專利名稱：一種銀杏葉中總黃酮和總內(nèi)酯的提取分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種天然植物中目標(biāo)組分的提取分離方法，具體涉及一種銀杏葉中總黃酮和總內(nèi)酯的高效提取分離制備方法。更進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及一種從銀杏葉中提取、分離制備黃酮及其苷類、銀杏二萜內(nèi)酯類和白果內(nèi)酯的方法，所述黃酮及其苷類、銀杏二萜內(nèi)酯類和白果內(nèi)酯在分離產(chǎn)物中總含量可以達(dá)到40%，甚至更高。
背景技術(shù)：
銀杏(拉丁學(xué)名為ginkgo，二名法為Ginkgo biloba)為落葉喬木，屬銀杏科裸子植物，又叫白果樹(shù)、公孫樹(shù)，是我國(guó)特有的珍貴樹(shù)種，也是世界上最古老的樹(shù)種，被稱做“活化石”。銀杏樹(shù)在我國(guó)有著廣泛的分布，例如著名的湖州長(zhǎng)興古銀杏長(zhǎng)廊(古銀杏長(zhǎng)廊位于小浦八都，為長(zhǎng)興縣三大古生態(tài)奇觀之一)，在整個(gè)長(zhǎng)廊長(zhǎng)約12. 5公里、寬在500米到5公里的范圍內(nèi)，散落著3萬(wàn)多株原生野銀杏，其中百年以上的老樹(shù)有2700多株。銀杏在我國(guó)作為藥用已有1000多年的歷史，根據(jù)《本草綱目》記載，銀杏具有“入肺經(jīng)、益脾氣、定喘咳、縮小便”等作用。清代張璐璐的《本經(jīng)逢源》中記載，白果具有降痰、 清毒、殺蟲(chóng)的功能，可治療“瘡疥疽瘤、乳癰潰爛、牙齒蟲(chóng)齲、小兒腹瀉、赤白帶下、慢性淋濁、 遺精遺尿”等癥。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉中含有的類黃酮物質(zhì)對(duì)動(dòng)物的循環(huán)系統(tǒng)、腦功能有明顯改善作用。近年來(lái)，銀杏葉用作保健食品和植物藥，廣泛用于防治記憶力下降、癡呆及心腦血管等疾病。孫保亮等(內(nèi)皮素-1與腦血管痙攣缺血性腦損害的關(guān)系及銀杏葉制劑的保護(hù)作用，孫保亮等，中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，1998年第11期)人探討了內(nèi)皮素1與蛛網(wǎng)膜下腔出血后缺血性腦損害的關(guān)系和銀杏葉制劑的防治作用，其應(yīng)用非開(kāi)顱大鼠模型，對(duì)SAH組和GBE 組測(cè)量基底動(dòng)脈管徑并觀察Mh內(nèi)微區(qū)腦血流量和顱內(nèi)血漿ET 1水平動(dòng)態(tài)改變，3天后對(duì)海馬CAl區(qū)行病理檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SAH后rCBF迅速而持續(xù)降低，血漿ET 1濃度顯著增加， BA痙攣，海馬CAl區(qū)神經(jīng)元明顯受損。GBE使上述改變均減輕，SAH時(shí)ET 1增加是導(dǎo)致缺血性腦損害的重要因素，GBE通過(guò)拮抗ET 1病理性增多而減輕缺血性腦損害。李明華等(濃縮銀杏葉口服液治療支氣管哮喘臨床觀察，李明華等，中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，1997年第4期)為探討濃縮銀杏葉口服液的氣運(yùn)抗炎作用，觀察了濃縮銀杏葉口服液對(duì)哮喘患者氣道高反應(yīng)性、臨床癥狀和肺功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)濃縮銀杏葉口服液可以顯著地降低哮喘患者的氣道高反應(yīng)性(P < 0. 05)、改善臨床癥狀(P < 0. 05)和肺功能 (P < 0. 05)，濃縮銀杏葉口服液是一種具有抗炎性質(zhì)的藥物。由于銀杏葉提取物具有獨(dú)特的藥用價(jià)值，國(guó)內(nèi)外對(duì)銀杏葉的化學(xué)成分進(jìn)行了較多的研究。池靜端等人(銀杏葉的化學(xué)成分研究，池靜端等，中國(guó)中藥雜志，1997年第2期)， 從銀杏葉的乙酸乙酯部分首次得到一二苯乙烯類化合物，經(jīng)理化常數(shù)測(cè)定，其結(jié)構(gòu)為3， 3' -二甲氧基_4，4' - 二羥基-1，2-二苯乙烯。
