專利名稱：抗嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒ds10株的單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及抗體工程技術(shù)，具體涉及抗嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒DSio株的單克隆抗體。
背景技術(shù)：
雞傳染性支氣管炎(Avian Infectious Bronchitis, IB)是由冠狀病毒屬的傳染性支氣管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus, IBV)引起的雞的一種急性、高度接觸性傳染病，以引起雞呼吸道感染、腎炎、產(chǎn)蛋下降為主要特征，可引起幼雞死亡率高達(dá)40%，成年雞感染后產(chǎn)蛋量下降10%-50%，給世界養(yǎng)雞業(yè)帶來(lái)重大的經(jīng)濟(jì)損失。
雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)具有多種血清型和多組織嗜性，自1931年最早報(bào)道呼吸型IB以來(lái)，隨后報(bào)道了腎型、腸型、生殖道型、腺胃型等傳染性支氣管炎，至今已經(jīng)報(bào)道的血清型達(dá)30余種，近年來(lái)新的血清型和變異株仍不斷出現(xiàn)，給流行病學(xué)的研究和防疫帶來(lái)了極大地困難，也給養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)的免疫雞群和非免疫雞群均易發(fā)生嗜腎型IBV的感染，其中已經(jīng)報(bào)道的有嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒DSlO株、HF2株
坐寸o嗜腎型雞傳染性支氣管炎的控制關(guān)鍵之一在于建立快速診斷的方法，目前國(guó)內(nèi)診斷IB的方法仍然是病毒的分離鑒定、血清學(xué)試驗(yàn)和分子生物學(xué)診斷方法(RT-PCR)等，但這些方法要么費(fèi)時(shí)費(fèi)力，要么操作過(guò)于繁瑣，實(shí)驗(yàn)室條件要求高，不適于大量臨床樣品的診斷，難以推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠高效分泌抗嗜腎型IBV DSlO株單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2G4。本發(fā)明的另一目的是提供雜交瘤細(xì)胞株2G4分泌的抗嗜腎型IBV DSlO株單克隆抗體，該單克隆抗體能夠特異性的識(shí)別嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒DSlO株。本發(fā)明的再一目的是提供能夠快速，簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確地檢測(cè)嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒的試劑盒。本發(fā)明提供一種分泌抗嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒DSlO株單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2G4，該雜交瘤細(xì)胞株保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)(地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院)，其保藏號(hào)為CGMCC No. 6172，保藏日期為2012年5月28日，分類命名為分泌抗嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒DSlO株單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞2G4。本發(fā)明提供所述雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒DSlO株單克隆抗體。本發(fā)明還提供一種用于檢測(cè)嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒的試劑盒，所述試劑盒包括所述抗嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒DSio株單克隆抗體。
