專利名稱：一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體的是涉及一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法。
背景技術(shù)：
隨著現(xiàn)代分析測試技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)越來越多的醫(yī)藥化合物具有手性結(jié)構(gòu)特征，即具有相互呈鏡像但彼此不能重合的對映異構(gòu)體；手性藥物的對映異構(gòu)體通常表現(xiàn)出 不同的生理行為，具有不同甚至截然相反的藥效[J. Chromat. A，2001，906，3-33]。因此，研究開發(fā)具有光學(xué)純度的手性藥物已成為醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)之一。制備具有光學(xué)純度的手性藥物需要依托不對稱合成和手性拆分技術(shù)，而關(guān)鍵在于設(shè)計(jì)和研制具有高立體選擇性的手性拆分劑。目前，優(yōu)先結(jié)晶法、手性膜拆分法、色譜拆分法、酶拆分法等手性拆分技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于手性藥物對映體的研究和制備中[Anal. Chem. 2010,82,4712-4722]。然而現(xiàn)有的這些方法都難以實(shí)現(xiàn)單一對映體的高效制備，通常得到的都是不同對映體的混合物。因此，如何調(diào)控手性拆分劑以實(shí)現(xiàn)對手性藥物不同對映異構(gòu)體的高效分子識別成為當(dāng)今科學(xué)家們亟待研究的一個(gè)課題[Nature Materials，2003，2，272-278]。DNA作為生物體內(nèi)儲存遺傳信息的重要物質(zhì)，因其獨(dú)特的手性結(jié)構(gòu)特征和分子識別特性，已成為材料和信息科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[Chirality，2007，19 :658-682 ；Science,2008，321，1795-1799]，特別是利用DNA分子組裝體為模板引導(dǎo)蛋白質(zhì)、量子點(diǎn)、過渡金屬等構(gòu)筑單元的準(zhǔn)確定位，以形成多尺度結(jié)構(gòu)特征的、功能化超分子組裝體[NatureNanotechnol. ,2006,1,190-194]。另一方面,從化學(xué)和生物學(xué)的角度,利用分子納米技術(shù)可以調(diào)控和設(shè)計(jì)具有特定組成和特定功能的DNA序列[Nature Reviews Genetics, 2006, 7,565-576 ；Angew. Chem. Int. Ed.，2007，46，6226-6236]，使其在手性藥物的選擇性合成與特異性識別方面顯露出誘人的應(yīng)用前景。基于DNA 二級結(jié)構(gòu)的多樣性和可調(diào)控性，以及堿基之間相互作用力弱等特點(diǎn)，利用小分子物質(zhì)，特別是某些金屬離子，可以誘導(dǎo)DNA構(gòu)型發(fā)生改變。這種誘導(dǎo)作用與金屬離子的類型和濃度、DNA序列的組成和長度以及溶液離子強(qiáng)度都有關(guān)系[Nucleic AcidsResearch, 2000，28，2439-2445]。例如，特定堿基組成的核酸序列在Ni2+或精氨的誘導(dǎo)下，其雙螺旋結(jié)構(gòu)可以由B型向Z型轉(zhuǎn)變，這種手性結(jié)構(gòu)以及表現(xiàn)出來的光譜特征的改變，為小分子藥物特異性識別提供了依據(jù)[J. Phys. Chem. B，2011，115，10182-10188 J. Am. Chem.Soc.，2009，131，2046-2047]。另外，金屬離子的加入，可以改變DNA序列與小分子藥物之間的結(jié)合作用，增大或減少DNA對藥物的結(jié)合能力[J. Fluoresc, 2011, 21,113-118]。到目前為止，利用特定的雙鏈寡核苷酸序列，通過金屬離子的誘導(dǎo)調(diào)控作用，對手性藥物對映體進(jìn)行拆分還未曾報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下—種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟(I)在pH為5-9條件下，向50-4000體積份數(shù)的摩爾濃度為O. 025-lmmol/L的雙鏈寡核苷酸溶液中加入I體積份數(shù)的摩爾濃度為O. 