃色葡萄球菌基因組DNA50ng、Pfu DNA聚合酶2U，無菌超純水補齊體積至loo μ I。各基因片斷的PCR反應(yīng)條件均為:第一階段95°C，5分鐘；第二階段94°C，30 秒；55°C，30 秒；72°C，90 秒；共 30 個循環(huán)；第三階段72 °C，10分鐘；③SEC2八種超抗原突變蛋白基因的鑒定:各片斷PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析并分離(參見圖1，如圖所示，經(jīng)PCR擴增和定點突變，獲得了特異性的八種突變蛋白基因，經(jīng)電泳檢測其大小與野生SEC2基因大小一致。進一步的序列測定確認突變基因構(gòu)建成功，可用于下一步表達載體的構(gòu)建。)，分別切下大小為717bp的基因片段，按博大泰克生物技術(shù)公司膠回收試劑盒使用說明書進行膠回收；回收產(chǎn)物分別與PGEM-T克隆載體連接，構(gòu)建成八種減毒超抗原突變蛋白基因克隆載體PGEM-T-SEC2-SEQ ID NO: 1、PGEM-T-SEC2-SEQ ID NO: 3、pGEM_T-SEC2_SEQ ID NO: 5、pGEM_T-SEC2_SEQ ID NO: 7、PGEM-T-SEC2-SEQ ID N0:9、pGEM_T-SEC2_SEQ ID NO: 11、pGEM_T-SEC2_SEQ ID NO: 13、PGEM-T-SEC2-SEQ ID NO: 15。連接反應(yīng)按Promega公司產(chǎn)品pGEM_T試劑盒使用說明書。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，(轉(zhuǎn)化操作按F.奧斯伯，R.布倫特，R.Ε.金斯頓，D.D.穆爾，J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉爾《精編分子生物學(xué)實驗指南》美國紐約John ffiley&Sons出版社1995年第三版P39-40),篩選陽性克隆并以Sanger雙脫氧末端終止法測定DNA序列。超抗原突變蛋白的表達I)八種超抗原腸毒素C2突變蛋白表達載體的構(gòu)建:分別將基因克隆載體PGEM-T-SEC2-SEQ ID NO: 1、pGEM_T-SEC2_SEQ ID NO: 3、pGEM_T-SEC2_SEQ ID N0:5、PGEM-T-SEC2-SEQ ID NO:7、pGEM_T-SEC2_SEQ ID NO:9、pGEM_T-SEC2_SEQ ID NO: 11、PGEM-T-SEC2-SEQ ID NO: 13、pGEM_T-SEC2_SEQ ID NO: 15 質(zhì)粒 DNA 以 EcoR1、XhoI 雙酶切，膠回收試劑盒分別回收序列表SEQ ID NO: K SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15 中的八種腸毒素 C2 突變蛋白基因。以T4DNA連接酶分別連接入經(jīng)同樣雙酶切的pET-28a表達載體，構(gòu)建成表達載體pET-28a-SEC2-SEQ ID NO: 1、pET_28a-SEC2_SEQ ID NO:3、pET_28a-SEC2_SEQ ID NO:5、pET-28a-SEC2-SEQ ID NO:7、pET_28a-SEC2_SEQ ID N0:9、pET_28a-SEC2_SEQ ID NO: 11、pET-28a-SEC2-SEQ ID NO: 13、pET_28a-SEC2_SEQ ID NO: 15。轉(zhuǎn)化 E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞，經(jīng)Sanger雙脫氧末端終止法測序鑒定正確重組克隆。2)超抗原突變蛋白 的誘導(dǎo)表達和純化:分別接種轉(zhuǎn)化了各表達載體質(zhì)粒的BL21(DE3)單菌落于含50μ g/ml卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，過夜活化培養(yǎng)，以1% (V/V)接種量轉(zhuǎn)接下一級，37°C搖床培養(yǎng)至OD6tltl為0.5，加入終濃度1.0mmoI/L的IPTG (購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，30°C誘導(dǎo)表達4小時。分別離心收集菌體，并將各收集的菌體重懸于1/5體積的平衡緩沖液(IOmMTirs-HCl, 0.5M NaCl, 20mM咪唑，pH7.9)，分別采用Ni親和層析柱對各目的產(chǎn)物進行純化，即獲得具有序列表SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16中氨基酸序列的八種腸毒素C2減毒突變蛋白；純化時以0.5ml/min速度上樣于預(yù)先平衡好的Ni親和層析柱；以含40mM咪唑的平衡緩沖液洗滌10個柱體積，洗去非特異性結(jié)合的雜蛋白；最后以洗脫緩沖液(20mMTirs-HCl, 0.5M NaCl,250mM咪唑，pH7.9)洗脫下目的產(chǎn)物，并對洗脫產(chǎn)物經(jīng)透析法除鹽濃縮。