專利名稱：一種提取和分離蟲草素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)產(chǎn)品深加工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提取和分離蟲草素的方法。
背景技術(shù)：
蟲草菌素又稱蟲草素、蛹蟲草菌素，3’ -脫氧腺苷，它是第一個(gè)從真菌中分離出來的核苷類抗菌素。其分子式為CltlH13N5O3,分子量為251. 24，熔點(diǎn)230-231°C，溶于水、熱乙醇和甲醇，不溶于苯、乙醚和氯仿，紫外光的最大吸收波長為259nm。蟲草素有抗腫瘤、抗白血病、抗菌、免疫調(diào)節(jié)、清除體內(nèi)自由基等多方面的藥理作用。另據(jù)報(bào)道，蟲草素一方面具有對DNA和RNA合成過程、加RNA和mRNA轉(zhuǎn)錄后修飾過程及腺苷酸環(huán)化酶活化等三方面的抑制作用，另一方面它又能促進(jìn)細(xì)胞分化，重建細(xì)胞骨架。蟲草素有降低膽固醇、降血糖、抗感染、抗瘧原蟲、抗蚊蟲的作用，含蟲草素的蟲草發(fā)酵液對哮喘及支氣管疾病、腎衰竭病人的腎功能等方面都有良好的輔助治療效果。
目前，蟲草素主要通過生物合成的方法經(jīng)由兩條途徑獲得一是直接從蛹蟲草子實(shí)體中提取；二是通過蛹蟲草液體發(fā)酵，從發(fā)酵液中提取。蟲草素的獲得主要從蛹蟲草子實(shí)體中提取。但子實(shí)體中含量只有0. 2-0. 6%，提取效率不高，因此蟲草素生產(chǎn)成本極高，價(jià)格昂貴。因?yàn)橄x草素療效顯著并且大量提取分離得到純品非常不易，目前國際市場上蟲草素的價(jià)格非常昂貴，隨著研究的深入蟲草素的商業(yè)價(jià)值更是不可估量。中山大學(xué)采用行星球磨法對冬蟲夏草子實(shí)體進(jìn)行破碎，超聲溶解，活性炭除雜來提取蟲草素(專利申請?zhí)朇N201110004151.0)。但是該方法在子實(shí)體破碎過程中容易產(chǎn)生熱量造成蟲草素提取率低，而且只能對干燥樣品進(jìn)行加工，對于含水高的樣品加工困難
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有的蟲草素提取方法過程中容易產(chǎn)生熱量造成蟲草素提取率低、純度低、只能對干燥樣品進(jìn)行加工，對于含水高的樣品加工困難的問題，而提供一種提取和分離蟲草素的方法。一種提取和分離蟲草素的方法，該方法包括如下步驟(I)超低溫粉碎將雪花冬蟲夏草原料采用低溫粉碎機(jī)以液氮為介質(zhì)在溫度為_196°C以下粉碎，得到粉末；(2)蟲草素的提取將步驟(I)得到的粉末和蒸餾水以重量比1:5-1:20混合，超聲波提取、離心過濾后，得到提取液；(3)分離將步驟(2)得到的提取液與大孔樹脂混合平衡，溫度20°C，經(jīng)洗脫液洗脫樹脂柱，收集流出液凍干；(4)純化用反向高效液相色譜將步驟(3)得到的流出液進(jìn)行純化，得到蟲草素的濃縮物。優(yōu)選的是，所述的步驟(I)中雪花冬蟲夏草為雪花冬蟲夏草子實(shí)體或雪花冬蟲夏草菌絲體。
優(yōu)選的是，所述的步驟(I)的溫度為_196°C。優(yōu)選的是，所述的步驟(2)是在超生頻率20-30KHZ，輸出功率100W-200W條件下進(jìn)行超生波提取。優(yōu)選的是，所述的步驟(2)中的超聲波提取時(shí)間為15_30min。優(yōu)選的是，所述的步驟(3)中的提取液的上樣量為大孔樹脂體積的10倍，提取液的吸附流速為大孔樹脂吸附流速的1-3倍。優(yōu)選的是，所述的步驟(3)中的洗脫液為濃度為20-50% (V/V)的乙醇，洗脫液為5-10倍樹脂柱體積，流速2-4BV/hr。