馬欣等人(高效液相色譜-紫外-電噴霧-質(zhì)譜法分析銀杏葉中黃酮醇苷類化合物，馬欣等，沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003年第4期)，用高效液相色譜-紫外-電噴霧-質(zhì)譜(HPLC UV ESI MQ法對(duì)銀杏葉中黃酮醇苷類化合物進(jìn)行分析，結(jié)果得到了樣品紫外色譜圖、總離子流色譜圖及相應(yīng)色譜峰的電噴霧-質(zhì)譜(ESI MS) 一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖。對(duì)譜圖進(jìn)行解析，鑒別出12種黃酮醇苷類化合物。唐于平等人(銀杏葉中的黃酮醇苷類成分，唐于平等，藥學(xué)學(xué)報(bào)，2000年第 5期)，對(duì)銀杏葉的化學(xué)成分進(jìn)行了分離、鑒定，其采用各種色譜技術(shù)進(jìn)行分離，用IR、 UV、MS、1HNMR、13C匪R和2DNMR光譜技術(shù)確定化合物的結(jié)構(gòu)，分得8個(gè)黃酮醇苷類成分槲皮素-3_0-i3-D-葡糖苷(1)，山奈酚-3-0-i3-D-葡糖苷O)；蘆丁(3)，山奈酚-3-0- β -D-蕓香糖苷(4)，異鼠李素-3-0- β -D蕓香糖苷( ，槲皮素-3-0- β -D葡萄糖基(1-2)-a-L-鼠李糖苷(6)，山奈酚-3-0-β-D-葡萄糖基(1_2) - α-L-鼠李糖苷(7)，異鼠李素-3-0- β -D-葡萄糖基(1-2) - α -L-鼠李糖苷⑶。樓鳳昌等人(銀杏萜內(nèi)酯的分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定，樓鳳昌等，中國(guó)天然藥物， 2004年第1期)，研究銀杏葉中的萜內(nèi)酯類成分，其采用95 %乙醇提取，索氏提取分段，硅膠柱層析得到總內(nèi)酯，再用制備型RP HPLC方法得到純化合物，用IR、1HNMR、13CNMR,尤其是通過(guò)2DNMR光譜技術(shù)確定化合物結(jié)構(gòu)，分得6個(gè)萜內(nèi)酯類成分，分別為白果內(nèi)酯(I )、銀杏內(nèi)酯Α( II )、銀杏內(nèi)酯B(III)、銀杏內(nèi)酯C(IV)、銀杏內(nèi)酯J( V)和銀杏內(nèi)酯K(VI)。其中銀杏內(nèi)酯K在10_6 10_5mol/L的終濃度下，可對(duì)2X 10_7mol/LPAF刺激的中性粒細(xì)胞β 葡萄糖酸苷酶的釋放有明顯的抑制作用。銀杏葉的化學(xué)成分較為復(fù)雜，經(jīng)分析測(cè)定銀杏葉提取物中含有160多種成分，主要成分為二萜內(nèi)酯和黃酮苷及有機(jī)酸等。其中萜類化合物為強(qiáng)效血小板活化因子(PAF)拮抗劑，包括銀杏苦內(nèi)酯A、B、C、M、J、銀杏新內(nèi)酯和白果內(nèi)酯，均具有二萜或半萜結(jié)構(gòu)。銀杏內(nèi)酯分子具有獨(dú)特的十二碳骨架結(jié)構(gòu)，嵌有一個(gè)叔丁基和6個(gè)5元環(huán)，包括一個(gè)螺04)壬烷， 一個(gè)四氫呋喃環(huán)和3個(gè)內(nèi)酯環(huán)，常見(jiàn)代號(hào)BN52020、BN52021、BN52022、BN52023、BN52024，分別代表銀杏苦內(nèi)酯A、B、C、M、J，其中BN52021在銀杏中的含量為0. 2%，選擇性抗PAF的活性最強(qiáng)。銀杏葉含35種黃酮類化合物，其中雙黃酮6種，黃酮苷元、黃酮苷M種，包括白果黃素、槲皮素、異鼠李素、山柰酚、白果雙黃酮、異白果雙黃酮等。銀杏葉提取物是具有重大市場(chǎng)潛力的植物提取物，以其為原料制成的各種制劑， 廣泛應(yīng)用于藥物、保健食品、功能性飲料等，也是近年暢銷的中成藥品種，在心腦血管用藥中處于比較重要的地位。在全球的天然藥物中，銀杏葉制劑是用量最大的品種之一。銀杏葉提取物(Ginkgo Biloba Extract，GBE)被廣泛運(yùn)用于藥品、食品補(bǔ)充劑、化妝品等。