本發(fā)明嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒DSlO株(縮寫為嗜腎型IBV DSlO株)抗原的純化方式簡(jiǎn)便可行；雜交瘤細(xì)胞株2G4分泌的抗嗜腎型IBV DSlO株單克隆抗體特異性強(qiáng)，制備方法簡(jiǎn)單；雜交瘤細(xì)胞株2G4能夠高效、穩(wěn)定分泌抗嗜腎型IBV DSlO株單克隆抗體，效價(jià)高達(dá)為1:102000，經(jīng)鑒定該單克隆抗體可以與嗜腎型IBV DSlO株特異性結(jié)合，出現(xiàn)單一一條反應(yīng)帶，證明抗嗜腎型IBV DSlO株單克隆抗體是嗜腎型IBV DSlO株的特異性抗體。由于該雜交瘤細(xì)胞株2G4能夠高效的分泌抗嗜腎型IBV DSlO株單克隆抗體，使得后續(xù)的純化步驟簡(jiǎn)單而且高效。本發(fā)明提供的抗嗜腎型IBV DSlO株單克隆抗體為嗜腎型IBV的臨床快速診斷以及嗜腎型IBV疫苗免疫的快速監(jiān)測(cè)提供了保障。采用本發(fā)明的抗嗜腎型IBVDSlO株單克隆抗體制備的試劑盒能夠快速，簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確地檢測(cè)雞傳染性支氣管炎病毒。



圖I表示間接ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞株2G4分泌的單克隆抗體的特異性結(jié)果。圖I中，縱坐標(biāo)為雜交瘤細(xì)胞株2G4分泌的單克隆抗體與不同病毒反應(yīng)后酶標(biāo)儀檢測(cè)的OD45tl值，AIV (H9)為禽流感(H9亞型)病毒，IBDV為雞傳染性法氏囊病毒，EDSV為雞減蛋綜合征病毒，NDV為雞新城疫病毒，IBV (DSlO)為嗜腎型IBV DSlO株病毒，陰性為陰性SPF尿囊液，PBS為PBS緩沖液對(duì)照。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一嗜腎型IBV DSlO株的繁殖、純化 I、嗜腎型IBV DSlO株
嗜腎型IBV DSlO株，2010年6月25日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC No. 3957。2、嗜腎型IBV DSlO株的繁殖
取_70°C凍存的嗜腎型IBV DSlO標(biāo)準(zhǔn)毒種于4°C融化，然后用PBS緩沖液按1:100倍稀釋病毒，接種于11日齡SPF雞胚(購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司種蛋，本實(shí)驗(yàn)室孵化)尿囊腔內(nèi)，接種量為0. I mL /胚。將接種后的SPF雞胚置37°C培養(yǎng)。棄去24小時(shí)內(nèi)死亡的胚。培養(yǎng)35小時(shí)后，收獲死胚及未死胚，并將其放入4°C冰箱冷凍至全部胚死亡后，收集死胚尿囊液(含嗜腎型IBV DS10)，檢驗(yàn)無(wú)菌后分裝凍存于-70°C冰箱備用。3、嗜腎型IBV DSlO株抗原的純化
(I)取-70°C凍存的含嗜腎型IBV DSlO的尿囊液(本實(shí)施例中的標(biāo)題2中方法制備所得)于4°C融化后，在4700Xg、4°C條件下離心20 min,取上清液；(2)將步驟(I)中獲得的上清液以14000Xg、4°C條件離心15 min，取上清液；(3)將步驟(2)獲得的上清液在54000父8、41條件下離心1.5 h,棄上清，在沉淀中加入適量TEN緩沖液，并用無(wú)菌滴管吹打沉淀使其分散、溶解，所得純化病毒溶液，添加￠-丙內(nèi)酯(終濃度0.5%。)41滅活24 h后作為嗜腎型IBV DSlO株滅活純化抗原(簡(jiǎn)稱滅活純化抗原)，_70°C保存?zhèn)溆?。?shí)施例二雜交瘤細(xì)胞株的建立
I、小鼠免疫
用嗜腎型IBV DSlO株的滅活純化抗原免疫6周齡的雌性BALB/c小鼠(購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，共免疫4次。首次免疫，用滅活純化抗原加等體積弗氏完全佐劑(購(gòu)自Sigma公司)的乳化液，免疫劑量為200 UL/只；第二、三次免疫，均用滅活純化抗原加等體積的弗氏不完全佐劑(購(gòu)自Sigma公司)的乳化液，免疫劑量為100 u L/只(第一、二、三次免疫之間間隔14天)；第三次免疫后7天，尾靜脈采血分離血清，用微量血凝抑制(HI)實(shí)驗(yàn)(錢曉佳等.雞傳染性支氣管炎病毒(M41) HI抗原的制備與初步應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35(30) =9545-9546,954.)檢測(cè)血清抗體水平，選取血清抗體效價(jià)最高的小鼠采用滅活純化抗原從尾靜脈注射加強(qiáng)免疫(即第4次免疫)，免疫劑量為50 U L/只。獲得嗜腎型IBV DSlO滅活純化抗原對(duì)BALB/c小鼠三免后的血清HI效價(jià)達(dá)到1:256，該血清分裝后-20°C保存，作為陽(yáng)性參考血清備用。2、飼養(yǎng)細(xì)胞的制備
