專利名稱：靶向產(chǎn)生i型干擾素的細胞的組合物和方法
靶向產(chǎn)生j型干擾素的細胞的組合物和方法
引用的相關(guān)申請
本申請要求2010年8月17日提交的題目為“Compositions and Methods for Targeting type I Interferon-Producing Cells (祀向產(chǎn)生I型干擾素的細胞的組合物和方法)”的美國專利申請?zhí)?1/374，497、2010年8月17日提交的題目為“Humanized Ant1-1nterIeukin 3 Receptor Alpha Chain Antibodies (人源化的抗白介素 3 受體 α 鏈抗體)”的美國專利申請?zhí)?1/374，489和2010年2月17日提交的題目為“Treatment of Chronic Inflammatory Conditions (慢性炎癥疾病狀況的治療)”的美國專利申請?zhí)?12/707,297的權(quán)益。通過引用將這些申請的全部內(nèi)容并入本文。技術(shù)領(lǐng)域
本公開涉及炎性疾病的治療。
發(fā)明背景
細胞因子的干擾素(IFN)家族包括I型和II型亞型。I型亞型由IFNa、IFN^、 IFNgj、IFNk和IFNt組成，II型以IFNy為代表。I型IFN具有多種免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，包括多克隆T細胞應(yīng)答的刺激、同種型轉(zhuǎn)換、I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子的表達以及樹突狀細胞(DC)分化的誘導(dǎo)。I型IFN刺激巨噬細胞和天然殺傷(NK)細胞以引發(fā)抗病毒應(yīng)答，并且針對腫瘤也是有活性的。I型IFN還通過改變下丘腦中熱敏神經(jīng)元的活性，進而引起發(fā)燒，而起到致熱因子的作用。I型IFN系統(tǒng)的特征為快速誘導(dǎo)和放大信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路， 確保發(fā)起強烈的抗病毒免疫應(yīng)答。
然而，盡管這類通路對快速的病毒清除是高度有效的，但這種放大在針對宿主組織的免疫應(yīng)答中可能不適 用的，引起自身免疫病。實例包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類風濕性關(guān)節(jié)炎和血管球性腎炎。
SLE是一種慢性自身免疫病，其中免疫缺陷導(dǎo)致多種器官中自身抗體的產(chǎn)生和隨后的炎癥和/或組織損傷，所述器官包括皮膚、腎臟、血液、腦和關(guān)節(jié)。疾病過程可以是長期活性的、再度惡化和緩和的或者長期緩和的。SLE的特征為很多細胞因子包括I型IFN如 IFNa的水平升高。
SLE中IFNa的作用的證據(jù)已在數(shù)項體外研究中得到證實，所述研究表明，來自 SLE患者的血清從正常哺乳動物的單核細胞誘導(dǎo)DC成熟。因此，來自SLE患者的血清能夠誘導(dǎo)正常的靜態(tài)單核細胞變成呈遞能夠誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的抗原。此外，SLE小鼠模型(NZB小鼠)中IFNARl (I型IFN受體的α鏈)表達的抑制減弱了溶血性貧血并且減弱了血管球性腎炎。
臨床上，活性SLE患者的血清I型IFN水平通常升高，并且這些水平與疾病活動性正相關(guān)。IFNa在SLE中的推定的作用的其他臨床證據(jù)來自這樣的觀察結(jié)果，用IFNa治療的未患SLE的患者偶爾會產(chǎn)生自身抗體和與SLE相符的臨床表現(xiàn)。
I型干擾素由很多細胞類型產(chǎn)生，包括淋巴細胞(NK細胞、B細胞和T細胞)、巨噬細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、成骨細胞和某些樹突狀細胞。漿細胞樣樹突狀細胞(PDC)已被鑒定為是應(yīng)答外來抗原時，I型IFN最有效的產(chǎn)生者。pDC是存在于血液以及I型干擾素來源的外周淋巴器官中的循環(huán)的樹突狀細胞亞型。人PDC通常表達表面標志物IL-3受體 α 鏈(IL-3Ra，CD123)、BDCA-2 (CD303)和 BDCA-4 (CD304)，但是不表達 CDllc 或 CD14，這使PDC與常規(guī)的樹突細胞或單核細胞相區(qū)別。在刺激以及隨后活化后，pDC產(chǎn)生大量的I型干擾素(主要為IFN- α和IFN- β )。
鑒于IFNa在I型IFN依賴的炎性疾病如SLE中的明顯作用，尋求能夠中和該細胞因子的作用的抗體或可溶性IFNAR蛋白作為潛在的治療方法。
為治療I型IFN依賴的炎性疾病如SLE而提出的可選方法是使用能與表達I型干擾素的細胞所表達的細胞表面分子結(jié)合的化合物。
已經(jīng)研究的一類用于治療自身免疫病的化合物是免疫毒素，所述免疫毒素包含與毒素綴合的來自抗體的單鏈Fv(ScFv)。已提出這些化合物可用于殺死表達IL_3R α的細胞。然而，這些分子具有很多缺點。例如，已知免疫毒素能引起肝臟和腎臟損傷。與scFv綴合的小尺寸的毒素還意味著，免疫毒素會被腎臟快速清除，這進一步惡化對該器官的損傷， 并且意味著免疫毒素可能不能在體內(nèi)保留足以賦予益處的時間。此外，毒素組分通常是非人的，這意味著它們可能在患者內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。該免疫應(yīng)答能夠中和毒素分子。因此，這類免疫毒素可能不適合治療慢性自身免疫病可能所需的多種治療。
發(fā)明概述
與以前的一些方法相反，本發(fā)明人意識到，阻斷I型IFN受體和/或IFN- α可能達不到足以避免損害I型IFN的陽性抗病毒效應(yīng)的特異性。本發(fā)明人而是集中在降低或阻止 IL-3對IL-3響應(yīng)細胞的活性和/或消耗或消除IL-3響應(yīng)細胞如pDC和嗜堿性粒細胞。本發(fā)明人利用針對IL-3Ra的免疫球蛋白來降低或阻止IL-3對IL-3響應(yīng)細胞如pDC和嗜堿性粒細胞的活性(即中和IL-3信號轉(zhuǎn)導(dǎo))。然而，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，僅中和IL-3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的免疫球蛋白不可能將IFNa水平降低至足以提供治療效果。因此，本發(fā)明人還使用能誘導(dǎo)哺乳動物的免疫系統(tǒng)的免疫球蛋白來至少部分消耗或消除IL-3響應(yīng)細胞(例如pDC和嗜堿性粒細胞)，從而治療I型IFN依賴性炎性疾病以及與pDC和嗜堿性粒細胞相關(guān)的疾病狀態(tài)例如狼瘡。通過使用能降低或阻止IL-3對IL -3響應(yīng)細胞的活性和至少部分消耗或消除 IL-3響應(yīng)細胞的免疫球蛋白，本發(fā)明人能在體外降低IFNa水平。通過利用哺乳動物免疫系統(tǒng)至少部分消耗或消除IL-3響應(yīng)細胞，避免毒素的使用及與其相關(guān)的副作用是可能的。
鑒于pDC不僅是I型IFN的唯一來源，而且是炎性疾病中I型IFN的重要來源，本發(fā)明人考慮到，本公開所提供的方法比針對I型IFN受體和/或IFN-α的方法提供了更精確的靶向治療方法，這種方法不大可能使I型IFN的積極效果無效。一類具體的I型IFN 依賴性炎性疾病是狼瘡，例如SLE。
本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)的能力增強的免疫球蛋白能夠以低劑量減少IFNa產(chǎn)生和/或循環(huán)pDC和嗜堿性粒細胞的數(shù)量。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，這些效應(yīng)在給藥后持續(xù)數(shù)天，并且效應(yīng)的長度是劑量依賴性的。
本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，pDC和嗜堿性粒細胞數(shù)量在免疫球蛋白給藥后恢復(fù)，這表明哺乳動物的免疫應(yīng)答(例如對病毒的應(yīng)答)也在治療后恢復(fù)。
本公開提供了治療哺乳動物的狼瘡的方法，所述方法包括給予哺乳動物一種免疫球蛋白，所述免疫球蛋白能結(jié)合IL-3Ra鏈并中和IL-3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且能消耗或至少部分消除與之結(jié)合的PDC和嗜堿性粒細胞，從而治療哺乳動物中的狼瘡，其中所述免疫球蛋白不與毒性化合物綴合，所述毒性化合物會殺死免疫球蛋白所結(jié)合的細胞。在一實例中，狼瘡是 SLE。
另外或可選地，本公開提供了治療哺乳動物的狼瘡的方法，所述方法包括給予哺乳動物一種免疫球蛋白，所述免疫球蛋白能結(jié)合IL-3Ra鏈并競爭性抑制單克隆抗體7G3 與IL-3Ra的結(jié)合，并且能消耗或至少部分消除與之結(jié)合的pDC和嗜堿性粒細胞，從而治療哺乳動物中的狼瘡。在一實例中，免疫球蛋白能結(jié)合IL-3Ra并中和IL-3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在一實例中，狼瘡是SLE。
另外或可選地，本公開提供了治療哺乳動物的狼瘡的方法，所述方法包括給予哺乳動物一種免疫球蛋白，所述免疫球蛋白能結(jié)合IL-3Ra鏈并競爭性抑制單克隆抗體7G3 與IL-3Ra的結(jié)合，并且能消耗或至少部分消除與之結(jié)合的pDC和嗜堿性粒細胞，從而治療哺乳動物中的狼瘡，其中所述免疫球蛋白不與毒性化合物綴合，所述毒性化合物會殺死免疫球蛋白所結(jié)合的細胞。免疫球蛋白能結(jié)合IL-3Ra并中和IL-3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在一實例中， 狼瘡是SLE。
本公開還提供了治療哺乳動物中干燥綜合征(Sj5grens syndrome)的方法，所述方法包括給予哺乳動物一種能結(jié)合IL-3Ra鏈的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白能中和 IL-3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或競爭性抑制單克隆抗體7G3與IL-3Ra的結(jié)合，并且其中所述免疫球蛋白能消耗或至少部分消除與之結(jié)合的PDC和嗜堿性粒細胞，從而治療哺乳動物中的干燥綜合征，并且其中所述免疫球蛋白不與毒性化合物綴合，所述毒性化合物會殺死免疫球蛋白所結(jié)合的細胞。
本公開還提供了治療哺乳動物中硬皮病的方法，所述方法包括給予哺乳動物一種能結(jié)合IL-3Ra鏈的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白能中和IL-3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或競爭性抑制單克隆抗體7G3與IL-3Ra的結(jié)合，并且其中所述免疫球蛋白能消耗或至少部分消除與之結(jié)合的PDC和嗜堿性粒細胞，從而治療哺乳動物中的系統(tǒng)性硬皮病，并且所述免疫球蛋白不與毒性化合物綴合，所述毒性化合物會殺死免疫球蛋白所結(jié)合的細胞。在一實例中， 硬皮病是系統(tǒng)性硬皮病。
在另一實例中，本公開提供了供本公開的上述實例使用的藥物組合物，所述藥物組合物包含能與IL-3Ra鏈結(jié)合 的免疫球蛋白和藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。 示例性的免疫球蛋白如本文所述且適用于本公開的實例。在一實例中，免疫球蛋白不與毒性化合物綴合，所述毒性化合物會殺死免疫球蛋白所結(jié)合的細胞。在一實例中，免疫球蛋白消耗或至少部分消除與之結(jié)合的PDC和嗜堿性粒細胞。在一實例中，免疫球蛋白能結(jié)合 IL-3Ra并中和IL-3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在一實例中，免疫球蛋白競爭性抑制單克隆抗體7G3與 IL-3Ra的結(jié)合。
在另一實例中，本公開提供了供本公開的上述實例使用的試劑盒，所述試劑盒包含能與IL-3Ra鏈結(jié)合的免疫球蛋白；藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑；以及試劑盒的使用說明書。能與IL-3Ra結(jié)合的示例性的免疫球蛋白如本文所述，并且被認為準用于本公開的本實例。
在一實例中，所述方法包括給予有效中和IL-3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并消耗或至少部分消除哺乳動物中PDC和嗜堿性粒細胞的量的免疫球蛋白。
在一實例中，IL-3Ra由產(chǎn)生一種或多種I型干擾素的pDC表達。因此，在一實例中，免疫球蛋白能與產(chǎn)生一種或多種I型干擾素的PDC上的IL_3Ra結(jié)合。
在一實例中，IL3Ra鏈由產(chǎn)生一種或多種細胞因子的嗜堿性粒細胞表達。因此，在一實例中，免疫球蛋白能與產(chǎn)生一種或多種細胞因子的嗜堿性粒細胞上的IL-3Ra結(jié)合。
在一實例中，免疫球蛋白能與單克隆抗體7G3結(jié)合相同的表位。
在另一實例中，免疫球蛋白結(jié)合的表位與單克隆抗體7G3所結(jié)合的表位重疊。
在一實例中，免疫球蛋白能與IL-3Ra特異性結(jié)合。
在一實例中，免疫球蛋白是裸免疫球蛋白。
本公開所考慮的示例性免疫球蛋白是抗體及其抗原結(jié)合片段。
在一實例中，免疫球蛋白是全長抗體。
在一實例中，免疫球蛋白是嵌合免疫球蛋白，例如嵌合抗體或其抗原結(jié)合片段。例如，嵌合抗體包含來自非人哺乳動物(例如，小鼠)產(chǎn)生的抗體的重鏈可變區(qū)(Vh)和輕鏈可變區(qū)和來自人的恒定區(qū)。在一實例中，嵌合抗體包含單克隆抗體7G3的可變區(qū)。
在另一實例中，免疫球蛋白是人源化免疫球蛋白，例如人源化抗體或其抗原結(jié)合片段。在一實例中，人源化抗體或其抗原結(jié)合片段是單克隆抗體7G3或其抗原結(jié)合片段的人源化形式。例如，人源化抗體包含來源于單克隆抗體7G3的互補性決定區(qū)(CDR)。在一實例中，人源化抗體包含單克隆抗體7G3的Vh的CDR。在另一或可選的實例中，人源化抗體包含單克隆抗體7G3的\的⑶R2和⑶R3以及單克隆抗體7G3的⑶Rl (包含一個或多個氨基酸取代)。在一實例中，人源化抗體包含輕鏈可變區(qū)(V和重鏈可變區(qū)(Vh)，輕鏈可變區(qū) (Vl)包含SEQ ID NO:3所示的序列，重鏈可變區(qū)包含SEQ ID N0:2所示的序列。
在另一實例中，免疫球蛋白是人免疫球蛋白，諸如人抗體或其抗原結(jié)合片段。
本公開所考慮的示例性抗原結(jié)合片段包括
⑴結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)；
(ii)Fv ；
(iii) scFv或其穩(wěn)定形式(例如,二硫化物穩(wěn)定的scFv)；
(iv) 二聚scFv或其穩(wěn)定形式；
(iv)雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體或更高級別的多聚體；
(V) Fab 片段；
(vi)Fab’ 片段；
(vii)F(ab’ )片段；
(viii)F(ab，)2 片段;
(ix)融合至抗體的Fe區(qū)的(i)-(viii)中的任一個；
(X)融合至能與免疫效應(yīng)細胞結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段的(i)_(viii)中的任一個。
如同根據(jù)本文公開的內(nèi)容對本領(lǐng)域技術(shù)人員所顯而易見的，在沒有與毒性化合物綴合的情況下，示例性的免疫球蛋白能夠消耗或至少部分消除與之結(jié)合的細胞。
在一實例中，免疫球蛋白促使細胞經(jīng)歷凋亡。
在一實例中，免疫球蛋白能夠誘導(dǎo)效應(yīng)子功能，例如導(dǎo)致殺死免疫球蛋白所結(jié)合的細胞的效應(yīng)子功能。示例性的效應(yīng)子功能包括ADCC、抗體依賴性細胞介導(dǎo)的吞噬作用(ADCP)和/或補體依賴性細胞毒性(⑶C)。
在一實例中，免疫球蛋白能夠誘導(dǎo)ADCC。
在一實例中，免疫球蛋白包含能夠誘導(dǎo)效應(yīng)子功能的抗體Fe區(qū)。例如，效應(yīng)子功能是FC介導(dǎo)的效應(yīng)子功能。在一實例中，F(xiàn)e區(qū)是IgGlFc區(qū)或IgG3Fc區(qū)或雜合體IgGl/ IgG2Fc 區(qū)。
在一實例中，免疫球蛋白能夠誘導(dǎo)與野生型人IgGl和/或人IgG3Fc區(qū)相似(例如，沒有顯著不同或處于約10%內(nèi))或相同水平的效應(yīng)子功能。
在一實例中，免疫球蛋白能夠誘導(dǎo)與本文所述的ch7G3或hz7G3相似(例如，沒有顯著不同或處于約10%內(nèi))或相同水平的效應(yīng)子功能。
