專利名稱：親和力降低的新抗體和制備所述抗體的方法
親和力降低的新抗體和制備所述抗體的方法相關(guān)申請的交叉引用
本申請要求2010年I月28日提交的美國臨時申請61/299，162的權(quán)益的優(yōu)先權(quán)，其整個內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。
背景技術(shù)：
單克隆抗體因其以高度特異性結(jié)合抗原的能力而被廣泛用作研究、診斷和治療試劑。除其與抗原特異性結(jié)合外，單克隆抗體還可以通過其Fe區(qū)活化補(bǔ)體系統(tǒng)和效應(yīng)細(xì)胞。為了正確地說明抗體的生物學(xué)性質(zhì)，合適的對照是必需的。在沒有合適對照的情況下，難以確定抗體的特異性結(jié)合活性與抗體的生物化學(xué)和生物學(xué)作用之間的因果關(guān)系。目前使用的對照單克隆抗體包括1.由天然存在的漿細(xì)胞瘤分泌的無已知靶抗 原的抗體；2.針對來自進(jìn)化遠(yuǎn)緣物種例如KLH (匙孔戚血藍(lán)蛋白)的抗原產(chǎn)生的抗體；3.與不同于目的抗原的已知靶抗原起反應(yīng)的抗體。在這些情況的每一種中，所用對照抗體具有限定不清的可變結(jié)構(gòu)域和不確定的抗原特異性。而在第三種情況下，仍存在交叉反應(yīng)性的問題。因此，當(dāng)使用目前可獲得的對照抗體時，常常會遇到例如交叉反應(yīng)性或非特異性結(jié)合等問題。此外，由于缺乏理想的對照抗體，因此常常使用制劑溶媒(例如生理鹽水)作為對照進(jìn)行研究。在這種情況下，如果不是不可能的話，也難以區(qū)別所觀察到的生物化學(xué)和/或生物學(xué)作用是特異性抗原/抗體相互作用的直接結(jié)果，還是非特異性作用的結(jié)果，非特異性作用例如抗體分子的其它部分或存在于抗體制備物中的污染物(例如宿主細(xì)胞蛋白質(zhì))的相互作用和生物學(xué)作用。鑒于至少這些原因，目前極其需要改進(jìn)的合理設(shè)計的對照抗體。發(fā)明概述
一方面，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生結(jié)合能力降低的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的方法，所述方法包括以下步驟(a)從CDR多肽內(nèi)鑒定出能夠與抗原相互作用的至少一個結(jié)合氨基酸；和(b)改變CDR多肽內(nèi)的所述至少一個結(jié)合氨基酸，使得所得CDR在結(jié)合抗原方面的能力降低。在一些實施方案中，所述⑶R位于抗體或抗體片段內(nèi)。在一些實施方案中，所述方法還包括驗證抗原結(jié)合喪失的步驟。可通過FACS分析實現(xiàn)驗證步驟。另一方面，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生結(jié)合能力降低的抗體或抗體片段的方法，所述方法包括以下步驟(a)自抗體或抗體片段內(nèi)鑒定出能夠與抗原相互作用的至少一個結(jié)合氨基酸；和(b)改變抗體或抗體片段內(nèi)的所述至少一個結(jié)合氨基酸，使得所得抗體在結(jié)合抗原方面的能力降低。在一些實施方案中，所述方法還包括驗證抗原結(jié)合喪失的步驟。可通過FACS分析實現(xiàn)驗證步驟。在一些實施方案中，所述相互作用是氫鍵、鹽橋和/或范德華力。在某些實施方案中，所述結(jié)合氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、組氨酸或谷氨酰胺。在其它實施方案中，所述結(jié)合氨基酸是酪氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、色氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或甘氨酸。在一些實施方案中，所述結(jié)合氨基酸被非結(jié)合氨基酸替換。在一些實施方案中，所述非結(jié)合氨基酸是丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸或甲硫氨酸。
在本發(fā)明的某些實施方案中，通過分析描述CDR和抗原間的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)來進(jìn)行鑒定結(jié)合氨基酸的步驟。另一方面，本發(fā)明包括采用本發(fā)明的方法產(chǎn)生的抗體或抗體片段。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體或抗體片段具有大于或等于約10_7的解離常數(shù)(Kd)。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體或抗體片段是完整的免疫球蛋白分子、scFv, Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2、Fd片段、Fv或二硫鍵連接的Fv。附圖簡述
圖I表示描述制備本發(fā)明的對照抗體的流程圖。圖2表示參與抗體-抗原相互作用的特定⑶R氨基酸的頻率。圖3表示包括Fv結(jié)構(gòu)域、Fab結(jié)構(gòu)域和Fe結(jié)構(gòu)域的抗體結(jié)構(gòu)的示例性示意圖。
圖4表示重組抗體生產(chǎn)的示例性方法的圖示。圖5表不OKT3的抗體產(chǎn)生和本發(fā)明的一些不例性對照抗體。圖6表示表明本發(fā)明的一些示例性對照抗體與人Jurkat細(xì)胞結(jié)合的FACS圖。圖7表示表明本發(fā)明的一些示例性對照抗體與人PBMC結(jié)合的FACS圖。圖8表示編碼0KT3重鏈的pME-wt0KT3 HC載體的圖譜。圖9表示編碼0KT3輕鏈的pME-wt0KT3 LC載體的圖譜。

圖10表示0KT3和0KT3變體與Jurkat細(xì)胞的結(jié)合。圖11表示變體抗體的藥代動力學(xué)。發(fā)明詳述
