鑒定親和力成熟的人類抗體的制作方法
【專利摘要】從一個核酸文庫中鑒定抗原特異性免疫球蛋白V區(qū)，該核酸文庫是通過使用了前導(dǎo)序列特異性正向引物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)而擴(kuò)增的。使用前導(dǎo)序列引物允許擴(kuò)增所有的V區(qū)序列（包括具有大量5’末端突變的那些），而沒有丟失原始的5’V區(qū)基因區(qū)段序列?？梢允褂帽还こ袒癁楸磉_(dá)所擴(kuò)增的V區(qū)編碼核酸的真核細(xì)胞或使用細(xì)菌噬菌體展示技術(shù)，針對抗原特異性V區(qū)對這些文庫進(jìn)行篩選。在后者情況下，使用比常規(guī)組的5’V區(qū)引物更大的引物制備一個第二V區(qū)文庫。經(jīng)由這種方法通過以下方式修正被引入這些擴(kuò)增產(chǎn)物中的序列錯誤：使用在通過這些V區(qū)引物所擴(kuò)增的產(chǎn)物中獲得的序列信息，以篩選使用這些前導(dǎo)序列引物創(chuàng)建的文庫。來自供體免疫球蛋白的片段的氨基酸序列信息可以用于輔助對編碼了供體抗體的重鏈和輕鏈的核酸的鑒定，以及用于設(shè)計用來擴(kuò)增此類核酸的引物。
【專利說明】鑒定親和力成熟的人類抗體
相關(guān)申請的交叉引用
[0001]本申請要求于2011年7月12日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/506，749的優(yōu)先權(quán)。
序列表
[0002]本申請包含已經(jīng)經(jīng)由EFS-Web以ASCII格式提交的序列表,并且特此將其通過引用以其全文結(jié)合。創(chuàng)建于2012年7月12日的所述ASCII副本名稱為54070121.txt并且大小是40，628字節(jié)。
發(fā)明領(lǐng)域
[0003]本發(fā)明總體上涉及免疫學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及用于鑒定包含體細(xì)胞高變的“親和力成熟的”人類抗體(Ab)的方法、組合物、以及試劑盒。
進(jìn)旦 冃月^
[0004]縱觀19世紀(jì)和20世紀(jì)，科學(xué)家和醫(yī)師夢想能夠定制設(shè)計對單個的生物靶標(biāo)具有高度特異性的治療劑。通過選擇性地攻擊疾病同時不傷害健康組織，這些“魔彈”被認(rèn)為是理想的治療劑。然而，直到20世紀(jì)70年代早期，當(dāng)Kohler (科勒)和Milstein (米爾斯坦)(Nature (《自然》)256:495，1975)研發(fā)了用于制備抗原(Ag)特異性單克隆抗體(mAb)的開創(chuàng)性方法時，才開始實現(xiàn)這個夢想。這也許是現(xiàn)代免疫學(xué)歷史中最重大的事件之一。使用這種新途徑，研發(fā)了眾多具有數(shù)千億美元的組合市場的研究、診斷產(chǎn)品、以及治療產(chǎn)品。
[0005]在Kohler (科勒)和Milstein (米爾斯坦)的方法中，各自表達(dá)一種獨特的免疫球蛋白(Ig)(即，mAb)的嚙齒動物B細(xì)胞通過與骨髓瘤細(xì)胞融合而得以永生化。這些分泌mAb的“雜交瘤”的無限復(fù)制的能力允許那些產(chǎn)生具有對給定Ag的高親和力的mAb的雜交瘤被選為用于產(chǎn)生大量相同的mAb的引擎。由該方法制備的mAb最終被用作人類治療劑。盡管有效，但是很快發(fā)現(xiàn)使用治療性嚙齒動物mAb不太理想，因為在多次給予之后，它們誘導(dǎo)抗嚙齒動物Ig免疫反應(yīng)，這中和了 mAb的活性并且經(jīng)常在受治療的患者中引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)。
[0006]因此，通過將人類B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，嘗試了改編Kohler (科勒)和Milstein (米爾斯坦)的嚙齒動物方法來制備人類mAb。由于許多不同的原因，這種“人類雜交瘤”技術(shù)證明比預(yù)期的更加具有挑戰(zhàn)性。首先，由于道德或醫(yī)學(xué)原因，通常難于通過反復(fù)地用Ag免疫人類受試者來增加Ag特異性B細(xì)胞的頻率。第二，還是由于道德或醫(yī)學(xué)原因，如在嚙齒動物中所進(jìn)行的那樣來分離人類脾臟組織以獲得B細(xì)胞是不切實際的。第三，永生化的產(chǎn)生mAb的人類細(xì)胞系不易于建立并且傾向于產(chǎn)生非常少的mAb。以及第四，因為人類免疫球蛋白多樣性、或單獨的Ab特異性的譜比嚙齒動物的譜高得多(~IO12對比~1O7單獨的特異性)，并且因為在給定的取樣中，采用的篩選方法被局限于不大于約IO4特異性，所以分離具有所希望的特異性的人類的分泌mAb的細(xì)胞在技術(shù)上難得多。通過這一技術(shù)鑒定具有低頻率特異性的mAb因此仍是一個令人生畏的、“大海撈針式”的努力。