01-lmol/L的二價(jià)金屬離子無機(jī)鹽的水溶液，在10-40°C下混合均勻，得到雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物溶液；(2)在與步驟⑴相同的pH條件下，將1-100體積份數(shù)的所述雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物溶液與I體積份數(shù)的摩爾濃度為O. 15-2mmol/L的手 性藥物溶液混合，吸附15-60分鐘；用截留分子量為1000-10000的超濾膜進(jìn)行超濾，濾液為富集的手性藥物的一種對映異構(gòu)體溶液，雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物上的吸附物為富集的手性藥物的另一種對映異構(gòu)體。步驟⑴優(yōu)選為在pH為5-9條件下，向100-1000體積份數(shù)的摩爾濃度為O. 05-0. 5mmol/L的雙鏈寡核苷酸溶液中加入I體積份數(shù)的摩爾濃度為O. 05-0. 5mol/L的二價(jià)金屬離子無機(jī)鹽的水溶液，在20-30°C下混合均勻，得到雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物溶液。所述雙鏈寡核苷酸為優(yōu)選為序列[(dG-dC)n]2或[(dA-dT)丄，η為I 0-400。所述步驟(I)中所述雙鏈寡核苷酸溶液的溶劑為磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、MES緩沖液、HEPES緩沖液或二甲胂酸鹽緩沖液。所述步驟(I)中所述二價(jià)金屬離子為銅離子、鎳離子、錳離子、鎂離子、鈣離子、鋅離子、鋇離子或鈷離子，所述無機(jī)鹽為鹽酸鹽、硝酸鹽或硫酸鹽。所述步驟(2)為在與步驟(I)相同的pH條件下，將4-40體積份數(shù)的所述雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物溶液與I體積份數(shù)的摩爾濃度為O. 25-lmmol/L的手性藥物溶液混合，吸附20-40分鐘；用截留分子量為3000-8000的超濾膜進(jìn)行超濾，濾液為富集的手性藥物的一種對映異構(gòu)體溶液，雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物上的吸附物為富集的手性藥物的另一種對映異構(gòu)體。所述手性藥物為氧氟沙星、布洛芬、華法林、萘普生、酮洛芬、氟比洛芬、西酞普蘭或普萘洛爾。所述步驟(2)中所述手性藥物溶液的溶劑為磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、MES緩沖液、HEPES緩沖液或二甲胂酸鹽緩沖液。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本方法利用生物相容性好的雙鏈寡核苷酸實(shí)現(xiàn)簡便、安全的手性藥物拆分，是一種綠色、清潔的手性藥物對映異構(gòu)體拆分新方法。
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明，但不對本發(fā)明作任何限制。實(shí)施例I一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟(I)在 pH = 7. 2 下，向 1000 μ L 摩爾濃度為 O. 05mmol/L 的[(dG_dC)20]2 溶液中力口入I μ L的摩爾濃度為O. lmol/L的氯化銅水溶液，在20°C混合均勻，得到[(dG_dC) 2(|]2-銅離子復(fù)合物溶液；[(dG-dC)2J2溶液的溶劑為磷酸鈉緩沖液；(2)在pH = 7. 2下，將400 μ L步驟(I)制備的[(dG_dC) J2-銅離子復(fù)合物溶液與100 μ L摩爾濃度為O. 5mmol/L的外消旋氧氟沙星溶液混合,吸附20分鐘，外消旋氧氟沙星溶液的溶劑為磷酸鈉緩沖液；然后將混合溶液裝入到截留分子量為3000的超濾離心管中，在8000rpm下離心20分鐘，濾液為富集的氧氟沙星的一種對映異構(gòu)體溶液，[(dG-dC) J2-銅離子復(fù)合物上的吸附物為富集的氧氟沙星的另一種對映異構(gòu)體。濾液中氧氟沙星的對映體過量值為9. 08%。將上述濾液經(jīng)過步驟(2)重復(fù)處理三次后，最終濾液中氧氟沙星的對映體過量值達(dá)到35. 19%。