本發(fā)明提供親和力降低的新抗體，其具有在基本不改變抗體的三維結(jié)構(gòu)的情況下降低或消除抗原結(jié)合的充分表征的可變結(jié)構(gòu)域。為了更容易地理解本發(fā)明，下文以及整個說明書對某些術(shù)語和短語作出定義。術(shù)語“抗體”在生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中被充分理解，通常是指完整抗體及任何抗體片段或其單鏈?？贵w是由稱為漿細(xì)胞的特化B淋巴細(xì)胞分泌的糖蛋白。其亦被稱為免疫球蛋白(Ig)，因為其含有存在于許多蛋白質(zhì)中的共有結(jié)構(gòu)域?？贵w最可能包含通常由二硫鍵連接的2條重(H)鏈和2條輕(L)鏈或其抗原結(jié)合部分。每條重鏈由重鏈可變區(qū)(Vh)和重鏈恒定區(qū)組成。每條輕鏈同樣由可變區(qū)(')和恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個結(jié)構(gòu)域CL組成。V1^P'區(qū)可進(jìn)一步再分成超變區(qū)，稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其散布有稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的更保守的區(qū)域。每個￥11和'由按以下順序自氨基端到羧基端排列的3個CDR和4個FR組成FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明還包括抗體片段?？贵w片段的實例包括(i) Fab片段，一種由VH、VpCL和CHl結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；(ii) F(ab’)2片段，一種包含在鉸鏈區(qū)通過二硫鍵連接的2個Fab片段的二價片段；(iii) Fd片段，其由V1^P CHl結(jié)構(gòu)域組成；(iv) Fv片段，其由抗體單臂的 Vh 和'結(jié)構(gòu)域組成，(V) dAb 片段(Ward 等，(1989) Nature 341:544 546)，其由 Vh結(jié)構(gòu)域組成；和(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)或(vii)兩個或更多個分離⑶R的組合，其可任選通過合成接頭連接。此外，雖然Fv片段的2個結(jié)構(gòu)域V1^P \由不同的基因編碼，但是可采用重組方法，通過合成接頭將它們連接，所述合成接頭使它們成為其中Vh和\區(qū)配對形成單價分子(稱為單鏈Fv (scFv)的一條蛋白質(zhì)鏈；參見例如Bird等(1988) Science242:423 426 ;以及 Huston 等(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:5879 5883)。這類單鏈抗體也意欲包括在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”內(nèi)。本文所用“抗體”和“抗體片段”可互換使用以描述本發(fā)明，除非另有明確說明。術(shù)語“超變區(qū)”、“HVR”或“HV”是指序列是超變的并形成結(jié)構(gòu)上確定的環(huán)的抗體可變結(jié)構(gòu)域的區(qū)域。抗體一般包含6個HVR ;3個在VH (H1、H2、H3)中，3個在VL (L1、L2、L3)中。在抗體分子中，VH結(jié)構(gòu)域的3個HVR和VL結(jié)構(gòu)域的3個HVR在三維結(jié)構(gòu)中被連接在一起形成抗原結(jié)合表面。因為這些序列形成與靶抗原的三維結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的表面，因此HVR亦被稱為互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)。術(shù)語“⑶R”及其復(fù)數(shù)“⑶Rs”是指互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)，其中3個構(gòu)成輕鏈可變區(qū)(CDRL1、CDRL2和CDRL3)的結(jié)合特性，3個構(gòu)成重鏈可變區(qū)(CDRH1、CDRH2和CDRH3)的結(jié)合特性。CDR有助于抗體分子的功能活性，并且被包括支架區(qū)或構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列分開。確切界定的⑶R邊界和長度取決于不同的分類和編號系統(tǒng)。因此⑶R可參考Kabat、Chothia、接觸或任何其它邊界定義。盡管有不同的邊界，這些系統(tǒng)的每一個在構(gòu)成可變序列內(nèi)的所 謂“超變區(qū)”中有某種程度的重疊。因此，就相鄰構(gòu)架區(qū)而言，按照這些系統(tǒng)的CDR定義的長度和邊界區(qū)域可不同。參見例如Kabat、Chothia和/或MacCallum等(Kabat等，載于“Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 第 5 版，美國衛(wèi)生與公眾服務(wù)部(U.S. Department of Health and Human Services), 1992; Chothia 等，J. Mol.Biol. , 1987，196: 901 ;和 MacCallum 等，J. Mol. Biol. , 1996，262: 732，各自均通過引用以其整體結(jié)合)?！皹?gòu)架區(qū)”或“FR”殘基是那些可變結(jié)構(gòu)域殘基而非本文定義的HVR殘基。示例性的構(gòu)架區(qū)由SEQ ID NOs. 15-22提供。本文術(shù)語“Fe區(qū)”用來定義免疫球蛋白重鏈的C端區(qū)，包括天然序列Fe區(qū)和變體Fe區(qū)。雖然免疫球蛋白重鏈的Fe區(qū)的邊界可不同，但人IgG重鏈Fe區(qū)通常被定義為從Cys226位或Pro230位的氨基酸殘基延伸至其羧基端。例如，可在抗體產(chǎn)生或純化期間，或者通過重組工程改造編碼抗體重鏈的核酸，除去Fe區(qū)的C端賴氨酸(EU編號系統(tǒng)的殘基447)。因此，完整抗體的組成可包含所有K447殘基均被除去的抗體群、無K447殘基被除去的抗體群和具有含或不含K447殘基的抗體的混合物的抗體群。用于本發(fā)明抗體的合適的天然序列Fe區(qū)包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE?！癋e受體”或“FcR”描述了與抗體Fe區(qū)結(jié)合的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列人FcR0此外，優(yōu)選的FcR是結(jié)合IgG抗體的FcR U受體)，并且包括Fe Y RI、Fe Y RII和FcyRIII亞類的受體，包括這些受體的等位基因變體和可變剪接形式，F(xiàn)cyRII受體包括FcyRIIA ( “活化受體”)和Fe Y RIIB ( “抑制受體”)，其具有主要在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域上不同的相似氨基酸序列?