在一實例中，免疫球蛋白能夠誘導(dǎo)水平提高的效應(yīng)子功能。
在一實例中，由免疫球蛋白誘導(dǎo)的效應(yīng)子功能水平相對于包含野生型IgGlFc區(qū)時的免疫球蛋白的效應(yīng)子功能水平是提高的。
在一實例中，效應(yīng)子功能相對于本文所述的ch7G3或hz7G3的效應(yīng)子功能是提高的，或大于本文所述的ch7G3或hz7G3的效應(yīng)子功能。
在一實例中，免疫球蛋白是去巖藻糖化的或包含去巖藻糖化的Fe區(qū)。
在另一實例中，免疫球蛋白與未經(jīng)改變以降低蛋白巖藻糖化的人細胞或CHO細胞所產(chǎn)生的免疫球蛋白相比具有較低水平的巖藻糖化。按照本實例，較低水平的巖藻糖化應(yīng)當被理解為表示，在包含免疫球蛋白的組合物中，巖藻糖化免疫球蛋白(例如，與包含巖藻糖的抗體的Asn297相連的糖基基團)的百分比低于未經(jīng)改變以降低蛋白巖藻糖化的人細胞或CHO細胞所產(chǎn)生的免疫球蛋白。
在一實例中，免疫球蛋白是hz7G3V3。例如，免疫球蛋白是包含輕鏈可變區(qū)(\)和重鏈可變區(qū)(Vh)的去巖藻糖化的人源化抗體，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID N0:3所示的序列，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID N0:2所示的序列。例如，免疫球蛋白是包含輕鏈和重鏈的去巖藻糖化的人源化抗體，所述輕鏈包含SEQ ID NO:5所示的序列,所述重鏈包含SEQ ID NO:4所示的序列。
在一實例中，免疫球蛋白是人源化抗體，其包含由不表達可檢測水平的(或表達降低水平的)α-1,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FUT8)的哺乳動物細胞(例如，CHO細胞)表達的輕鏈可變區(qū)(VJ和重鏈可變區(qū)(Vh)，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID Ν0:3所示的序列，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID Ν0:2所示的序列。在一實例中，免疫球蛋白是去巖藻糖化的人源化抗體，其包含由不表達可檢測水平的(或表達降低水平的)α -1, 6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FUT8) 的哺乳動物細胞(例如，CHO細胞)表達的輕鏈和重鏈，所述輕鏈包含SEQ ID NO: 5所示的序列，所述重鏈包含SEQ ID Ν0:4所示的序列。
在一實例中，免疫球蛋白包含F(xiàn)e區(qū)，所述Fe區(qū)包含增強免疫球蛋白所誘導(dǎo)的效應(yīng)子功能的一個或多個氨基酸序列取代。例如，與不含取代的Fe區(qū)相比，一個或多個氨基酸序列取代增加了 Fe區(qū)對Fe Y受體(Fe Y R)的親和力。例如，與不含取代的Fe區(qū)相比，一個或多個氨基酸序列取代增加了 Fe區(qū)對選自Fe Y R1、Fc Y RIIa,Fe y RIIc和Fe y RIIIa的 Fe Y R的親和力。在一實例中，一個或多個氨基酸序列取代是
⑴按照Kabat EU編號系統(tǒng)的S239D、A330L和I332E ;或
(ii)按照 Kabat EU 編號系統(tǒng)的 S239D 和 I332E。
例如，免疫球蛋白是包含輕鏈可變區(qū)(')和重鏈可變區(qū)(Vh)的人源化抗體，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO: 3所示的序列，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO: 2所示的序列， 其中所述抗體包含含有以下的Fe區(qū)
一個或多個氨基酸序列取代是
⑴按照Kabat EU編號系統(tǒng)的S239D、A330L和I332E ;或
(ii)按照 Kabat EU 編號系統(tǒng)的 S239D 和 I332E。
在一實例中，免疫球蛋白選自hz7G3Vl和hz7G3V2。例如，免疫球蛋白是包含這樣的輕鏈和重鏈的抗體(hz7G3Vl)，所述輕鏈包含SEQ ID NO:5所示的序列，所述重鏈包含SEQ ID N0:6所示的序列，或是包含這樣的輕鏈和重鏈的抗體(hz7G3V2)，所述輕鏈包含SEQ ID NO:5所示的序列的輕鏈,所述重鏈包含SEQ ID N0:7所示的序列。
在一實例中，給予哺乳動物免疫球蛋白之后，哺乳動物中循環(huán)的pDC和/或嗜堿性粒細胞的數(shù)量與給予免疫球蛋白之前循環(huán)的PDC和/或嗜堿性粒細胞數(shù)量相比減少至少約 50%。
例如，給予哺乳動物免疫球蛋白之后至少約6小時，哺乳動物中循環(huán)的pDC和/或嗜堿性粒細胞的數(shù)量與給予免疫球蛋白之前循環(huán)的PDC和/或嗜堿性粒細胞數(shù)量相比減少至少約50%。
例如，在給予后沒有進一步給予免疫球蛋白的情況下，哺乳動物中循環(huán)的pDC和/ 或嗜堿性粒細胞的數(shù)量與給予免疫球蛋白之前循環(huán)的PDC和/或嗜堿性粒細胞數(shù)量相比減少至少約50%，持續(xù)至少7天。例如，在給予后沒有進一步給予免疫球蛋白的情況下，哺乳動物中循環(huán)的PDC和/或嗜堿性粒細胞的數(shù)量與給予免疫球蛋白之前循環(huán)的pDC和/或嗜堿性粒細胞數(shù)量相比減少至少約50%,持續(xù)至少8天或10天或11天或15天或20天或21天或22天或28天或35天或42天或49天或50天或57天或60天或63天或70天。
例如，哺乳動物中循環(huán)的pDC和/或嗜堿性粒細胞的數(shù)量與給予免疫球蛋白之前循環(huán)的PDC和/或嗜堿性粒細胞數(shù)量相比減少至少約50%或55%或60%或65%或70%或 75% 或 80% 或 85% 或 90% 或 95% 或 96% 或 97% 或 98% 或 99%。
在一實例中，所述方法包括給予有效量的免疫球蛋白，諸如治療有效量的免疫球蛋白。
在一實例中，所述方法包括給予哺乳動物約O. 0001mg/kg至50mg/kg免疫球蛋白。例如，所述方法包括給予約O. 0005mg/kg至約50mg/kg。例如，所述方法包括給予約 O. 001mg/kg至約45mg/kg。例如，所述方法包括給予約0. 005mg/kg至約40mg/kg。例如， 所述方法包括給予約0. 05mg/kg至約35mg/kg。例如,所述方法包括給予約0. lmg/kg至約 30mg/kg。例如,所述方法包括給予約0. lmg/kg至約15mg/kg。例如,所述方法包括給予約 0. lmg/kg至約10mg/kg。例如,所述方法包括給予約0. lg/kg至約lmg/kg。例如,所述方法包括給予約10mg/kg至約30mg/kg。例如,所述方法包括給予約20mg/kg至約30mg/kg。
在一實例中，給予免疫球蛋白的劑量為0. lmg/kg。
在一實例中，給予免疫球蛋白的劑量為lmg/kg。
在一實例中，給予免疫球蛋白的劑量為10mg/kg。
在一實例中，給予免疫球蛋白的劑量為30mg/kg。
在一實例中，多次給予哺乳動物免疫球蛋白。在一實例中，給藥間的時間為至少約7天,諸如至少約8天,例如,至少約9天或10天。在一實例中，給藥間的時間為至少約11 天。在另一實例中，給藥間的時間為至少約15天,諸如至少約16天,例如，至少約18天或 20天。在一實例中，給藥間的時間為至少約22天。在另一實例中，給藥間的時間為至少約 25天,諸如至少約30天,例如,至少約40天或45天。在一實例中，給藥間的時間為至少約 57或60天。
例如，給予免疫球蛋白的劑量為O. 000lmg/kg至5mg/kg,諸如O. 0005mg/kg至 5mg/kg,例如，O. 00lmg/kg 至 5mg/kg,諸如 O. 005mg/kg 至 5mg/kg,以及 5mg/kg,并且給藥間的時間為至少約7天或8天或9天或10天或11天。例如，給予免疫球蛋白的劑量為O. Olmg/ kg至5mg/kg,并且給藥間的時間為至少約7天或8天或9天或10天或11天。例如,給予免疫球蛋白的劑量為O. lmg/kg至2mg/kg,并且給藥間的時間為至少約7天或8天或9天或 10天或11天。例如，給予免疫球蛋白的劑量為O. lmg/kg至lmg/kg,并且給藥間的時間為至少約7天或8天或9天或10天或11天。在一些實例中，給藥間的時間為至少約7天且小于約22天，諸如至少約11天或15天且小于約20天，例如至少約13天且小于約18天。
在一實例中，給予免疫球蛋白的劑量為O. lmg/kg,并且給藥間的時間為6天或7天或8天或9天或10天或11天或14天或15天。
在一實例中，給予免疫球蛋白的劑量為lmg/kg，并且給藥間的時間為6天或7天或 8天或9天或10天或11天或14天或15天或20天或21天或22天。
例如，給予免疫球蛋白的劑量為6mg/kg至50mg/kg,并且給藥間的時間為至少約 15天。例如,給予免疫球蛋白的劑量為10mg/kg至30mg/kg,并且給藥間的時間為至少約14 或15天。例如,給予免疫球蛋白的劑量為20mg/kg至30mg/kg,并且給藥間的時間為至少約 14或15天。在一些實例中，給藥間的時間為至少約20天且小于約70天，諸如至少約21或 22天且小于約65天，例如至少約25天且小于約57天。
在一實例中，給予免疫球蛋白的劑量為10mg/kg，并且給藥間的時間為14天或15 天 或21天或22天或30天或48天或50天或56天或57天或60天。
在一實例中，給予免疫球蛋白的劑量為30mg/kg，并且給藥間的時間為14天或15 天或21天或22天或30天或48天或50天或56天或57天或60天。
在一實例中，在一段時間和一定條件下，將免疫球蛋白給予患狼瘡如SLE的哺乳動物，從而降低哺乳動物(例如，如本文所述)中循環(huán)的免疫復(fù)合物和/或自身抗體和/或狼瘡如SLE的炎癥或其他癥狀的水平。在一實例中，一次或多次給予免疫球蛋白。在一些實例中，如果多次給予免疫球蛋白，則應(yīng)當給予足以顯著降低哺乳動物(例如，如本文所述) 中循環(huán)的免疫復(fù)合物和/或自身抗體和/或狼瘡如SLE的炎癥或其他癥狀的水平的次數(shù)。 在一些實例中，當哺乳動物(例如，如本文所述)中循環(huán)的免疫復(fù)合物和/或自身抗體和/ 或狼瘡如SLE的炎癥或其他癥狀的水平不再顯著降低時，再次給予免疫球蛋白。
在一些實例中，如果多次給予免疫球蛋白，應(yīng)當給予足以將哺乳動物(例如，如本文所述)中循環(huán)的免疫復(fù)合物和/或自身抗體和/或狼瘡如SLE的炎癥或其他癥狀的水平降低至與健康個體的水平相似的水平(例如，10%或20%內(nèi))的次數(shù)。在一些實例中，當哺乳動物(例如，如本文所述)中循環(huán)的免疫復(fù)合物和/或自身抗體和/或狼瘡如SLE的炎癥或其他癥狀的水平不再顯著降低時，再次給予免疫球蛋白。
在一實例中，所述方法還包括檢測哺乳動物中循環(huán)的免疫復(fù)合物和/或自身抗體和/或狼瘡如SLE的炎癥或其他癥狀的水平，如果水平?jīng)]有降低，重復(fù)給予免疫球蛋白。在一實例中，哺乳動物中循環(huán)免疫復(fù)合物和/或自身抗體和/或狼瘡如SLE的炎癥或其他癥狀的水平降低至在健康哺乳動物中所檢測的水平。在一實例中，所述方法還包括檢測哺乳動物的循環(huán)和/或發(fā)炎組織中的pDC和/或嗜堿性粒細胞的數(shù)量。在一實例中，方法還包括如果在循環(huán)中所檢測到的pDC和/或嗜堿性粒細胞的數(shù)量是給予免疫球蛋白之前循環(huán)中的PDC和/或嗜堿性粒細胞數(shù)量的約50%內(nèi)，則重復(fù)給予免疫球蛋白。例如，方法還包括如果在循環(huán)中所檢測到的PDC和/或嗜堿性粒細胞的數(shù)量是給予免疫球蛋白之前循環(huán)中的PDC和/或嗜堿性粒細胞數(shù)量的約60%、70%、75%、80%、85%、90%或95%內(nèi)，則重復(fù)給予免疫球蛋白。在一實例中，在免疫球蛋白給藥停止之后，個體中循環(huán)的pDC和/或嗜堿性粒細胞 的數(shù)量增加。例如，個體中循環(huán)的PDC和/或嗜堿性粒細胞的數(shù)量增加至與正?；蚪】祩€體和/或正常或健康個體群體中的水平相似的水平。例如，在停止治療后約11天或20天或22天或30天或57天或60天或65天或70天之后，個體中循環(huán)的pDC和/或嗜堿性粒細胞的數(shù)量增加。本公開還提供了預(yù)防哺乳動物的狼瘡如SLE復(fù)發(fā)的方法，所述方法包括將本文根據(jù)任何實例所述的免疫球蛋白給予經(jīng)歷狼瘡如SLE復(fù)發(fā)或有發(fā)展狼瘡如SLE復(fù)發(fā)風險的哺乳動物，從而預(yù)防狼瘡如SLE的復(fù)發(fā)。在一實例中，方法包括給予有效量的免疫球蛋白，諸如預(yù)防有效量的免疫球蛋白。在一實例中，方法還包括鑒定經(jīng)歷狼瘡如SLE復(fù)發(fā)的哺乳動物。例如，所述方法包括檢測哺乳動物循環(huán)中的自身抗體(例如，抗Clq)和/或抗dsDNA抗體和/或免疫復(fù)合物。確定經(jīng)歷狼瘡如SLE復(fù)發(fā)的哺乳動物的方法是本領(lǐng)域內(nèi)已知的和/或是本文所描述的。在一實例中，按照本文根據(jù)本公開的任何實例所述給予免疫球蛋白。在一實例中,待治療的哺乳動物需要這種治療。例如，哺乳動物患有疾病或疾病狀態(tài)或有發(fā)展出疾病或疾病狀態(tài)的風險或正在經(jīng)歷疾病或疾病狀態(tài)的復(fù)發(fā)或有復(fù)發(fā)的風險。在一實例中，需要治療的哺乳動物循環(huán)中的IFNa水平升高，例如與健康哺乳動物群體中所檢測的水平相比。合適地，按照本公開的前述實例，哺乳動物是人。根據(jù)以下的詳細描述，其他方面、實例和優(yōu)勢將變得顯而易見。給予的詳細描述和具體實例僅為說明性的，因為根據(jù)該詳細描述，本公開實質(zhì)和范圍內(nèi)的各種改變和變動對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言都將是顯而易見的。此外，實例表明了本公開所公開的方法的原理，并未具體說明本公開適用的對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言明顯有用的所有實例。附圖的簡要說明

圖1圖示了多種細胞譜系(X軸)中每個細胞的IL-3Ra的平均表達水平(Y軸)。圖2包括兩幅圖，顯示了多種劑量的能結(jié)合IL-3Ra的去巖藻糖化人源化抗體(hz7G3V3)給藥之前和之后，嗜堿性粒細胞(左側(cè))或pDC(右側(cè))的百分比。數(shù)量表示為外周血樣品中總細胞的百分比(Y軸)。相對于抗體給藥時間的外周血收集時間顯示在X軸上。還顯示了抗體的劑量。圖3圖示了多種抗體在不同條件下誘導(dǎo)的ADCC所引起的細胞裂解水平。命名所研究的抗體的系統(tǒng)命名法與本文描述的一致。在自體靶標效應(yīng)子條件(pDCl-NKl、pDC2-NK2)和異體靶標效應(yīng)子條件(pDCl-NK2、pDC2-NKl)下研究抗體。結(jié)果表示為所測定的特異性裂解的百分比，為用ExtranTM獲得的自發(fā)裂解和最大裂解的函數(shù)。圖4包括兩幅圖，顯示了含有用C型CpG寡核苷酸活化的pDC的PBMC分泌到細胞培養(yǎng)基中的IFNa的量。細胞與X軸上所示濃度的所示抗體一起培養(yǎng)。利用ELISA檢測到的IFNa的量顯示在Y軸上。顯示了利用寡核苷酸活化后6小時(左側(cè))和24小時(右偵D進行測定的結(jié)果。·圖5圖示了含有用C型CpG寡核苷酸活化的pDC的PBMC分泌到細胞培養(yǎng)基中的IFNa的量。細胞與多種濃度的能結(jié)合IL-3Ra的去巖藻糖化人源化抗體(hz7G3V3)或同種型對照抗體(如圖所示)一起培養(yǎng)。利用ELISA檢測到的IFNa的量顯示在Y軸上。顯示了利用寡核苷酸活化后24小時進行測定的結(jié)果。圖6圖示了用含有C型CpG寡核苷酸活化的pDC的PBMC分泌到細胞培養(yǎng)基中的IFNa的量。細胞與多種濃度的能結(jié)合IL-3Ra的去巖藻糖化人源化抗體(hz7G3V3)或相同抗體的Fab片段(7G3Fab)(如圖所示)一起培養(yǎng)。利用ELISA檢測到的IFNa的量顯示在Y軸上。顯示了利用寡核苷酸活化后24小時進行測定的結(jié)果。發(fā)明的詳細描述序列表說明SEQ ID N0:1是IL_3Ra鏈的氨基酸序列。SEQ ID NO: 2是hz7G3的Vh的氨基酸序列。SEQ ID NO: 3是hz7G3的Vl的氨基酸序列。SEQ ID N0:4是hz7G3的重鏈的氨基酸序列。SEQ ID N0:5是hz7G3的輕鏈的氨基酸序列。SEQ ID N0:6是hz7G3Vl的重鏈的氨基酸序列。SEQ ID NO: 7是hz7G3V2的重鏈的氨基酸序列。通則在整個說明書中，除非明確陳述并非如此或上下文指示并非如此，提及一個步驟、物質(zhì)組成、步驟組或物質(zhì)組合物組應(yīng)當被認為包括一個和多個(即一或多)步驟、物質(zhì)組成、步驟組或物質(zhì)組成組。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，本公開允許進行除了所具體描述的那些之外的變化和修改。應(yīng)當理解，本公開包括所有這些變化和修改。本公開還包括本說明書中單獨或共同提及或指出的所有步驟、特征、組合物和化合物，以及任何兩個或更多個步驟或特征的任何和所有組合。本公開并非限制于本文描述的具體實例的范圍，這些實例僅意圖示例的目的。功能等同的產(chǎn)物、組合物和方法明確處于本公開的范圍內(nèi)。本公開的任何實例應(yīng)被認為準用于本公開的任何其他實例，除非本公開明確陳述并非如此。除非明確限定并非如此，本文所用的所有技術(shù)和科學術(shù)語應(yīng)當被認為具有與本領(lǐng)域技術(shù)人員(例如，細胞培養(yǎng)、分子遺傳學、免疫學、免疫組織化學、蛋白化學和生物化學中)所通常理解的相同的含義。