世界市場(chǎng)上銀杏葉制品的年銷售額達(dá)50億美元，已成為植物藥制劑的全球冠軍品種；我國(guó)銀杏葉制劑年銷售額從2000年的6億元發(fā)展到2004年的17億元，目前已成為心腦血管系統(tǒng)植物藥領(lǐng)先品種。銀杏制劑的質(zhì)量主要取決于銀杏黃酮和銀杏內(nèi)酯的含量，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)要求銀杏制劑中的銀杏黃酮的含量大于對(duì)％，銀杏內(nèi)酯含量大于6% (Kanows ki， S, et al. Phytomedicine,1997,4(1) :3-13)。研究結(jié)果表明銀杏黃酮具有抗氧化、抗癌和對(duì)腦心血管的保護(hù)作用。覃仁輝等人(銀杏葉中黃酮類化合物的提取及其醫(yī)藥學(xué)應(yīng)用，覃仁輝等，長(zhǎng)沙大學(xué)學(xué)報(bào)，2004年第6期)，應(yīng)用銀杏葉提取物及口服藥物銀可絡(luò)治療老年冠心病患者沈例，發(fā)現(xiàn)治療后左心室收縮期功能明顯改善，銀杏葉提取物及其主要有效成分黃酮苷和銀杏內(nèi)脂具有擴(kuò)張動(dòng)脈血管、降低血粘度、抑制血小板聚集、拮抗特異性血小板活化因子、改善周圍血管循環(huán)等作用。章家勝等人(銀杏葉總黃酮對(duì)腦、心缺氧的保護(hù)作用，章家勝等，中醫(yī)中藥基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，1999年第5期)，研究了銀杏葉總黃酮對(duì)腦、心缺氧的保護(hù)作用，銀杏葉總黃酮 25、50、100mg/kg2顯著延長(zhǎng)夾閉氣管后小鼠心電圖時(shí)間和斷頭喘氣時(shí)間，并呈量效關(guān)系，在 25-100mg/kg2范圍內(nèi)，銀杏葉總黃酮顯著降低腦、心組織中MDA和NO含量，結(jié)果表明銀杏葉總黃酮對(duì)腦、心缺氧有顯著保護(hù)作用，其作用可能與抑制膜脂質(zhì)過(guò)氧化及減少NO有關(guān)。目前，針對(duì)銀杏葉中的黃酮和內(nèi)酯類化合物已經(jīng)研發(fā)多種提取分離的方法。楊榮華等人(銀杏葉中有效成分提取最優(yōu)化生產(chǎn)工藝研究，楊榮華等，中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2007年第3期)，基于國(guó)內(nèi)外已有的對(duì)銀杏葉的提取方法，結(jié)合樹(shù)脂吸附生產(chǎn)工藝的優(yōu)點(diǎn)，運(yùn)用乙醇-樹(shù)脂吸附法，提取銀杏葉萜類內(nèi)酯及其黃酮，研究結(jié)果顯示乙醇-樹(shù)脂吸附法運(yùn)用于銀杏葉有成本低、回收率高、有機(jī)溶劑殘留少等優(yōu)點(diǎn)。胡衛(wèi)兵等人(銀杏葉黃酮超臨界二氧化碳萃取條件研究，胡衛(wèi)兵等，湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2004年第2期)，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)研究，對(duì)超臨界流體萃取銀杏葉黃酮類化合物的工藝進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明影響萃取得率的各因素強(qiáng)烈程度的順序由大到小為夾帶劑濃度、萃取壓力、萃取溫度；在流量為35kg/h，萃取時(shí)間為池的條件下，最佳萃取實(shí)驗(yàn)工藝條件為萃取壓力15MPa，乙醇濃度為90%，萃取溫度為55°C，此時(shí)，黃酮類化合物萃取得率較理想?，F(xiàn)有技術(shù)，包括上述引用文獻(xiàn)列舉的方法，能夠制備出其所期望的目的產(chǎn)物，但是這些方法普遍存在產(chǎn)品純度低、重現(xiàn)性差、耗時(shí)長(zhǎng)、技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化難、無(wú)法大規(guī)模生產(chǎn)等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的之一在于提供一種銀杏葉中總黃酮和總內(nèi)酯類化合物的高效提取分離制備方法，其中所述提取分離物的主要成分為黃酮及其苷類、銀杏二萜內(nèi)酯類。