；罨荏wFe y RIIA在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域含有基于免疫受體酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受體Fe Y RIIB在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域含有基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITM)。(參見 M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997))。FcR 的綜述見Ravetch 和 Kinet, Annu. Rev. TmmunoI 9: 457-92 (1991) ；CapeI 等,Immunomethods4: 25-34 (1994);以及 de Haas 等，J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)。其它FcR，包括與其它同種型結(jié)合的FcR以及將來鑒定的FcR，均包括在本文術(shù)語“FcR”中。抗體可以是異種的、同種異體的或同基因的或其修飾形式(例如人源化的、嵌合的等)?？贵w還可是完全人抗體。本文所用術(shù)語“單克隆抗體”是指針對特定表位顯示單一結(jié)合特異性和親和力的抗體。因此，術(shù)語“人單克隆抗體”是指這樣的抗體，其顯示單一結(jié)合特異性并且具有來源于人種系或非種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)。在一個實施方案中，人單克隆抗體由包括B細(xì)胞的雜交瘤產(chǎn)生，所述B細(xì)胞獲自轉(zhuǎn)基因非人動物(例如轉(zhuǎn)基因小鼠)，其具有包含與永生化細(xì)胞融合的人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組。在本發(fā)明的一些實施方案中，對抗體或其片段進(jìn)行修飾以降低或消除潛在的糖基化位點。這類修飾抗體常被稱為“去糖基化”抗體。為了改進(jìn)抗體或其抗原結(jié)合片段的結(jié)合親和力，可通過例如誘變(例如定點誘變)來改變抗體的糖基化位點?！疤腔稽c”是指被真核細(xì)胞識別作為糖殘基連接位置的氨基酸殘基。糖(例如寡糖)所連接的氨基酸通常是天冬酰胺(N-聯(lián))、絲氨酸(0-聯(lián))和蘇氨酸(0-聯(lián))殘基。為了鑒定抗體或抗原-結(jié)合片段內(nèi)的潛在糖基化位點，通過例如利用可公開獲取的數(shù)據(jù)庫例如生物學(xué)序列分析中心(Center for Biological Sequence Analysis)提供的網(wǎng)站(對于預(yù)測N-聯(lián)糖基化位點，參見 http://www. cbs. dtu. dk/services/NetNGlyc/,對于預(yù)測 0_ 聯(lián)糖基化位點，參見http://www. cbs. dtu. dk/services/NetOGlyc/),對抗體的序列進(jìn)行檢查。用 于改變抗體的糖基化位點的其它方法描述于美國專利號6，350，861和5，714，350。此外，抗體糖基化可受其中產(chǎn)生抗體糖基化的細(xì)胞、抗體的構(gòu)象和細(xì)胞培養(yǎng)條件影響。本發(fā)明優(yōu)選的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是人細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。術(shù)語“人源化抗體”是指由來源于哺乳動物而非人的抗體CDR以及人抗體的FR區(qū)和恒定區(qū)組成的抗體。人源化抗體可用作治療劑的有效組分，因為在人體中人源化抗體的抗原性降低。在治療應(yīng)用的情況下，本發(fā)明的目的是設(shè)計人源化抗體的親和力降低的抗體。術(shù)語“重組抗體”包括所有通過重組方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體，例如(a)自動物(例如小鼠)(其免疫球蛋白基因為轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體的)或者由其制備的雜交瘤(在下文第I部分作進(jìn)一步描述)分離的抗體，(b)自經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達(dá)抗體的宿主細(xì)胞(例如轉(zhuǎn)染瘤)分離的抗體，(C)自重組的組合抗體文庫分離的抗體，和(d)通過任何其它方法(涉及將免疫球蛋白基因序列剪接成其它DNA序列)制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體。這類重組抗體具有來源于種系和/或非種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)。然而，在某些實施方案中，可對這類重組抗體進(jìn)行體外誘變(或當(dāng)使用動物(其對于Ig序列為轉(zhuǎn)基因的)時為體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，因此重組抗體Vh和\區(qū)的氨基酸序列是這樣的序列，雖然來源于人種系Vh和\序列以及與人種系V1^P \序列有關(guān)，但可能并非天然存在于體內(nèi)種系庫(repertoire)內(nèi)。術(shù)語“雙特異性單克隆抗體”是指其結(jié)合臂與兩種不同類型的抗原具有雙重特異性的單克隆抗體。雙特異性單克隆抗體不是天然存在的；其必須用重組DNA或細(xì)胞融合技術(shù)制備。用該方法，對于這類抗體可能同時與細(xì)胞毒性細(xì)胞(使用受體諸如CD3)和癌癥靶細(xì)胞(諸如CD19)結(jié)合，導(dǎo)致更有效地殺死靶癌細(xì)胞。本發(fā)明的目的是設(shè)計雙特異性單克隆抗體的親和力降低的抗體使得雙特異性抗體的一個或兩個臂可對抗原具有降低或消除的親和力。術(shù)語“KD”意欲指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數(shù)?？贵w對于單價表位的結(jié)合強(qiáng)度的量度稱為親和力。在某些情況下，抗體可與抗原形成多價相互作用。在這種情況下，抗體/抗原相互作用的表觀解離平衡常數(shù)可不同于單價解離常數(shù)。
