用于檢測和測定連翹苷的抗體、方法和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及小分子半抗原的抗體及其制備方法與應(yīng)用，特別是涉及連翹苷及其衍 生物的抗體及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 本發(fā)明涉及用于檢測和定量連翹苷的方法和試劑盒，以及其中使用的半抗原、免 疫原、偶聯(lián)物（conjugate)和抗體。
[0003] 其中"檢測"是指定性分析物質(zhì)是否存在。
[0004] 其中"測定"是指對物質(zhì)進行定量分析。
[0005] 連翹苷，來源于木犀科植物連翹的干燥果實的提取物。
[0006] 分子式：C27H340n 分子量：534. 56
[0007] 連翹苷屬于雙環(huán)氧木脂素類化合物的葡萄糖苷，熔點184°C~185°C。
[0008] 研究表明，連翹苷顯示多種生物學(xué)活性和藥理作用。具有具有抗炎解熱，抗氧化， 降血脂，保肝及神經(jīng)保護等多種藥理活性。
[0009] 目前建立了多種連翹苷的定性與定量檢測和測定分析方法，如薄層層析法、HPLC 法，HP LC-MS法等。其中最常用的方法是高效液相色譜法。但含連翹苷的生物樣品（包括 血漿、尿、唾液等）含有大量的影響含量測定的蛋白質(zhì)及內(nèi)源性物質(zhì)；同時連翹苷可能呈結(jié) 合狀態(tài)，必須經(jīng)過處理，排除內(nèi)源性雜質(zhì)和代謝物的干擾，使結(jié)合狀態(tài)的連翹苷游離后才能 測定；同時還需要濃縮以滿足儀器檢測靈敏度的要求，處理程序復(fù)雜，費時費力；另外由于 連翹苷進入體內(nèi)后，組織中的分布是極其微量的，即使經(jīng)過富集，進行含量測定仍是極其困 難的。最后，對于連翹苷在靶器官和組織中分布，以及細胞和亞細胞定位的研究，需要通過 免疫組織化學(xué)和westblot等方法，但由于缺乏連翹苷的抗體，阻礙了此方面的研究。因此， 有必要開發(fā)出一種用于檢側(cè)和測定生物樣品中連翹苷的方法，對闡明相關(guān)藥材或復(fù)方的作 用機理，以及其體內(nèi)分布和代謝研究，將具有特別的價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的半抗原連翹苷可提供確定的結(jié)構(gòu)性抗原決定部位，但是它本身并不具備 免疫原性，因此必須要偶聯(lián)到適宜的賦予抗原性的載體物質(zhì)上，這樣所形成的免疫原才會 在注射到宿主動物體內(nèi)后誘發(fā)免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明提供一種如下結(jié)構(gòu)的免疫原：
[0011]
[0012] 其中R是0至6個碳的烷基橋（連接半抗原與載體物質(zhì)的橋），優(yōu)選R = 0,即PI 直接與連翹苷氧化后的醛基結(jié)合，或R是C1-C6取代或未取代的、直鏈或支鏈的、飽和或不 飽和的亞烷基，更優(yōu)選R是C1-C4未取代的、直鏈的、飽和的亞烷基。
[0013] P1是賦予抗原性的載體物質(zhì)。載體物質(zhì)選自蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片合成的多肽或半 合成的多肽。其中蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段選自白蛋白、血清蛋白、球蛋白、目鏡蛋白和脂蛋白， 優(yōu)選為牛血清白蛋白、卵清蛋白、牛丙種球蛋白、甲狀腺素結(jié)合球蛋白、鎖眼形血藍蛋白 (keyhole limpet haemocyanin，KLH)，更優(yōu)選自鎖眼形血藍蛋白或牛血清蛋白（BSA)。合 成多肽或半合成多肽是具有足夠數(shù)量的可利用氨基的合成聚氨基酸，優(yōu)選多聚賴氨酸。合 成或天然聚合物是帶有反應(yīng)官能基的聚合物材料，特別是能夠結(jié)合到半抗原產(chǎn)生免疫原的 碳水化合物、酵母或多糖。