用高效液相色譜對(duì)所述提取分離物進(jìn)行定量分析檢測(cè)，結(jié)果表明目標(biāo)成分 (黃酮及其苷類、銀杏二萜內(nèi)酯類)的總含量達(dá)到30%或以上，甚至40%。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的銀杏葉中總黃酮和總內(nèi)酯的高效提取分離方法主要包括以下步驟提取、醇沉、水沉、大孔樹(shù)脂分離和硅膠基質(zhì)鍵合材料分離。1)提取所述提取包括稱取銀杏葉，加入占銀杏葉重量8-12倍、體積濃度為10% -50%低碳醇，在20°C -50°C下浸泡提取2-5次，每次1-5天，將提取液合并，并將提取液濃縮得到相對(duì)密度為1. 15-1.25的浸膏。所述銀杏葉優(yōu)選含水量為-10%的銀杏葉。所述低碳醇的加入量?jī)?yōu)選占銀杏葉重量9-11倍，更優(yōu)選9-10倍。所述低碳醇的體積濃度優(yōu)選為20% -45%,更優(yōu)選30% -40%。所述浸泡溫度優(yōu)選為30 V -50 V，更優(yōu)選30 V -40 V。所述提取次數(shù)優(yōu)選2-4次，更優(yōu)選3-4次。所述每次浸泡時(shí)間優(yōu)選1-4天，更優(yōu)選2-4天。
所述低碳醇優(yōu)選甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或其混合物，更優(yōu)選甲醇和乙醇，進(jìn)一步優(yōu)選乙醇。2)醇沉所述醇沉包括在步驟1)獲得的浸膏中加入低碳醇，使低碳醇體積濃度達(dá)到 50-70%，并充分?jǐn)嚢瑁?-4°C冷藏靜置12-48小時(shí)，隨后分離除去固體、膠體等，將獲得的液體濃縮至相對(duì)密度為1. 10-1. 25的浸膏；再加入低碳醇使低碳醇體積濃度達(dá)到70%-90%， 并充分?jǐn)嚢瑁?-4°C冷藏靜置12-48小時(shí)后再次分離除去固體、膠體等，將獲得的液體濃縮揮發(fā)除去低碳醇，濃縮得到相對(duì)密度為1. 15-1. 25的浸膏。所述分離除去固體、膠體等操作優(yōu)選采用過(guò)濾操作。所述冷藏靜置時(shí)間優(yōu)選15-36小時(shí)，更優(yōu)選M-36小時(shí)。所述低碳醇優(yōu)選甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或其混合物，更優(yōu)選甲醇和乙醇，進(jìn)一步優(yōu)選乙醇。3)水沉所述水沉包括將醇沉后的浸膏按照1 5-1 10的體積比加入水，充分?jǐn)嚢瑁?0-4°C冷藏靜置M-240小時(shí)，隨后分離除去固體、膠體等，將獲得的液體中的固體物質(zhì)去除后，濾液濃縮至相對(duì)密度為1. 10-1. 20的浸膏。所述體積比優(yōu)選1 6-1 9，更優(yōu)選1 7-1 8。所述冷藏靜置時(shí)間優(yōu)選36-192小時(shí)，更優(yōu)選72-120小時(shí)。所述分離除去固體、膠體等操作優(yōu)選采用過(guò)濾操作。將獲得的液體中的固體物質(zhì)去除優(yōu)選采用離心分離，所述離心分離優(yōu)選采用離心機(jī)離心分離，所述離心機(jī)優(yōu)選10000-25000轉(zhuǎn)/分鐘的高速離心機(jī)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該知悉，所述離心分離也可以使用過(guò)濾后進(jìn)行微濾的技術(shù)替代，只要其能夠去除水沉下來(lái)的固體物質(zhì)就可。4)大孔樹(shù)脂分離所述大孔樹(shù)脂分離包括將水沉完的浸膏上樣于非極性大孔樹(shù)脂柱，上樣量與分離材料體積比為1 5-1 50，分別采用水、體積濃度10-30%的低碳醇、體積濃度30-60% 低碳醇和60-90%低碳醇洗脫，每次洗脫的體積為3-6個(gè)柱體積，流速為1-3個(gè)柱體積/ 小時(shí)；收集10-30%低碳醇和60-90%低碳醇洗脫組分，合并洗脫液并濃縮至相對(duì)密度為 1. 