實(shí)驗(yàn)證明，用本實(shí)施例的方法也可用于拆分布洛芬、華法林、萘普生、酮洛芬或氟比洛芬。實(shí)施例2一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟(I)在 pH = 8. 5 下，向 1000 μ L 摩爾濃度為 O. 05mmol/L 的[(dG_dC) 10]2 溶液中力口AlOyL的摩爾濃度為O. 5mol/L的硫酸鋅水溶液，在20°C混合均勻，得到[(dG_dC) 10]2-鋅離子復(fù)合物溶液；[(dG-dC) 10]2溶液的溶劑為Tris-鹽酸緩沖液。(2)在pH = 8. 5下，將400 μ L步驟(I)制備的[(dG_dC) 1(|]2-鋅離子復(fù)合物溶液與10 μ L摩爾濃度為2mmol/L的外消旋氧氟沙星溶液混合，吸附40分鐘，氧氟沙星溶液的溶劑為Tris-鹽酸緩沖液；然后將混合溶液裝入到截留分子量為1000的超濾離心管中，在8000rpm下離心20分鐘，濾液為富集的氧氟沙星的一種對映異構(gòu)體溶液，[(dG_dC) 10]2-鋅離子復(fù)合物上的吸附物為富集的氧氟沙星的另一種對映異構(gòu)體。濾液中氧氟沙星的對映體過量值為10. 54%。將上述濾液經(jīng)過步驟(2)重復(fù)處理三次后，最終濾液中氧氟沙星的對映體過量值達(dá)到40. 11%。實(shí)驗(yàn)證明，本實(shí)施例的方法也可用于拆分布洛芬、華法林、萘普生、酮洛芬氟或比洛芬。實(shí)施例3一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟(I)在 PH = 8. 5 下，向 1000 μ L 摩爾濃度為 O. 025mmol/L 的[(dA-dT) 400]2 溶液中加入20yL的摩爾濃度為O. 05mol/L的硝酸鎂水溶液，在30°C混合均勻，得到[(dA-dT)4J2-鎂離子復(fù)合物溶液；[(dA-dT)4J2溶液的溶劑為Tris-鹽酸緩沖液。(2)在pH = 8. 5下，將400 μ L步驟(I)制備的[(dA_dT)4J2-鎂離子復(fù)合物溶液與400 μ L摩爾濃度為O. 15mmol/L的外消旋布洛芬溶液混合，吸附15分鐘，布洛芬溶液的溶劑為Tris-鹽酸緩沖液；然后將混合溶液通過截留分子量為10000的超濾膜，濾液為富集的布洛芬的一種對映異構(gòu)體溶液，[(dA-dT)4J2-鎂離子復(fù)合物上的吸附物為富集的布洛芬的另一種對映異構(gòu)體。濾液中布洛芬的對映體過量值為9. 81%。將上述濾液經(jīng)過步驟
(2)重復(fù)處理三次后，最終濾液中布洛芬的對映體過量值達(dá)到33.04%。實(shí)驗(yàn)證明，本實(shí)施例的方法也可用于拆分氧氟沙星、酮洛芬、氟比洛芬或西酞普
ΛΑ
~O實(shí)施例4一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟
(I)在 pH = 5. 0 下，向 4000ii L 摩爾濃度為 0. 5mmol/L 的[(dG_dC)20]2 溶液中力口AluL的摩爾濃度為lmol/L的硝酸鎳水溶液，在15°C混合均勻，得到[(dG-dC)2J2-鎳離子復(fù)合物溶液；[(dG-dC)20]2溶液的溶劑為MES緩沖液；(2)在pH = 5.0下，將IOOOii L步驟(I)制備的[(dG_dC)2Q]2-鎳離子復(fù)合物溶液與100 u L摩爾濃度為lmmol/L的外消旋華法林溶液混合，吸附30分鐘，華法林溶液的溶劑為MES緩沖液；然后將混合溶液裝入到截留分子量為3000的超濾離心管中，在8000rpm下離心20分鐘，濾液為富集的華法林的一種對映異構(gòu)體溶液，[(dG-dC)2J2-鎳離子復(fù)合物上的吸附物為富集的華法林的另一種對映異構(gòu)體。濾液中華法林的對映體過量值為7.88%。將上述濾液經(jīng)過步驟(2)重復(fù)處理三次后，最終濾液中華法林的對映體過量值達(dá)到 27. 21%。實(shí)驗(yàn)證明，本實(shí)施例的方法也可用于拆分氧氟沙星、酮洛芬、氟比洛芬、西酞普蘭或普萘洛爾。 實(shí)施例5一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟(I)在pH = 5. 8下，向IOOOii L摩爾濃度為lmmol/L的[(dG_dC)丨J2溶液中加入I U L的摩爾濃度為0. 01mol/L的氯化錳水溶液，在10°C混合均勻，得到[(dG_dC) i J2-錳離子復(fù)合物溶液；[(dG-dC) 100]2溶液的溶劑為二甲胂酸鈉緩沖液。(2)在pH = 5. 8下，將500 U L步驟(I)制備的[(dG_dC) 100]2_錳離子復(fù)合物溶液與500 ii L摩爾濃度為lmmol/L的外消旋氧氟沙星溶液混合,吸附30分鐘,氧氟沙星溶液的溶劑為二甲胂酸鈉緩沖液；然后將混合溶液通過截留分子量為8000的超濾膜，濾液為富集的氧氟沙星的一種對映異構(gòu)體溶液，[(dG-dC) 1(J2-錳離子復(fù)合物上的吸附物為富集的氧氟沙星的另一種對映異構(gòu)體。