親和力隨存在于抗體上的抗原結(jié)合部位和特異性抗原的抗原決定簇或表位之間的非共價鍵而變化。在典型情況下，抗體用于其特異性結(jié)合性質(zhì)，而且當(dāng)使用重組蛋白作為分析物，抗體作為配體，例如在BIAC0RE儀器中通過表面等離振子共振(SPR)技術(shù)測定時，抗體以約小于10_7 M、例如約小于10_8 M、10_9 M或10, M或甚至更低的親和力(Kd)結(jié)合，且與預(yù)定抗原結(jié)合的親和力是與非特異性抗原(例如BSA、酪蛋白)而非預(yù)定抗原或密切相關(guān)抗原結(jié)合的親和力的至少I. I倍、I. 2倍、I. 3倍、I. 4倍、I. 5倍、I. 6倍、I. 7倍、I. 8倍、
I.9 倍、2. 0 倍、2. 5 倍、3. 0 倍、3. 5 倍、4. 0 倍、4. 5 倍、5. 0 倍、6. 0 倍、7. 0 倍、8. 0 倍、9. 0 倍或10. 0倍或更多倍。短語“識別抗原的抗體”和“對抗原有特異性的抗體”在本文中與術(shù)語“與抗原特異性結(jié)合的抗體”互換使用。具有“降低的親和力”的抗體是指Kd約大于10_7M，例如是Kr7 M的約10倍、或100倍、或1000倍。本發(fā)明的目的是設(shè)計幾乎不與或不與抗原特異性結(jié)合的抗體。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體具有大于或等于約10_7的解離常數(shù)(Kd)。更優(yōu)選本發(fā)明的抗體具有大于或等于約10_6的解離常數(shù)(Kd)。最優(yōu)選本發(fā)明的抗體對限定的抗原無可檢測的特異性結(jié)合。
根據(jù)Ig類別，可以結(jié)合多達(dá)5個結(jié)構(gòu)分子以形成任一種抗體。在哺乳動物中，有5種Ig類別(IgG、IgM、IgA、IgD和IgE);在鳥類中，有3種類別(IgY、IgM和IgE)。在選定的哺乳動物中，因重鏈保守區(qū)中的多態(tài)性所致，IgG和IgA被進(jìn)一步細(xì)分成亞類，稱為同種型。術(shù)語“核酸分子”或“多核苷酸”意欲包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈的或雙鏈的，但優(yōu)選為雙鏈DNA。本發(fā)明還包括附圖中所示序列的“保守序列修飾”，包括核苷酸和氨基酸序列修飾，其不顯著影響或改變由所述核苷酸序列編碼的抗體或含有所述氨基酸序列的抗體的結(jié)合特性。這類保守序列修飾包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如定點誘變和PCR介導(dǎo)的誘變，將修飾引入附圖所示的序列中。保守氨基酸取代包括其中氨基酸殘基被具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基替換的取代。本領(lǐng)域已界定了具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有以下側(cè)鏈的氨基酸堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、￠-分支的側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，由本文公開的重鏈和輕鏈可變區(qū)核苷酸序列編碼的抗體和/或含有本文公開的重鏈和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列的抗體包括由經(jīng)保守修飾的類似序列編碼的基本類似抗體或含有經(jīng)保守修飾的類似序列的基本類似抗體。下面提供如何根據(jù)本文公開的序列(即重鏈和輕鏈可變區(qū))產(chǎn)生所述基本類似抗體的進(jìn)一步論述?？砂凑諛?biāo)準(zhǔn)技術(shù)使本發(fā)明的核酸組成突變，以得到基因序列。對于編碼序列，這些突變可按需要影響氨基酸序列。具體地說，預(yù)期基本同源于或來源于天然V、D、J、恒定、轉(zhuǎn)換區(qū)的DNA序列和本文所述的其它這類序列(其中“來源”表明序列與另一序列相同或自另一序列修飾)。以下分部更詳細(xì)地描述了本發(fā)明的各個方面。I.親和力降低的抗體本發(fā)明親和力降低的抗體是經(jīng)合理設(shè)計以消除或降低與抗原結(jié)合的抗體。現(xiàn)有優(yōu)選親和力降低的抗體是除CDR區(qū)以外在各方面都類似于野生型(天然)抗體的抗體，并且相對于野生型抗體幾乎沒有可辨別的三維結(jié)構(gòu)變化。示例性抗體是顯示與抗原的結(jié)合親和力降低10倍的抗體。優(yōu)選親和力降低的抗體與抗原結(jié)合，且與抗原的結(jié)合親和力降低100倍。更優(yōu)選親和力降低的抗體與抗原結(jié)合，且與抗原的結(jié)合親和力降低1000倍。最優(yōu)選親和力降低的抗體與抗原無顯著結(jié)合，并且相對于背景結(jié)合水平，檢測不到與抗原的特異性結(jié)合?？赏ㄟ^常用實驗方法包括表面等離振子共振，或放射性配體結(jié)合測定法，或流式細(xì)胞術(shù)，來測量親和力。在涉及使用抗體的許多體內(nèi)和體外應(yīng)用中，本發(fā)明親和力降低的抗體可用作其野生型(天然)對應(yīng)物(其保持與抗原的特異性結(jié)合)的對照試劑。可采用各種已知技術(shù)，例如重組DNA技術(shù)和其它標(biāo)準(zhǔn)分子和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)，來產(chǎn)生本發(fā)明親和力降低的抗體?？刹捎帽绢I(lǐng)域眾所周知的重組DNA技術(shù)和基因轉(zhuǎn)染方法，來制備重組的親和力逄低的抗體(Morrison, S. (1985) Science 229 :1202)。例如編碼序列、具有已知抗原特異 性的抗體編碼多核苷酸可通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)(例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增，并連接至表達(dá)載體(例如PME)中?？