[0007]與“人類雜交瘤”方法的研發(fā)相平行，科學(xué)家還開始嘗試通過用來自人類抗體的那些氨基酸序列替代不同的嚙齒動物氨基酸序列來“人源化”嚙齒動物抗體。在一個典型的應(yīng)用中，將鼠科Ig可變區(qū)與人類恒定結(jié)構(gòu)域結(jié)合，或?qū)⑹罂苹パa(bǔ)決定區(qū)(CDR)嫁接到人類Ig構(gòu)架上。將這種新的重組核酸構(gòu)建體插入被轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞中的表達(dá)載體中，當(dāng)培養(yǎng)時，這些宿主細(xì)胞可以產(chǎn)生大量的嵌合mAb。盡管這種技術(shù)已經(jīng)為改善mAb在治療應(yīng)用的有用性做出了很多(通過減少人類抗嚙齒動物免疫球蛋白反應(yīng))，但是剩余的嚙齒動物序列仍然可以引起不希望的抗mAb反應(yīng)[例如，HAMA (人抗鼠抗體)反應(yīng)]的發(fā)展，該抗mAb反應(yīng)可以中和mAb或甚至在患者中引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)。
[0008]用于產(chǎn)生人類mAb的另一個途徑已經(jīng)是使用嵌合體動物，其中該宿主動物的Ig基因已經(jīng)部分地被其人類對應(yīng)部分替代。通過疫苗接種，這些敲除/敲入的動物產(chǎn)生人類Ab，并且它們的包含B細(xì)胞的脾臟可以用于使用常規(guī)的雜交瘤技術(shù)制備人類mAb。已經(jīng)與這一技術(shù)相關(guān)聯(lián)的不足之處包括:由于人類Ig相關(guān)基因的不完整的譜，多樣性(特異性)和親和力減少；不純粹是人類的體液應(yīng)答(“人源化”轉(zhuǎn)基因動物保留其天然T細(xì)胞并且具有鼠科抗體應(yīng)答的“滲漏”表達(dá))；產(chǎn)生的抗體具有非人類糖基化模式(例如，人源化動物中的包含Gal a l-3Gal的寡糖通常在人類中找不到并且因此被鑒定為異物)；以及在動物中經(jīng)歷發(fā)展的抗體不被針對在人類中的耐受性而“選擇”-因此即使來自部分的人類序列，它們在人類中不一定是非免疫原性的(即，不是真正的人類的)。[0009]聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法的出現(xiàn)使得擴(kuò)增整個的或部分的Ig基因成為可能，并且允許創(chuàng)建包含cDNA的質(zhì)粒的文庫，這些cDNA編碼來自有待生產(chǎn)的外周血白細(xì)胞(PBL)的Ig重鏈可變區(qū)和Ig輕鏈可變區(qū)(V區(qū))。傳統(tǒng)上，用于噬菌體展示的文庫產(chǎn)生涉及一組重鏈可變區(qū)的6個引物、K鏈的可變區(qū)的4個引物、以及λ鏈的可變區(qū)的9個引物。(如描述于Barbas (巴爾巴斯)等人，《卩策菌體展示:實驗室手冊》Cold Spring Harbor (冷泉港出版社)，2001中)?？梢允褂脕碜赃@些文庫的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)菌或其他宿主細(xì)胞(例如，酵母菌)，然后可以針對Ag特異性Ig組分對其進(jìn)行篩選。在噬菌體展示途徑中，將人類Ig V區(qū)基因克隆進(jìn)細(xì)菌噬菌體中，以便在細(xì)菌噬菌體顆粒的表面上展示Ab片段。將來自大量人類Ab基因文庫的基因插入噬菌體的文庫中。每個噬菌體可以潛在地攜帶不同V區(qū)的基因并且在其表面上展示出不同的V區(qū)。通常，可以使用這些噬菌體在細(xì)菌噬菌體表面上展示Ab構(gòu)建體，該Ab構(gòu)建體由被一個接頭分開的Ig重鏈V區(qū)和Ig輕鏈V區(qū)組成(單鏈片段可變的Ab或scFv),這樣使得每個重鏈V區(qū)和輕鏈V區(qū)能以一種接近地模擬mAb如何與Ag結(jié)合的方式與靶標(biāo)抗原結(jié)合。類似于噬菌體展示，在酵母菌展示中，Ig組分作為與Aga2p蛋白的融合物以一種將該融合蛋白突出遠(yuǎn)離細(xì)胞表面的方式展示在酵母菌的表面上，。然后，可以使用流式細(xì)胞術(shù)選擇那些表達(dá)與靶標(biāo)Ag反應(yīng)的Ig組分的酵母細(xì)胞。一旦被噬菌體展示或酵母菌展示所鑒定，就將表達(dá)的重鏈V區(qū)和/或輕鏈V區(qū)基因進(jìn)行回收并且將其插入全長重鏈和/或輕鏈表達(dá)載體中。培養(yǎng)被此類載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞允許產(chǎn)生大量的mAb。
[0010]噬菌體展示或酵母菌展示技術(shù)的主要益處是可以針對Ag反應(yīng)性對并入了多達(dá)1000億相異的V區(qū)的巨大文庫進(jìn)行篩選。這些技術(shù)的一個弊端是在第一輪展示中分離的V區(qū)典型地具有非常低的親和力。產(chǎn)生低親和力抗體的常見原因是使用這種方法時決定性的高變序列(高變序列創(chuàng)建成熟的高親和力抗體)的丟失的結(jié)果。產(chǎn)生高親和力抗體的B淋巴細(xì)胞通常已經(jīng)經(jīng)歷被稱為體細(xì)胞高變的過程。在這個過程中，編碼V區(qū)序列的種系經(jīng)歷基因突變，這樣使得V區(qū)的基因序列被改變。這可以導(dǎo)致“成熟的”V區(qū)序列的產(chǎn)生，該“成熟的”V區(qū)序列對于給定抗原具有充分更高的親和力。通常理解的是，體細(xì)胞高變是用于產(chǎn)生抗體多樣性和高親和力抗體的根本重要的事件。體細(xì)胞高變不會被發(fā)現(xiàn)于種系基因組序列中，并且僅在獨特的B淋巴細(xì)胞克隆中表現(xiàn)。
[0011]使用噬菌體展示途徑產(chǎn)生低親和力抗體已經(jīng)成為這種方法的主要局限性。該困難確實已經(jīng)導(dǎo)致許多其他復(fù)雜途徑的發(fā)展，包括如上所述的人源化小鼠以及體外體細(xì)胞高變。人類中的抗體經(jīng)歷了使得它們在人體中被耐受的選擇過程。這些技術(shù)導(dǎo)致使用了并非基于人類體內(nèi)選擇過程的抗體序列，并且因此這些抗體在人類中可以是免疫原性的。無論如何，克服產(chǎn)生低親和力抗體已經(jīng)成為這些方法的主要挑戰(zhàn)。