10-1. 20 的浸膏。所述上樣量與分離材料體積比優(yōu)選為1 10-1 40，更優(yōu)選1 15_1 30。所述低碳醇優(yōu)選甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或其混合物，更優(yōu)選甲醇和乙醇，進(jìn)一步優(yōu)選乙醇。5)硅膠基質(zhì)鍵合材料分離所述硅膠基質(zhì)鍵合材料分離包括以粒徑10-100微米的硅膠基質(zhì)鍵合材料為填料，以不同體積濃度的低碳醇水溶液作為洗脫液，低碳醇的體積濃度從10-70%變化，收集目標(biāo)洗脫組分，干燥處理即為銀杏葉中總黃酮和總內(nèi)酯類化合物。所述硅膠基質(zhì)鍵合材料的粒徑優(yōu)選40-100微米，更優(yōu)選40-70微米。所述低碳醇優(yōu)選甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或其混合物，更優(yōu)選甲醇和乙醇，進(jìn)一步優(yōu)選甲醇。
本發(fā)明采用特定的單元操作組合提取、醇沉、水沉、大孔樹(shù)脂分離和硅膠基質(zhì)鍵合材料分離，以及采用大孔樹(shù)脂和硅膠基質(zhì)鍵合材料作為特定的分離介質(zhì)，獲得了銀杏葉中的總黃酮和總內(nèi)酯類化合物。用高效液相色譜對(duì)所述銀杏葉中的總黃酮和總內(nèi)酯類化合物進(jìn)行定量分析檢測(cè)，結(jié)果表明目標(biāo)成分(黃酮及其苷類、銀杏二萜內(nèi)酯類)的總含量達(dá)到 30%或以上，甚至40%。這遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于現(xiàn)有技術(shù)的含量水平。同時(shí)，本發(fā)明采用特定的單元操作組合提取、醇沉、水沉、大孔樹(shù)脂分離和硅膠基質(zhì)鍵合材料分離，其能夠大規(guī)模工業(yè)化使用，遠(yuǎn)遠(yuǎn)擺脫了現(xiàn)有技術(shù)中的低產(chǎn)量、實(shí)驗(yàn)室規(guī)模生產(chǎn)。本發(fā)明所公開(kāi)的上述方法均能夠制備獲得銀杏葉中總黃酮和總內(nèi)酯，但基于提高制備效率優(yōu)化操作等目的，本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案為一種銀杏葉中總黃酮和總內(nèi)酯的提取分離制備方法，所述方法包括1)提取稱取含水量為1 % -10%的銀杏葉，加入其重量8-12倍、濃度為 10% -50%乙醇，20-50°C浸泡提取2-5次，每次1_5天，合并提取液，將提取液濃縮得到相對(duì)密度為1. 15-1. 25的浸膏；2)醇沉將浸膏中加入乙醇使乙醇體積濃度達(dá)到50-70%，并充分?jǐn)嚢瑁?-4°C冷藏靜置12-36小時(shí)，過(guò)濾，將濾液濃縮至相對(duì)密度為1. 10-1. 25的浸膏；再加入乙醇使乙醇體積濃度達(dá)到70-90%，并充分?jǐn)嚢瑁?-4°C冷藏靜置12-48小時(shí)過(guò)濾，將濾液濃縮揮發(fā)除去乙醇，濃縮得到相對(duì)密度為1. 15-1. 25的浸膏；3)水沉將醇沉完的浸膏按照1 5-1 10的體積比加入水，充分?jǐn)嚢瑁?_4°C冷藏靜置M-240小時(shí)，過(guò)濾，樣品溶液經(jīng)過(guò)10000-25000轉(zhuǎn)/分鐘的高速離心機(jī)離心，樣品濃縮至相對(duì)密度為1. 10-1. 20的浸膏；4)大孔樹(shù)脂分離將水沉完的浸膏上樣于非極性大孔樹(shù)脂柱，上樣量與分離材料體積比為1 5-1 50，分別采用水、體積濃度10-30%乙醇、體積濃度30-60%乙醇和60-90%乙醇洗脫，每次洗脫的體積為3-6個(gè)柱體積，流速為1-3個(gè)柱體積/小時(shí)；收集 10-30%乙醇和60-90%乙醇洗脫組分，合并洗脫液并濃縮至相對(duì)密度為1. 10-1. 20的浸膏；5)硅膠基質(zhì)鍵合材料分離以粒徑10-100微米的硅膠基質(zhì)鍵合材料為填料，以不同體積濃度的甲醇水溶液作為洗脫液，對(duì)大孔樹(shù)脂分離得到的浸膏進(jìn)行洗滌，甲醇的體積濃度從10-70%變化，收集目標(biāo)洗脫組分，干燥處理即為銀杏葉中的總黃酮和總內(nèi)酯類化合物。