優(yōu)選的是，所述的步驟(4)中反向高效液相色譜條件為色譜柱20X150mmX5um的 C18 制備柱，柱溫20°C，流動(dòng)相組成10%甲醇，0. 05M磷酸緩沖液，pH7. 2，流速lml/min,檢測波長260nm，進(jìn)樣量200ul。優(yōu)選的是，所述的步驟(4)用反向高效液相色譜將步驟(3)得到的流出液進(jìn)行純化，經(jīng)納濾脫鹽、干燥得到蟲草素的濃縮物。優(yōu)選的是，所述的納濾脫鹽用的復(fù)合膜為截留分子量200Da的NF-1812卷式聚酰胺。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供一種提取和分離蟲草素的方法，該方法將雪花冬蟲夏草原料采用低溫粉碎機(jī)以液氮為介質(zhì)在溫度為_196°C以下粉碎，可以防止高溫條件下蟲草素提取率降低，得到粉末；將得到的粉末和蒸餾水以重量比1:5-1:20混合，在超生頻率20-30KHZ，輸出功率100W-200W條件下進(jìn)行超生波提取、離心過濾后，得到提取液，該方法采用低頻超聲低輸出功率促溶，可以提高蟲草素的提取率，防止蟲草素在高頻超聲波條件下被破壞；將得到的提取液與大孔樹脂混合平衡，溫度20°C，經(jīng)洗脫液洗脫樹脂柱，收集流出液凍干，水提取結(jié)合樹脂親和，可以防止有機(jī)污染，同時(shí)有助于其他蟲草活性成分的綜合加工；用反向高效液相色譜進(jìn)行純化、經(jīng)納濾脫鹽、干燥得到蟲草素的濃縮物。經(jīng)測定，本發(fā)明的一種提取和分離蟲草素的方法，蟲草素的質(zhì)量含量最高可達(dá)到98-99%，回收率可達(dá)到88-90%。


圖I為本發(fā)明實(shí)施例2雪花冬蟲夏草菌絲體經(jīng)超聲波提取后蟲草素含量分析的HPLC譜圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例2雪花冬蟲夏草菌絲體與大孔樹脂混合后蟲草素含量分析的HPLC譜圖；圖3為本發(fā)明實(shí)施例2雪花冬蟲夏草菌絲體經(jīng)冷凍干燥后蟲草素含量分析的HPLC譜圖。
具體實(shí)施方式
一種提取和分離蟲草素的方法，該方法包括如下步驟(I)超低溫粉碎將雪花冬蟲夏草原料采用低溫粉碎機(jī)以液氮為介質(zhì)在溫度為_196°C以下粉碎，得到粉末；(2)蟲草素的提取將步驟(I)得到的粉末和蒸餾水以重量比1:5-1:20混合，超聲波提取、離心過濾后，得到提取液；(3)分離將步驟(2)得到的提取液與大孔樹脂混合平衡，溫度20°C，經(jīng)洗脫液洗脫樹脂柱，收集流出液凍干；(4)純化用反向高效液相色譜將步驟(3)得到的流出 液進(jìn)行純化，得到蟲草素的濃縮物。所述的步驟(I)中雪花冬蟲夏草為雪花冬蟲夏草子實(shí)體或雪花冬蟲夏草菌絲體。所述的步驟(I)的溫度優(yōu)選為_196°C，過200-700目篩，得到粉末。所述的步驟(2)得到的粉末和蒸餾水重量比優(yōu)選為I :10混合。所述的步驟(2)是在超生頻率20-30KHZ，輸出功率100W-200W條件下進(jìn)行超生波提取，提取時(shí)間為15-30min。所述的步驟(2)中離心過濾過程中的轉(zhuǎn)速為5000轉(zhuǎn)/分，時(shí)間為15min。所述的步驟(3)中大孔樹脂為天津市海光化工有限公司生產(chǎn)，型號為NKA II。所述的步驟(3)中的提取液的上樣量為大孔樹脂體積的10倍，提取液的吸附流速為大孔樹脂吸附流速的1-3倍。