[0012]噬菌體展示通常產(chǎn)生低親和力抗體的一個原因是它涉及使用基于種系V區(qū)序列的引物序列。使用基于種系序列的V區(qū)引物，存在兩個可能的結(jié)果:(I)由于引物與高變序列之間的不匹配不能導(dǎo)致引物退火，所以這些引物將不能與體細(xì)胞突變序列雜交；或，(2)引物與高變序列之間的不匹配是保留的，這樣使得退火確實發(fā)生，但是擴(kuò)增導(dǎo)致由引物編碼的種系序列而非潛在的高變序列的重演。在任何一種情況下，由于噬菌體展示方法涉及使用了編碼種系V區(qū)序列的PCR引物序列進(jìn)行決定性的PCR擴(kuò)增步驟，并且由于這些引物從抗體V區(qū)的內(nèi)部擴(kuò)增Ig序列，所以使用種系引物序列產(chǎn)生的cDNA文庫將不包含體細(xì)胞高變序列的完整的譜。此外并且重要的是，該譜將完全沒有在V區(qū)(即由種系編碼引物編碼的區(qū))的5’末端具有高變的抗體。
[0013]換言之，使用基于種系序列的引物重演種系V區(qū)序列，由此丟失了由引物序列編碼的區(qū)域內(nèi)的高變。該方法因此系統(tǒng)地消除了 V區(qū)的這些區(qū)域中的高變并且導(dǎo)致高變抗體序列的整體丟失。在低頻率Ab的情況中(即，低于受試者的Ag特異性的整個譜的0.1%、0.01%,0.001%,0.0001%、或0.00001%)，對于它噬菌體展示系統(tǒng)是可論證地最適合的，發(fā)現(xiàn)可以用來制備高親和力HiAb的V區(qū)基因變得更加具有挑戰(zhàn)性。
概述
`[0014]本發(fā)明基于以下的改進(jìn)方法的研發(fā):鑒定在人類Ab譜中以低頻率出現(xiàn)的Ag特異性Ig V區(qū)，這樣使得可以使用這些V區(qū)制備Ag特異性人類mAb或其他靶向Ag的構(gòu)建體。本發(fā)明還允許鑒定更完整的V區(qū)文庫，特別是編碼這樣的抗體序列的那些:這些抗體序列包含用于產(chǎn)生高親和力抗體的決定性的體細(xì)胞突變。
[0015]這種改進(jìn)方法的研發(fā)是基于以下出人意料的發(fā)現(xiàn):傳統(tǒng)的噬菌體展示和酵母菌展示方法允許對靶標(biāo)Ag具有高親和力的人類外周血單核細(xì)胞(PBMC)中的許多V區(qū)逃過鑒定。在傳統(tǒng)的噬菌體展示和酵母菌展示方法中，使用PCR以擴(kuò)增對應(yīng)于Ig重鏈和/或Ig輕鏈的V區(qū)的核酸序列。起動PCR擴(kuò)增過程的正向引物具有與每個V區(qū)的5’種系末端互補(bǔ)的核酸序列，這樣使得編碼V區(qū)的cDNA將被擴(kuò)增。
[0016]歸因于負(fù)責(zé)產(chǎn)生Ab多樣性的若干過程，成熟Ab的V區(qū)的氨基酸序列與種系序列不同并且彼此不同。哺乳動物中的Ig基因區(qū)段按可變(V)外顯子、多樣性(D)外顯子、連接(J)外顯子、以及恒定(C)外顯子的組排列。人類重鏈的DNA包括約50個功能性VH區(qū)段、30個DH區(qū)段、以及6個JH區(qū)段。K鏈包括約40個功能性V K區(qū)段、五個Jk區(qū)段、以及I個C K區(qū)段。λ鏈DNA包含30個V λ區(qū)段，以及J λ和C λ區(qū)段各自4個。連接多樣性來自基因片段的不精確連接，并且在重組過程中，非模板核苷酸可以通過末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶被添加至鄰接的基因區(qū)段之間，并且變?yōu)榛パa(bǔ)決定區(qū)(⑶R)的一部分。然后，組裝的V-D-J或V-J區(qū)段通過單個的核苷酸取代(體細(xì)胞高變)的逐步摻入而變得多樣化，這導(dǎo)致更大程度的抗體多樣性和親和力成熟。
[0017]位于每個V區(qū)重鏈和輕鏈上的三個⑶R區(qū)展示出最多的序列多樣性。由于這種多樣性，這些區(qū)也被稱為高變區(qū)。重鏈和輕鏈的六個CDR對于決定Ab的Ag結(jié)合特異性而言是決定性的。因為每個V區(qū)的5’種系末端不在高變區(qū)內(nèi)，所以認(rèn)為使用針對在這個位點處的種系序列的正向引物的常規(guī)方法是沒有問題的。并且確實，對于鑒定在高頻人類Ab中的那些V區(qū)，該方法證明是非常有用的。
[0018]在本發(fā)明之前的工作中，嘗試鑒定低頻Ab。盡管可以使用例如ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測定)的技術(shù)在外周血樣品中鑒定具有所希望的特異性的Ab，但是當(dāng)在常規(guī)的噬菌體展示方法中使用這些樣品時，不能產(chǎn)生高親和力Ab。這在工業(yè)中是一個普遍問題并且已經(jīng)研發(fā)了制造突變以創(chuàng)建V區(qū)的組合文庫的復(fù)雜的體外方法。這些方法是困難的、費(fèi)力的，并且不一定產(chǎn)生保留了天然人類序列的抗體。