本發(fā)明銀杏葉中總黃酮和總內(nèi)酯的提取分離制備方法的提取、醇沉和大孔樹(shù)脂分離步驟中所用的低碳醇，可以是物理-化學(xué)性質(zhì)相近的甲醇、乙醇、丙醇、丁醇及其混合物， 但本發(fā)明優(yōu)選采用乙醇。采用乙醇的有益技術(shù)效果是，能有效提高有效成分提取效率，而且雜質(zhì)的提取率會(huì)大幅降低，給后續(xù)的分離制備減輕麻煩。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該知悉，本發(fā)明的工藝方法不僅僅限于從銀杏葉中提取分離制備總黃酮和總內(nèi)酯，其還可以應(yīng)用于其他用途，比如用于銀杏的果實(shí)，用于提取分離制備總黃酮和總內(nèi)酯，以及用于其他植物的葉子、果實(shí)和根莖等，制備其他有效成分。本發(fā)明所公開(kāi)的制備方法具有如下優(yōu)點(diǎn)1.主要成分的含量高。由于本發(fā)明針對(duì)目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了系統(tǒng)的提取分離制備工藝流程，并使用了大孔樹(shù)脂和新型硅膠基鍵合材料，通過(guò)工藝的整體系統(tǒng)性和高效新型分離材料的選擇性，可以保證主要成分的含量達(dá)到30%以上。2.重現(xiàn)性好。本發(fā)明利用提取分離工藝的標(biāo)準(zhǔn)化，特別是大孔樹(shù)脂柱層析分離的標(biāo)準(zhǔn)化，以及新型硅膠基質(zhì)鍵合材料化學(xué)性能的穩(wěn)定性，可以保證分離制備的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。3.周期短。本發(fā)明從原藥材的粉碎提取到制備得到目標(biāo)組分的產(chǎn)品，只需要10天的時(shí)間。4.有機(jī)殘留低。由于本發(fā)明摒棄了傳統(tǒng)工藝中溶劑萃取、硅膠柱層析等工藝，采用了有機(jī)溶劑使用量較少的大孔樹(shù)脂分離和新型分離材料，而且最終產(chǎn)品采用干燥處理，所以最終產(chǎn)品的有機(jī)溶劑殘留特別小。5.能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。本發(fā)明所采用工藝非常容易實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，自動(dòng)化，適于進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)例僅限于說(shuō)明本發(fā)明，而非對(duì)本發(fā)明的限定。實(shí)施例1 將含水量為6%的銀杏葉原藥材粉碎，定量稱取10千克，置于200升提取罐加入重量100千克40%乙醇溶液，30°C浸泡提取3次，每次2天，合并提取液，將提取液濃縮得到相對(duì)密度為1. 21的浸膏3. 6L。將浸膏中加入乙醇使乙醇體積濃度達(dá)到60%，并攪拌30分鐘，4°C冷藏靜置M小時(shí)，過(guò)濾，將濾液濃縮至相對(duì)密度為1. 15的浸膏；再加入乙醇使乙醇體積濃度達(dá)到80%，并充分?jǐn)嚢?0分鐘，4°C冷藏靜置48小時(shí)過(guò)濾，將濾液濃縮揮發(fā)除去乙醇，濃縮得到相對(duì)密度為1. 17的浸膏2. 8L。將醇沉完的浸膏中按照1 6的體積比加入水16. 8L，充分?jǐn)嚢?0分鐘，4°C冷藏靜置72小時(shí)，過(guò)濾，樣品溶液經(jīng)過(guò)20000轉(zhuǎn)/分鐘的高速離心機(jī)離心，樣品濃縮至相對(duì)密度為1. 07的浸膏2. 5L。將水沉完的浸膏上樣于XAD-4型非極性大孔樹(shù)脂柱，大孔樹(shù)脂分離材料體積為 25L,分別采用150L水、120L體積濃度20%乙醇、90L體積濃度50%乙醇和90L 80%乙醇洗脫，流速為2個(gè)柱體積/小時(shí)；收集20%乙醇和80%乙醇洗脫組分，合并洗脫液并濃縮至相對(duì)密度為1. 10的浸膏1. IL ；稱取粒徑40微米的新型硅膠基質(zhì)鍵合材料3千克，裝柱，柱徑100mm，柱長(zhǎng)380mm， 分別用10L15%甲醇水溶液、16L55%甲醇水溶液洗脫，收集55%洗脫組分，加熱濃縮，真空干燥處理即為銀杏葉中總黃酮和總內(nèi)酯類化合物，共計(jì)142克，通過(guò)高效液相分析檢測(cè)，總黃酮及其苷類含量為25. 5 %，銀杏內(nèi)酯類含量為6. 7%。實(shí)施例2 將含水量為2 %的銀杏葉原藥材粉碎，定量稱取2千克，置于50升提取罐加入重量 18千克20%乙醇溶液，45°C浸泡提取5次，每次1天，合并提取液，將提取液濃縮得到相對(duì)密度為1. 15的浸膏1. IL0