進(jìn)行細(xì)胞融合前24h，將一只約8周齡未免疫的BALB/c小鼠摘眼球采血分離血清，該血清作為陰性參考血清備用；將處死后的小鼠置于75%酒精浸泡10 min。之后轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)，使小鼠仰臥固定于消毒好的解剖板上，用無(wú)菌鑷子在其上腹部的位置提起腹部皮膚并用無(wú)菌眼科剪將其剪開，鈍性剝離暴露小鼠腹膜，用無(wú)菌玻璃注射器吸取10 mL含20%小 牛血清的HAT培養(yǎng)液(Sigma公司，H0262)注入到小鼠腹腔內(nèi)后，右手持注射器不動(dòng)，左手用無(wú)菌鑷子夾酒精棉球輕輕地按摩小鼠腹部?jī)蓚?cè)，然后右手注射器反復(fù)吸吹直至吸入注射器的含20%小牛血清的HAT培養(yǎng)液泛黃為止。把吸出的培養(yǎng)液注入無(wú)菌平皿中，置于顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整培養(yǎng)液體積使細(xì)胞密度約為IO5個(gè)/mL。然后用移液器將細(xì)胞濃度為IO5個(gè)/mL的培養(yǎng)液加到5塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 u L，置于37°C，5% C02的培養(yǎng)箱中，作為飼養(yǎng)細(xì)胞備用。3、細(xì)胞融合
細(xì)胞融合按照常規(guī)方法(劉秀梵，單克隆抗體在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用(第一版)[M].合肥安徽科技技術(shù)出版社，1994: 18-30.)進(jìn)行。取本實(shí)施例步驟I中進(jìn)行第4次免疫三天后的BALB/c小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞(ATCC，北京中原合聚經(jīng)貿(mào)有限公司)按5:1的比例混勻于50 mL刻度離心管，用20-30 mL的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(購(gòu)自Sigma公司)洗滌2次，然后在1000 rpmUO min條件下離心，棄上清，用手掌輕擊管底，使沉淀細(xì)胞松散均勻；將此融合管移入37°C水浴中預(yù)熱并輕輕旋轉(zhuǎn)，在60 s內(nèi)將I mL預(yù)熱至37°C的50% PEG-4000(購(gòu)自南京生興生物科技公司)沿管壁滴加到融合管中的沉淀細(xì)胞上；在5 min內(nèi)將25 mL預(yù)熱至37°C的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基沿管壁滴加到融合管中，具體方法第I min加I mL，第2 min加4 mL，第3-5 min加20 mL，邊加邊輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)離心管；然后將融合管在37°C靜置10 min,在1000 rpm下離心5 min，棄上清，加入50 mL含HAT (Sigma公司，H0262)的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；按每孔0. ImL加入已經(jīng)培養(yǎng)有飼養(yǎng)細(xì)胞(見實(shí)施例二步驟2)的96孔培養(yǎng)板中，置37°C、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5天后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，并用新鮮的含HAT的DMEM培養(yǎng)基換出培養(yǎng)板孔中1/2培養(yǎng)基；10天后，用含HT (Sigma公司，H0137)的DMEM培養(yǎng)基換出原含HAT的培養(yǎng)基；觀察融合細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待其分布至孔底面積1/5以上時(shí)，吸出細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行抗體檢測(cè)。4、雜交瘤細(xì)胞的篩選
通過(guò)檢測(cè)各融合細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的抗體來(lái)篩選雜交瘤細(xì)胞。當(dāng)檢測(cè)孔為陽(yáng)性時(shí)，說(shuō)明該孔的雜交瘤細(xì)胞分泌抗嗜腎型IBV DSlO株單克隆抗體。