[0019]本發(fā)明源于尋找噬菌體系統(tǒng)不能產(chǎn)生對這些低頻抗體具有高親和力的抗體的原因。當(dāng)考慮他們先前的實驗時，顯示(a)在V區(qū)的5’末端的氨基酸序列中，存在遠(yuǎn)離種系的相當(dāng)大比率的突變，并且(b)在CDR外部的V區(qū)區(qū)段中的兩個氨基酸替換對Ab-Ag的親和力具有顯著的作用，令人吃驚的認(rèn)識到，使用針對5’種系末端序列的引物擴(kuò)增V區(qū)序列的常規(guī)方法導(dǎo)致丟失了許多那些在其5’末端具有突變的V區(qū)的文庫，并且在PCR過程中，還在該區(qū)域引入了序列錯誤。即使在嚴(yán)格PCR條件下，這些種系序列引物也可與包含一些數(shù)目的體細(xì)胞突變的V區(qū)交叉雜交。因此，當(dāng)擴(kuò)增V區(qū)時，這些引物在cDNA中重演種系序列。具有真正高親和力V區(qū)的體細(xì)胞高變將因此丟失。重要的是還認(rèn)識到，就是那些丟失的V區(qū)預(yù)期被包含在最高親和力的Ab中。V區(qū)中的前十個氨基酸可以并且通常的確包含體細(xì)胞高變。在該區(qū)域中的單個的氨基酸變化可以影響抗體結(jié)合。
[0020]在此處所描述的創(chuàng)新途徑中，不是使用5’V區(qū)序列的PCR引物來擴(kuò)增V區(qū)，而是使用前導(dǎo)序列特異性正向引物來擴(kuò)增V區(qū)。因為前導(dǎo)序列恰好在V區(qū)基因的上游，所以包括具有5’末端突變的那些序列的所有V區(qū)序列得以擴(kuò)增。所以，產(chǎn)生的文庫包含比通過常規(guī)方法(導(dǎo)致所有具有體細(xì)胞高變的V區(qū)序列丟失)所制備的那些更加完整的V區(qū)譜。因此，分離已經(jīng)進(jìn)行了體細(xì)胞突變的低頻V區(qū)是可能的?？梢詫Ψ聪蛞镞M(jìn)行選擇以允許Ig同種型的所有亞類(例如，Y、μ、α、K、λ、等)的擴(kuò)增，或重鏈的單獨的亞類(例如，^3或Y4)的擴(kuò)增，以具有更加有針對性的文庫。
[0021]使用前導(dǎo)序列引物擴(kuò)增的V區(qū)核酸的表達(dá)導(dǎo)致前導(dǎo)肽被包含在V區(qū)蛋白產(chǎn)物中。當(dāng)使用哺乳動物細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)來表達(dá)這些核酸時，內(nèi)源的翻譯后加工機(jī)制去除該前導(dǎo)肽，允許V區(qū)或多個V區(qū)(例如，重鏈和輕鏈)構(gòu)建體的表達(dá)，而沒有前導(dǎo)肽干擾Ag結(jié)合篩選測定。然而，在細(xì)菌噬菌體展示技術(shù)中，前導(dǎo)肽不能被去除。前導(dǎo)肽的存在可以干擾Ag結(jié)合篩選測定，并且由此妨礙對于對靶標(biāo)Ag具有高親和力的V區(qū)的檢測。
[0022]為了克服這個問題，本發(fā)明還提供了第二 V區(qū)文庫的創(chuàng)建，該第二 V區(qū)文庫是使用比常規(guī)組的5’V區(qū)引物更大的引物來制備(“第二步”擴(kuò)增)。與使用傳統(tǒng)的引物組擴(kuò)增的數(shù)目相比，更大組的引物允許擴(kuò)增更多數(shù)目的V區(qū)序列。當(dāng)然，因為這些引物是設(shè)計用來擴(kuò)增種系序列而非體細(xì)胞突變的序列的，所以這些引物本身將在擴(kuò)增產(chǎn)物中引入序列錯誤(即，使得這些體細(xì)胞突變被去除并且被種系序列取代)。在使用噬菌體展示以分離在表達(dá)scFv的噬菌體中的結(jié)合靶標(biāo)Ag的那些V區(qū)之后，進(jìn)而對編碼經(jīng)鑒定的V區(qū)的核酸進(jìn)行測序。使用那一序列信息，特異性地擴(kuò)增那些核酸的反向引物可被制得并且連同前導(dǎo)序列正向引物一起可被用來擴(kuò)增來自第一文庫的V區(qū)，以鑒定存在于用以制備第一文庫的供體中的Ag特異性V區(qū)的真實且完整的(體細(xì)胞高變的)序列。
[0023]除了前述內(nèi)容之外，還使用了一種蛋白質(zhì)組學(xué)途徑，其中血漿IgG被分離(例如，使用蛋白G色譜法，隨后是Ag親和色譜法)。通過毛細(xì)管等電聚焦進(jìn)一步將生成的Ag特異性IgG混合物進(jìn)行分離。然后，用蛋白酶消化IgG并且通過質(zhì)譜法(MS)確定肽片段氨基酸序列。在第二步擴(kuò)增不能產(chǎn)生適當(dāng)?shù)捏w細(xì)胞高變V區(qū)序列的事件中(B卩，V區(qū)種系引物不能與所希望的5’ V區(qū)序列交叉雜交/退火，該5’ V區(qū)序列包含來自第一輪擴(kuò)增的體細(xì)胞突變序列)，可以使用分離的Ag特異性IgG的從頭測序信息來進(jìn)行第一輪cDNA的V區(qū)產(chǎn)物的核酸測序。確切地說，使用來自MS從頭蛋白測序的部分測序數(shù)據(jù)來設(shè)計V區(qū)反向引物?？梢詫⑦@些反向引物與前導(dǎo)序列正向引物一起使用來對V區(qū)的5’末端進(jìn)行鑒定并測序。一旦鑒定出這些高突變區(qū)，就可以使用常規(guī)PCR擴(kuò)增完整的V區(qū)序列。然后，可以將這些V區(qū)組裝成完整的具有體細(xì)胞高變的抗體。還可以使用MS肽序列信息來證實Ag特異性V區(qū)在文庫篩選過程中被正確鑒定。
[0024]因此，本發(fā)明的特征在于前導(dǎo)區(qū)特異性引物，這些引物用于擴(kuò)增對人類免疫球蛋白的V區(qū)進(jìn)行編碼的核酸。這些引物可以包括(a)在嚴(yán)格雜交條件下，與選自SEQ IDNO: 1-76的核苷酸序列的互補(bǔ)物結(jié)合的核酸序列，或(b)選自SEQ ID NO: 1-76的核酸序列。