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將浸膏中加入乙醇使乙醇體積濃度達(dá)到50%，并攪拌30分鐘，4°C冷藏靜置36小時(shí)，過(guò)濾，將濾液濃縮至相對(duì)密度為1. 12的浸膏；再加入乙醇使乙醇體積濃度達(dá)到85%，并充分?jǐn)嚢?0分鐘，4°C冷藏靜置M小時(shí)過(guò)濾，將濾液濃縮揮發(fā)除去乙醇，濃縮得到相對(duì)密度為1. 24的浸膏0. 7L。將醇沉完的浸膏中按照1 10的體積比加入水7L，充分?jǐn)嚢?0分鐘，4°C冷藏靜置240小時(shí)，過(guò)濾，樣品溶液經(jīng)過(guò)25000轉(zhuǎn)/分鐘的高速離心機(jī)離心，樣品濃縮至相對(duì)密度為1. 09的浸膏0. 35L。將水沉完的浸膏上樣于XAD-1600型非極性大孔樹(shù)脂柱，大孔樹(shù)脂分離材料體積為15L，分別采用60L水、50L體積濃度30%乙醇、60L體積濃度40%乙醇和80L 75%乙醇洗脫，流速為1. 6個(gè)柱體積/小時(shí)；收集30%乙醇和75%乙醇洗脫組分，合并洗脫液并濃縮至相對(duì)密度為1. 08的浸膏0. 23L ；稱取粒徑70微米的新型硅膠基質(zhì)鍵合材料0. 7千克，裝柱，柱徑70mm，柱長(zhǎng) 210mm,分別用3. 5L12%甲醇水溶液、4L50%甲醇水溶液洗脫，收集50%洗脫組分，加熱濃縮，真空干燥處理即為銀杏葉中總黃酮和總內(nèi)酯類化合物，共計(jì)四克，通過(guò)高效液相分析檢測(cè)，總黃酮及其苷類含量為26. 2 %，銀杏內(nèi)酯類含量為6. 6 %。實(shí)施例3 將含水量為9%的銀杏葉原藥材粉碎，定量稱取25千克，置于500升提取罐加入重量300千克50%乙醇溶液，50°C浸泡提取2次，每次5天，合并提取液，將提取液濃縮得到相對(duì)密度為1. 23的浸膏7. 9L。將浸膏中加入乙醇使乙醇體積濃度達(dá)到70%，并攪拌30分鐘，4°C冷藏靜置15小時(shí)，過(guò)濾，將濾液濃縮至相對(duì)密度為1. 14的浸膏；再加入乙醇使乙醇體積濃度達(dá)到85%，并充分?jǐn)嚢?0分鐘，4°C冷藏靜置40小時(shí)過(guò)濾，將濾液濃縮揮發(fā)除去乙醇，濃縮得到相對(duì)密度為1. 19的浸膏4. 6L。將醇沉完的浸膏中按照1 8的體積比加入水36. 8L，充分?jǐn)嚢?0分鐘，4°C冷藏靜置120小時(shí)，過(guò)濾，樣品溶液經(jīng)過(guò)20000轉(zhuǎn)/分鐘的高速離心機(jī)離心，樣品濃縮至相對(duì)密度為1. 06的浸膏7. 4L。將水沉完的浸膏上樣于X-5型非極性大孔樹(shù)脂柱，大孔樹(shù)脂分離材料體積為 200L，分別采用1000L水、700L體積濃度25%乙醇、1100L體積濃度40%乙醇和600L 90% 乙醇洗脫，流速為2個(gè)柱體積/小時(shí)；收集25%乙醇和90%乙醇洗脫組分，合并洗脫液并濃縮至相對(duì)密度為1. 12的浸膏3. 3L ；稱取粒徑100微米的新型硅膠基質(zhì)鍵合材料9千克，裝柱，柱徑200mm，柱長(zhǎng) 295mm,分別用30L16%甲醇水溶液、20L60%甲醇水溶液洗脫，收集60%洗脫組分，加熱濃縮，真空干燥處理即為銀杏葉中總黃酮和總內(nèi)酯類化合物，共計(jì)339克，通過(guò)高效液相分析檢測(cè)，總黃酮及其苷類含量為25. 8 %，銀杏內(nèi)酯類含量為7.0%。實(shí)施例4 將含水量為8%的銀杏葉原藥材粉碎，定量稱取5千克，置于100升提取罐加入重量60千克30%乙醇溶液，30°C浸泡提取4次，每次5天，合并提取液，將提取液濃縮得到相對(duì)密度為1. 