刹捎脴?biāo)準(zhǔn)定點誘變技術(shù)將突變引入表達(dá)載體，以破壞所編碼抗體的抗原結(jié)合?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知技術(shù)(例如磷酸鈣沉淀、電穿孔、脂轉(zhuǎn)染)，將編碼經(jīng)突變的抗體重鏈和輕鏈基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞(例如293T細(xì)胞、CHO-細(xì)胞)。在將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，細(xì)胞將開始產(chǎn)生突變抗體并將突變抗體分泌至培養(yǎng)基中?？赏ㄟ^例如鑒定和選擇表達(dá)突變抗體的細(xì)胞，來實現(xiàn)長期的大規(guī)?？贵w生產(chǎn)。可采用本領(lǐng)域已知技術(shù)從這些培養(yǎng)上清液和/或細(xì)胞中分離和純化重組抗體。或者，突變抗體可在其它表達(dá)系統(tǒng)或完整生物體中產(chǎn)生，或者可合成產(chǎn)生。在另一個實施方案中，親和力降低的抗體可作為嵌合抗體產(chǎn)生，其中將抗體重鏈和/或輕鏈的可變區(qū)與來自各種物種的恒定結(jié)構(gòu)域融合。另外，可按照標(biāo)準(zhǔn)方案例如公開于美國專利5，565，332的方案，制備人源化的親和力降低的抗體。在另一個實施方案中，可采用本領(lǐng)域已知技術(shù)，例如如美國專利5，565，332,5, 871，907或5，733，743中所述，將包含核酸分子的載體(其編碼特異性抗體鏈的多肽鏈與可復(fù)制基因展示包(replicable generic display package)組分的融合物)與含有編碼單一結(jié)合對成員的第二多肽鏈的核酸分子的載體之間的重組來產(chǎn)生抗體鏈?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)，例如采用描述于以下文獻(xiàn)的方法，來產(chǎn)生親和力降低的抗體Robinson等，國際專利公布號PCT/US86/02269 ;Akira等，歐洲專利申請 184, 187 ；Taniguchi, M.，歐洲專利申請 171, 496 ；Morrison 等，歐洲專利申請 173, 494 ；Neuberger 等，PCT 申請 WO 86/01533 ；Cabilly 等，美國專利號 4, 816, 567 ；Cabilly 等，歐洲專利申請 125,023 ；Better 等(1988) Science 240:1041-1043 ；Liu 等(1987) Proc.Natl. Acad. Sci. USA84:3439-3443 ;Liu 等(1987) J. Immunol. 139:3521-3526 ；Sun 等(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84:214-218 ；Nishimura 等(1987) CancerRes. 47:999-1005 ;Wood 等(1985) Nature 314:446-449 ;和 Shaw 等(1988) J. Natl.Cancer Inst. 80:1553-1559) ；Morrison, S. L. (1985) Science 229:1202-1207 ;0i等(1986) Biotechniques 4:214 ；ffinter 美國專利 5, 225, 539 ；Jones 等(1986) Nature321:552-525 ;Verhoeyan 等(1988) Science 239:1534 ；以及 Beidler 等(1988) J.Immunol. 141:4053-4060。在本發(fā)明的又另一個方面，部分或已知的抗體序列可用來產(chǎn)生和/或表達(dá)親和力降低的抗體。抗體主要通過位于6個重鏈和輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)的氨基酸殘基與靶抗原相互作用。為此，各個抗體間的CDR內(nèi)的氨基酸序列比CDR外的序列更加多樣化。因為CDR序列負(fù)責(zé)大部分抗體-抗原相互作用，所以可能通過構(gòu)建表達(dá)載體來表達(dá)模擬特異性抗體的性質(zhì)的重組抗體，所述載體包括植入來自具有不同性質(zhì)的不同抗體的構(gòu)架序列中的特異性抗體的 CDR 序列(參見例如 Riechmann, L.等，1998,Nature 332:323-327 ;Jones,P.等，1986, Nature 321:522-525 ;以及 Queen, C.等，1989, Proc. Natl. Acad. See. U.S.A.86:10029-10033)。所述構(gòu)架序列可獲自包括種系或非種系抗體基因序列的公共DNA數(shù)據(jù)庫。這些種系序列將不同于成熟的抗體基因序列，因為它們將不包括完全裝配的可變基因，其在B細(xì)胞成熟期間通過V(D) J連接而形成。種系基因序列也可在均勻跨可變區(qū)的各處不同于高親和力二級庫抗體的序列。例如，體細(xì)胞突變在構(gòu)架區(qū)的氨基端部分相對稀少。例如，體細(xì)胞突變在構(gòu)架區(qū)I的氨基端部分和在構(gòu)架區(qū)4的羧基端部分相對稀少。此外，許多體細(xì)胞突變不顯著改變抗體的結(jié)合性質(zhì)。為此，不必要獲得特定抗體的完整DNA序列以產(chǎn) 生具有類似于原始抗體的結(jié)合性質(zhì)的完整重組抗體(參見1999年3月12日提交的PCT/US99/05535)。對于此目的，跨越⑶R區(qū)的部分重鏈和輕鏈序列通常就足夠。使用部分序列以確定哪個種系和/或非種系可變和連接基因區(qū)段對重組的抗體可變基因產(chǎn)生影響。然后使用種系和/或非種系序列填補(bǔ)可變區(qū)的缺失部分。重鏈和輕鏈前導(dǎo)序列在蛋白質(zhì)成熟期間被切割，且不會對最終抗體的性質(zhì)產(chǎn)生影響。為了加入缺失序列，通過連接或PCR擴(kuò)增將克隆的cDNA序列與合成寡核苷酸聯(lián)合?；蛘撸麄€可變區(qū)可合成為一組短的重疊寡核苷酸，并通過PCR擴(kuò)增聯(lián)合以產(chǎn)生全部合成的可變區(qū)克隆。該方法具有某些優(yōu)勢，例如消除或包括特定的限制位點，或使特定的密碼子最優(yōu)化。