[0025]在另一個方面中，本發(fā)明的特征在于一組前導(dǎo)區(qū)特異性引物，這些引物用于擴(kuò)增至少 90% (例如，至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或 99%)的對人類組織(例如，外周血)樣品中的人類免疫球蛋白V區(qū)進(jìn)行編碼的核酸。該組可以是擴(kuò)增100%的對人類組織樣品中的人類免疫球蛋白V區(qū)進(jìn)行編碼的核酸的一組。該組可以包括至少50個不同的引物，并且這些不同的引物中的每一個可以包括一個不同的核酸序列，例如SEQ IDNO: 1-76的那些。該組還可以包括至少32個不同的引物，并且這些不同的引物中的每一個可以包括一個不同的核酸序列，例如SEQ ID NO: 1-32的那些。該組可以包括至少15個不同的引物，并且這些不同的引物中的每一個可以包括一個不同的核酸序列，例如SEQ IDN0:33-48的那些。該組可以包括至少27個不同的引物，并且這些不同引物中的每一個可以包括一個不同的核酸序列，例如SEQ ID N0:49_76的那些。
[0026]還在本發(fā)明中的是一個噬菌體文庫，該噬菌體文庫包括至少IO5 (例如，至少105、106、或IO7)個編碼免疫球蛋白重鏈的核酸分子，這些免疫球蛋白重鏈在可變區(qū)的前8個氨基酸中具有體細(xì)胞高變。
[0027]本發(fā)明進(jìn)一步包括一種純化的抗體，該純化抗體包括通過篩選噬菌體展示文庫而確定的可變區(qū)序列，該噬菌體展示文庫包括通過使用前導(dǎo)區(qū)特異性引物對分離自人類受試者的B淋巴細(xì)胞進(jìn)行的PCR擴(kuò)增而分離的編碼可變區(qū)的核酸序列。
[0028]在另一個方面中，本發(fā)明的特征在于一種包括以下步驟的方法:(a)使用第一 PCR來擴(kuò)增來自包括B淋巴細(xì)胞的人類組織樣品的人類免疫球蛋白重鏈和輕鏈核苷酸序列，其中在PCR擴(kuò)增中使用前導(dǎo)區(qū)特異的特異性引物；(b)將擴(kuò)增產(chǎn)物從該第一 PCR步驟中分離；
(c)通過將來自該第一 PCR步驟的分離的擴(kuò)增產(chǎn)物插入表達(dá)載體中來創(chuàng)建第一組構(gòu)建體；并且(d)將第一組構(gòu)建體引入第一組宿主細(xì)胞中，以創(chuàng)建人類免疫球蛋白核苷酸序列的一個第一文庫。在這個方法中，這些前導(dǎo)區(qū)特異性引物可以包括一組不同的多核苷酸，這些不同的多核苷酸中的每一個在嚴(yán)格雜交條件下與選自由SEQ ID NO: 1-76組成的組的不同的核酸序列的互補(bǔ)物結(jié)合。該方法還可以包括以下步驟中的一個或多個:(e)使用第二PCR來擴(kuò)增來自第一文庫或人類組織樣品的人類免疫球蛋白的核苷酸序列，其中在PCR擴(kuò)增中使用可變區(qū)特異的特異性引物；(f)從該第二 PCR步驟分離第二組擴(kuò)增產(chǎn)物；(g)通過將第二組分離的擴(kuò)增產(chǎn)物插入表達(dá)載體中來創(chuàng)建第二組構(gòu)建體；(h)將第二組構(gòu)建體引入第二組宿主細(xì)胞中，以創(chuàng)建人類免疫球蛋白核苷酸序列的一個第二文庫；(i)針對編碼特異性地結(jié)合靶標(biāo)抗原的可變區(qū)的核苷酸序列對該第二文庫進(jìn)行篩選；(j)獲得編碼特異性地結(jié)合靶標(biāo)抗原的可變區(qū)的核苷酸序列的序列；(k)使用獲得的序列信息來產(chǎn)生反向引物，該反向引物特異性地針對這樣的核苷酸序列，這些核苷酸序列編碼特異性地結(jié)合靶標(biāo)抗原的可變區(qū)；并且(I)在第三PCR中使用該反向引物以及前導(dǎo)區(qū)特異性引物，以擴(kuò)增來自該第一文庫的核苷酸序列，該核苷酸序列對應(yīng)于人類組織樣品中的B淋巴細(xì)胞中的免疫球蛋白的序列，該B淋巴細(xì)胞促進(jìn)免疫球蛋白與靶標(biāo)抗原的結(jié)合。在此處所描述的本發(fā)明的方法中還可以使用蛋白質(zhì)組學(xué)。
[0029]額外地，在本發(fā)明之內(nèi)的是一個人類免疫球蛋白cDNA文庫，該cDNA文庫包括完整組的體細(xì)胞高變V區(qū)序列。
[0030]除非另外定義，否則在此所使用的所有技術(shù)術(shù)語均具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。通常理解的生物學(xué)術(shù)語的定義可以在列赫爾(Rieger)等人的《遺傳學(xué)詞匯:經(jīng)典及分子》，第五版，施普林格出版社:紐約，1991 (Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular,5thedition, Springer-Verlag:New York, 1991);以及盧因(Lewin)的《基因 V》，牛津大學(xué)出版社:紐約，1994 (Lewin, Genes V, Oxford University Press:New York, 1994)中找到。通常理解的醫(yī)學(xué)術(shù)語的定義可以在《斯特曼的醫(yī)學(xué)辭典》(Stedman’s Medical Dictionary),第27版，利平科特(Lippincott), Williams & Wilkins (威廉姆斯和威爾金斯)，2000，中找到。`
[0031]如在此使用，一種“抗體”或“Ab”是一種免疫球蛋白(Ig)、相同的或異源的Ig的溶液、或Ig的混合物。一種“抗體”還可以指代Ig的片段和工程化版本，例如Fab、Fab’、以及F(ab’)2片段；以及scFv、雜共軛(heteroconjugate)Ab、以及利用Ig衍生的Q)R來賦予抗原特異性的類似的人工分子。一種“單克隆抗體”或“mAb”是由一個克隆B細(xì)胞系表達(dá)的一種Ab或僅含有能夠與一種特定抗原的特定表位發(fā)生免疫反應(yīng)的抗原結(jié)合位點的一個種類的Ab分子群。一種“多克隆抗體”或“多克隆Ab”為異源Ab的一種混合物。典型地，一種多克隆Ab將包括結(jié)合特定抗原的大量不同的Ab分子，其中這些不同Ab中的至少一些與該抗原的不同表位發(fā)生免疫反應(yīng)。如在此使用，一種多克隆Ab可以是兩種或更多種mAb的混合物。