濾液中氧氟沙星的對映體過量值為12.31%。將上述濾液經(jīng)過步驟(2)重復(fù)處理三次后，最終濾液中氧氟沙星的對映體過量值達(dá)到34. 79%。實(shí)驗(yàn)證明，本實(shí)施例的方法也可用于拆分氧氟沙星、酮洛芬、氟比洛芬、西酞普蘭或普萘洛爾。實(shí)施例6—種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟(I)在 pH = 8.0 下，向 IOOOii L 摩爾濃度為 0. lmmol/L 的[(dG_dC) 400]2 溶液中力口入IOii L的摩爾濃度為0. 3mol/L的硝酸鋇水溶液，在40°C混合均勻，得到[(dG_dC)4J2-鋇離子復(fù)合物溶液；[(dG-dC) 4(J2溶液的溶劑為Tris-鹽酸緩沖液。(2)在pH = 8.0下，將500 ii L步驟(I)制備的[(dG_dC)4J2-鋇離子復(fù)合物溶液與500 ii L摩爾濃度為lmmol/L的外消旋氧氟沙星溶液混合,吸附30分鐘,氧氟沙星溶液的溶劑為Tris-鹽酸緩沖液；然后將混合溶液通過截留分子量為10000的超濾膜，濾液為富集的氧氟沙星的一種對映異構(gòu)體溶液，[(dG-dC) 4 J 2-鋇離子復(fù)合物上的吸附物為富集的氧氟沙星的另一種對映異構(gòu)體。濾液中氧氟沙星的對映體過量值為11.45%。將上述濾液按步驟(2)重復(fù)處理三次后,最終濾液中氧氟沙星的對映體過量值達(dá)到32. 25%。實(shí)驗(yàn)證明，本實(shí)施例的方法也可用于拆分布洛芬、華法林、萘普生、酮洛芬或氟比洛芬。實(shí)施例7
一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟(1)在？11 = 9.0下，向10001^摩爾濃度為0.05臟01/1的(dA_dT) J2溶液中加A5uL的摩爾濃度為0. 05mol/L的硝酸鈣水溶液，在20°C混合均勻，得到[(dA_dT) 10]2-鈣離子復(fù)合物溶液；[(dA-dT) 10]2溶液的溶劑為Tris-鹽酸緩沖液。(2)在pH = 9. 0下，將500 u L步驟(I)制備的[(dA_dT) 1(|]2-鈣離子復(fù)合物溶液與500 ii L摩爾濃度為0. 25mmol/L的外消旋布洛芬溶液混合，吸附60分鐘，布洛芬溶液的溶劑為Tris-鹽酸緩沖液；然后將混合溶液裝入到截留分子量為1000的超濾離心管中，在8000rpm下離心20分鐘，濾液為富集的布洛芬的一種對映異構(gòu)體溶液，[(dA_dT) 10]2-鈣離子復(fù)合物上的吸附物為富集的布洛芬的另一種對映異構(gòu)體。濾液中布洛芬的對映體過量值為6. 50%。將上述濾液經(jīng)過步驟(2)重復(fù)處理三次后，最終濾液中布洛芬的對映體過量值達(dá)到 18. 79%。實(shí)驗(yàn)證明，本實(shí)施例的方法也可用于拆分氧氟沙星、華法林、萘普生、酮洛芬或氟比洛芬。實(shí)施例8一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟(I)在pH =7. 2下，向1000^摩爾濃度為0.05臟01/1的[(dG_dC): J2溶液中力口入L的摩爾濃度為0. 05mol/L的氯化鈷水溶液，在35°C混合均勻，得到[(dG_dC) i J2-鈷離子復(fù)合物溶液；[(dG-dC) 100]2溶液的溶劑為HEPES緩沖液。(2)在pH = 7. 2下，將1000 ii L步驟(I)制備的[(dG_dC): J2-鈷離子復(fù)合物溶液與10 ii L摩爾濃度為2mmol/L的外消旋氟比洛芬溶液混合,吸附40分鐘,氟比洛芬溶液的溶劑為JEPES緩沖液；然后將混合溶液通過截留分子量為8000的超濾膜，濾液為富集的 氟比洛芬的一種對映異構(gòu)體溶液，[(dG-dC) 1(J2-鈷離子復(fù)合物上的吸附物為富集的氟比洛芬的另一種對映異構(gòu)體。濾液中布洛芬的對映體過量值為15.26%。將上述濾液經(jīng)過步驟(2)重復(fù)處理三次后,最終濾液中氟比洛芬的對映體過量值達(dá)到40. 01%。實(shí)驗(yàn)證明，本實(shí)施例的方法也可用于拆分布氧氟沙星、布洛芬、萘普生、酮洛芬或普洛萘爾。
權(quán)利要求