所述的步驟(3)中的洗脫液為濃度為20-50% (V/V)的乙醇，洗脫液為5_10倍樹脂柱體積，流速2-4BV/hr。所述的步驟(4)中反向高效液相色譜條件為色譜柱20X150_X5um 的 C18 制備柱，柱溫20。。，流動(dòng)相組成10%甲醇，0. 05M磷酸緩沖液，pH7. 2，流速lml/min,檢測波長260nm，進(jìn)樣量200ul。所述的步驟(4)用反向高效液相色譜將步驟(3)得到的流出液進(jìn)行純化后，優(yōu)選經(jīng)納濾脫鹽、干燥得到蟲草素的濃縮物。所述的納濾脫鹽將純化后的提取液在溫度為20°C，pH7. 2,0. 4Mpa操作壓力下進(jìn)行納濾脫鹽，所述的納濾脫鹽用的復(fù)合膜為截留分子量200Da的NF-1812卷式聚酰胺，有效膜面積0. 2m2,弱負(fù)電性；所述的冷凍干燥是在_40°C，IOpa條件下進(jìn)行。實(shí)施例I將雪花冬蟲夏草子實(shí)體原料采用低溫粉碎機(jī)(上海麗科高分子材料有限公司)以液氮為介質(zhì)在_196°C條件下粉碎，過200目篩，得到粉末；將得到的粉末和蒸餾水以重量比I 5混合，在超生頻率(日本本多W-115超聲波清洗機(jī))28KHz，輸出功率200W條件下進(jìn)行超生波提取，提取時(shí)間為30min，然后以轉(zhuǎn)速5000轉(zhuǎn)/分離心(高速冷凍離心機(jī)GL-20B)過濾15min,得到提取液，經(jīng)液相色譜分析，蟲草素質(zhì)量含量0. 0010% ;將提取液與大孔樹脂(天津市海光化工有限公司生產(chǎn)，型號為NKA II)混合平衡，溫度20°C，上樣量10倍樹脂體積，吸附流速3倍樹脂BV/hr，以濃度為20% (V/V)乙醇為洗脫劑洗脫樹脂柱，洗脫劑為10倍樹脂柱體積，流速2BV/hr ;收集流出液凍干，經(jīng)HPLC分析測定，蟲草素質(zhì)量含量達(dá)51%，回收率達(dá)90% ;用反向高效液相色譜(Waters Delta600)進(jìn)行純化，反向高效液相色譜條件為色譜柱C18制備柱(20X150mmX5um)，柱溫20°C，流動(dòng)相組成10%甲醇，0. 05M磷酸緩沖液，pH7. 2，流速lml/min，檢測波長260 nm，進(jìn)樣量200ul ;然后將純化后的提取液在溫度為20°C，pH7. 2,0. 4Mpa操作壓力下進(jìn)行納濾脫鹽，所述的納濾脫鹽用的復(fù)合膜為截留分子量200Da的NF-1812卷式聚酰胺，有效膜面積0. 2m2,弱負(fù)電性；在_40°C，IOpa條件下冷凍干燥得到蟲草素的濃縮物。經(jīng)測定純度98%，回收率88%，蟲草素質(zhì)量含量達(dá)到98%。實(shí)施例2雪花冬蟲夏草菌絲體原料采用低溫粉碎機(jī)(上海麗科高分子材料有限公司)以液氮為介質(zhì)在_196°C條件下粉碎，過700目篩，得到粉末；將得到的粉末和蒸餾水以重量比I 10混合，在超生頻率(日本本多W-115超聲波清洗機(jī))30KHz，輸出功率100W條件下進(jìn)行超生波提取，提取時(shí)間為20min，然后以轉(zhuǎn)速5000轉(zhuǎn)/分離心(高速冷凍離心機(jī)GL-20B)過濾15min，得到提取液，經(jīng)液相色譜分析，蟲草素質(zhì)量含量0. 