[0032]一種Ab的“抗原結(jié)合部分”被包含在Ab的Fab部分的可變區(qū)內(nèi)并且是賦予對Ab的抗原特異性的Ab的部分(即，典型地由Ab的重鏈和輕鏈的⑶R形成的三維口袋)?！癋ab部分”或“Fab區(qū)”是木瓜蛋白酶消化的Ig的蛋白水解片段，該片段包含那個Ig的抗原結(jié)合部分?！胺荈ab部分”是不在該Fab部分內(nèi)的Ab的那個部分，例如，“Fe部分”或“Fe區(qū)”。Ab的“恒定區(qū)”是在可變區(qū)外的Ab的那個部分。[0033]當(dāng)提及一種蛋白分子(例如Ab)時，“純化的”意味著與天然伴隨此類分子的組分分離。典型地，當(dāng)一種Ab或蛋白按重量計至少約10% (例如，9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.9%和100%)不含其天然關(guān)聯(lián)的非Ab蛋白或其他天然存在的有機(jī)分子時，它是純化的?？梢酝ㄟ^任何適當(dāng)?shù)姆椒?，例如柱色譜法、聚丙烯酰胺凝膠電泳或HPLC分析來測量純度。一種化學(xué)合成的蛋白或在一種細(xì)胞類型(不是該蛋白天然存在的細(xì)胞類型)中產(chǎn)生的其他重組蛋白是“純化的”。
[0034]“結(jié)合”(bind、binds)或“與…反應(yīng)”意指一個分子識別并且粘附一個樣品中的特定的第二分子，但是基本上不識別或粘附該樣品中的其他分子。通常，“特異性結(jié)合”另一個分子的Ab具有對于該另一分子而言大于約105、IO6, IO7,108、109、10' 1011、或IO12升/摩爾的Kd。
[0035]如在此相對于核酸和氨基酸而使用的，術(shù)語“百分比序列一致性”意指兩個比對序列之間的完全匹配的數(shù)目除以較短的序列的長度并且乘以100?？梢匀缑枋鲇赟mith(史密斯)和Waterman(沃特曼),Advances in Applied Mathematics(《應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展》)2:482-489(1981)中的進(jìn)行核酸序列的比對，并且如描述于Dayhoff (戴浩夫)，Atlas of ProteinSequences and Structure (《蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖集》),Μ.0.Dayhoff (戴浩夫)編輯,增刊53:353-358, National Biomedical Research Foundation (國家生物醫(yī)學(xué)研究基金會)，華盛頓，美國，以及Gribskov (哥博斯科夫)(1986)Nucl.Acids Res.(《核酸研究》)14:6745中的進(jìn)行氨基酸序列的比對。如使用以上方法所確定的，當(dāng)兩個DNA序列、或兩個多肽序列在這些分子的定義長度上展示出至少約80%-85%、至少約85%-90%、至少約90%_95%、或至少約95%-98%的序列一致性時，這些序列彼此“基本上同源”。如在此使用的，基本上同源還指展示出與指定的DNA或多肽序列完全一致的序列。例如在如為那個具體的系統(tǒng)所定義的嚴(yán)格條件下，可以在DNA印跡雜交實驗中鑒定基本上同源的DNA序列。定義適當(dāng)?shù)碾s交條件在本領(lǐng)域的技術(shù)之內(nèi)。參見，例如，Sambrook (薩姆布魯克)等人,Molecular Cloning (《分子克隆》):A Laboratory Manual (《實驗室手冊》),第二版，(1989) Cold Spring Harbor (冷泉港出版社)，N.Y.；Nucleic Acid Hybridization:A Practical Approach(《核酸雜交:實用方法》)，B.D.Hames (哈姆斯)和S.J.Higgins (希金斯)編著，(1985)牛津；華盛頓；IRL出版社。`
[0036]如在此使用的，術(shù)語“嚴(yán)格雜交條件”意指在45°C下、在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中，隨后在至少60°C下、在0.2X SSC,0.1%SDS中洗滌。
[0037]雖然類似或等同于在此所述的那些的方法和材料可用于本發(fā)明的實踐或測試，但以下描述了適合的方法和材料。本文所提及的全部出版物、專利申請、專利和其他參考文獻(xiàn)通過引用方式以其全文結(jié)合。在發(fā)生沖突的情況下，將以本說明書(包括定義)為準(zhǔn)。另外，以下所討論的具體實施例僅僅是說明性的而不旨在是限制性的。
附圖簡要說明
[0038]圖1是在本發(fā)明的重鏈PCR擴(kuò)增策略中的一個步驟的示意圖。
[0039]圖2是在本發(fā)明的重鏈PCR擴(kuò)增策略中的另一個步驟的示意圖。
[0040]圖3是在本發(fā)明的輕鏈PCR擴(kuò)增策略中的一個步驟的示意圖。
[0041]圖4是在本發(fā)明的輕鏈PCR擴(kuò)增策略中的另一個步驟的示意圖。
[0042]圖5是一個圖表，該圖表顯示重鏈可變區(qū)亦或輕鏈可變區(qū)上游的前導(dǎo)肽的存在抑制ScFv片段與其抗原結(jié)合。當(dāng)與沒有前導(dǎo)區(qū)(LC-HC)的ScFv片段相比時，包含重鏈上的前導(dǎo)區(qū)(LC-LHC)、輕鏈上的前導(dǎo)區(qū)(LLC-HC)以及重鏈和輕鏈上的前導(dǎo)區(qū)(LLC-LHC)的ScFv片段減少了與該抗原的結(jié)合。