采用如下方法檢測(cè)融合細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的抗體(間接ELISA檢測(cè))取滅活純化抗原用碳酸鹽緩沖液以體積比1:200稀釋，在96孔細(xì)胞板中每孔加入100 U L稀釋后的滅活純化抗原，4°C包被過(guò)夜；棄去液體，用PBST緩沖液(含0. 5% Tween-20的PBS緩沖液)洗滌三次，5 min/次，最后用吸水紙拍干；用1% BSA-PBST (含1%牛血清白蛋白(BSA)(購(gòu)自Sigma公司)的PBST緩沖液)，100 uL /孔，37°C封閉I h ;再用PBST緩沖液洗滌3次，5min/次，最后一次拍干；將細(xì)胞培養(yǎng)上清液(本實(shí)施例步驟3獲得)、用0. 5% BSA-PBST (含有質(zhì)量濃度為0. 5% BSA的PBST緩沖液)1:100倍稀釋的陰性參考血清(實(shí)施例二步驟2制備)和陽(yáng)性參考血清(實(shí)施例二步驟I制備)加入相應(yīng)孔內(nèi)(第一排第一列的孔加入PBS緩沖液作為空白對(duì)照)，100 u L/孔，37°C作用I. 5 h后，棄去液體用PBST緩沖液洗滌3次，5min/次，最后一次拍干；加入用0. 5% BSA-PBST按1:3500稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(購(gòu)自北京金杉生物科技有限公司)，100 UL/孔，37°C作用I h后，棄去液體，用PBST緩沖液洗滌3次，5 min/次，最后一次拍干；加入底物顯色液(Biosharp公司，TMB-S-002)，100 u L/孔，37°C避光顯色10 min后加入終止液(2 mo I/L的H2SO4)終止反應(yīng)；酶標(biāo)儀測(cè)定OD45tl值。以空白對(duì)照調(diào)零，P為各孔的OD45tl值，N為加入陰性參考血清的孔的OD45tl值。當(dāng)N彡0. 1，加入陽(yáng)性參考血清的孔的OD45tl值與加入陰性參考血清的孔的OD45tl值的比值(P/N) ^2.1, 即陰、陽(yáng)性對(duì)照成立的情況下，P/N彡2. I的檢測(cè)孔判為陽(yáng)性，I. 5彡P(guān)/N < 2. I的檢測(cè)孔判為可疑，P/N < I. 5的檢測(cè)孔判為陰性。5、雜交瘤細(xì)胞的亞克隆
將步驟4篩選所獲得的分泌特異性單克隆抗體的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，及時(shí)采用有限稀釋法(劉秀梵，單克隆抗體在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用(第一版)[M].合肥安徽科學(xué)技術(shù)出版社，1994:35-36)進(jìn)行亞克隆。挑選陽(yáng)性孔，采用有限稀釋法連續(xù)進(jìn)行2-3次的亞克隆。首先對(duì)雜交瘤細(xì)胞陽(yáng)性孔中的活細(xì)胞進(jìn)行染色計(jì)數(shù)，用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋成約10個(gè)細(xì)胞/mL，將稀釋好的細(xì)胞懸液加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 u L，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4_5天后，用倒置顯微鏡觀察，標(biāo)出所有單個(gè)克隆生長(zhǎng)孔，培養(yǎng)至8-9天時(shí)取細(xì)胞上清做間接ELISA檢測(cè)(實(shí)施例二步驟4方法);選擇陽(yáng)性的單克隆細(xì)胞進(jìn)行3次以上同樣的亞克隆，直到亞克隆后所有細(xì)胞孔上清檢測(cè)均為陽(yáng)性，且各孔檢測(cè)的OD值比較接近，將多次亞克隆后的陽(yáng)性孔細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)后凍存。獲得能穩(wěn)定分泌抗嗜腎型IBV DSlO株單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株 2G4。實(shí)施例三抗嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒DSlO株單克隆抗體的制備
取7 8周齡健康BALB/c母鼠(購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，腹腔注射液體石蠟(0. 5ml/只)一周后，將雜交瘤細(xì)胞株2G4以PBS緩沖液稀釋后注入小鼠腹腔，每只小鼠注射0. 2mL，約含I 2X IO6個(gè)雜交瘤細(xì)胞。7-10天后當(dāng)小鼠腹部明顯膨大時(shí)采集腹水。將采集的腹水在4000 rpm條件下離心5分鐘，棄去油脂與沉淀后，所得上清液即為初步純化的腹水。將初步純化的腹水小量分裝，于-70°C保存?zhèn)溆?。?shí)施例四抗嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒DSlO株單克隆抗體腹水效價(jià)的測(cè)定及亞類鑒定