0012%,如圖I所示(圖中的標(biāo)注※的峰代表蟲草素)；將提取液與大孔樹脂(天津市海光化工有限公司生產(chǎn)，型號為NKA II)混合平衡，溫度20°C，上樣量10倍樹脂體積，吸附流速I倍樹脂BV/hr，以濃度為30% (V/V)乙醇為洗脫劑洗脫樹脂柱，洗脫劑為10倍樹脂柱體積，流速3BV/hr ;流出液凍干，經(jīng)液相色譜檢測分析測定，回收率達(dá)92%，蟲草素質(zhì)量含量達(dá)54%，如圖2所示(圖中的標(biāo)注※的峰代表蟲草素)；用反向高效液相色譜進(jìn)行純化，反向高效液相色譜條件為色譜柱C18制備柱(20\150臟\511111)，柱溫201，流動(dòng)相組成10%甲醇，0. 05M磷酸緩沖液，pH7. 2，流速lml/min，檢測波長260nm，進(jìn)樣量200ul ;然后將純化后的提取液在溫度為20°C，PH7. 2,0. 4Mpa操作壓力下進(jìn)行納濾脫鹽，所述的納濾脫鹽用的復(fù)合膜為截留分子量200Da的NF-1812卷式聚酰胺，有效膜面積0. 2m2,弱負(fù)電性；在在_40°C，IOpa條件下冷凍干燥得到蟲草素的濃縮物。經(jīng)測定純度99%，回收率90%，蟲草素質(zhì)量含量達(dá)到99%，如圖3所示(圖中的標(biāo)注※的峰代表蟲草素)。實(shí)施例3雪花冬蟲夏草子實(shí)體原料采用低溫粉碎機(jī)(上海麗科高分子材料有限公司)以液氮為介質(zhì)在_196°C條件下粉碎，過500目篩，得到粉末；將得到的粉末和蒸餾水以重量比I 20混合，在超生頻率(日本本多W-115超聲波清洗機(jī))20KHz，輸出功率100W條件下進(jìn)行超生波提取，提取時(shí)間為lOmin，然后以轉(zhuǎn)速5000轉(zhuǎn)/分離心(高速冷凍離心機(jī)GL-20B)過濾15min，得到提取液，經(jīng)液相色譜分析，蟲草素質(zhì)量含量0. 0011%;將提取液與大孔樹脂(天津市海光化工有限公司生產(chǎn)，型號為NKA II)混合平衡，溫度20°C，上樣量10倍樹脂體積，吸附流速I. 5倍樹脂BV/hr，以濃度為50% (V/V)乙醇為洗脫劑洗脫樹脂柱，洗脫劑為10倍樹脂柱體積，流速4BV/hr ;將流出液凍干，經(jīng)液相色譜檢測分析測定，回收率達(dá)91%，蟲草素質(zhì)量含量達(dá)52% ;用反向高效液相色譜進(jìn)行純化，反向高效液相色譜條件為色譜柱C18制備柱(20\150臟\511111)，柱溫:20°C，流動(dòng)相組成10%甲醇，0. 05M磷酸緩沖液，pH7. 2，流速lml/min，檢測波長260nm，進(jìn)樣量200ul ;然后將純化后的提取液在溫度為20°C，pH7.2，0. 4Mpa操作壓力下進(jìn)行納濾脫鹽，所述的納濾脫鹽用的復(fù)合膜為截留分子量200Da的NF-1812卷式聚酰胺，有效膜面積0. 2m2,弱負(fù)電性；在在_40°C，IOpa條件下冷凍干燥得到蟲草素的濃縮物。經(jīng)測定純度98. 5%，回收率89%，蟲草素質(zhì)量含量達(dá)到9 8. 5%。
權(quán)利要求
1.一種提取和分離蟲草素的方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)超低溫粉碎將雪花冬蟲夏草原料采用低溫粉碎機(jī)以液氮為介質(zhì)在溫度為_196°C以下粉碎，得到粉末； (2)蟲草素的提取將步驟(I)得到的粉末和蒸餾水以重量比1:5-1:20混合，超聲波提取、離心過濾后，得到提取液； (3)分離將步驟(2)得到的提取液與大孔樹脂混合平衡，溫度20°C，經(jīng)洗脫液洗脫樹脂柱，收集流出液凍干； (4)純化用反向高效液相色譜將步驟(3)得到的流出液進(jìn)行純化，得到蟲草素的濃縮物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種提取和分離蟲草素的方法，其特征在于，所述的步驟(I)中雪花冬蟲夏草為雪花冬蟲夏草子實(shí)體或雪花冬蟲夏草菌絲體。