[0014] 半抗原的制備本發(fā)明描述了半抗原連翹苷的糖苷結(jié)構(gòu)中的兩個鄰羥基經(jīng)過過 碘酸鈉氧化為醛基從而與載體物質(zhì)發(fā)生的偶聯(lián)作用，產(chǎn)生免疫原。偶聯(lián)物成功制備并純化 后分別經(jīng)質(zhì)譜（MS)和核磁共振氫譜和碳譜（1HNMR和13CNMR)確證。
[0015] 免疫原的合成本發(fā)明的半抗原和蛋白質(zhì)載體的連接可使用本領(lǐng)域己知的任何 連接方式。例如過碘酸鹽氧化法等。采用過碘酸氧化法制備免疫原時，是將5毫克的半抗 原連翹苷溶解在lml 20%甲醇中，加入含有8毫克的過碘酸鈉溶液1毫升，室溫下反應(yīng)一個 小時，緩慢滴加到10_20mg/mL的牛血清蛋白碳酸鹽緩沖溶液中，攪拌反應(yīng)6小時，裝入透析 袋，分別用蒸餾水和〇. Olmol/L的CBS緩沖溶液透析3-5d，分裝保存于-20°C的冰箱中。
[0016] 合成免疫原的分析方法為了確認載體物質(zhì)上結(jié)合有適當(dāng)?shù)陌肟乖?，在免疫前?使用紫外分光度法或矩陣輔助紫外激光解析/電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS)對每個 免疫原進行評估。連翹苷免疫原反應(yīng)物和產(chǎn)物的吸收峰相比（200nm-400nm)，可判斷是否偶 合，并根據(jù)反應(yīng)物和產(chǎn)物的摩爾吸光系數(shù)計算偶聯(lián)物與半抗原的比例。
[0017] 使用voyager STR生物分光度測量方法研究站激光解析質(zhì)譜與延遲萃取結(jié)合進行 MALDI-T0F質(zhì)譜。將每個要分析的等分試樣在0. 1%的三氟乙酸水溶液中稀釋制成lmg/ml 的試樣溶液。使用芥子酸基質(zhì)和牛血清白蛋白作為外標(biāo)分析等分試樣（luL)。
[0018] 對于優(yōu)選的載體物質(zhì)，牛血清白蛋白或KLH而言，優(yōu)選半抗原與蛋白質(zhì)的結(jié)合比 為 6-15 : 1。
[0019] 第二方面，免疫檢測時需要將連翹苷與標(biāo)記試劑進行偶合。因此，本發(fā)明提供一種 如下結(jié)構(gòu)的偶合物；
[0020]
[0021 ] 其中R是0至6個碳的烷基，P2是可檢測的標(biāo)記試劑，標(biāo)記試劑選自酶、發(fā)光物質(zhì)、 放射性物質(zhì)或它們的混合物，更優(yōu)選地標(biāo)記試劑是過氧化物酶。最優(yōu)選地標(biāo)記試劑是辣根 過氧化物酶（HRP)。發(fā)光物質(zhì)選自生物發(fā)光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)或熒光物質(zhì)。
[0022] 偶合物的合成本發(fā)明的半抗原和蛋白質(zhì)載體的連接可使用本領(lǐng)域己知的任何 連接方式。例如過碘酸鹽氧化法等。采用過碘酸氧化法制備免疫原時，是將5毫克的半抗 原連翹苷溶解在lml 20%甲醇中，加入含有8毫克的過碘酸鈉溶液1毫升，室溫下反應(yīng)一 個小時，離心，取上清液加入到10-20mg/mL的牛血清蛋白碳酸鹽緩沖溶液中，攪拌反應(yīng)6小 時，裝入透析袋，分別用蒸餾水和0.0 lmol/L的CBS緩沖溶液透析3-5d，分裝保存于-20°C 的冰箱中。