除非指出并非如此，本公開中所用的細胞培養(yǎng)和免疫學技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標準方法。這類技術(shù)在以下來源的文獻中有描述和解釋，諸如J.Perbal，APractical Guide to Molecular Cloning,John Wiley and Sons (1984),J.Sambrooket al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (分子克隆實驗室手冊)，ColdSpring Harbour Laboratory Press(1989), T. A. Brown (主編),Essential MolecularBiology:A Practical Approach(基礎(chǔ)分子生物學實踐方法)，Volumes I and2, IRL Press(1991), D. M. Glover and B. D. Hames(主編)，DNA Cloning:A PracticalApproach (DNA 克隆實踐方法)，Volumes 1-4, IRL Press (1995and 1996), andF. M. Ausubel et al.(主編)，Current Protocols in Molecular Biology (分子生物學現(xiàn)行規(guī)范)，Greene Pub. Associates and Wiley-1nterscience (1988,包括至今的所有更新)，Ed Harlow and David Lane (主編)antibodies: A Laboratory Manual (抗體實驗室手冊)，Cold Spring Harbour Laboratory, (1988),以及 J. E. Coligan et al.(主編)Current Protocols in Immunology (免疫學最新實驗方案)，John Wiley & Sons (包括至今的所有更新)。
通過 Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, NationalInstitutes of Health, Bethesda, Md. , 1987 and 1991,Bork et al.,J Mol.Biol.242，309-320，1994，Chothia and Lesk J. Mol Biol.196:901-917，1987，Chothia etal. Nature 342，877-883，1989 和 / 或 Al-Lazikani et al. , J Mol Biol273, 927-948, 1997中的論述可以進一步闡明本文關(guān)于可變區(qū)及其一部分、免疫球蛋白、抗體及其片段的的描述和定義。術(shù)語“和/或”，例如“X和/或Y”應(yīng)被理解為表示“X和Y”或“X或Y”，并且應(yīng)當被認為為兩種含義或任一種含義提供了明確的支持。在整個說明書中，詞語“包含(comprise) ”或變型如“包含(comprises) ”或“包含(comprising) ”應(yīng)被理解為暗指包括所陳述的元件、整體或步驟,或元件、整體或步驟組，但是不排除任何其他元件、整體或步驟，或元件、整體或步驟組。本文所用的術(shù)語“來源于”用來表示指定的整體可以獲自特定的來源，盡管并不必然直接來自該來源。選擇的定義本文所用的術(shù)語“免疫球蛋白”包括免疫球蛋白基因復(fù)合物的任何抗原結(jié)合蛋白產(chǎn)物，包括免疫球蛋白同種型IgA、IgD、IgM、IgG和IgE及以上的抗原結(jié)合片段。示例性的免疫球蛋白是抗體。免疫球蛋白可以是多克隆的或單克隆的，單克隆抗體是本公開的一種示例性形式。術(shù)語“免疫球蛋白”包括適于去免疫化從而降低或消除哺乳動物對已給予所述哺乳動物的免疫球蛋白的免疫應(yīng)答的任何免疫球蛋白。在治療人的特定情況下，合適的免疫球蛋白包括嵌合、人源化或人免疫球蛋白。術(shù)語“免疫球蛋白”還包括包含改變的或變異的氨基酸殘基、序列或糖基化的經(jīng)修飾、誘變、嵌合和/或人源化的免疫球蛋白，不管其是天然存在的還是人類干預(yù)所產(chǎn)生的(例如通過重組DNA技術(shù))。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，基于適合結(jié)合IL-3Rci鏈的可選的免疫球蛋白或非免疫球蛋白支架，本公開的“免疫球蛋白”可以用其他結(jié)合部分和/或序列替代。示例性的蛋白包括Fe受體結(jié)合部分。例如，術(shù)語“免疫球蛋白”所包括的蛋白包括結(jié)構(gòu)域抗體、駱駝抗體和來自軟骨魚的抗體(即，免疫球蛋白新抗原受體(IgNAR))。通常，駱駝抗體和IgNAR包含VH，而缺少\，并且通常被稱為重鏈免疫球蛋白。其他“免疫球蛋白”包括T細胞受體和含有其他免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域的能夠結(jié)合抗原的蛋白，例如借助包含可變區(qū)的抗原結(jié)合位點。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當意識到，“抗體”通常被認為是由多條多肽鏈(例如包含\的多肽和包含Vh的多肽)組成的包含可變區(qū)的蛋白?？贵w通常還包含恒定結(jié)構(gòu)域，其中的一些可以排列成恒定區(qū)或恒定片段或可結(jié)晶片段(Fe)。V1^P'相互作用，從而形成包含抗原結(jié)合區(qū)的Fv，所述抗原結(jié)合區(qū)能夠特異性結(jié)合一種或數(shù)種密切相關(guān)的抗原。通常，來自哺乳動物的輕鏈是K輕鏈或λ輕鏈,來自哺乳動物的重鏈是α、δ、ε、Y或μ。抗體可以為任何類型(例如，IgG, IgE, IgM, IgD, IgA和IgY)、種類(例如，IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)或亞類。術(shù)語“抗體”還包括人源化抗體、靈長類源化抗體(primatizedantibody)、人抗體和嵌合抗體。術(shù)語“全長抗體”、“完整抗體”或“全抗體”可交換使用，與抗體的抗原結(jié)合片段相反，是指處于基本完整形式的抗體。具體而言，全抗體包括具有包含F(xiàn)e區(qū)的重鏈和輕鏈的抗體。恒定結(jié)構(gòu)域可以是野生型序列的恒定結(jié)構(gòu)域(例如，人野生型序列的恒定結(jié)構(gòu)域) 或其氨基酸序列變體。在某些情況下，完整抗體可以具有一種或多種效應(yīng)子功能?？贵w的“抗原結(jié)合片段”包含完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)和/或可變區(qū)?？贵w片段的實例包括Fab、Fab’、F(ab' )2和Fv片段；雙鏈抗體；線性抗體；單鏈抗體分子以及由抗體片段形成的多特異性抗體。在本公開的背景下，“效應(yīng)子功能”是指由能與抗體的Fe區(qū)(天然序列Fe區(qū)或氨基酸序列變異的Fe區(qū))結(jié)合的細胞或蛋白介導(dǎo)的那些生物活性，其會導(dǎo)致殺死細胞。由抗體誘導(dǎo)的效應(yīng)子功能的實例包括補體依賴性細胞毒性；抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC);抗體依賴性細胞介導(dǎo)的吞噬作用(ADCP);和B細胞活化。在本公開的背景下，術(shù)語“由免疫球蛋白誘導(dǎo)的效應(yīng)子功能”或類似用語與“免疫球蛋白的效應(yīng)子功能”或類似用語可交換使用，且每一種都為另一種提供文字支持?！翱贵w依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性”或“ADCC”指一種形式的細胞毒性，其中分泌的Ig結(jié)合至某些細胞毒性細胞(例如，自然殺傷(“NK”)細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞)展示的Fe受體(“FcR”)上，致使這些細胞毒性效應(yīng)細胞能夠特異性結(jié)合承載抗原的靶細胞，隨后用細胞毒素殺死靶細胞。為了評價目的分子的ADCC活性，可以進行體外ADCC測定。用于這類測定的可用效應(yīng)細胞包括外周血單核細胞(“PBMC”)和NK細胞。本文所用的“可變區(qū)”是指本文所定義的能夠特異性結(jié)合抗原的抗體的輕鏈和/或重鏈部分，并且例如包括⑶R的氨基酸序列，即，⑶R1、⑶R2和⑶R3以及框架區(qū)(FR)。例如，可變區(qū)包含三或四個FR(例如，F(xiàn)RU FR2、FR3和任選的FR4)以及三個⑶R。Vh是指重鏈的可變區(qū)。VL是指輕鏈的可變區(qū)。在實施本公開的方法的過程中，歸于CDR和FR的氨基酸位置可以按照Kabat (1987 and 1991，同上)或其他編號系統(tǒng)限定，例如Clothiaand Lesk(1987 和 / 或 1989,同上和 / 或 Al-Lazikani et al·, 1997,同上)的高變環(huán)編號系統(tǒng)。例如，按照Kabat編號系統(tǒng)，Vh FR和⑶R的定位如下按照Kabat編號系統(tǒng)編號的殘基 1-30 (FRl)，31-25 (CDRl)，36-49 (FR2)，50-65 (CDR2)，66-94 (FR3)，95-102 (CDR3)和103-113 (FR4)。例如，按照Kabat編號系統(tǒng)，Vl FR和CDR的定位如下殘基1- 23 (FRl)，24-34(CDRl)，35-49(FR2)，50-56(CDR2)，57-88(FR3)，89-97(CDR3)和 98-107(FR4)。
本文所用的術(shù)語“互補性決定區(qū)”(同義CDR ；BP⑶R1、⑶R2和⑶R3)是指在FR間形成環(huán)的抗體可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基，其序列隨抗體不同而不同。一些或所有CDR賦予抗體結(jié)合抗原的能力。每個可變結(jié)構(gòu)域通常具有被稱為⑶R1、⑶R2和⑶R3的三個⑶R區(qū)。每個互補性決定區(qū)可以包含來自Kabat et al.，(1991)所定義的“互補性決定區(qū)”的氨基酸殘基和/或來自Chothia and Lesk(1987)或任何其他已知的編號技術(shù)或以上的組合的“高變環(huán)”的那些殘基，包括頂GT編號系統(tǒng)(Le Franc et al.，2003)?！翱蚣軈^(qū)”(下文稱為FR)是除了⑶R殘基之外的那些可變結(jié)構(gòu)域殘基。本文所用的術(shù)語“恒定區(qū)”或“可結(jié)晶片段”或“Fe”或“Fe區(qū)”或“Fe部分”(其在本文可交換使用)是指包含至少一個恒定結(jié)構(gòu)域的抗體部分，并且其通常(盡管不是必需)是糖基化的且能夠與一種或多種Fe受體和/或補體級聯(lián)的組分結(jié)合。重鏈恒定區(qū)可以選自五種同種型即α、δ、ε、Y或μ中的任一種。此外，不同亞類的重鏈(諸如IgG亞類的重鏈)負責不同的效應(yīng)子功能，并且因而，通過選擇所需的重鏈恒定區(qū)，可以產(chǎn)生具有期望效應(yīng)子功能的蛋白。示例性的重鏈恒定區(qū)是Y I(IgGl), y2(IgG2)和Y3(IgG3)或以 上的雜合體?！昂愣ńY(jié)構(gòu)域”是抗體中的結(jié)構(gòu)域，其序列在同種型抗體/抗體如IgG或IgM或IgE間是高度相似的。抗體的恒定區(qū)通常包含多個恒定結(jié)構(gòu)域，例如Υ、α和δ重鏈的恒定區(qū)包含兩個恒定結(jié)構(gòu)域。本文所用的術(shù)語“特異性結(jié)合”應(yīng)該認為表示，與備選抗原或細胞相比，免疫球蛋白能更頻繁、更快速、更持久和/或以更高的親和力與IL-3Ra或表達IL_3Ra的細胞反應(yīng)或結(jié)合。通過閱讀本定義還應(yīng)當理解，例如，能夠特異性結(jié)合IL-3Ra的免疫球蛋白可以特異性結(jié)合第二抗原或者可以不特異性結(jié)合第二抗原。因此，“特異性結(jié)合”并不必然排除另一種抗原的結(jié)合或非可檢測結(jié)合。術(shù)語“特異性結(jié)合”與本文的“選擇性結(jié)合”可以交換使用。通常，本文提及結(jié)合表示特異性結(jié)合，并且每個術(shù)語應(yīng)被理解為為另一術(shù)語提供明確的支持。術(shù)語“競爭性抑制”應(yīng)當被理解為表示，免疫球蛋白降低或防止稱為7G3的單克隆抗體與IL-3Ra的結(jié)合。從上文顯而易見的是，免疫球蛋白不需要完全抑制單克隆抗體7G3的結(jié)合，而是其僅需要將結(jié)合降低統(tǒng)計學顯著的量，例如，降低至少約10%或20%或30%或40%或50%或60%或70%或80%或90%或95%。測定結(jié)合的競爭性抑制的方法是本領(lǐng)域內(nèi)已知的和/或如本文所述。例如，在存在或不存在免疫球蛋白的情況下，將單克隆抗體7G3暴露于IL_3Ra。如果在存在免疫球蛋白的情況下比在不存在免疫球蛋白的情況下結(jié)合的單克隆抗體少，則認為免疫球蛋白競爭性抑制單克隆抗體7G3的結(jié)合。兩個表位背景下的“重疊”應(yīng)該被認為表示，兩個表位共享足以允許能結(jié)合一個表位的免疫球蛋白競爭性抑制能結(jié)合另一表位的免疫球蛋白的結(jié)合的數(shù)量的氨基酸殘基。例如，兩個表位共享至少I或2或3或4或5或6或更多個氨基酸。本文所用的術(shù)語“中和”應(yīng)該被認為表示，免疫球蛋白能夠降低或防止細胞中的IL-3介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或降低或防止IL-3與IL-3Ra鏈和/或IL_3Ra鏈與IL_3Ri3鏈的異二聚體(也稱為集落刺激因子2受體)的結(jié)合。本文提及“單克隆抗體7G3”或“7G3”是指以登錄號HB-12009保藏在ATCC以及在US6177078中所描述的稱為7G3的雜交瘤所產(chǎn)生的單克隆抗體。單克隆抗體7G3也是商購可獲得的，例如從BD Biosciences (NJ，USA)獲得。術(shù)語“Kabat的EU編號系統(tǒng)”應(yīng)當被理解為表示，免疫球蛋白重鏈的編號是按照 Kabat et al. , 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5thEd. , United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda中所教導(dǎo)的EU指數(shù)。EU指數(shù)基于人IgGl EU抗體的殘基編號。本文所用的術(shù)語“治療”是指在臨床病理過程中為改變被治療的個體或細胞的自然過程而設(shè)計的臨床干預(yù)。期望的治療效果包括降低疾病進展的速率、改善或緩和疾病狀態(tài)以及緩和或改良預(yù)后。例如，如果與疾病(例如，狼瘡)相關(guān)的一種或多種癥狀減輕或消除了，則個體被成功“治療”。本文所用的術(shù)語“預(yù)防”包括在個體中提供與疾病的發(fā)作或復(fù)發(fā)相關(guān)的預(yù)防。個體可以傾向于或有發(fā)展疾病或疾病復(fù)發(fā)風險，但是還沒有診斷出疾病或疾病復(fù)發(fā)。如本文所用的，有發(fā)展疾病或疾病狀態(tài)或其復(fù)發(fā)(例如SLE)或再度惡化“風險”的 哺乳動物，在按照本公開進行治療之前可能具有或可能不具有可檢測的疾病或疾病癥狀，以及可能已表現(xiàn)出或可能還未表現(xiàn)出可檢測的疾病或疾病癥狀。“有風險”表示哺乳動物具有一種或多種風險因子，所述風險因子是與本領(lǐng)域已知的和/或本文所描述的疾病或疾病狀態(tài)發(fā)展相關(guān)的可測量的參數(shù)?！坝行Я俊笔侵钢辽僭趧┝可嫌行У牧壳页掷m(xù)實現(xiàn)期望的治療或預(yù)防效果所需的時間?？梢栽谝淮位蚨啻谓o藥中提供有效量。在本公開的一些實例中，術(shù)語“有效量”表示實現(xiàn)上文所述的疾病或疾病狀態(tài)的治療所需的量。有效量可以隨待治療的疾病或疾病狀態(tài)而不同，并且還可以隨與被治療的哺乳動物相關(guān)的體重、年齡、種族背景、性別、健康狀況和/或身體狀況以及其他因素而不同。通常，有效量可以落入醫(yī)學從業(yè)者通過常規(guī)測試和實驗可以確定的相對寬泛的范圍(例如“劑量”范圍)內(nèi)。可以以單劑量或可以以在一段治療時間重復(fù)一次或數(shù)次的劑量給予有效量。“治療有效量”至少是實現(xiàn)特定病癥(例如，SLE)可測量的改善所需的最低濃度。本文的治療有效量可以隨諸如患者的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重的因素以及個體中免疫球蛋白引發(fā)期望應(yīng)答的能力而不同。治療有效量還是其中治療有益作用超過免疫球蛋白的任何毒性或有害作用的量。“預(yù)防有效量”是指在劑量上有效的量且持續(xù)實現(xiàn)期望的預(yù)防效果所需的時間。通常但并非必需的，由于預(yù)防劑量在疾病之前或在疾病早期階段用于哺乳動物中，因此預(yù)防有效量可以小于治療有效量。如本文所用的，“漿細胞樣樹突狀細胞”或“pDC”是見于外周血淋巴器官中的能產(chǎn)生I型干擾素如IFNa和IFN β的一類循環(huán)樹突狀細胞。人pDC表達表面標志物IL_3Ra、BDCA-2 (CD303)、BDCA_4 (CD304)和 toll 樣受體 7 和 9。通常，人 pDC 不表達 CDllc 或 CD14。典型的人 pDC 表面表型是 CD20' CD3TD14' CD19XD56' HUTDR+、CDllcT 和 CD123+。如本文所用的，“嗜堿性粒細胞”是一類能產(chǎn)生多種細胞因子(例如，IL-4、IL-6、IL-13)、組胺和白三烯的稀有的粒細胞。人嗜堿性粒細胞表達細胞表面標志物如IL-3Ra、Fe ε Rl、CD49b、CD69 或 CD203。術(shù)語“裸抗體”是指沒有與另一種化合物，例如毒性化合物或放射性標記物綴合的抗體。