該方法還可用來篩選一種物種(例如人)中特定免疫球蛋白編碼序列的文庫，以設(shè)計來自另一種物種(例如小鼠)中的已知抗體序列的同族(cognate)免疫球蛋白編碼序列。來自雜交瘤的重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)錄物的核苷酸序列用來設(shè)計一組重疊的合成寡核苷酸，以產(chǎn)生具有與天然序列相同的氨基酸編碼能力的合成V序列。合成重鏈和K鏈序列可在三個方面不同于天然序列重復(fù)核苷酸堿基的串(string)被間斷以利于寡核苷酸合成和PCR擴(kuò)增；按照Kozak規(guī)則摻入最適翻譯起始位點(Kozak，1991，J. Biol. Chem.);及在翻譯起始位點上游對限制位點進(jìn)行改造。對于重鏈和輕鏈可變區(qū)兩者，最優(yōu)化編碼鏈序列和相應(yīng)的非編碼鏈序列大致在相應(yīng)的非編碼寡核苷酸的中點分解成30-50個核苷酸。因此，對于每條鏈，寡核苷酸可裝配成為跨越150-400個核苷酸區(qū)段的重疊雙鏈組。該庫(pool)然后用作模板以產(chǎn)生150-400個核苷酸的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。通常，單一可變區(qū)寡核苷酸組可被分解成2個庫，將其單獨擴(kuò)增以產(chǎn)生產(chǎn)兩個重疊的PCR產(chǎn)物。然后，通過PCR擴(kuò)增使這些重疊產(chǎn)物聯(lián)合以形成完整的可變區(qū)。亦可期需的是，在PCR擴(kuò)增中包括重鏈或輕鏈恒定區(qū)的重疊片段以產(chǎn)生可容易地克隆至表達(dá)載體構(gòu)建體的片段。然后，將重新構(gòu)建的重鏈和輕鏈可變區(qū)與克隆啟動子、前導(dǎo)序列、翻譯起始序列、前導(dǎo)序列、恒定區(qū)、3’未翻譯序列、聚腺苷酸化序列和轉(zhuǎn)錄終止序列聯(lián)合以形成表達(dá)載體構(gòu)建體。可將重鏈和輕鏈表達(dá)構(gòu)建體并入單一載體中，共轉(zhuǎn)染、依次轉(zhuǎn)染或單獨轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞，然后使其融合形成表達(dá)兩條鏈的宿主細(xì)胞。用于該用途的質(zhì)粒是本領(lǐng)域已知的，包括下面的實施例部分提供的質(zhì)粒。可以構(gòu)建類似的質(zhì)粒用于表達(dá)其它重鏈同種型，或用于表達(dá)包含、輕鏈的抗體。本發(fā)明的抗體因此還包括來自不同物種的抗體的各種同種型(IgG、IgE、IgA、IgM和IgD)。在本發(fā)明的又另一個方面，可采用噬菌體和/或酵母展示技術(shù)，產(chǎn)生親和力降低的抗體。例如，具有已知抗原特異性的抗體重鏈(VH)和輕鏈(VL)的可變區(qū)可融合為單鏈Fv片段，并在噬菌體和/或酵母表面上展示。展示這類scFv可對其靶抗原顯示強(qiáng)的結(jié)合活性。可在Fv片段的一個或多個CDR上進(jìn)行隨機(jī)誘變，從而構(gòu)建噬菌體文庫?？舍槍Σ辉亠@示抗原結(jié)合的克隆對文庫進(jìn)行選擇，從而鑒定消除或降低抗原結(jié)合的CDR突變。親和力降低的抗體的抗原特異性的降低和/或消除的驗證可采用本領(lǐng)域已知方法進(jìn)行。可用于驗證抗原結(jié)合降低的技術(shù)包括例如FAC分析、免疫印跡法、競爭結(jié)合測定法、免疫組織化學(xué)和表面等離振子共振技術(shù)。可通過例如分析抗原表面上的氨基酸與抗體 CDR區(qū)中的氨基酸之間的相互作用，來鑒定負(fù)責(zé)抗原和抗體之間相互作用的氨基酸(結(jié)合氨基酸)。這些相互作用的性質(zhì)可分為3大類，范德華力、氫鍵和鹽橋。在抗原決定簇和⑶R氨基酸側(cè)鏈之間最常形成相互作用，但氫鍵也可能受抗原決定簇和CDR氨基酸側(cè)鏈之間的水分子介導(dǎo)。最頻繁參與范德華力相互作用的CDR氨基酸包括Ala、Phe、Ile、Leu、ASn、Pr0、Gin、Val、Trp和Tyr。最常形成鹽橋的⑶R氨基酸包括Asp、Glu、Arg和Lys。最常參與氫鍵相互作用的⑶R氨基酸包括Asp、Glu、His、Lys> Arg、Ser和Tyr。參與抗原相互作用的CDR氨基酸的分析顯示這樣的模式，其中某些氨基酸比其它氨基酸更可能參與抗體/抗原相互作用。通過CDR區(qū)內(nèi)特定氨基酸的定點誘變(突變)，或者通過分析抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)(x-tal)，來測定結(jié)合氨基酸/抗原相互作用。用于該分析的抗體列于表I中。表I.用于抗體/抗原相互作用分析的抗體
ImI抗原I方法—
0KT31_CD3_X-tal
23C32骨橋蛋白X - tal
5c83CD154X-tal
7G104白介素-23X-tal
B13I25_蚯蚓肌紅蛋白C-螺旋肽突變
Fab4-4-205 單鏈 DNA突變
FabDl. 35 雞卵溶菌酶突變
H576CD8X-tal
HyHEL-IO5 雞卵溶菌酶突變
HyHEL-55 雞卵溶菌酶突變
K411B7 _阿特拉津突變
McPC6035 _磷酸膽堿突變
Rituxan8CD20X-tal
YTS1569|CD8|x-tal
I. Crystal structure of the human T cell receptor CD3 epsilon gammaheterodimer complexed to the therapeutic mAb OKT3 (與治療性 mAb OKT3 復(fù)合的人T 細(xì)胞受體 CD3 e y 異二聚體的晶體結(jié)構(gòu)) Kjer-Nielsen L, Dunstone MA, KostenkoL, Ely LK, Beddoe T, Mifsud NA, Purcell AW, Brooks AG, McCluskey J, Rossjohn J.(2004) Proc Natl Acad Sci USA. 101:7675-7680。