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種提取和分離蟲草素的方法，其特征在于，所述的步驟(I)的溫度為-196°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種提取和分離蟲草素的方法，其特征在于，所述的步驟(2)是在超生頻率20-30KHZ，輸出功率100W-200W條件下進(jìn)行超生波提取。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或4所述的一種提取和分離蟲草素的方法，其特征在于，所述的步驟(2)中的超聲波提取時(shí)間為15-30min。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種提取和分離蟲草素的方法，其特征在于，所述的步驟(3)中的提取液的上樣量為大孔樹脂體積的10倍，提取液的吸附流速為大孔樹脂吸附流速的1-3 倍。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種提取和分離蟲草素的方法，其特征在于，所述的步驟(3)中的洗脫液為濃度為20-50%的乙醇，洗脫液為5-10倍樹脂柱體積，流速2-4BV/hr。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種提取和分離蟲草素的方法，其特征在于，所述的步驟(4)中反向高效液相色譜條件為 色譜柱20X150_X5um的C18制備柱， 柱溫20°C， 流動(dòng)相組成10%甲醇，0. 05M磷酸緩沖液，pH7. 2， 流速lml/min, 檢測波長260nm, 進(jìn)樣量200ul。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種提取和分離蟲草素的方法，其特征在于，所述的步驟(4)用反向高效液相色譜將步驟(3)得到的流出液進(jìn)行純化，經(jīng)納濾脫鹽、干燥得到蟲草素的濃縮物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種提取和分離蟲草素的方法，其特征在于，所述的納濾脫鹽用的復(fù)合膜為截留分子量200Da的NF-1812卷式聚酰胺。
全文摘要
本發(fā)明提供一種提取和分離蟲草素的方法，屬于農(nóng)產(chǎn)品深加工技術(shù)領(lǐng)域。解決現(xiàn)有的蟲草素提取方法過程中容易產(chǎn)生熱量造成蟲草素提取率低、純度低、只能對干燥樣品進(jìn)行加工，對含水高的樣品加工困難的問題。該方法是將雪花冬蟲夏草低溫粉碎后以料水1:5-1:20混合，在超生頻率20-30kHz條件下超聲提取后，與大孔樹脂混合平衡，用反向高效液相色譜進(jìn)行純化，經(jīng)納濾脫鹽、干燥最終得到蟲草素的濃縮物。本發(fā)明采用低溫液氮研磨，并且結(jié)合低頻超生低輸出功率促溶，使蟲草素的質(zhì)量含量最高可達(dá)到98-99%，回收率可達(dá)到88-90%。
文檔編號C07H1/08GK102746355SQ20121020319
公開日2012年10月24日 申請日期2012年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月19日
發(fā)明者太青林, 太龍杰, 成懷暢, 王秀然 申請人:吉林省起泰科技有限公司