僅為了系統(tǒng)命名的目的且并非限制，IL-3RCI鏈的氨基酸序列參見Gene ID登錄號 3563 和 / 或 SEQ ID NO:1。按照本公開治療的“哺乳動物”可以靈長類、牲畜(例如綿羊、馬、牛、豬、驢)、伴生動物(例如諸如狗和貓的寵物)、實驗室試驗動物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠)、表演動物(例如賽馬、駱駝、靈緹犬)或捕獲的野生動物。在一實例中，哺乳動物是人。免瘡球蛋白適用于本公開方法的示例性免疫球蛋白如本文所述，并且以下的段落描述了其他示例性的免疫球蛋白。 在一實例中，免疫球蛋白能夠減少已與IFN α分泌誘導(dǎo)劑接觸的PBMC的IFN α分泌。例如，將PBMC暴露于toll樣受體(TLR) -7/9激動劑，例如CpG寡核苷酸，例如C型CpG寡核苷酸。例如，將細胞與濃度為ΙμΜ或2μΜ或3μΜ或4μΜ或5μΜ的C型CpG寡核苷 酸接觸。在一實例中，與在不存在免疫球蛋白或存在同種型對照免疫球蛋白(例如，其不結(jié)合IL-3Ra)情況下的水平相比，IFNa的水平降低。在一實例中，IFNa的水平降低約50%或至少60%或至少70%或至少80%或至少90%。例如，免疫球蛋白能夠?qū)崿F(xiàn)IFN α的降低，其濃度為O. 01 μ g/ml至約15 μ g/ml,例如O. 04 μ g/ml至約4 μ g/ml,例如,O.1 μ g/ml至約I μ g/ml0在另一實例中，免疫球蛋白能夠減少PBMC群體中可檢測的pDC和/或嗜堿性粒細胞的數(shù)量。在一實例中，與在不存在免疫球蛋白或存在同種型對照免疫球蛋白(例如，其不結(jié)合IL-3Ra )情況下的水平相比，pDC和/或嗜堿性粒細胞的數(shù)量減少。在一實例中，pDC和/或嗜堿性粒細胞的數(shù)量減少約50%或至少60%或至少70%或至少80%或至少90%。在一實例中，免疫球蛋白能夠在PBMC與免疫球蛋白接觸后4小時內(nèi)，或PBMC與免疫球蛋白接觸后24小時內(nèi)或PBMC與免疫球蛋白接觸后48小時內(nèi)減少pDC和/或嗜堿性粒細胞的數(shù)量。在另一實例中，在以不超過2mg/kg的劑量,例如不超過lmg/kg的劑量或不超過O. lmg/kg的劑量單次給藥后，免疫球蛋白能夠減少哺乳動物(例如，非人靈長類，諸如石蟹猴)中循環(huán)的嗜堿性粒細胞和/或pDC的數(shù)量,持續(xù)至少7天。例如,嗜堿性粒細胞和/或PDC的數(shù)量減少至小于給予免疫球蛋白之前的細胞數(shù)量的70%(或80%或90%或95%)。在一實例中，將細胞的數(shù)量計算為外周血中總細胞的百分比。例如，細胞減少持續(xù)至少8天或10天或11天。例如,pDC數(shù)量減少持續(xù)至少8天或9天或10天或11天或12天或13天或14天或15天。在一實例中,pDC數(shù)量減少持續(xù)至少11天。例如,嗜堿性粒細胞數(shù)量減少持續(xù)至少5天或6天或7天或8天或9天或10天。在一實例中，嗜堿性粒細胞數(shù)量減少持續(xù)至少8天。在另一實例中，在以不超過40mg/kg的劑量,例如不超過30mg/kg的劑量或不超過10mg/kg的劑量單次給藥后，免疫球蛋白能夠降低哺乳動物(例如，非人靈長類，諸如石蟹猴)中循環(huán)的嗜堿性粒細胞和/或pDC的數(shù)量,持續(xù)至少15天。例如,嗜堿性粒細胞和/或PDC的數(shù)量降低至小于給予免疫球蛋白之前的細胞數(shù)量的70%(或80%或90%或95%)。在一實例中，將細胞的數(shù)量計算為外周血中總細胞的百分比。例如，細胞降低持續(xù)至少21天或22天或30天或35天或40天或49天或50天或57天或63天或65天或70天。例如，pDC數(shù)量降低持續(xù)至少12天或13天或14天或15天或16天或17天或18天或19天或20天。在一實例中，PDC數(shù)量降低持續(xù)至少15天。例如，嗜堿性粒細胞數(shù)量降低持續(xù)至少12天或13天或14天或15天或16天或17天或18天或19天或20天或21天或22天或23天或24天或25天或26天或27天或28天。在一實例中，嗜堿性粒細胞數(shù)量降低持續(xù)至少15天(例如，10mg/kg劑量之后)或22天(例如,30mg/kg劑量之后)。在一實例中，當給予哺乳動物(例如，非人靈長類，諸如石蟹猴)時，免疫球蛋白不減少或消耗嗜中性粒細胞和/或T細胞和/或B細胞和/或單核細胞和/或紅細胞的數(shù)量。例如，與給予免疫球蛋白之前的水平相比，免疫球蛋白不能使嗜中性粒細胞和/或T細胞和/或B細胞和/或單核細胞和/或紅細胞的數(shù)量減少或消耗超過約10%或20%或30%或40%或50%或統(tǒng)計學顯著的量。例如，免疫球蛋白不誘導(dǎo)嗜中性粒細胞和/或T細胞和/或B細胞和/或單核細胞和/或紅細胞的死亡。技述 在一實例中，按照任何實例，本文所述的免疫球蛋白是抗體。產(chǎn)生抗體的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的和/或描述于Harlow and Lane (主編)Antibodies:A Laboratory Manual (抗體實驗室手冊)，Cold Spring HarborLaboratory, (1988)。通常，在這類方法中，將IL-3R α蛋白或其免疫原性片段或表位或表達并展示這些(即，免疫原)的細胞，任選地與任何合適的或期望的載體、佐劑或藥學上可接受的賦形劑一起配制，并給予非人動物，例如，小鼠、雞、大鼠、兔、豚鼠、狗、馬、牛、山羊或豬。可以通過鼻內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)途徑或通過任何其他已知的途徑給予免疫原?？梢酝ㄟ^對免疫后不同時間點的免疫動物采集血液來監(jiān)測多克隆抗體的產(chǎn)生。如果需要達到期望的抗體滴度，可以給予一次或多次另外的接種免疫。重復(fù)增強和滴定的過程直到達到合適的滴度。當獲得期望的免疫原性水平時，對免疫動物取血，分離血清并儲存，和/或使用動物來產(chǎn)生單克隆抗體(Mab)。單克隆抗體是本公開所考慮的一種示例性的抗體形式。術(shù)語“單克隆抗體”或“MAb”是指能夠與相同的抗原，例如，抗原內(nèi)相同的表位結(jié)合的同質(zhì)抗體群。該術(shù)語并非意圖限制抗體的來源或產(chǎn)生抗體的方式。為了產(chǎn)生Mab，可以使用多種已知技術(shù)中的任何一種，諸如例如，US4196265或Harlow and Lane (1988),同上中示例的方法。例如，在足以刺激產(chǎn)抗體細胞的條件下，用免疫原免疫合適的動物。諸如兔、小鼠和大鼠的嚙齒動物是示例性動物。經(jīng)遺傳改造以表達人免疫球蛋白并且例如不表達鼠免疫球蛋白的小鼠，也可以用于產(chǎn)生本公開的抗體(例如，如W02002/066630中所描述)。免疫后，選擇具有產(chǎn)生抗體潛能的體細胞，尤其是B淋巴細胞(B細胞)，用于產(chǎn)生MAb的方案中。這些細胞可以獲自脾、扁桃體或淋巴結(jié)的活檢組織，或獲自外周血樣品。然后將來自免疫動物的B細胞與永生的骨髓瘤細胞融合，所述骨髓瘤細胞通常來源于與免疫原所免疫的動物相同的物種。通過在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)來擴增雜合體，所述選擇培養(yǎng)基包含能在組織培養(yǎng)基中阻斷核苷酸重新合成的試劑。示例性的試劑氨基蝶呤、氨甲蝶呤和重氮絲氨酸。例如，通過流式細胞術(shù)和/或免疫組化和/或免疫測定(例如放射性免疫測定、酶免疫測定、細胞毒性測定、空斑測定、斑點免疫測定等)，將擴增的雜交瘤進行抗體特異性和/或滴度的功能選擇。可選地，ABL-MYC技術(shù)(NeoClone，Madison WI 53713，USA)用于產(chǎn)生分泌 MAb 的細胞系(例如，如 Largaespada et al, J.1mmunol. Methods. 197:85-95，1996 中所描述的)。還可以通過篩選展示文庫，例如噬菌體展示文庫，來產(chǎn)生和分離抗體，例如如US6300064和/或US5885793中所描述的。在一實例中，抗體是US 6，177,078中所描述的7G3、6H6或9F5。還考慮這些抗體的修飾版本(例如，諸如通過本文所述方法的去免疫化、嵌合或人源化版本)。嵌合抗體免疫球蛋白可以是合成的免疫球蛋白。在一實例中，本文所述的抗體是嵌合抗體。術(shù)語“嵌合抗體”是指這樣抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與來源于特定物種(例如， 鼠，諸如小鼠)或?qū)儆谔囟贵w種類或亞類的抗體中的對應(yīng)序列相同或同源，而鏈的其余部分與與來源于另一物種(例如，靈長類，諸如人)或?qū)儆诹硪豢贵w種類或亞類的抗體中的對應(yīng)序列相同或同源。通常，為了產(chǎn)生主要具有人結(jié)構(gòu)域的抗體，嵌合抗體利用嚙齒動物或兔的可變區(qū)以及人的恒定區(qū)。產(chǎn)生嵌合抗體的方法描述于例如US4816567和US5807715中。本公開還包括嵌合免疫球蛋白，例如其中將來自一個物種的可變區(qū)與來自另一物種的蛋白區(qū)融合。例如，本公開考慮包含來自一物種的T細胞受體的可變區(qū)的免疫球蛋白，所述T細胞受體的可變區(qū)與來自不同物種的T細胞受體恒定結(jié)構(gòu)區(qū)域融合。人源化抗體和人抗體本公開的抗體可以是人源化的或人的。術(shù)語“人源化抗體”應(yīng)被理解為指一種嵌合抗體亞類，其具有來源于非人物種的抗體的抗原結(jié)合位點或可變區(qū)和其余的基于人抗體的結(jié)構(gòu)和/或序列的抗體結(jié)構(gòu)?？乖Y(jié)合位點包含移植到人抗體可變結(jié)構(gòu)域的適當FR上的來自非人抗體的互補性決定區(qū)(CDR)和其余來自人抗體的區(qū)域。抗原結(jié)合位點可以是野生型的或通過一個或多個氨基酸取代而修飾的。在某些情況下，人免疫球蛋白的FR殘基由對應(yīng)的非人殘基取代。非人抗體或或其一部分(例如，可變區(qū))人源化的方法是本領(lǐng)域內(nèi)已知的?？梢园凑誙S5225539或US5585089的方法進行人源化。不排除抗體人源化的其他方法。本文所用的與抗體相關(guān)的術(shù)語“人抗體”是指具有來源于或?qū)?yīng)于人(例如人種系細胞或體細胞)中所見的序列的可變區(qū)(例如VH、VJ以及任選地恒定區(qū)的抗體?！叭丝贵w”可以包括不是人序列所編碼的氨基酸殘基，例如通過隨機或體外定點突變所引入的突變(尤其是涉及少量的抗體殘基，例如抗體的1、2、3、4或5個殘基，例如構(gòu)成抗體的一個或多個⑶R的1、2、3、4或5個殘基中的保守型取代或突變)。這些“人抗體”實際上并非必需由人產(chǎn)生，而是，它們可以利用重組方法產(chǎn)生和/或可以從包含編碼人抗體恒定區(qū)和/或可變區(qū)的核酸的轉(zhuǎn)基因動物(例如，小鼠)分離(例如，如上文所述)。人抗體可以利用本領(lǐng)域內(nèi)已知的多種技術(shù)來產(chǎn)生，包括噬菌體展示文庫(例如，如US5885793中所描述的)。識別所選表位的人抗體還可以利用稱為“定向選擇(guided selection) ”的技術(shù)來產(chǎn)生。在該方法中，所選的非人單克隆抗體，例如小鼠抗體，用于指導(dǎo)識別相同表位的完全為人的抗體的選擇(例如，如US5565332中所描述的)。去免疫化抗體和免疫球蛋白本公開還考慮去免疫化抗體或蛋白。去免疫化抗體和蛋白已被移除(即，突變)了一個或多個表位，例如B細胞表位或T細胞表位，從而降低了哺乳動物將激發(fā)對所述抗體或蛋白的免疫應(yīng)答的可能性。產(chǎn)生去免疫化抗體和蛋白的方法是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，且描述于例如 W000/34317、W02004/108158 和 W02004/064724 中。引入合適的突變并表達和測定所產(chǎn)生的蛋白的方法基于本文的描述對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。重鏈抗體重鏈抗體在結(jié)構(gòu)上與很多其他形式的抗體的不同在于，它們包含重鏈但不包含輕鏈。因此，這些免疫球蛋白也被稱為“只有重鏈的抗體”。重鏈免疫球蛋白見于例如，駱駝和軟骨魚(也稱為IgNAR)中。 為了將天然存在的重鏈抗體中所存在的可變區(qū)與常規(guī)4鏈抗體中所存在的重鏈可變區(qū)(其被稱為“VH結(jié)構(gòu)域”)和常規(guī)4鏈抗體中所存在的輕鏈可變區(qū)(其被稱為結(jié)構(gòu)域”)區(qū)別開來，通常將重鏈抗體中所存在的可變區(qū)稱為駱駝抗體中的“VHH結(jié)構(gòu)域”和IgNAR 中的 V-NAR。來自駱駝的重鏈抗體及其可變區(qū)以及用于其產(chǎn)生和/或分離和/或使用的方法的一般描述特別參見以下參考文獻W094/04678、W097/49805和WO 97/49805。來自軟骨魚的重鏈免疫球蛋白及其可變區(qū)以及用于其產(chǎn)生和/或分離和/或使用的方法的一般描述特別參見W02005/118629?？贵w片段單結(jié)構(gòu)域抗體在一些實例中，本公開的免疫球蛋白是或包含單結(jié)構(gòu)域抗體(其與術(shù)語“結(jié)構(gòu)域抗體”或“dAb”可交換使用)。單結(jié)構(gòu)域抗體是包含抗體的所有或一部分重鏈可變結(jié)構(gòu)域的單條多肽鏈。在某些實例中，單結(jié)構(gòu)域抗體是人單結(jié)構(gòu)域抗體(Domantis, Inc. , Waltham, MA ;參見例如 US6248516)。雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體在一些實例中，本公開的免疫球蛋白是或包含雙鏈抗體、三鏈抗體四鏈抗體或諸如TO98/044001和/或W094/007921中所描述的更高級別的蛋白復(fù)合物。例如，雙鏈抗體是包含兩條相關(guān)多肽鏈的蛋白，每條多肽鏈都包含結(jié)構(gòu)\-X_VH或VH-X-'，其中\(zhòng)是抗體輕鏈可變區(qū)，Vh是抗體重鏈可變區(qū)，X是包含不足以允許單條多肽鏈中的Vh和'連接(或形成Fv)的殘基的連接體或不存在，并且其中一條多肽鏈的Vh與另一條多肽鏈的\結(jié)合，從而形成抗原結(jié)合位點，即，形成能夠特異性結(jié)合一種或多種抗原的Fv分子。\和Vh在每條多肽鏈中可以是相同的，或者\和Vh在每條多肽鏈中可以是不同的，以便形成雙特異性雙鏈抗體(即，包含具有不同特異性的兩個Fv)。能夠誘導(dǎo)效應(yīng)子活性的雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體等可以利用能夠結(jié)合IL-3Ra的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和能夠結(jié)合免疫細胞例如T細胞(例如，CD3)上的細胞表面分子的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域來產(chǎn)生。單鏈Fv(scFv)片段本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當意識到，scFvs包含處于單條多肽鏈中的VH和Vlj區(qū)以及Vh和Vl間的多肽連接體，所述多肽連接體能夠使得scFv形成期望的用于抗原結(jié)合的結(jié)構(gòu)(即，用于單條多肽鏈的Vh和'彼此連接從而形成Fv)。例如，連接體包含超過12個氨基酸殘基，(Gly4Ser)3是scFv的多個優(yōu)選連接體之一。本公開還考慮二硫化物穩(wěn)定的Fv (或diFv或dsFv)，其中將一個半胱氨酸殘基引入Vh的FR和\的FR，并且半胱氨酸殘基通過二硫鍵連接從而產(chǎn)生穩(wěn)定的Fv?？蛇x地或此外，本公開包括二聚scFv,即，包含通過非共價或共價鍵,例如通過亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域(例如，來源于Fos或Jun)而連接的兩個scFv分子的蛋白。可選地，兩個scFv通過長度足以允許兩個scFv形成并能夠結(jié)合抗原的肽連接體而連接，如在S20060263367中所描述本公開還考慮能夠誘導(dǎo)效應(yīng)子活性的二聚scFv。例如,一個scFv能結(jié)合IL_3Ra，另一個scFv能結(jié)合免疫細胞例如T細胞(例如，CD3)上的細胞表面分子。在一實例中，二聚蛋白是dAb和scFv的組合。能夠誘導(dǎo)效應(yīng)子功能的雙特異性抗體片段的實例描述于例如 US7235641 中。