2. Molecular basis of recognition of human osteopontin by 23C3， apotential therapeutic antibody for treatment of rheumatoid arthritis (—種潛在用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療性抗體23C3識別人骨橋蛋白的分子基礎(chǔ)).Du J, HouS，Zhong C，Lai Z, Yang H，Dai J, Zhang D, Wang H，Guo Y，Ding J. (2008) J MolBiol. 382:835-842。3. Structure of CD40 ligand in complex with the Fab fragment of aneutralizing humanized antibody (與中和人源化抗體的Fab片段復(fù)合的⑶40配體的結(jié)構(gòu))o Karpusas M, Lucci J, Ferrant J, Benjamin C， Taylor FR， Strauch K， GarberE, Hsu YM. (2001) Structure. 4;9:321-329。4. Crystal structures of the pro-inflammatory cytokine interleukin-23and its complex with a high-affinity neutralizing antibody (促炎細(xì)胞因子白介素-23及其與高親和力中和抗體的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)).Beyer BMj IngramR, Ramanathan L, Reichert P，Le HVj Madison V，Orth P. (2008) J Mol Biol. 382:942-955。5. Structure, function and properties of antibody binding sites (抗體結(jié)合部位的結(jié)構(gòu)、功能和性質(zhì)) Mian IS, Bradwell AR，Olson AJ. (1991) J Mol Biol.217:133-151。6. Atomic structure of an alphabeta T cell receptor (TCR) heterodimerin complex with an anti-TCR fab fragment derived from a mitogenic antibody (與來源于促有絲分裂抗體的抗TCR fab片段的復(fù)合的a ^ T細(xì)胞受體(TCR)異二聚體的原子結(jié)構(gòu))。Wang J, Lim K，Smolyar A，Teng M, Liu J, Tse AG，Liu J, Hussey RE, ChishtiY， Thomson CTj Sweet RMj Nathenson SG， Chang HCj Sacchettini JCj Reinherz EL(1998) EMBO J. 17:10-26。7. Mapping of a hapten-binding site: molecular modeling andsite-directed mutagenesis study of an anti-atrazine antibody (半抗原-結(jié)合部位的作圖抗阿特拉津抗體的分子建模和定點誘變研究).Kusharyoto W，Pleiss JjBachmann TTj Schmid RD. Protein Eng. (2002) 15:233-41。8. Structural basis for recognition of CD20 by therapeutic antibodyRituximab (治療性抗體利妥昔單抗識別⑶20的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)).Du J, Wang H，Zhong C，Peng B，Zhang Mj Li B，Huo S，Guo Y，Ding J. (2007) J Biol Chem. 282:15073-80。9. The Crystal Structure of CD8 in Complex with YTS156. 7. 7 Fab andInteraction with Other CD8 Antibodies Define the Binding Mode of CD8 alphabetato MHC Class I (與YTS156. 7. 7 Fab復(fù)合的⑶8晶體結(jié)構(gòu)和與其它⑶8抗體的相互作用限定 CD8 a 0 與MHC I 類的結(jié)合方式) Shore DA, Issafras H，Landais E, Teyton LjWilson IA. (2008) J Mol. Biol.待發(fā)表?？贵w/抗原相互作用的分析顯示，Tyr更頻繁地與抗原決定簇相互作用，占全部相互作用的約四分之一，接著是Ser，其負(fù)責(zé)相互作用的約14% (表2，圖2)。與Asn和Glu —起，這些4種氨基酸占全部接觸的一半以上(56%)?？乖佑|性CDR氨基酸的這類偏倚允許產(chǎn)生用于鑒定最可能與抗原決定簇相互作用的CDR氨基酸的算法。簡單地說，根據(jù)本領(lǐng)域已知的和上文描述的方法來鑒定CDR區(qū)。對于具有已知晶體結(jié)構(gòu)的抗體，可對結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析以確定接觸抗原決定簇的CDR殘基。對于其結(jié)構(gòu)未知或無法獲得的抗體，可根據(jù)表2和圖3所示頻率，確定可能參與抗原相互作用的CDR殘基。可通過 改變在能夠結(jié)合抗原的抗體中參與抗體/抗原接觸的一個或多個氨基酸(結(jié)合氨基酸)，來產(chǎn)生本發(fā)明親和力降低的抗體?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的或本文描述的任何技術(shù)，包括但不限于晶體結(jié)構(gòu)分析和氨基酸接觸頻率統(tǒng)計數(shù)據(jù)應(yīng)用(表2和圖3)，來鑒定結(jié)合氨基酸。在一些實施方案中，至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、
19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個結(jié)合氨基酸被改變。在一些實施方案中，至少10%、25%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%的結(jié)合氨基酸被改變?？刹捎闷茐慕Y(jié)合氨基酸與抗原形成接觸的能力的任何方法，包括但不限于用非結(jié)合氨基酸替換結(jié)合氨基酸和/或使結(jié)合氨基酸缺失，來進(jìn)行結(jié)合氨基酸的改變。可通過結(jié)合氨基酸(其破壞結(jié)合氨基酸接觸抗原的能力)上游或下游氨基酸序列的缺失、替換或插入，來改變結(jié)合氨基酸。表2.⑶R氨基酸接觸性抗原決定簇的頻率。