通過SDS-PAGE電泳鑒定蛋白大小及純度(參見圖2，如圖所示，大腸桿菌BL21(DE3)重組表達菌株經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)，并經(jīng)N1-親和層析柱純化后，獲得了高純度的突變蛋白，能夠滿足進一步的實驗需要。)。實施例3超抗原活性檢測取SPF級純系小鼠Balb/c，通過頸椎處死后在無菌條件下取其脾臟，輕輕壓碎后過200目篩網(wǎng)。然后將過篩網(wǎng)后的細胞懸液在1000rpm/min轉(zhuǎn)速下離心5min收集細胞沉淀，用5mL紅細胞裂解液重懸細胞，靜置5min后于1000rpm/min離心5min。再以不含血清的1640培養(yǎng)基(購自Gibco公司)清洗細胞1-2次，最后用含10%小牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)液(購自Gibco公司)調(diào)節(jié)細胞濃度，以8X IO5Cells/孔加到96孔板中。分別將經(jīng)純化的各具有序列表 SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6 和 SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 16中氨基酸序列的八種超抗原突變蛋白基因編碼蛋白分別以 lng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml、10000ng/ml 的終濃度加入各孔。以 BSA作為陰性對照，SEC2標(biāo)準品作為陽性對照，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)72h后，加入25ul/孔的MTT液(購自Sigma公司)。繼續(xù)培養(yǎng)4h，1500r/min離心5分鐘后棄上清培養(yǎng)液，收集細胞，加入濃度為120ul/孔的二甲基亞砜溶液(DMSO)，溶解15min后，酶標(biāo)儀上以570nm測定各孔的吸光值(參見圖3，八種突變蛋白在不同濃度范圍均能夠有效地刺激小鼠T細胞增殖。除SEC2(H118A)、SEC2 (H122A)、SEC2 (H118A/H122A)三種突變蛋白刺激能力與野生型SEC2活性接近外，其他五中突變蛋白的T細胞刺激活性均有不同程度的下降，在體外能有效刺激小鼠T淋巴細胞增殖，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性)。本發(fā)明所用到小鼠為SPF級BALB/c純系小鼠，是一種體內(nèi)外均無寄生蟲和特殊病原菌的近交系小鼠，實驗結(jié)果精度高，可比性好，應(yīng)激反應(yīng)均一。實施例4SEC2突變蛋白的抗腫瘤活性檢測將小鼠肝癌細胞H印al-6傳代培養(yǎng)后用胰蛋白酶-EDTA消化液消化，用含10%FBS的1640培養(yǎng)基稀釋成濃度為5X 105cellS/mL的單細胞懸液，然后以2.5X IO4Cells/孔培養(yǎng)在96孔板。將按實施例3中方法分離獲得的小鼠脾淋巴細胞以5X 105cells/well加入到上述含有H印al-6細胞的96孔板 中，使效靶比達到20:1。然后將經(jīng)純化的各具有序列表SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6 和 SEQ ID NO:8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16中氨基酸序列的八種超抗原突變蛋白基因編碼蛋白分別以100、1000、10000ng/mL的終濃度加入各孔。以BSA作為陰性對照，SEC2野生蛋白作為陽性對照，并設(shè)腫瘤細胞對照孔、淋巴細胞自然釋放孔、空白對照孔及調(diào)零孔，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，按常規(guī)條件培養(yǎng)72h，加入20ul/孔的MTT液(購自Sigma公司)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，IOOOr/min離心收集細胞，加入120ul/孔的二甲基亞砜溶液(DMS0)，溶解15min后，酶標(biāo)儀上以570nm測定各孔的吸光值。腫瘤抑制瘤計算公式如下:100-[(蛋白實驗孔吸光值-淋巴細胞自然釋放孔吸光值)/ (腫瘤細胞對照孔吸光值-空白對照孔吸光值)]X 100%。實驗結(jié)果如圖4所示。結(jié)果顯示所有突變蛋白與陰性對照BSA相比均有顯著的抗腫瘤活性，但抗腫瘤活性有不同程度的下降。其中SEC2(H118A)、SEC2(H122A)、SEC2(H118A/H122A)三種突變蛋白的抑瘤活性與野生型SEC2接近。實施例5以健康大白兔(體重約2.0-2.5kg)作為熱源活性試驗?zāi)Ｐ?。試驗前每只兔子體溫連續(xù)保持穩(wěn)定90分鐘，且起始體溫不超過38.6to39.5° C的個體方可用于進一步的試驗。