其他抗體和抗體片段本公開還考慮其他抗體和抗體片段，例如(i)US5, 731，168中所描述的“鑰孔(key and hole) ”雙特異性蛋白；(ii)異源綴合蛋白，例如US4，676，980中所描述的；(iii)利用化學交聯(lián)連接體產(chǎn)生的異源綴合蛋白，例如如US4，676，980中所描述的；以及(iv)Fab3(例如，如 EP19930302894 中所描述的)。Fe 區(qū)本公開包括包含抗體的Fe區(qū)的免疫球蛋白，包括與Fe融合的免疫球蛋白的抗原結(jié)合片段用于產(chǎn)生本公開蛋白的Fe區(qū)的序列可以從很多來源獲得。在一些實例中，蛋白的Fe或其一部分來源于人抗體。此外，F(xiàn)e或其一部分可以來源于任何抗體種類(包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE)和任何抗體同種型(包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)。在一實例中，F(xiàn)e是人同種型IgGl或人同種型IgG2或人同種型IgG3或以上任一個的雜合體。在一實例中，F(xiàn)e區(qū)能夠誘導(dǎo)效應(yīng)子功能。例如，F(xiàn)e區(qū)是人IgGl或IgG3Fc區(qū)。在另一實例中，F(xiàn)e區(qū)是IgGl和IgG2Fc區(qū)的雜合體或IgGl和IgG3Fc區(qū)的雜合體或IgG2和IgG3Fc區(qū)的雜合體。人IgGl和IgG2Fc區(qū)的示例性雜合體描述于Chappel et al. , Proc.Natl Acad. Sc1. USA，88:9036-9040，1991 中。用于確定Fe區(qū)是否能誘導(dǎo)效應(yīng)子功能的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的和/或在本文做了描述。效應(yīng)子功能合適的是，適用于本公開方法的抗IL-3Ra免疫球蛋白具有或表現(xiàn)出促進或能夠使IL-3Ra +漿細胞樣樹突狀細胞至少部分消耗、大量消耗或消除的效應(yīng)子功能。這種效應(yīng)子功能可以是增強的對Fe受體的結(jié)合親和力、增強的抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)、增強的抗體依賴性細胞介導(dǎo)的吞噬作用(ADCP)和/或增強的補體依賴性細胞毒性(CDC)。如同基于本文的描述對本領(lǐng)域技術(shù)人員所顯而易見的，本公開的一些實例利用能夠誘導(dǎo)效應(yīng)子功能的免疫球蛋白。
在一實例中，免疫球蛋白以其能夠誘導(dǎo)效應(yīng)子功能，如ADCC這樣的方式結(jié)合IL_3R ct 0在一實例中，免疫球蛋白結(jié)合IL-3Ra內(nèi)的表位，該表位允許免疫球蛋白誘導(dǎo)效應(yīng)子功能，如ADCC。在另一實例中，免疫球蛋白能夠結(jié)合哺乳動物中pDC和/或嗜堿性粒細胞上的IL-3R a，從而誘導(dǎo)效應(yīng)子功能，如ADCC。例如，免疫球蛋白保持結(jié)合細胞表面上的IL-3Ra持續(xù)足以誘導(dǎo)效應(yīng)子功能，如ADCC的時間。例如，免疫球蛋白不會被太快內(nèi)在化，而允許誘導(dǎo)ADCC?！た蛇x地或此外，免疫球蛋白以允許免疫效應(yīng)細胞結(jié)合免疫球蛋白中的Fe區(qū)并誘導(dǎo)效應(yīng)子功能如ADCC的方式，結(jié)合細胞表面上的IL-3Ra。例如，當免疫球蛋白結(jié)合能夠與免疫效應(yīng)細胞上的Fe受體(例如，F(xiàn)e YR)相互作用的IL-3Ra結(jié)合時，免疫球蛋白的Fe區(qū)就以這樣的方式暴露。在本公開的背景下，術(shù)語“免疫效應(yīng)細胞”應(yīng)被理解為表示，表達Fe受體且能夠通過ADCC或ADCP殺死與其結(jié)合的細胞的任何細胞。涉及免疫球蛋白的效應(yīng)子功能的上述段落的每一個都應(yīng)被認為準用于誘導(dǎo)CDC。例如，免疫球蛋白以允許補體成分Clq結(jié)合免疫球蛋白中的Fe區(qū)并誘導(dǎo)CDC的方式結(jié)合到細胞表面上的IL_3Ra。在一實例中，免疫球蛋白能夠誘導(dǎo)水平升高的效應(yīng)子功能。在一實例中，由Fe區(qū)所誘導(dǎo)的效應(yīng)子功能水平相對于IgGl抗體的野生型Fe區(qū)或IgG3抗體的野生型Fe區(qū)升高。在另一實例中，與沒有修飾的Fe區(qū)相比，F(xiàn)e區(qū)經(jīng)修飾能提高其能夠誘導(dǎo)的效應(yīng)子功能水平。這類修飾可以在氨基酸水平和/或二級結(jié)構(gòu)水平和/或三級結(jié)構(gòu)水平和/或是對Fe區(qū)的糖基化。在一實例中，抗IL_3Ra免疫球蛋白具有或表現(xiàn)出的效應(yīng)子功能水平大于ch7G3(含有野生型人IgGlFc區(qū)的7G3的嵌合版本，在國際公開W02009/070844中稱為CSL360)或hz7G3 (包含野生型人IgGlFc區(qū)的7G3的人源化版本)所表現(xiàn)出的水平。在本公開的背景下，ch7G3和hz7G3表現(xiàn)出基本相同水平的效應(yīng)子功能。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以以很多方式中的任何一種來表明較高的效應(yīng)子功能，例如較高水平的影響、更持久的影響或更快速的影響。例如，抗IL-3Ra免疫球蛋白具有或表現(xiàn)出包括抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)在內(nèi)的效應(yīng)子功能。在一實例中，F(xiàn)e區(qū)包含能提高其誘導(dǎo)增強的效應(yīng)子功能的能力的一個或多個氨基酸修飾。在一實例中，F(xiàn)e區(qū)以更高的親和力結(jié)合一種或多種Fcy R。在一實例中，F(xiàn)e區(qū)對FcyR的親和力比野生型Fe區(qū)親和力大I倍多或比野生型Fe區(qū)親和力大5倍多或比野生型Fe區(qū)親和力大5倍至300倍。在一實例中，F(xiàn)e區(qū)在選自以下的位置處包含至少一個氨基酸取代:230、233、234、235、239、240、243、264、266、272、274、275、276、278、302、318、324、325、326、328、330、332和335，所述位置按Kabat的EU指數(shù)編號。在一實例中，F(xiàn)e區(qū)包含選自以下的至少一個氨基酸取代P230A、E233D、L234E、L234Y、L2341、L235D、L235S、L235Y、L2351、S239D、S239E、S239N、S239Q、S239T、V2401、V240M、F243L、V2641、V264T、V264Y、V2661、E272Y、K274T、K274E、K274R、K274L、K274Y、F275W、N276L、Y278T、V3021、E318R、S324D、S3241、S324V、N325T、K3261、K326T、L328M、L3281、L328Q、L328D、L328V、L328T、A330Y、A330L、A3301、I332D、I332E、I332N、I332Q、T335D、T335R 和 T335Y、其按 Kabat 的EU指數(shù)編號。在一實例中、Fe區(qū)包含選自以下的氨基酸取代V2641、F243L/V2641、L328M、I332E、L328M/I332E、V264I/I332E、S298A/I332E、S239E/I332E、S239Q/I332E、S239E、A330Y、I332D、L328I/I332E、L328Q/I332E、V264T、V2401、V2661、S239D、S239D/I332D、S239D/I332E、 S239D/I332N、 S239D/I332Q、 S239E/I332D、 S239E/I332N、 S239E/I332Q、S239N/I332D、S239N/I332E、S239Q/I332D、A330Y/I332E、V264I/A330Y/I332E、A330L/I332E、V264I/A330L/I332E、L234E、L234Y、L2341、L235D、L235S、L235Y、L2351、S239T、V240M、V264Y、A3301、N325T、L328D/I332E、L328V/I332E、L328T/I332E、L328I/I332E、S239E/V264I/I332E、 S239Q/V264I/I332E、 S239E/V264I/A330Y/I332E、 S239D/A330Y/I332E、S239N/A330Y/I332E、S239D/A330L/I332E、S239N/A330L/I332E、V264I/S298A/I332E、 S239D/S298A/I332E、 S239N/S298A/I332E、 S239D/V264I/I332E、 S239D/V264I/S298A/I332E、 S239D/V264I/A330L/I332E、 S239D/I332E/A3301、 P230A、 P230A/E233D/ I332E、E272Y、K274T、K274E、K274R、K274L、K274Y、F275W、N276L、Y278T、V3021、E318R、S324D、S3241、S324V、K3261、K326T、T335D、T335R、T335Y、V240I/V2661、S239D/A330Y/I332E/L2341、 S239D/A330Y/I332E/L235D、 S239D/A330Y/I332E/V2401、 S239D/A330Y/I332E/V264T、S239D/A330Y/I332E/K326E 和 S239D/A330Y/I332E/K326T，其按 Kabat 的 EU指數(shù)編號。在另一實例中，相對于Fe Y Rllb，F(xiàn)e區(qū)能更有效地結(jié)合Fe Y Rllla。例如，F(xiàn)e區(qū)在選自以下的位置處包含至少一個氨基酸取代234、235、239、240、264、296、330和1332，所述位置按Kabat的EU指數(shù)編號。在一實例中，F(xiàn)e區(qū)包含選自以下的至少一個氨基酸取代L234Y、L2341、L2351、S239D、S239E、S239N、S239Q、V240A、V240M、V2641、V264Y、Y296Q、A330L、A330Y、A3301、I332D和I332E，其按Kabat的EU指數(shù)編號。例如，F(xiàn)e區(qū)包含選自以下的氨基酸取代I332E、V264I/I332E、S239E/I332E、S239Q/I332E、Y296Q、A330L、A330Y、I332D、S239D、S239D/I332E、A330Y/I332E、V264I/A330Y/I332E、A330L/I332E、V264I/A330L/I332E、L234Y、L2341、L2351、V240A、V240M、V264Y、A3301、S239D/A330L/I332E、S239D/S298A/I332E、S239N/S298A/I332E、S239D/V264I/I332E、S239D/V264I/S298A/I332E和 S239D/V264I/A330L/I332E，其按 Kabat 的 EU 指數(shù)編號。在另一實例中，F(xiàn)e區(qū)誘導(dǎo)的ADCC的水平大于野生型Fe區(qū)介導(dǎo)的水平。例如，F(xiàn)e區(qū)誘導(dǎo)ADCC的水平比野生型Fe區(qū)誘導(dǎo)的水平大5倍多或比野生型Fe區(qū)誘導(dǎo)的水平大5倍至1000倍。在一實例中，F(xiàn)e區(qū)在選自以下的位置處包含至少一個氨基酸取代230、233、234、235、239、240、243、264、266、272、274、275、276、278、302、318、324、325、326、328、330、332 和335，所述位置按Kabat的EU指數(shù)編號。在一實例中，F(xiàn)e區(qū)包含選自以下的至少一個氨基酸取代:P230A、E233D、L234E、L234Y、L2341、L235D、L235S、L235Y、L2351、S239D、S239E、S239N、S239Q、S239T、V2401、V240M、F243L、V2641、V264T、V264Y、V2661、E272Y、K274T、K274E、K274R、K274L、K274Y、F275W、N276L、Y278T、V3021、E318R、S324D、S3241、S324V、N325T、K3261、K326T、L328M、L3281、L328Q、L328D、L328V、L328T、A330Y、A330L、A3301、I332D、I332E、I332N、I332Q、T335D、T335R 和 T335Y，其按 Kabat 的 EU 指數(shù)編號。在一實例中，F(xiàn)e 區(qū)包含選自以下的氨基酸取代V2641、F243L/V2641、L328M、I332E、L328M/I332E、V264I/I332E、S298A/I332E、S239E/I332E、S239Q/I332E、S239E、A330Y、I332D、L328I/I332E、L328Q/I332E、V264T、V2401、V2661、S239D、S239D/I332D、S239D/I332E、S239D/I332N、S239D/I332Q、S239E/I332D、S239E/I332N、S239E/I332Q、S239N/I332D、S239N/I332E、S239Q/I332D、A330Y/I332E、V264I/A330Y/I332E、A330L/I332E、V264I/A330L/I332E、L234E、L234Y、L2341、L235D、L235S、L235Y、L2351、S239T、V240M、V264Y、A3301、N325T、L328D/I332E、L328V/I332E、L328T/I332E、L328I/I332E、S239E/V264I/I332E、S239Q/V264I/I332E、 S239E/V264I/A330Y/I332E、 S239D/A330Y/I332E、 S239N/A330Y/I332E、S239D/A330L/I332E、S239N/A330L/I332E、V264I/S298A/I332E、S239D/S298A/I332E、 S239N/S298A/I332E、 S239D/V264I/I332E、 S239D/V264I/S298A/I332E、 S239D/V264I/A330L/I332E、S239D/I332E/A3301、P230A、P230A/E233D/I332E、E272Y、K274T、K274E、K274R、K274L、K274Y、F275W、N276L、Y278T、V3021、E318R、S324D、S3241、S324V、K3261、K326T、T335D、T335R、T335Y、V240I/V2661、S239D/A330Y/I332E/L2341、S239D/A330Y/I332E/L235D、 S239D/A330Y/I332E/V2401、 S239D/A330Y/I332E/V264T、 S239D/A330Y/I332E/K326E 和 S239D/A330Y/I332E/K326T，其按 Kabat 的 EU 指數(shù)編號。