將初步純化的腹水用PBS緩沖液以2倍倍比稀釋，將各濃度的腹水加入到封閉好的包被有滅活純化抗原(用碳酸鹽緩沖液以1:200稀釋)的96孔酶標(biāo)板孔中(第一排第一列的孔加入PBS緩沖液作為空白對(duì)照)，100 u L/孔，370C，孵育90 min ;用PBST緩沖液洗滌3次，5 min/次，最后一次拍干；加入1:3500稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG (購(gòu)自北京金杉生物科技有限公司)，100 UL/孔，37°C作用I h，PBST洗滌3次，5 min/次，最后一次拍干；加入底物顯色液(Biosharp公司，TMB-S-002), 100 u L/孔，37°C避光顯色10 min后加入終止液(2mo I/L H2SO4)終止反應(yīng)；經(jīng)酶標(biāo)儀測(cè)定0D450nm值。以空白對(duì)照調(diào)零，P為各檢測(cè)孔的值，N為加入陰性參考血清的孔的OD45tl值。當(dāng)N < 0. 1，加入陽(yáng)性參考血清的孔的OD450值與N的比值(P/N)彡2. 1，即陰、陽(yáng)性對(duì)照成立的情況下，P/N彡2. I的檢測(cè)孔判為陽(yáng)性，以陽(yáng)性孔的最大稀釋度作為單克隆抗體的腹水效價(jià)。結(jié)果顯示雜交瘤細(xì)胞株2G4分泌的抗嗜腎型IBV DSlO株單克隆抗體腹水間接ELISA效價(jià)為1:102000。采用鼠單克隆抗體亞類鑒定試劑盒(Sigma公司，IS02-1KT)對(duì)抗嗜腎型IBV DSlO株單克隆抗體進(jìn)行亞類鑒定，實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行，結(jié)果表明雜交瘤細(xì)胞株2G4分泌的抗嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒DSlO株單克隆抗體屬于IgGl亞類。實(shí)施例五抗嗜腎型IBV DSlO株單克隆抗體與嗜腎型IBV DSlO株的反應(yīng)原性與特異性鑒定
用Western-blotting (J.薩姆布魯克，D. W.拉賽爾.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].第三版 北京科學(xué)出版社，1998,884-895.)鑒定雜交瘤細(xì)胞株2G4分泌的抗嗜腎型IBV DSlO株單克隆抗體的反應(yīng)原性與特異性。嗜腎型IBV DSlO株尿囊液、陰性尿囊液(無(wú)菌采集自4°C致死的12日齡SPF雞胚)經(jīng)5%濃縮膠和10%分離膠中進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離后，以
2mA/cm2,90 min，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用10% BSA (購(gòu)自Sigma公司)溶液4°C封閉2 h ;用PBST緩沖液洗膜3次，5 min/次；以抗嗜腎型IBV DSlO株單克隆抗體為一抗，以I :2500稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG (購(gòu)自北京金杉生物科技有限公司)為二抗；用增強(qiáng)型DAB顯色試劑盒(購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司)顯色。結(jié)果顯示，該單克隆抗體可以與嗜腎型IBV DSlO株特異性結(jié)合，在14 KDa左右處有單一一條反應(yīng)條帶，而不與陰性尿囊液反應(yīng)，證明該抗嗜腎型IBV DSlO株單克隆抗體是嗜腎型IBV DSlO株的特異性抗體。用碳酸鹽緩沖液將含禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)H9亞型、雞傳染性法氏囊病毒(Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)、雞減蛋綜合征病毒(Egg DropSyndrome Virus, EDSV)、雞新城疫病毒(New Castle Disease Virus, NDV)、嗜腎型 IBVDSlO株的SPF雞胚尿囊液、陰性尿囊液1:200稀釋后按實(shí)施例二步驟4的方法包被96孔酶標(biāo)板，以雜交瘤細(xì)胞株2G4分泌的抗嗜腎型IBV DSlO株單克隆抗體為一抗，同時(shí)設(shè)PBS緩沖液陰性對(duì)照進(jìn)行間接ELISA實(shí)驗(yàn)(參見實(shí)施例二步驟4方法)。