詳細(xì)說明
[0043]本發(fā)明涵蓋涉及包含體細(xì)胞高變的人類抗體序列的鑒定的方法、組合物、以及試劑盒。以下描述的優(yōu)選實施例說明了這些方法、組合物、以及試劑盒的調(diào)適。雖然如此，根據(jù)這些實施例的說明，基于以下提供的說明可以完成和/或?qū)嵺`本發(fā)明的其他方面。
一般方法
[0044]在此描述了涉及常規(guī)免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的方法。免疫學(xué)方法(例如，用于抗原Ab復(fù)合物的檢測和定位的測定，免疫沉淀法，免疫印跡等)通常在本領(lǐng)域是已知的，并且描述于方法學(xué)專著中，例如Current Protocols in Immunology (《當(dāng)代免疫學(xué)實驗手冊》)，Coligan (科爾根)等人編輯，約翰威利父子出版公司(John ffiley&Sons),紐約。分子生物學(xué)的技術(shù)詳細(xì)描述于以下專著中，例如Sambrook (薩姆布魯克)等人編著的《分子克隆:實驗室手冊》，第2版，第1-3卷，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，2001 (Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd ed., vol.1-3, Sambrook etal., ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.，2001);以及Ausubel (奧蘇貝爾)等人編著的《當(dāng)代分子生物學(xué)實驗手冊》，格林出版與威利交叉科學(xué)，紐約(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., ed., Greene Publishingand ffiley-1nterscience, New York)。Ab 方法描述于《治療性 Ab 手冊》(Handbook ofTherapeutic Abs)，杜貝爾.S (Dubel, S.)編著，威利-VCH 出版社(Wiley-VCH)，2007 中。
概述
[0045]在用于鑒定Ag特異性Ig V區(qū)的傳統(tǒng)噬菌體展示和酵母菌展示方法中，使用PCR來擴(kuò)增對應(yīng)于Ig重鏈和/或Ig輕鏈的V區(qū)的核酸序列。起動PCR擴(kuò)增過程的正向引物具有作為每個V區(qū)的5’種系末端的互補(bǔ)物的核酸序列，這樣使得編碼V區(qū)的cDNA將被擴(kuò)增。在由于體細(xì)胞高變而使5’V區(qū)基因區(qū)段不同于種系的情況中，該P(yáng)CR過程優(yōu)先擴(kuò)增具有5’種系序列的產(chǎn)物，該5’種系序列導(dǎo)致噬菌體展示文庫和酵母菌展示文庫中多樣性的丟失。
[0046]在本發(fā)明的一個方面中，使用前導(dǎo)序列特異性正向引物擴(kuò)增V區(qū)。因為前導(dǎo)序列恰好在V區(qū)基因的上游，所以包括具有大量5’末端突變的那些序列的所有V區(qū)序列得以擴(kuò)增，而沒有丟失原始的5’ V區(qū)基因區(qū)段序列。所以，與通過常規(guī)方法制備的那些文庫相比，用該方法制備的文庫包含更加完整的V區(qū)譜。可以使用被工程化為表達(dá)所擴(kuò)增的V區(qū)編碼核酸的哺乳動物細(xì)胞，針對Ag特異性V區(qū)對這些文庫進(jìn)行篩選。內(nèi)源的翻譯后加工機(jī)制去除該前導(dǎo)肽，允許V區(qū)或多個V區(qū)(例如，重鏈和輕鏈)構(gòu)建體的表達(dá)，而沒有前導(dǎo)肽干擾Ag結(jié)合篩選測定。在細(xì)菌噬菌體展示技術(shù)中，在前導(dǎo)肽可以干擾Ag結(jié)合篩選測定的情況下，本發(fā)明還提供了第二 V區(qū)文庫的創(chuàng)建，該第二 V區(qū)文庫是使用比常規(guī)組的5’ V區(qū)引物更大的引物制備的。與使用傳統(tǒng)的引物組擴(kuò)增的數(shù)目相比，更大組的引物允許擴(kuò)增更大數(shù)目的V區(qū)序列，但是如前所述的，會導(dǎo)致序列錯誤被引入擴(kuò)增產(chǎn)物中。使用噬菌體展示來篩選以高親和力結(jié)合靶標(biāo)Ag的scFv中的那些V區(qū)。然后對編碼經(jīng)鑒定的V區(qū)的核酸進(jìn)行測序，并且使用該序列信息，特異性地擴(kuò)增那些核酸的反向引物可被制得并且連同前導(dǎo)序列正向引物一起可被用來擴(kuò)增來自第一文庫的V區(qū)，以鑒定存在于用以制備第一文庫的供體中的Ag特異性V區(qū)的真實且完整的序列。來自供體Ig的片段的氨基酸序列信息可以用于輔助編碼了供體Ab的重鏈和輕鏈的核酸的鑒定，以及用于設(shè)計用來擴(kuò)增此類核酸的PCR引物。
PCR引物
[0047]本發(fā)明的一個方面包括正向PCR引物，用于從編碼其前導(dǎo)序列的核苷酸擴(kuò)增重鏈和輕鏈人類Ig V區(qū)?？梢杂脕頂U(kuò)增100%的這些序列的一組(例如，2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、或更多個)這樣的引物優(yōu)選用來捕獲低頻V區(qū)，盡管還可以使用捕獲小于100% (例如，70%-99%、70%-75%、75%-80%、80%-85%、85%-90%、90%-95%、或95%-99%)的這些序列的一組引物。一組這些引物的一個實例列舉于下表1AUBJP IC中。使用這些引物組(或具有與表1AUBJP IC中的那些基本上同源的引物的引物組)以及適當(dāng)?shù)姆聪蛞?，因為前?dǎo)序列恰好在V區(qū)基因的上游，所以包括具有大量5’末端突變的那些序列的所有V區(qū)序列可以得到擴(kuò)增。