在一實例中，F(xiàn)e區(qū)包含以下氨基酸取代S239D/I332E，其按Kabat的EU指數(shù)編號。該Fe區(qū)與野生型Fe區(qū)相比對Fe Y RIIIa的親和力提高約14倍，且與野生型Fe區(qū)相比誘導(dǎo)ADCC的能力提高約3. 3倍。在一實例中，F(xiàn)e區(qū)包含以下氨基酸取代S239D/A330L/I332E，其按Kabat的EU指數(shù)編號。該Fe區(qū)與野生型Fe區(qū)相比對Fe Y RIIIa的親和力提高約138倍，且與野生型Fe區(qū)相比誘導(dǎo)ADCC的能力提高約323倍。能夠提高Fe區(qū)誘導(dǎo)效應(yīng)子功能的能力的其他氨基酸取代，是本領(lǐng)域內(nèi)已知的和/或描述于例如US6737056或US7317091中。在一實例中，改變Fe區(qū)的糖基化以提高其誘導(dǎo)增強的效應(yīng)子功能的能力。就這點而言，由哺乳動物細胞產(chǎn)生的天然抗體通常包含分支的二分支寡糖，所述寡糖通常是通過N-連接連接于Fe區(qū)Ch2結(jié)構(gòu)域的Asn297。寡糖可以包括多種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙?；咸前?GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及與二分支(biantennary)寡糖結(jié)構(gòu)“莖部”中的GlcNAc連接的巖藻糖。在一些實例中，本公開的Fe區(qū)包含缺少與Fe區(qū)(直接或間接)連接的巖藻糖的碳水化合物結(jié)構(gòu)，即，F(xiàn)e區(qū)是“去巖藻糖化的”。這類變體可以具有提高的誘導(dǎo)ADCC的能力。產(chǎn)生去巖藻糖化抗體的方法包括,在不能表達α-1,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FUT8)的細胞系中表達免疫球蛋白(例如,如Yumane-Ohnuki et al. , Biotechnol.Bioengineer.，87:614-622, 2004中所描述的)、在表達針對FUT8的小干擾RNA的細胞中表達免疫球蛋白(例如，如 Mori et al.，Biotechnol. Bioengineer.，88:901-908，2004 中所描述的)、在不能表達鳥苷二磷酸(⑶P)-甘露糖4，6-脫水酶(GMD)的細胞中表達免疫球蛋白(例如，如 Kanda et al.，J. Biotechnol.，130:300-310，2007 中所描述的)。本公開還考慮了具有降低的巖藻糖化水平的免疫球蛋白的用途，所述免疫球蛋白例如利用經(jīng)修飾以表達β —(1，4)-N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶III(GnT-1II)的細胞系產(chǎn)生(例如，如Um0naet al.，Nat. Biotechnol.，17:176-180，1999 中所描述的)。在一實例中，本公開的免疫球蛋白是去巖藻糖化的。例如，免疫球蛋白在不表達FUT8的細胞(例如，哺乳動物細胞，諸如CHO細胞)中產(chǎn)生。
其他方法包括使用本身就產(chǎn)生能夠誘導(dǎo)增強的Fe介導(dǎo)的效應(yīng)子功能的抗體的細胞系(例如用于產(chǎn)生病毒疫苗的鴨胚胎來源的干細胞，W02008/129058 ;產(chǎn)生重組蛋白的鳥EBX 細胞，WO 2008/142124)?？捎糜诒竟_方法中的免疫球蛋白還包括具有二分化寡糖(bisectedoligosaccharide)的那些,例如其中與Fe區(qū)連接的二分支寡糖由GlcNAc平分。這類免疫球蛋白可以具有降低的巖藻糖化和/或提高的ADCC功能。這類免疫球蛋白的實例描述于例如 US6602684 和 US20050123546 中。還考慮了在寡糖中具有至少一個與Fe區(qū)連接的半乳糖殘基的免疫球蛋白。這類免疫球蛋白可以具有提高的CDC功能。這類免疫球蛋白描述于例如W01997/30087和W01999/22764 中。表現(xiàn)出ADCC活性的免疫球蛋白的非限制性實例包括本文稱為“hz7G3Vl ”、“hz7G3V2”和“hz7G3V3”的單克隆抗體。在每種情況下，由這些免疫球蛋白表現(xiàn)出的效應(yīng)子 功能水平相對于ch7G3 (包含野生型人IgGl Fe區(qū)的7G3的嵌合形式)或hz7G3的水平是提高的或大于ch7G3或hz7G3的水平。在另一非限制性實例中，可以重頭產(chǎn)生這樣的抗IL-3Ra免疫球蛋白，所述免疫球蛋白由于結(jié)合不同的表位或具有較慢的內(nèi)在化動力學(例如與ch7G3或hz7G3相比)而具有增強的效應(yīng)子功能，如增強的ADCC功能。測定免疫球蛋白誘導(dǎo)效應(yīng)子功能的能力的方法是本領(lǐng)域已知的和/或在本文中有較詳細的描述。其他修飾本公開還考慮了對免疫球蛋白的其他修飾。例如，免疫球蛋白包含能增加免疫球蛋白的半衰期的一個或多個氨基酸取代。例如，免疫球蛋白包含的Fe區(qū)包含能提高Fe區(qū)對新生兒Fe區(qū)(FcRn)的親和力的一個或多個氨基酸取代。例如，F(xiàn)e區(qū)在較低的pH，例如約pH 6. O時對FcRn具有提高的親和力，以促進內(nèi)涵體中的Fc/FcRn結(jié)合。在一實例中，與Fe區(qū)在約pH7. 4時的親和力相比，其在約pH6時對FcRn的親和力增加，這促進了 Fe在細胞再循環(huán)之后重新釋放入血液中。這些氨基酸取代通過降低從血液的清除可用于延長免疫球蛋白的半衰期。示例性的氨基酸取代包括按照Kabat的EU編號系統(tǒng)的T250Q和/或M428L。例如，在US20070135620中描述了其他或可選的氨基酸取代。蛋白產(chǎn)生在一實例中，本文所述的任何實例的免疫球蛋白通過在足以產(chǎn)生免疫球蛋白的條件下培養(yǎng)雜交瘤來產(chǎn)生，例如如本文所描述和/或本領(lǐng)域內(nèi)已知的。重組表汰在另一實例中，本文所述的任何實例的免疫球蛋白是重組的。就重組蛋白而言，可以將編碼重組蛋白的核酸克隆入表達載體，然后將表達載體轉(zhuǎn)染入宿主細胞，如大腸桿菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞，諸如猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人胚胎腎(HEK)細胞或除此之外不產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細胞。用于表達免疫球蛋白的示例性細胞是CHO細胞、骨髓瘤細胞或HEK細胞。實現(xiàn)這些目標的分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，且描述于例如如Ausubel etal.，(主編)，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates andWiley-1nterscience (1988,包括至今的所有更新)或 Sambrook et al. , MolecularCloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)中。大量的克隆和體外擴增方法適用于重組核酸的構(gòu)建。產(chǎn)生重組抗體的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。參見 US4，816，567 或 US5530101。分離后，將插入的核酸與表達構(gòu)建體或表達載體中的啟動子可操作地連接，用于進一步的克隆(DNA的擴增)或用于在無細胞系統(tǒng)或細胞中表達。本文所用的術(shù)語“啟動子”應(yīng)在其最寬泛的背景下來理解，并且包括基因組基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，包括TATA盒或起始元件,在具有或不具有改變核酸表達(例如響應(yīng)于發(fā)育和/或外部刺激，或以組織特異性方式)的其他調(diào)控元件(例如，上游激活序列、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點、增強子和沉默子)，所述TATA盒或起始元件是精確轉(zhuǎn)錄起始所需的。在本背景下，術(shù)語“啟動子”還用于描述重組的、合成的或融合核酸，或賦予、激活或增強啟動子可操作地連接的核酸的表達的衍生物。示例性的啟動子可以含有其他拷貝的一個或多個特異性調(diào)控元件以進一步增強所述核酸的表達和/或改變所述核酸的空間表達和/或時間表達。本文所用的術(shù)語“與……可操作地連接”表示相對于核酸定位啟動子，使得核酸的表達受啟動子的控制。用于在細胞中表達的很多載體是可獲得的。載體組分通常包括但不限于，一個或多個以下元件信號序列、編碼免疫球蛋白的序列(例如，來源于本文提供的信息)、增強子元件、啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當了解用于表達免疫球蛋白的合適序列。示例性的信號序列包括原核分泌信號(例如，pelB、堿性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或耐熱腸毒素II)、酵母分泌信號(例如,轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列(invertase leader)、α因子前導(dǎo)序列或酸性磷酸酶前導(dǎo)序列)或哺乳動物分泌信號(例如，單純皰疹gD信號)。在哺乳動物細胞中有活性的示例性啟動子包括巨細胞病毒立即早期啟動子(CMV-1E)、人延伸因子1-α啟動子(EFl)、小核RNA啟動子(Ula和Ulb)、α -肌凝蛋白重鏈啟動子、猿猴病毒40啟動子(SV40)、勞氏肉瘤病毒啟動子(RSV)、腺病毒主要晚期啟動子、β-肌動蛋白啟動子；包含CMV增強子/β-肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子或其活性片段的雜合體調(diào)控元件?？捎玫牟溉閯游锼拗骷毎档膶嵗怯蒘V40轉(zhuǎn)化的猴腎CVl系(C0S-7, ATCC CRL 1651);人胚胎腎系(293或經(jīng)亞克隆用于在懸浮培養(yǎng)物中生長的293細胞)；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10);或中國倉鼠卵巢細胞(CHO)。適于在酵母細胞中表達的典型的啟動子包括但不限于，ADHl啟動子、GALl啟動子、GAL4啟動子、CUPl啟動子、PH05啟動子、nmt啟動子、RPRl啟動子或TEFl啟動子，所述酵母細胞諸如例如選自以下的酵母細胞畢赤酵母(Pichia pastoris)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和裂殖酵母(S. pombe)。將分離的核酸或包含所述分離的核酸的表達構(gòu)建體導(dǎo)入細胞中用于表達的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。用于給定細胞的計數(shù)取決于已知的成功技術(shù)。將重組DNA導(dǎo)入細胞中的方法包括顯微注射、DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體例如通過使用lipofectamine (Gibco, MD, USA)和 / 或 cellfectin (Gibco, MD, USA)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、PEG 介導(dǎo)的DNA攝取、電穿孔和諸如通過使用包被DNA的鎢或金粒子(Agracetus Inc.，WI，USA)的微粒轟擊等。
用于產(chǎn)生免疫球蛋白的宿主細胞可以在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)，這取決于所用的細胞類型。諸如 Ham，s FlO (Sigma)、最小必需培養(yǎng)基((Minimal Essential Medium, MEM),Sigma))、RPM1-1640 (Sigma)和達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基((Dulbecco's ModifiedEagle’s Medium, DMEM), Sigma)的可商購的培養(yǎng)基適合培養(yǎng)哺乳動物細胞。培養(yǎng)本文論述的其他細胞類型的培養(yǎng)基是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。蛋白的分離純化免疫球蛋白的方法是本領(lǐng)域內(nèi)已知的和/或在本文中有描述。如果免疫球蛋白被分泌到培養(yǎng)基中，通常首先利用可商購獲得的蛋白濃縮濾器，例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元,從這類表達系統(tǒng)中濃縮上清液。可以在上述步驟的任一步中包括諸如PMSF的蛋白酶抑制劑以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素以防止外來污染物生長。
例如，可以利用離子交換、羥基磷灰石層析、疏水作用層析、凝膠電泳、透析、親和層析(例如，蛋白A親和層析或蛋白G層析)或上述的任意組合純化從細胞制備的免疫球蛋白。這些方法是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，且描述于例如W099/57134或Ed Harlow and DavidLane(主編)Antibodies:A Laboratory Manual (抗體實驗室手冊)，Cold Spring HarbourLaboratory, (1988)中。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)當了解，可以修飾免疫球蛋白使之包括能夠促進純化或檢測的標簽，例如多組氨酸標簽(例如六組氨酸標簽)、或流感病毒血凝素(HA)標簽、或猿猴病毒5 (V5)標簽、或FLAG標簽、或谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)標簽。然后，利用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法如親和純化來純化得到的免疫球蛋白。例如，通過以下來純化包含六組氨酸標簽的免疫球蛋白將包含免疫球蛋白的樣品與能特異性結(jié)合固定于固體或半固體支持物上的六組氨酸標簽的鎳-氨基三乙酸(N1-NTA)接觸，洗滌樣品已去除未結(jié)合的免疫球蛋白，以及隨后洗脫結(jié)合的免疫球蛋白?？蛇x地或此外，能結(jié)合標簽的配體或抗體用于親和純化方法中。測定免疫球蛋白的活性確定競爭性結(jié)合確定競爭性抑制單克隆抗體7G3的結(jié)合的免疫球蛋白的測定，對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。例如，將7G3與可檢測的標記，例如熒光標記或放射性標記綴合。然后將標記的抗體與測試免疫球蛋白混合，并與IL-3Ra或其表位或表達IL_3Ra或其表位的細胞接觸。然后測定標記7G3的水平，并與標記抗體與不存在免疫球蛋白情況下的IL-3Ra、表位或細胞接觸時所測定的水平進行比較。如果與不存在測試免疫球蛋白的情況相比，存在測試免疫球蛋白的情況下標記7G3的水平降低，則免疫球蛋白被認為競爭性抑制7G3與IL_3Ra的結(jié)合。任選地，將測試免疫球蛋白綴合于不同于7G3的標記。這種可選的標記允許檢測測試免疫球蛋白與IL-3Ra或表位或細胞結(jié)合的水平。在另一實例中，允許免疫球蛋白在IL-3R α與7G3接觸之前結(jié)合IL_3R α。與不存在免疫球蛋白的情況相比，存在免疫球蛋白的情況下結(jié)合的7G3的量降低，表明免疫球蛋白競爭性抑制7G3與IL-3Ra的結(jié)合。還可以利用標記的免疫球蛋白并首先允許7G3結(jié)合IL-3Ra來進行相互測定。在這種情況下，與不存在7G3的情況相比，存在7G3的情況下結(jié)合IL-3Ra的標記免疫球蛋白的量降低，表明免疫球蛋白競爭性抑制7G3與IL-3Ra的結(jié)
口 O在另一實例中，繪制免疫球蛋白結(jié)合的表位以確定其與7G3結(jié)合的表位是相同還是重疊。表位繪制方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。例如，產(chǎn)生一系列跨越IL-3Ra序列的重疊肽，例如包含10-15個氨基酸的肽。然后將免疫球蛋白與所確定的其能結(jié)合的每種肽接觸。這允許確定包含免疫球蛋白所結(jié)合的表位的肽。如果免疫球蛋白結(jié)合多個非連續(xù)的肽，則免疫球蛋白可以結(jié)合構(gòu)象表位?？蛇x地或此外，例如通過丙氨酸掃描誘變使IL_3Ra內(nèi)的氨基酸殘基突變，并確定降低或防免疫球蛋白和/或7G3結(jié)合的突變。降低或防止免疫球蛋白結(jié)合的任何突變都可能位于免疫球蛋白所結(jié)合的表位內(nèi)。