將經(jīng)純化的各具有序列表 SEQ ID N0:2、SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:6 和 SEQ ID N0:8、SEQID NO: 10,SEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 16中氨基酸序列的八種超抗原突變蛋白基因編碼蛋白分別經(jīng)0.22 μ m微孔濾膜過濾除菌后，用無菌PBS溶液分別稀釋至10 μ g/ml,以10μ g/kg的劑量分別通過耳緣靜脈進行注射。通過熱源試驗測定儀觀察每組兔子體溫在4小時以內(nèi)的變化情況，并計算溫度變化差異(Λ Temperature)。以野生SEC2及無菌PBS緩沖液分別作為陽性和陰性對照，每組測試3只兔子。結(jié)果如圖5.A和B所示，顯示本發(fā)明突變蛋白的熱源活性均有不同程度的降低，其中SEC2(H118A)和SEC2(H122A)兩種突變蛋白在保留較高超抗原活性基礎(chǔ)上(見實施例3和4)，其致熱毒性有顯著的降低。因此具有進一步開發(fā)低毒性超抗原SEC2的潛力。實施例6SEC2突變蛋白的體內(nèi)催吐活性研究以健康幼貓(8-10周，約500g)作為催吐活性試驗?zāi)Ｐ?。將純化獲得的腸毒素突變蛋白分別經(jīng)0.22 μ m微孔濾膜過濾除菌后，用無菌PBS溶液稀釋至相同濃度，然后以每只貓2mg的劑量進行腹腔注射，然后觀察6小時以內(nèi)的反應(yīng)，并記錄期催吐及腹瀉反應(yīng)(參見表I)。試驗過程中盡量減少對其的干擾。表I為野生型SEC2和八種SEC2點突變蛋白的體內(nèi)催吐活性試驗。如表I所示，與野生型SEC2相比較，八種腸毒素催吐活性和腹瀉活性均有顯著的下降，本發(fā)明構(gòu)建的突變蛋白毒性有顯著的下降。表1.幼貓腹腔注射不同SEC2突變體蛋白催吐活性比較
權(quán)利要求
1.一種減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白，其特征在于:所述減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白具有序列表 SEQ ID NO: 7,SEQ ID NO:1USEQ ID N0:13 或 SEQ ID N0:15 中堿基序列。
2.—種權(quán)利要求1所述的減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白，其特征在于:所述減毒腸毒素C2超抗原突變編碼蛋白具有序列表SEQ ID N0:8、SEQ IDNO:12,SEQ ID NO: 14或SEQ IDNO: 16中氨基酸序列。
3.一種按權(quán)利要求1所述的減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白的制備方法，其特征在于: 以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物對sec2-F:5’-CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3 ’ 和 sec2(HI18A)-R:5 ’-GGTTTCCTTCAGCTTTTGTTATTCC3’;sec2(HI18A)-F:5 ’-GGAATAACAAAAGCTGAAGGAAAC CAC-3’ 和 sec2_R:5’ -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’ 分別擴增獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，采用上述獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進行PCR擴增擴得具有序列表SEQ ID NO: 7中堿基序列Sec2(H118A)突變 基因； 以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物對sec2-F:5’ CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3’和 sec2 (H122A)-R:5’-CCATTATCAAAGGCGTTTCCTTC-3’;sec2(H122A)-F:5’-GGAAACgCCTTTGATAATGGGAAC-3’ 和 sec2_R:5’ -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’ 分別擴增獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，采用上述獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進行PCR擴增擴得具有序列表SEQ IDNO: 11中堿基序列sec2(H122A)突變基因； 以SEQ ID N0:7中堿基序列Sec2(H118A)突變基因為模板，采用引物對sec2-F:5’ -CGGAA TTCGAGAGTCAACCAGA-3’ 和 sec2 (H118A/H122A)-R: 5’ -CCATTATCAAAGGCGTTTCCTTC-3， ；sec2(H118A/H122A)-F:5， -GGAAACGCCTTTGATAATGGGAAC-3，和 