權(quán)利要求
1.一種用于產(chǎn)生具有降低的結(jié)合能力的抗體或抗體片段的方法，所述方法包括以下步驟 a)獲得靶抗原的信息； b)合理鑒定抗體或抗體片段內(nèi)能夠與靶抗原相互作用的一個或多個結(jié)合氨基酸； c)改變抗體或抗體片段內(nèi)一個或多個結(jié)合氨基酸序列使得所得抗體或抗體片段具有降低的結(jié)合抗原的能力；和 d)測試經(jīng)改變的抗體或抗體片段與靶抗原的結(jié)合親和力，使得經(jīng)改變的抗體或抗體片段具有降低的與抗原結(jié)合的能力。
2.一種用于產(chǎn)生具有降低的特異性結(jié)合能力的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的方法，所述方法包括以下步驟 a)從重鏈或輕鏈可變區(qū)、CDR多肽序列內(nèi)鑒定CDR多肽序列中能夠與抗原相互作用的至少一個氨基酸；和 b)改變CDR多肽的氨基酸序列，以降低或消除與抗原的相互作用。
3.權(quán)利要求2的方法，其中CDR多肽序列中的氨基酸改變通過用非相互作用的氨基酸替換至少一個氨基酸來進(jìn)行。
4.權(quán)利要求2的方法，其中一個氨基酸與抗原之間的相互作用是選自以下的分子吸引力氫鍵、弱的共價相互作用、極性力、非極性力、鹽橋和范德華力。
5.權(quán)利要求2的方法，其中所述CDR多肽序列中的氨基酸選自天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、組氨酸和谷氨酰胺。
6.權(quán)利要求2的方法，其中所述CDR多肽序列中的氨基酸選自酪氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、色氨酸、精氨酸、苯丙氨酸和甘氨酸。
7.權(quán)利要求3的方法，其中所述非相互作用的氨基酸選自丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述非相互作用的氨基酸是丙氨酸。
9.權(quán)利要求2的方法，其中鑒定相互作用的氨基酸的步驟通過分析描述CDR多肽序列和抗原之間的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)來進(jìn)行。
10.權(quán)利要求2的方法，其中所述CDR多肽序列位于抗體或抗體片段內(nèi)。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述抗體或抗體片段選自 (a)完整的免疫球蛋白分子； (b)scFv ； (c)Fab 片段; (d)Fab，片段； (e)F(abf )2 ； (f)Fv ； (g)Fd片段；和 (h)二硫鍵連接的Fv。
12.權(quán)利要求10的方法，所述方法還包括驗證抗原結(jié)合喪失的步驟。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述驗證步驟通過FACS、ELISA或放射免疫測定法實現(xiàn)。
14.權(quán)利要求10的方法，其中所述抗體具有大于或等于約10_7的近似解離常數(shù)(Kd)。
15.權(quán)利要求10的結(jié)合能力降低的抗體。
16.一種用于產(chǎn)生具有降低的結(jié)合能力的抗體或抗體片段的方法，所述方法包括以下步驟 a)從抗體或抗體片段內(nèi)鑒定能夠與抗原相互作用的至少一個氨基酸；和 b)改變抗體或抗體片段的氨基酸序列，以降低或消除與抗原的相互作用。
17.權(quán)利要求16的方法，其中抗體或抗體片段中的氨基酸改變通過用非相互作用的氨基酸替換至少一個氨基酸來進(jìn)行。
18.權(quán)利要求16的方法，其中一個氨基酸與抗原之間的相互作用是選自以下的分子吸引力氫鍵、弱的共價相互作用、極性力、非極性力、鹽橋和范德華力。
19.權(quán)利要求16的方法，其中所述抗體或抗體片段中的氨基酸選自天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、組氨酸和谷氨酰胺。
20.權(quán)利要求16的方法，其中所述抗體或抗體片段中的氨基酸選自酪氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、色氨酸、精氨酸、苯丙氨酸和甘氨酸。
21.權(quán)利要求17的方法，其中所述非相互作用的氨基酸選自丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述非相互作用的氨基酸是丙氨酸。
23.權(quán)利要求16的方法，其中所述鑒定相互作用氨基酸的步驟通過分析描述抗體或抗體片段與抗原之間的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)來進(jìn)行。
24.權(quán)利要求16的方法，所述方法還包括驗證抗原結(jié)合喪失的步驟。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述驗證步驟通過FACS、ELISA或放射免疫測定法實現(xiàn)。
26.權(quán)利要求16的方法，其中所述抗體或抗體片段具有大于或等于約10_7的近似解離常數(shù)(Kd)。
27.權(quán)利要求16的方法，其中所述抗體或抗體片段選自 (a)完整的免疫球蛋白分子； (b)scFv ； (c)Fab 片段; (d)Fab，片段； (e)F(abf )2 ； (f)Fv ； (g)Fd片段；和 (h)二硫鍵連接的Fv。
28.權(quán)利要求16的結(jié)合能力降低的抗體或抗體片段。
全文摘要
本發(fā)明提供用于制備合理設(shè)計的親和力降低的新抗體的方法。本發(fā)明的方法制備這樣的抗體，其具有設(shè)計成在不改變總體三維抗體結(jié)構(gòu)的情況下降低或消除親代抗體的抗原結(jié)合活性的可變結(jié)構(gòu)域。使用在不同測定法中采用本發(fā)明方法制備的抗體允許研究人員將特異性抗原-抗體相互作用產(chǎn)生的作用與其它非特異性抗體作用區(qū)分。
文檔編號C07K16/28GK102971342SQ201180017079
公開日2013年3月13日 申請日期2011年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月28日
發(fā)明者張秀青 申請人:Ab生物科學(xué)公司