1.ー種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，其特征包括如下步驟 (1)在pH為5-9條件下，向50-4000體積份數(shù)的摩爾濃度為O.025-lmmol/L的雙鏈寡核苷酸溶液中加入I體積份數(shù)的摩爾濃度為O. 01-lmol/L的ニ價(jià)金屬離子無機(jī)鹽的水溶液，在10-40°C下混合均勻，得到雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物溶液； (2)在與步驟(I)相同的pH條件下，將1-100體積份數(shù)的所述雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物溶液與I體積份數(shù)的摩爾濃度為O. 15-2mmol/L的手性藥物溶液混合，吸附15-60分鐘；用截留分子量為1000-10000的超濾膜進(jìn)行超濾，濾液為富集的手性藥物的一種對映異構(gòu)體溶液，雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物上的吸附物為富集的手性藥物的另ー種對映 異構(gòu)體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征是所述步驟(I)為在pH為5-9條件下，向100-1000體積份數(shù)的摩爾濃度為O. 05-0. 5mmol/L的雙鏈寡核苷酸溶液中加入I體積份數(shù)的摩爾濃度為O. 05-0. 5mol/L的ニ價(jià)金屬離子無機(jī)鹽的水溶液，在20_30°C下混合均勻，得到雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征是所述雙鏈寡核苷酸為序列[(dG-dC)n]2或[(dA-dT)n]2, η 為 10-400。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征是所述步驟(I)中所述雙鏈寡核苷酸溶液的溶劑為磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、MES緩沖液、HEPES緩沖液或ニ甲胂酸鹽緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征是所述步驟(I)中所述ニ價(jià)金屬離子為銅離子、鎳離子、錳離子、鎂離子、鈣離子、鋅離子、鋇離子或鈷離子，所述無機(jī)鹽為鹽酸鹽、硝酸鹽或硫酸鹽。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征是所述步驟(2)為在與步驟⑴相同的pH條件下，將4-40體積份數(shù)的所述雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物溶液與I體積份數(shù)的摩爾濃度為O. 25-lmmol/L的手性藥物溶液混合，吸附20-40分鐘；用截留分子量為3000-8000的超濾膜進(jìn)行超濾，濾液為富集的手性藥物的一種對映異構(gòu)體溶液，雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物上的吸附物為富集的手性藥物的另ー種對映異構(gòu)體。
7.根據(jù)權(quán)利要求I或6所述的方法，其特征是所述手性藥物為氧氟沙星、布洛芬、華法林、萘普生、酮洛芬、氟比洛芬、西酞普蘭或普萘洛爾。
8.根據(jù)權(quán)利要求I或6所述的方法，其特征是所述步驟(2)中所述手性藥物溶液的溶劑為磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、MES緩沖液、HEPES緩沖液或ニ甲胂酸鹽緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟(1)在pH為5-9條件下，向雙鏈寡核苷酸溶液中加入二價(jià)金屬離子無機(jī)鹽的水溶液，混合均勻，得到雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物溶液；(2)在與步驟(1)相同的pH條件下，將雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物溶液與手性藥物溶液混合，吸附；用截留分子量為1000-10000的超濾膜進(jìn)行超濾，濾液為富集的手性藥物的一種對映異構(gòu)體溶液，雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物上的吸附物為富集的手性藥物的另一種對映異構(gòu)體。本方法利用生物相容性好的雙鏈寡核苷酸實(shí)現(xiàn)簡便、安全的手性藥物拆分，是一種綠色、清潔的手性藥物對映異構(gòu)體拆分新方法。
文檔編號C07C57/30GK102633583SQ201210063929
公開日2012年8月15日 申請日期2012年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月12日
發(fā)明者付雁, 張金利, 李韡, 段小麗, 陳雄飛 申請人:天津大學(xué)