sec2_R:5， -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’分別擴增獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，采用上述獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進行PCR擴增擴得具有序列表SEQ IDNO: 13中堿基序列sec2 (H118A/H122A)突變基因； 以序列表SEQ ID勵:13中堿基序列8況2 011184/!11224)突變基因為模板，采用引物對sec2-F:5，-CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3，和 sec2 (H47A)-R: 5，-GTTATAAATTAAATCT GCTGCCAAA-3，; sec2 (H47A) _F: 5，-TTTGGCAGCAGATTTAATTTATAAC-3，和 sec2_R: 5，-TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’分別擴增獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2_F和sec2-R為引物，采用上述獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進行PCR擴增擴得具有序列表SEQ IDNO: 15中堿基序列sec2 (H47A/H118A/H122A)突變基因； 而后將具有序列表 SEQ ID NO: 7,SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 13 和 SEQID NO: 15 中堿基序列中的堿基序列分別克隆入表達載體pET-28a，以大腸桿菌BL21 (DE3)為宿主菌，分別構(gòu)建成異源表達減毒腸毒素C2突變蛋白的基因工程菌，經(jīng)誘導(dǎo)后在培養(yǎng)基中異源表達得具有序列表 SEQ ID N0:8、SEQID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16 中氨基酸序列中的堿基序列的減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白。
4.按權(quán)利要求3減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白的制備方法，其特征在于:所述的誘導(dǎo)方法是通過以IPTG為誘導(dǎo)物進行誘導(dǎo)表達。
5.按權(quán)利要求3所述的減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白的制備方法，其特征在于:所述將所得蛋白分離純化的純蛋白。
6.按權(quán)利要求5所述的減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白的制備方法，其特征在于:所述離純化方法為Ni親和層析法，所用的介質(zhì)為瓊脂糖凝膠樹脂。
7.一種按權(quán)利要求1所述的減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白的應(yīng)用，其特征在于:具有序列表 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID N0:13 或 SEQ ID NO: 15 中堿基序列的減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白可 作為抗腫瘤免疫的藥物或作為防止催吐、腹瀉的藥物。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體的說是一種減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白及其制備方法和應(yīng)用。所述減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白具有序列表SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15中堿基序列。以金黃色葡萄球菌DNA為模板，以引物對進行PCR擴增，然后以sec2-F和sec2-R為引物，以獲得PCR產(chǎn)物為模板進行PCR擴增得到突變基因，將其克隆入pET-28a，構(gòu)建減毒腸毒素C2突變蛋白的基因工程菌。本發(fā)明所述突變蛋白在保持一定超抗原活性的基礎(chǔ)上，其催吐和致熱活性較野生型腸毒素C2蛋白有顯著的降低，達到了降低毒副作用的目的。
文檔編號C07K14/31GK103214562SQ20131007878
公開日2013年7月24日 申請日期2008年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月19日
發(fā)明者王小剛, 徐明愷, 張惠文, 劉昌孝, 陳艷, 陳巨余 申請人:沈陽協(xié)合集團有限公司