[0023] 另一方面，本發(fā)明涉及對于本發(fā)明第一方面的免疫原產(chǎn)生的抗體，這些抗體能夠 至少與一個連翹苷結(jié)構(gòu)上的表位結(jié)合，優(yōu)選與完整的連翹苷結(jié)構(gòu)表位相結(jié)合，該抗體是多 克隆的，或是單克隆的，優(yōu)選為單克隆抗體，且具有對連翹苷的特異性的抗體。
[0024] 免疫檢測時要將該抗體固定在支撐底物上。優(yōu)選地，該方法進一步包括將所述血 清抗體固定到支撐底物上，優(yōu)選固體支持物，最優(yōu)選聚苯乙烯固體支持物。
[0025] 本發(fā)明進一步提供一種制備抗體的方法，該方法包含通過重復(fù)給予根據(jù)本發(fā)明的 連翹苷的免疫原免疫動物，優(yōu)選脊稚動物，最優(yōu)選哺乳動物，并收集從免疫動物得到的血清 的步驟。
[0026] 另一方面，本發(fā)明包括在試樣中檢測或測定連翹苷的方法，該方法包括用本發(fā)明 的偶合物或其混合物和本發(fā)明的抗體或其混合物接觸試樣；檢測或測定結(jié)合的綴合物的數(shù) 量；并且從標(biāo)準(zhǔn)曲線推斷試樣中連翹苷的的存在或數(shù)量。
[0027] 另一方面，本發(fā)明還描述了如何將針對這種免疫原產(chǎn)生的抗體用于開發(fā)可用來檢 測和測定連翹苷的存在的通用分析方法和相應(yīng)的試劑盒。該試劑盒包括用本發(fā)明的偶合 物或其混合物和本發(fā)明的抗體或其混合物，同時該試劑盒可以任意地包括應(yīng)用所述綴合物 和所述抗體在試樣中檢測或測定連翹苷的指導(dǎo)。優(yōu)選地，試樣是溶液，如生物流體。更優(yōu)選 地，試樣是血清或尿。在本發(fā)明的方法和試劑盒中，首選各自不同的交聯(lián)劑（免疫原的和偶 合物的）。
[0028] 另一方面，本發(fā)明包括使用本發(fā)明的偶合物或其混合物和本發(fā)明的抗體或其混合 物在試驗試樣如生物流體中檢測或測定連翹苷。
[0029] 為了產(chǎn)生多克隆抗血清，將免疫原與Freund佐劑混合，并且將混合物注射入宿主 動物體內(nèi)，如兔、羊、鼠或馬。進一步注射（加強）并取血清試樣評價抗體滴度。達到最佳 滴度時，隨后將宿主動物放血得到適當(dāng)體積的特異性的抗血清。要求的抗體純化水平視計 劃的應(yīng)用而定。對于許多目的，根本不需要純化，但是，在其它情況下，例如抗體固定在固體 載體上，純化步驟能夠除去不想要的物質(zhì)和除去非特異性的結(jié)合。本發(fā)明特異性抗體作為 試劑在免疫試驗中用于測定或檢測生物流體中的連翹苷的含量是需要純化的。
[0030] 單克隆抗體的制備本發(fā)明所述單克隆抗體是指獲自基本上同源的抗體群的抗 體，即組成該群體的抗體個體都相同，除了可能存在少量可能的自發(fā)突變。
[0031] 本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員己知的各種技術(shù)進行制備。例如，本 發(fā)明完全抗原，可被施用于動物以誘導(dǎo)單克隆抗體的產(chǎn)生。對于單克隆抗體，可利用雜交 瘤技術(shù)來制備或可用重組DNA法制備。骨髓瘤細胞可選鼠類的骨髓瘤細胞系，包括衍生自 M0PC-21和MPC-11小鼠腫瘤的骨髓瘤細胞系以及SP-2/0、ΝΖ0或X63-Ag8-653細胞，以及 人骨髓瘤和小鼠-人雜合骨髓瘤細胞系。
[0032] 對雜交瘤細胞生長于其中的培養(yǎng)基進行分析以檢測具有所需特異性的單克隆抗 體的產(chǎn)生，如通過體外結(jié)合分析，例如酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA)或放射免疫分析（RIA)。 表達抗體的細胞的位置可用FACS進行檢測。然后，可將雜交瘤克隆通過有限