可選地或此外，用7G3結(jié)合的表位產(chǎn)生免疫球蛋白，因而其可能結(jié)合相同的表位。任選地，測定免疫球蛋白對IL-3Ra或其表位的解離常數(shù)(Kd)。在一實例中，IL-3Ra結(jié)合免疫球蛋白的“Kd”或“Kd值”通過放射性標記的IL_3Ra結(jié)合測定(RIA)來測量。該測定在存在滴定系列的未標記IL-3R α的情況下，利用最低濃度的放射性IL-3R a平衡免疫球蛋白。在洗滌以去除未結(jié)合的IL-3Ra之后，測定放射量，其表明蛋白的Kd。按照另一實例，通過利用表面等離子體共振測定，例如利用BIAcore表面等離子體共振(BIAcore, Inc. , Piscataway, NJ),用固定的 IL_3Ra 來測量 Kd 或 Kd 值。在一些實例中，選擇與7G3具有相似Kd或具有比7G3高的Kd的蛋白，因為它們可能競爭與IL-3Ra的結(jié)合。確定中和在本公開的一些實例中，免疫球蛋白能夠中和IL-3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。用于評價免疫球蛋白通過受體中和配體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力的各種測定是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。在一實例中，免疫球蛋白降低或防止IL-3與3R α鏈和/或IL-3R α鏈與IL-3R β鏈的異二聚體結(jié)合?？梢岳脴擞浀腎L-3和/或標記的免疫球蛋白作為本文所述的競爭結(jié)合測定進行這些測定。在另一實例中，免疫球蛋白降低或防止來自嗜堿性粒細胞的IL-3介導(dǎo)的組胺釋放。例如，將包含嗜堿性粒細胞的低密度白細胞與IgE、IL-3和多種濃度的免疫球蛋白一起孵育。對照細胞不包含免疫球蛋白(陽性對照)或IL_3(陰性對照)。然后利用標準技術(shù)例如RIA評價釋放的組胺水平。將組胺釋放的水平降低至低于陽性對照水平的免疫球蛋白被認為能中和IL-3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在一實例中，降低的水平與免疫球蛋白濃度相關(guān)。例如，在Lopez et al. , J. Cell. Physiol. , 145:69, 1990中描述了評價IL-3介導(dǎo)的組胺釋放的示例性方法。在另一實例中，免疫球蛋白降低或防止白血病細胞系TF-1的IL-3介導(dǎo)的增殖。例如，將TF-1細胞在沒有IL-3或GM-CSF的情況下培養(yǎng)足以使它們停止增殖的時間(例如，24-48小時)。然后，在存在IL-3和多種濃度的免疫球蛋白的情況下培養(yǎng)細胞。對照細胞不包含免疫球蛋白(陽性對照)或IL-3 (陰性對照)。然后利用標準技術(shù)例如3H-脫氧胸苷摻入法評價細胞增殖。在存在IL-3的情況下，將細胞增殖降低或防止至低于陽性對照水平的免疫球蛋白被認為能中和IL-3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
評價IL-3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中和的另一測定包括，確定免疫球蛋白是否降低或防止對內(nèi)皮細胞的IL-3介導(dǎo)的作用。例如，在存在IL-3 (任選地，有IFN- Y )和多種濃度的免疫球蛋白的情況下，培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)。然后，例如利用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)評價分泌IL-6的量。對照細胞不包含免疫球蛋白(陽性對照)或IL-3(陰性對照)。在存在IL-3的情況下，將IL-6產(chǎn)生降低或防止至低于陽性對照水平的免疫球蛋白被認為能中和IL-3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。本公開還考慮了評價IL-3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中和的其他方法。確定效應(yīng)子功能評價ADCC活性的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。在一實例中，利用51Cr釋放測定、銪釋放測定或35S釋放測定評價ADCC活性水平。在這些測定的每一種中，將表達IL-3Ra的細胞與一種或多種所述化合物在足以使化合物被細胞攝取的條件下培養(yǎng)一段時間。就35S釋放測定而言，可以將表達IL-3Rci的細胞與 35S標記的蛋氨酸和/或半胱氨酸培養(yǎng)足以使標記的氨基酸并入新合成的蛋白中的時間。然后，在存在或不存在免疫球蛋白以及存在免疫效應(yīng)細胞如外周血單核細胞(PBMC)和/或NK細胞的情況下培養(yǎng)細胞。然后檢測細胞培養(yǎng)基中51Cr、銪和/或35S的量，與不存在免疫球蛋白的情況相比，存在免疫球蛋白情況下的增加表明免疫球蛋白具有效應(yīng)子功能。公開了評價免疫球蛋白所誘導(dǎo)的ADCC水平的示例性出版物包括Hellstrom, et al. Proc. Natl Acad.Sc1.USA 83:7059-7063，1986 以及 Bruggemann, et al. , J. Exp. Med. 166:1351-1361，1987。評價免疫球蛋白所誘導(dǎo)的ADCC水平的其他測定包括流式細胞術(shù)的ACTI 非放射性細胞毒性測定(CellTechnology，Inc. CA, USA)或CytoTox 96 非放射性細胞毒性測定(Promega, WI, USA)?？蛇x地或此外，通過測定免疫球蛋白對一種或多種Fe YRs的親和力來評價免疫球蛋白的效應(yīng)子功能，例如如US7317091中所描述的。還可以實施Clq結(jié)合測定以證實免疫球蛋白能結(jié)合Clq并可以誘導(dǎo)⑶C。為了評價補體活化，可以進行CDC測定(參見例如，Gazzano-Santoro et al, J.1mmunol. Methods202:163， 1996)。評價治療功效體外測定可利用多種體外測定來評價免疫球蛋白治療本文所述的疾病或疾病狀態(tài)如狼瘡的能力。例如，在存在或不存在免疫球蛋白和疾病或疾病狀態(tài)中存在的那些細胞的誘導(dǎo)劑(例如，狼瘡情況下的CpG寡核苷酸和/或免疫復(fù)合物)的情況下，培養(yǎng)pDC和/或嗜堿性粒細胞或包含這些細胞的細胞群(例如，PBMC)。然后，例如通過利用ELISA測定分泌入細胞培養(yǎng)基中的IFNa的水平，來評價免疫球蛋白在治療疾病或疾病狀態(tài)中的功效。可選地或此外，評價組胺分泌或IL-4、IL-6和/或IL-13分泌的水平。與不存在免疫球蛋白(或存在同種型對照免疫球蛋白)的情況相比，這些細胞因子中任一種的水平的降低，表明所述免疫球蛋白適于治療疾病或疾病狀態(tài)?？蛇x地或此外，評價細胞死亡的水平。細胞死亡(尤其是在不存在其他細胞類型的死亡在背景以上的可檢測的增加的情況下的PDC和/或嗜堿性粒細胞細胞死亡)的增加，表明免疫球蛋白適于治療疾病或疾病狀態(tài)。在這點上，如上文所論述的，認為諸如IFNa的細胞因子在某些疾病/疾病狀態(tài)例如狼瘡中起作用。因此，降低IFNa產(chǎn)生的免疫球蛋白被認為適于治療這種疾病狀態(tài)。體內(nèi)測定在一實例中，利用體內(nèi)測定評價免疫球蛋白治療疾病或疾病狀態(tài)的功效。例如，將免疫球蛋白給予非人動物(例如，非人靈長類)，并評價循環(huán)的PDC和/或嗜堿性粒細胞數(shù)量/水平。與給予之前和/或沒有給予免疫球蛋白的對照哺乳動物相比，降低pDC和/或嗜堿性粒細胞的數(shù)量/水平的免疫球蛋白被認為適于治療疾病或疾病狀態(tài)。在另一實例中，例如利用ELISA，檢測哺乳動物循環(huán)中的諸如IFNa的細胞因子的水平。與給予之前和/或沒有給予免疫球蛋白的對照哺乳動物相比，降低細胞因子水平的免疫球蛋白被認為適于治療疾病或疾病狀態(tài)。由于諸如IFNa的細胞因子被認為在某些疾病/疾病狀態(tài)例如狼瘡中起作用，因此降低IFNa產(chǎn)生的免疫球蛋白被認為適于治療這種 疾病狀態(tài)。在另一實例中，將免疫球蛋白給予狼瘡的非人哺乳動物(例如，非人靈長類)模型。例如，在足以產(chǎn)生SLE模型的條件下，將來自患有SLE的人的血漿輸入非人靈長類如石蟹猴中，持續(xù)一段時間(例如，如 Pincus et al.，Clin.1mmunol.，105:141-154，2002 中所描述的)。將免疫球蛋白給予非人靈長類，并例如利用本文所述的測定評價其對SLE癥狀的影響。例如，評價抗dsDNA抗體和/或免疫復(fù)合物的水平。降低一種或多種SLE癥狀的免疫球蛋白被認為適于治療SLE。待治療的疾病狀態(tài)待通過本公開方法治療的疾病或疾病狀態(tài)通常與I型干擾素相關(guān)或部分由I型干擾素引起或介導(dǎo)和/或響應(yīng)產(chǎn)生I型干擾素的樹突細胞和/或嗜堿性粒細胞的消耗、去除或至少部分消除。合適的是，疾病或疾病狀態(tài)選自系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、干燥綜合征和包括系統(tǒng)性硬皮病(SSc)在內(nèi)的硬皮病。在一實例中，疾病或疾病狀態(tài)是狼瘡。例如，疾病或疾病狀態(tài)是盤狀狼瘡、亞急性皮膚型紅斑狼瘡、藥物誘導(dǎo)性狼瘡、新生」L狼瘡、狼瘡性腎炎或SLE。具體的疾病或疾病狀態(tài)是SLE。在一實例中，SLE是血清陰性SLE，S卩，不以自身抗體為特征。因此，在一實例中，本公開的方法還包括鑒定患有血清陰性SLE的哺乳動物，例如通過檢測自身抗體如本文所述的自身抗體的缺乏。在另一實例中，SLE是血清陽性SLE。例如，SLE的特征為自身抗體，諸如抗核抗體(ANA)、抗Clq抗體、抗雙鏈DNA(dsDNA)抗體、抗Sm抗體、抗核核糖核蛋白抗體、抗磷脂抗體、抗核糖體P抗體、抗Ro/SS-A抗體、抗Ro抗體和抗La抗體。因此，在一實例中，本公開的方法還包括鑒定患有血清陽性SLE的哺乳動物，例如通過檢測自身抗體如本文所述的自身抗體的存在。檢測自身抗體的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言應(yīng)是顯而易見的。例如，在足以形成抗體抗原復(fù)合物的條件下，將來自個體的血清或血漿與抗原例如dsDNA接觸一段時間。然后，在用于形成復(fù)合物的條件下，將得到的復(fù)合物與能夠結(jié)合哺乳動物抗體的標記抗體(例如，抗Fe抗體)接觸一段時間，并檢測標記的量。標記的檢測表明自身抗體的存在。本文所述的任何實例的方法還可以包括，基于患有疾病或疾病狀態(tài)或有發(fā)展疾病或疾病狀態(tài)復(fù)發(fā)的風險，來選擇用于治療的哺乳動物。這類疾病狀態(tài)和疾病的具體實例如上文所述。例如，可以基于例如上文所述的自身抗體的檢測，來鑒定患有狼瘡或有發(fā)展出狼瘡或其復(fù)發(fā)風險的個體。此外或可選地，可以按照當前的美國風濕病學會(American College ofRheumatology, ACR)標準來診斷SLE和/或可以通過一個大不列顛群島狼瘡活動組(British Isles Lupus Activity Group, BI LAG) “A”標準或兩個 BILAG “B”標準和 / 或通過歐洲統(tǒng)一狼瘡活動測定(European Consensus Lupus Activity Measure,ECLAM)和/或通過狼瘡活動指數(shù)(LAI)和/或通過國立衛(wèi)生研究院SLE指數(shù)評分(National Institutesof Health SLE Index Score, SIS)和 / 或通過系統(tǒng)性狼瘡活動測定(Systemic LupusActivity Measure, SLAM)和/或通過SLE疾病活動指數(shù)(SLEDAI)來定義活動疾病。根據(jù)Tan et al. Arth Rheum 25, 1982改編的用來診斷SLE的一些病征、癥狀或其他指征可以是面頰紅疫(例如臉頰上的疫子)、盤狀紅疫或紅色凸起的板塊(red raised patches);光 敏性諸如對陽光起反應(yīng)，導(dǎo)致皮疹的發(fā)生或增加；口腔潰瘍諸如鼻子或口的潰瘍；關(guān)節(jié)炎諸如涉及兩個或更多個周邊關(guān)節(jié)的非侵蝕性關(guān)節(jié)炎(其中關(guān)節(jié)周圍的骨頭沒有損壞的關(guān)節(jié)炎)；漿膜炎、胸膜炎或心包炎；腎病癥諸如尿中蛋白過量(大于O. 5gm/天或測試棒上為3+)和/或細胞管型(源于尿和/或白細胞和/或腎管細胞的異常部分)；神經(jīng)學病征、癥狀或其他指征、突然發(fā)作(痙攣)和/或在沒有藥物情況下的精神病或已知能引起這類效應(yīng)的代謝紊亂；以及血液學病征、癥狀或其他指征諸如溶血性貧血或白細胞減少癥(每立方毫米白細胞計數(shù)低于4，000細胞)或淋巴球減少癥(每立方毫米少于1，500個淋巴細胞)或血小板減少癥(每立方毫米少于100，000個血小板)。必須有兩次或更多次機會檢測到白細胞減少癥和淋巴球減少癥。必須在沒有已知能誘導(dǎo)血小板減少癥的藥物的情況下檢測到血小板減少癥。本公開并不局限于狼瘡的這些病征、癥狀或其他指征。在一實例中，例如通過一個或多個上述標準，哺乳動物已被診斷為患有重度SLE。有狼瘡復(fù)發(fā)風險的哺乳動物也可以表現(xiàn)出一種或多種上述癥狀并且之前已患有狼瘡的癥狀?？蛇x地或此外，已知有狼瘡復(fù)發(fā)風險的哺乳動物在之前已患有狼瘡，并且正在用雌激素療法和/或磺胺類藥物和/或干擾素治療。在一實例中，個體患有干燥綜合征。本文所述的每一實例都應(yīng)被認為準用于治療干燥綜合征。可以通過檢測自身抗體(例如,抗核抗體(例如，SSA/Ro和SSB/La)、類風濕因子、α -胞襯蛋白和/或抗甲狀腺抗體)、眼干燥、唾液腺炎癥和/或貧血癥來診斷干燥綜合征(或選擇患有干燥綜合征的個體)。在一實例中，干燥綜合征與狼瘡相關(guān)，即發(fā)生在患有狼瘡的個體中。在一實例中，個體患有硬皮病。本文所述的每一實例都應(yīng)被認為準用于治療硬皮病。在一實例中，硬皮病是系統(tǒng)性硬皮病，諸如限制型系統(tǒng)性硬皮病或彌漫型系統(tǒng)性硬皮病?？梢酝ㄟ^檢測以下來診斷硬皮病(或選擇患有硬皮病的個體):自身抗體(例如，抗拓撲異構(gòu)酶抗體(在彌漫型系統(tǒng)性硬皮病形式中)、抗著絲?？贵w(在限制型系統(tǒng)性硬皮病形式中)、抗U3抗體或抗RNA聚合酶抗體)、導(dǎo)致皮膚緊繃或皮膚硬化，尤其是手指、腳、面部和頸部上的皮膚的皮膚炎癥的局部跡象或大范圍跡象(紅、腫、敏感、癢和痛)。還可以在例如消化系統(tǒng)、肺和血管中發(fā)生多種癥狀。在一實例中，硬皮病與狼瘡相關(guān)，即發(fā)生在患有狼瘡的個體中。在一實例中，哺乳動物對用于治療疾病或疾病狀態(tài)的另一化合物的治療有抵抗力、沒有足夠的響應(yīng)或不適于用于治療疾病或疾病狀態(tài)的其他化合物的治療。例如，哺乳動物對用以下藥劑的治療有抵抗力、沒有足夠的響應(yīng)或不適于用以下藥劑治療皮質(zhì)類固醇和/或免疫抑制劑和/或抗瘧劑和/或咪唑硫嘌呤和/或環(huán)磷酰胺和/或麥考酚酸莫酯和/或氨甲蝶呤和/或抗TNF抗體和/或抗CD20抗體和/或抗IL6抗體和/或抗CD22抗體?！そM合物合適的是，在用于將抗IL-3Ra免疫球蛋白給予哺乳動物的組合物或方法中，如本領(lǐng)域所理解的，將免疫球蛋白與藥學上可接受的載體、稀釋劑和/或賦形劑組合。因此，本公開的一個實例提供了包含與藥學上可接受的載體、稀釋劑和/或賦形劑組合的抗IL-3R α免疫球蛋白的藥物組合物。在另一實例中，本公開提供了包含適于與給予哺乳動物之前的免疫球蛋白組合或混合的藥學上可接受的載體、稀釋劑和/或賦形劑的試劑盒。在該實例中，試劑盒還可以包含使用說明書。在一般術(shù)語中，“載體、稀釋劑或賦形劑”表示可以被安全地給予任何哺乳動物例如人的固體或液體摻入物、粘合劑、稀釋劑、包封物質(zhì)、乳化劑、潤濕劑、溶劑、懸浮劑、涂布劑或潤滑劑。取決于具體的給藥途徑，可以使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的各種可接受的載體、稀釋劑或賦形劑，例如如Remington’s Pharmaceutical Sciences (雷明頓藥物學)(MackPublishing Co. N. J. USA, 1991)中所描述的。僅為了舉例，載體、稀釋劑或賦形劑可以選自糖(例如蔗糖、麥芽糖、海藻糖、葡萄糖)、淀粉、纖維素及其衍生物、麥芽、明膠、滑石、硫酸鈣、包括植物油、合成油和合成甘油單酯和甘油二脂在內(nèi)的油、低級醇、多元醇、褐藻酸、磷酸鹽緩沖溶液、諸如硬脂酸鈉或硬脂酸鎂的潤滑劑、等滲鹽水以及無熱原水。例如，載體、稀釋劑或賦形劑與腸胃外給藥兼容或適于腸胃外給藥。腸胃外給藥包括不通過消化道的任何給藥途徑。腸胃外給藥的非限制性實例包括注射、輸注等。舉例來說,注射給藥包括靜脈內(nèi)注射、動脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射和皮下注射。還考慮了通過貯庫制劑或緩釋試劑遞送，所述貯庫制劑或緩釋試劑例如可以通過皮內(nèi)、肌肉內(nèi)和皮下遞送。聯(lián)合療法在一實例中，將能結(jié)合IL-3Ra的免疫球蛋白與用于治療疾病或疾病狀態(tài)例如狼瘡(諸如SLE)的另一種化合物聯(lián)合給藥，或者作為聯(lián)合或其他治療步驟，或者作為治療制劑的其他組分。例如，其他化合物是抗炎化合物?？蛇x地或此外，其他化合物是免疫抑制劑。可選地或此外，其他化合物是皮質(zhì)類固醇如潑尼松和/或強的松龍?？蛇x地或此外，其他化合物是抗瘧化合物如羥化氯喹或氯奎寧。可選地或此外，其他化合物是氨甲蝶呤?？