表1A:重鏈前導(dǎo)區(qū)正向引物
【權(quán)利要求】
1.一種前導(dǎo)區(qū)特異性引物，用于擴(kuò)增對一種人類免疫球蛋白的V區(qū)進(jìn)行編碼的核酸。
2.如權(quán)利要求1所述的引物，包括一個在嚴(yán)格雜交條件下與選自下組的核苷酸序列的互補(bǔ)物結(jié)合的核酸序列，該組由SEQ ID NO: 1-76組成。
3.如權(quán)利要求1所述的引物，包括一個選自由SEQID NO: 1-76組成的組的核酸序列。
4.一組前導(dǎo)區(qū)特異性引物，用于擴(kuò)增至少90%的對一個人類組織樣品中的一種人類免疫球蛋白的V區(qū)進(jìn)行編碼的核酸。
5.如權(quán)利要求4所述的組，其中該組擴(kuò)增100%的對一個人類組織樣品中的一種人類免疫球蛋白的V區(qū)進(jìn)行編碼的核酸。
6.如權(quán)利要求4所述的組，其中該組包括至少50個不同的引物，并且這些不同的引物中的每一個包括一個選自由SEQ ID NO: 1-76組成的組的不同的核酸序列。
7.如權(quán)利要求4所述的組，其中該組包括至少32個不同的引物，并且這些不同的引物中的每一個包括一個選自由SEQ ID NO: 1-32組成的組的不同的核酸序列。
8.如權(quán)利要求4所述的組，其中該組包括至少15個不同的引物，并且這些不同的引物中的每一個包括一個選自由SEQ ID NO:33-48組成的組的不同的核酸序列。
9.如權(quán)利要求4所述的組，其中該組包括至少27個不同的引物，并且這些不同的引物中的每一個包括一個選自由SEQ ID NO:49-76組成的組的不同的核酸序列。
10.一種噬菌體文庫，包括至少IO5個編碼免疫球蛋白重鏈的核酸分子，這些免疫球蛋白重鏈在可變區(qū)的前8個氨基酸中具有體細(xì)胞高變。
11.一種純化的抗體，包括通過篩選一個噬菌體展示文庫而確定的一個可變區(qū)序列，該噬菌體展示文庫包括通過使用前導(dǎo)區(qū)特異性引物對分離自一位人類受試者的B淋巴細(xì)胞進(jìn)行的PCR擴(kuò)增而分離的編碼可變區(qū)的核酸序列。
12.—種方法，包括以下步驟: (a)使用一個第一PCR來擴(kuò)增來自包括B淋巴細(xì)胞的一個人類組織樣品的人類免疫球蛋白重鏈和輕鏈核苷酸序列，其中在該P(yáng)CR擴(kuò)增中使用前導(dǎo)區(qū)特異的特異性引物； (b)從該第一PCR步驟分離擴(kuò)增產(chǎn)物； (c)通過將來自該第一PCR步驟的這些分離的擴(kuò)增產(chǎn)物插入表達(dá)載體中來創(chuàng)建第一組構(gòu)建體；并且 (d)將該第一組構(gòu)建體引入第一組宿主細(xì)胞中，以創(chuàng)建人類免疫球蛋白核苷酸序列的一個第一文庫。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中這些前導(dǎo)區(qū)特異性引物包括一組不同的多核苷酸，這些不同的多核苷酸中的每一個在嚴(yán)格雜交條件下與選自由SEQ ID ΝΟ:1-76組成的組的一個不同的核酸序列的互補(bǔ)物結(jié)合。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，進(jìn)一步包括以下步驟: (e)使用一個第二PCR來擴(kuò)增來自該第一文庫或該人類組織樣品的人類免疫球蛋白核苷酸序列，其中在該P(yáng)CR擴(kuò)增中使用可變區(qū)特異性引物； (f)從該第二PCR步驟分離第二組擴(kuò)增產(chǎn)物； (g)通過將該第二組分離的擴(kuò)增產(chǎn)物插入表達(dá)載體中來創(chuàng)建第二組構(gòu)建體； (h)將該第二組構(gòu)建體引入第二組宿主細(xì)胞中，以創(chuàng)建人類免疫球蛋白核苷酸序列的一個第二文庫；(i)針對編碼特異性地結(jié)合一個靶標(biāo)抗原的可變區(qū)的核苷酸序列對該第二文庫進(jìn)行篩選; U)獲得編碼特異性地結(jié)合一個靶標(biāo)抗原的可變區(qū)的核苷酸序列的序列； (k)使用所獲得的序列信息來產(chǎn)生一個反向引物，該反向引物特異性地針對這樣的核苷酸序列，該核苷酸序列編碼特異性地結(jié)合一個靶標(biāo)抗原的可變區(qū)； (I)在一個第三PCR中使用該反向引物以及這些前導(dǎo)區(qū)特異性引物，以擴(kuò)增來自該第一文庫的一個核苷酸序列，該核苷酸序列對應(yīng)于該人類組織樣品中的B淋巴細(xì)胞中的免疫球蛋白的序列，該B淋巴細(xì)胞促進(jìn)該免疫球蛋白與該靶標(biāo)抗原的結(jié)合。
15.一個人類免疫球蛋白cDNA文庫， 包括完整組的體細(xì)胞高變的V區(qū)序列。
【文檔編號】C12Q1/68GK103687873SQ201280034673
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年7月12日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月12日
【發(fā)明者】J·西馬德 申請人:?？怂股锟萍脊?br>