結(jié)果顯示雜交瘤細(xì)胞株2G4分泌的抗嗜腎型IBV DSlO株單克隆抗體僅與嗜腎型IBV DSlO株尿囊液毒成強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，與陰性對(duì)照和其它雞病毒尿囊液均為陰性反應(yīng)(見圖1)，表明本發(fā)明獲得的雜交瘤細(xì)胞株2G4分泌的抗嗜腎型IBV DSlO株單克隆抗體具有很好的特異性。其中禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV) H9亞型購(gòu)自南京天邦生物科技有限公司，雞傳染性法氏囊病毒(Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)、雞減蛋綜合征病毒(Egg Drop Syndrome Virus, EDSV)和雞新城疫病毒(New Castle Disease Virus,NDV)購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。注本發(fā)明中各實(shí)施例用到的試劑如下
(I)PBS緩沖液氯化鈉(NaCl) 8. 0 g，氯化鉀(KCl ) 0. 2 g，磷酸氫二鈉 (Na2HPO4 12H20) 2. 9 g，磷酸二氫鉀(KH2PO4) 0. 2 g，加去離子水溶解后定容至I, 000 mL,用I M氫氧化鈉(NaOH)調(diào)pH值為7. 4，121°C滅菌15 min，4°C保存。(2) PBST緩沖液含質(zhì)量濃度為0. 5% Tween-20的PBS緩沖液。(3)碳酸鹽緩沖液含有 0. 05 mol/L Na2CO3 和 0. 05 mol/L NaHCO3 的水溶液，pH值為9.6。(4) 1% BSA-PBST :含質(zhì)量濃度為1%牛血清白蛋白(BSA)的PBST緩沖液。(5) 0. 5% BSA-PBST :含質(zhì)量濃度為0. 5%牛血清白蛋白(BSA)的PBST緩沖液。
(6)TEN 緩沖液50 mmol/L的Tris-HCL緩沖液中含有50 mmol/L的NaCl、5 mmol/L 的 Na2EDTA, pH7. 4。
權(quán)利要求
1.一種分泌抗嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒DSlO株單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2G4，其保藏號(hào)為CGMCC No. 6172。
2.—種權(quán)利要求I所述雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒DSlO株單克隆抗體。
3.一種用于檢測(cè)嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括權(quán)利要求2所述抗嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒DSlO株單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供抗嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒DS10株的單克隆抗體，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供一種分泌抗嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒DS10株單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2G4，該雜交瘤細(xì)胞株的保藏號(hào)為CGMCCNo.6172。本發(fā)明提供所述雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒DS10株單克隆抗體。雜交瘤細(xì)胞株2G4能夠高效、穩(wěn)定分泌抗嗜腎型IBVDS10株單克隆抗體，效價(jià)高達(dá)為1:102000，經(jīng)鑒定該單克隆抗體可以與嗜腎型IBVDS10株特異性結(jié)合，出現(xiàn)單一一條反應(yīng)帶，證明抗嗜腎型IBVDS10株單克隆抗體是嗜腎型IBVDS10株的特異性抗體。
文檔編號(hào)C07K16/10GK102719406SQ20121020490
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月20日
發(fā)明者侯繼波, 唐應(yīng)華, 楊維維, 陸吉虎, 高峰 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院