蛇x地或此外，其他化合物是咪唑硫嘌呤?？蛇x地或此外，其他化合物是環(huán)磷酰胺?？蛇x地或此外，其他化合物是麥考酚酸莫酯?？蛇x地或此外，其他化合物是抗CD20抗體(例如，利妥昔單抗或奧法單抗(ofatumumab))?？蛇x地或此外,其他化合物是抗⑶22抗體(例如,依帕珠單抗)。可選地或此外，其他化合物是抗TNF抗體(例如，英夫利昔單抗或阿達木單抗或戈利木單抗)?？蛇x地或此外，其他化合物是CTLA-4拮抗劑(例如，阿貝西普、CTLA4-1g)?？蛇x地或此外,其他化合物是抗IL-6抗體。可選地或此外，其他化合物是BLys拮抗劑如抗BLys抗體(例如，貝利單抗)。給藥的劑量和時機為了預(yù)防或治療疾病或疾病狀態(tài)或其復(fù)發(fā)，活性藥劑(即，抗IL-3Ra免疫球蛋白)的合適劑量，取決于待治療的疾病的類型、疾病的嚴重程度和進程、給予的免疫球蛋白是用于預(yù)防性目的還是治療性目的、以前的治療、患者的臨床史和對免疫球蛋白的響應(yīng)以及主治醫(yī)師的決定。具體的劑量方案，即劑量、時機和重復(fù)，取決于具體的個體和由醫(yī)師評價的該個體的醫(yī)療史。通常，臨床醫(yī)生將給予免疫球蛋白，直到達到實現(xiàn)預(yù)期結(jié)果的劑量。本公開的方法可用于治療、減輕或預(yù)防哺乳動物中疾病或疾病狀態(tài)如狼瘡(例如，SLE)的癥狀，或用于改善哺乳動物的預(yù)后?？梢愿纳苹加欣钳彽牟溉閯游锏纳钯|(zhì)量，并且在用免疫球蛋白治療之后可以減輕或消除狼瘡的癥狀。本公開的方法還可以用于延遲 有發(fā)展出狼瘡或其復(fù)發(fā)風險的個體中狼瘡的發(fā)展或預(yù)防狼瘡。對于本文所述的免疫球蛋白的體內(nèi)給藥，正常劑量的量可以為每天約10ng/kg至高達約100mg/kg個體體重或更高。示例性劑量及其范圍在本文中有描述。對于數(shù)天或更長時間的重復(fù)給藥，取決于待治療的疾病或病癥的嚴重程度，可以持續(xù)治療，直到實現(xiàn)期望的癥狀抑制。在一些實例中，給予免疫球蛋白的初始(或負荷)劑量為約lmg/kg至約30mg/kg，例如約lmg/kg至約10mg/kg或約2mg/kg或約3mg/kg或4mg/kg或5mg/kg。然后,給予免疫球蛋白的維持劑量為約O. 000lmg/kg至約lmg/kg,例如約O. 0005mg/kg至約lmg/kg,例如約 O. 001mg/kg 至約 lmg/kg,例如約 0. 005mg/kg 至約 lmg/kg,例如約 0. lmg/kg 至約 Img/kg,例如約 0. 2mg/kg 或 0. 3mg/kg 或 0. 4mg/kg 或 0. 5mg/kg?？梢悦?7-30 天,例如每 10-15天，例如每10或11或12或13或14或15天給予維持劑量。在一些實例中，給予免疫球蛋白的劑量為約0. 0001mg/kg至約50mg/kg,例如約0. 0005mg/kg 至約 50mg/kg,例如約 0. 00lmg/kg 至約 45mg/kg,例如約 0. 005mg/kg 至約40mg/kg,例如約0. 05mg/kg至約35mg/kg。例如，給予免疫球蛋白的劑量為約0. O lmg/kg至約 lmg/kg,例如約 0. lmg/kg 至約 lmg/kg,例如約 0. 2mg/kg 或 0. 3mg/kg 或 0. 4mg/kg 或0. 5mg/kg (例如，沒有更高的負荷劑量)。在一些實例中，例如每7-30天，例如每10-22天，例如每10-15天，例如每10或11或12或13或14或15或16或17或18或19或20或21或22天，給予多種劑量。例如，每7天或每14天或每21天給予免疫球蛋白。在一些實例中，給予免疫球蛋白的劑量為約lmg/kg至約30mg/kg,例如約lmg/kg至約 10mg/kg,或約 2mg/kg 或約 3mg/kg 或 4mg/kg 或 5mg/kg,或例如約 10mg/kg 至 30mg/kg,例如約10mg/kg或15mg/kg或20mg/kg或25mg/kg(例如，沒有更低的維持劑量)。在一些實例中，例如每10-70天，例如每14-70天，例如每14-60天，例如每14-50天，例如每14-40天，或每14-30天給予多種劑量。例如每14或21或25或28或35或40或42或49或50或55或57或63或70天給予劑量。例如，每21天或每28天或每35天或每42天或每49天或每56天給予免疫球蛋白。在一些實例中，在開始治療時，在不超過連續(xù)7天或連續(xù)6天或連續(xù)5天或連續(xù)4天給予哺乳動物免疫球蛋白。就沒有對治療作出足夠響應(yīng)的哺乳動物而言，可以在一周內(nèi)給予多劑量?？蛇x地或此外，給予的劑量可以逐漸增加。在另一實例中，對于經(jīng)歷不良反應(yīng)的哺乳動物，可以在一周內(nèi)多天或連續(xù)多天內(nèi)將初始(或負荷)劑量分開。可以在已進行一次或多次免疫球蛋白給藥的哺乳動物中，憑經(jīng)驗確定特定免疫球蛋白的劑量。為了評價免疫球蛋白的功效，可以監(jiān)測疾病或疾病狀態(tài)例如狼瘡(例如SLE)的臨床癥狀。按照本公開的方法，免疫球蛋白的給藥可以是連續(xù)的或間歇性的，這取決于例如接受者的生理狀況、給藥的目的是治療性的還是預(yù)防性的以及熟練的從業(yè)者已知的其他因素。免疫球蛋白的給藥在預(yù)選的一段時間內(nèi)可以基本上是連續(xù)的，或可以以一系列間隔的 劑量，例如在狼瘡(例如SLE)發(fā)作期間或之后給予免疫球蛋白。在一實例中，給予免疫球蛋白以便實現(xiàn)評價SLE嚴重程度的評分的下降，例如BILAG標準和/或ECLAM和/或LAI和/或SIS和/或SLAM和/或SLEDAI。例如，利用免疫球蛋白的治療實現(xiàn)BILAG和/或SLEDAI下降一個或兩個或三個點。例如，到開始治療后15周或開始治療后30周或開始治療后52周實現(xiàn)下降。例如，效應(yīng)維持到開始治療后約20周或30周或40周或50周。非限制性實施例實施例中所用的抗體名稱如下⑴抗IL-3Ra小鼠單克隆抗體(命名為7G3)；
(ii)7G3與人IgGl恒定結(jié)構(gòu)域的嵌合版本(命名為ch7G3) ; (iii) 7G3的人源化IgGl版本(命名為 hz7G3) ； (iv)含有 Xencor V90、S239D/I332E、Gl/G2Fc 修飾的 7G3 的人源化版本(命名為 hz7G3Vl) ；(v)含有Xencor V209、S239D/I332E/A330L、Gl/G2Fc 修飾的 7G3 的人源化版本(命名為hz7G3V2);以及(vi)利用巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶缺陷的CHO細胞系產(chǎn)生的hz7G3的去巖藻糖化版本(命名為hz7G3V3)。實施例1IL-3Ra 的表達利用標準技術(shù)從人鑒定PBMC，并利用能結(jié)合譜系特異性細胞表面標志物的抗體分離各種細胞系。利用Quantibrite 珠(BD Biosciences),確定每種譜系的每個細胞的IL-3Ra分子的數(shù)量。如圖1所示，IL-3Ra在pDC和嗜堿性粒細胞上高度表達，而在測試的其他細胞譜系上以低水平表達。這種限制性表達模式使得IL-3Ra成為經(jīng)設(shè)計以選擇性消除pDC和嗜堿性粒細胞的抗體的有用靶標。實施例2抗IL-3R a mAb體外消耗人pDC通過FicolI 分離從正常供體分離外周血單核細胞(PBMC)，并將PBMC在沒有抗體(無抗體)、有10 μ g/ml抗ch7G3或有10 μ g/ml抗hz7G3V3的條件下，在37° C下，在RPMI/10%FCS中孵育不同的時間。在96孔U-底平板中，在200 μ L體積內(nèi)，常規(guī)培養(yǎng)IxlO6個細胞。通過流式細胞術(shù)測定漿細胞樣樹突狀細胞(PDC)數(shù)量和嗜堿性粒細胞數(shù)量的分析(分別為表I和2)。通過流式細胞術(shù)將人pDC鑒定為譜系標志物陰性(⑶20_、⑶3_、⑶14_、⑶19_CD56_)、HLA-DR陽性、⑶IIc陰性和IL_3Ra陽性(參見流程圖中的門控盒)。通過流式細胞術(shù)將人嗜堿性粒細胞鑒定為譜系標志物陰性(⑶20_、⑶3_、⑶14_、⑶19_CD56_)、IgE陽性和IL-3Ra陽性。在Fe結(jié)構(gòu)域中含有修飾的抗IL-3Ra抗體(hz7G3V3)早在添加后4小時就消耗PBMC的pDC和嗜堿性粒細胞，并且維持pDC和嗜堿性粒細胞消耗高達添加后48小時。沒有增強效應(yīng)子功能的抗IL-3R抗體(ch7G3)的添加導(dǎo)致在添加后24小時和48小時時觀察到PDC數(shù)量減少。然而，所觀察到的效應(yīng)遠遠小于針對hz7G3V3所觀察到的效應(yīng)，并且到48小時時實質(zhì)上也沒有完全消耗pDC。表1:抗體處理后細胞培養(yǎng)物中pDC的百分比
權(quán)利要求
1.治療哺乳動物的狼瘡的方法，所述方法包括給予所述哺乳動物一種免疫球蛋白，所述免疫球蛋白能結(jié)合白介素3受體a (IL-3RQ)鏈并競爭性抑制單克隆抗體7G3與IL-3RQ的結(jié)合，并且所述免疫球蛋白能消耗或至少部分消除與之結(jié)合的漿細胞樣樹突狀細胞(PDC)和嗜堿性粒細胞，從而治療所述哺乳動物的狼瘡，其中所述免疫球蛋白不與毒性化合物綴合，所述毒性化合物會殺死所述免疫球蛋白所結(jié)合的細胞。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述狼瘡是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述IL3Ra鏈由產(chǎn)生一種或多種I型干擾素的pDC表達。
4.如權(quán)利要求1或3所述的方法，其中所述IL3Ra鏈由產(chǎn)生一種或多種細胞因子的嗜堿性粒細胞表達。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述免疫球蛋白與單克隆抗體7G3結(jié)合相同的表位或重疊的表位。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述免疫球蛋白能中和IL-3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述免疫球蛋白是抗體或其抗原結(jié)合片段。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述抗體是嵌合抗體。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述嵌合抗體是包含單克隆抗體7G3的可變區(qū)的嵌合抗體。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述抗體是人源化抗體。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述人源化抗體是包含來源于單克隆抗體7G3的互補性決定區(qū)的人源化抗體。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述人源化抗體包含輕鏈可變區(qū)重鏈可變區(qū)(Vh)，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:3所示的序列，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:2所示的序列。
13.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述抗體是人抗體。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述免疫球蛋白能夠誘導(dǎo)效應(yīng)子功能。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述效應(yīng)子功能是抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞介導(dǎo)的吞噬作用(ADCP)和/或補體依賴性細胞毒性(CDC)。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其中由所述免疫球蛋白誘導(dǎo)的效應(yīng)子功能水平相對于包含野生型IgGl Fe區(qū)時的免疫球蛋白的效應(yīng)子功能水平是提高的。
17.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述效應(yīng)子功能相對于ch7G3或hz7G3的效應(yīng)子功能是提高的，或大于ch7G3或hz7G3的效應(yīng)子功能。
18.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述免疫球蛋白包含去巖藻糖化的Fe區(qū)。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述免疫球蛋白是hz7G3V3。
20.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述免疫球蛋白包含F(xiàn)e部分，所述Fe部分包含增強所述免疫球蛋白所誘導(dǎo)的效應(yīng)子功能的一個或多個氨基酸序列取代。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中與不含所述取代的Fe部分相比，所述一個或多個氨基酸序列取代增加了所述Fe部分對Fe Y受體(Fe Y R)的親和力。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述一個或多個氨基酸序列取代是 (i)按照Kabat EU編號系統(tǒng)的S239D、A330L和I332E ;或(ii)按照Kabat EU編號系統(tǒng)的S239D和I332E。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述免疫球蛋白選自hz7G3Vl和hz7G3V2。
24.如權(quán)利要求1所述的方法，其中在給予所述免疫球蛋白之后，所述哺乳動物中循環(huán)的漿細胞樣樹突狀細胞(PDC)和嗜堿性粒細胞的數(shù)量與給予所述免疫球蛋白之前所述哺乳動物中循環(huán)的pDC和/或嗜堿性粒細胞數(shù)量相比降低至少約50%。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，給予所述免疫球蛋白之后至少約6小時，所述哺乳動物中循環(huán)的PDC和嗜堿性粒細胞的數(shù)量與給予所述免疫球蛋白之前所述哺乳動物中循環(huán)的PDC和/或嗜堿性粒細胞數(shù)量相比降低至少約50%。
26.如權(quán)利要求24所述的方法，其中在給予后沒有進一步給予所述免疫球蛋白的情況下，所述哺乳動物中循環(huán)的PDC和嗜堿性粒細胞的數(shù)量與給予所述免疫球蛋白之前所述哺乳動物中循環(huán)的pDC和/或嗜堿性粒細胞數(shù)量相比降低至少約50%,持續(xù)至少7天。
27.如權(quán)利要求1所述的方法，包括給予所述哺乳動物約O.001mg/kg至50mg/kg免疫球蛋白。
28.如權(quán)利要求26所述的方法，其中多次給予所述哺乳動物所述免疫球蛋白，并且其中給藥間的時間為至少約11天。
29.用于治療哺乳動物的狼瘡的藥物組合物，所述藥物組合物包含免疫球蛋白和藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑，所述免疫球蛋白能結(jié)合白介素3受體a (IL-3RCI)鏈并競爭性抑制單克隆抗體7G3與IL-3Ra的結(jié)合，其中所述免疫球蛋白能消耗或至少部分消除與之結(jié)合的漿細胞樣樹突狀細胞(PDC)和嗜堿性粒細胞，并且其中所述免疫球蛋白不與毒性化合物綴合，所述毒性化合物會殺死所述免疫球蛋白所結(jié)合的細胞。
30.用于權(quán)利要求1-27中任一項所述方法的試劑盒，所述試劑盒包含免疫球蛋白，所述免疫球蛋白能結(jié)合IL-3Ra鏈并競爭性抑制單克隆抗體7G3與IL_3Ra的結(jié)合；藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑；以及所述試劑盒的使用說明書，其中所述免疫球蛋白能消耗或至少部分消除與之結(jié)合的漿細胞樣樹突狀細胞(PDC)和嗜堿性粒細胞，其中所述免疫球蛋白不與毒性化合物綴合，所述毒性化合物會殺死所述免疫球蛋白所結(jié)合的細胞。
全文摘要
本公開提供了治療狼瘡、干燥綜合征或硬皮病的方法，所述方法包括給予哺乳動物一種免疫球蛋白，所述免疫球蛋白能結(jié)合白介素3受體α(IL-3Rα)鏈并消耗或至少部分消除與其結(jié)合的漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)和嗜堿性粒細胞。
文檔編號C07K16/28GK103002913SQ201180016427
公開日2013年3月27日 申請日期2011年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月17日
發(fā)明者基諾·路易吉·瓦伊洛, 安德魯·納什, 尤金·馬拉斯闊夫斯基, 尼克·威爾遜, 薩曼塔·布斯菲爾德 申請人:Csl有限公司