17的浸膏2. 3L。將浸膏中加入乙醇使乙醇體積濃度達(dá)到60%，并攪拌30分鐘，4°C冷藏靜置48小時(shí)，過(guò)濾，將濾液濃縮至相對(duì)密度為1. 18的浸膏；再加入乙醇使乙醇體積濃度達(dá)到80%，并充分?jǐn)嚢?0分鐘，4°C冷藏靜置M小時(shí)過(guò)濾，將濾液濃縮揮發(fā)除去乙醇，濃縮得到相對(duì)密度為1. 16的浸膏1. 51L。將醇沉完的浸膏中按照1 9的體積比加入水13. 6L，充分?jǐn)嚢?0分鐘，4°C冷藏靜置72小時(shí)，過(guò)濾，樣品溶液經(jīng)過(guò)15000轉(zhuǎn)/分鐘的高速離心機(jī)離心，樣品濃縮至相對(duì)密度為1. 09的浸膏1. 4L。將水沉完的浸膏上樣于HP-20型非極性大孔樹(shù)脂柱，大孔樹(shù)脂分離材料體積為 50L，分別采用300L水、250L體積濃度15%乙醇、200L體積濃度55%乙醇和250L 75%乙醇洗脫，流速為1個(gè)柱體積/小時(shí)；收集15%乙醇和75%乙醇洗脫組分，合并洗脫液并濃縮至相對(duì)密度為1. 11的浸膏0. 57L；稱取粒徑100微米的新型硅膠基質(zhì)鍵合材料1. 6千克，裝柱，柱徑100mm，柱長(zhǎng) 205mm,分別用6L14%甲醇水溶液、10L56%甲醇水溶液洗脫，收集56%洗脫組分，加熱濃縮，真空干燥處理即為銀杏葉中總黃酮和總內(nèi)酯類化合物，共計(jì)69克，通過(guò)高效液相分析檢測(cè)，總黃酮及其苷類含量為25. 8 %，銀杏內(nèi)酯類含量為6.8%。實(shí)施例5 銀杏葉的含水量為3%，投料量和制備過(guò)程與實(shí)施例1相同，最終制備總黃酮和總內(nèi)酯類化合物，共計(jì)146克，通過(guò)高效液相分析檢測(cè)，總黃酮及其苷類含量為25.4%，銀杏內(nèi)酯類含量為6.5%。申請(qǐng)人:聲明，本發(fā)明通過(guò)上述實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的詳細(xì)工藝設(shè)備和工藝流程， 但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)工藝設(shè)備和工藝流程，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)工藝設(shè)備和工藝流程才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)， 對(duì)本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開(kāi)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種銀杏葉中總黃酮和總內(nèi)酯的提取分離方法，其特征在于，所述方法主要包括以下步驟1)提取所述提取包括稱取銀杏葉，加入占銀杏葉重量8-12倍、體積濃度為10% -50%低碳醇，在20°C -50°C下浸泡提取2-5次，每次1-5天，將提取液合并，并將提取液濃縮得到相對(duì)密度為1. 15-1. 25的浸膏；2)醇沉所述醇沉包括在步驟1)獲得的浸膏中加入低碳醇，使低碳醇體積濃度達(dá)到50-70%， 并充分?jǐn)嚢瑁?-4°C冷藏靜置12-48小時(shí)，隨后分離除去固體、膠體等，將獲得的液體濃縮至相對(duì)密度為1. 10-1. 25的浸膏；再加入低碳醇使低碳醇體積濃度達(dá)到70%-90%，并充分?jǐn)嚢瑁?-4°C冷藏靜置12-48小時(shí)后再次分離除去固體、膠體等，將獲得的液體濃縮揮發(fā)除去低碳醇，濃縮得到相對(duì)密度為1. 15-1. 25的浸膏；3)水沉所述水沉包括將醇沉后的浸膏按照1 5-1 10的體積比加入水，充分?jǐn)嚢瑁?-4°C 冷藏靜置M-240小時(shí)，隨后分離除去固體、膠體等，將獲得的液體中的固體物質(zhì)去除后，濾液濃縮至相對(duì)密度為1. 10-1. 20的浸膏；4)大孔樹(shù)脂分離所述大孔樹(shù)脂分離包括將水沉完的浸膏上樣于非極性大孔樹(shù)脂柱，上樣量與分離材料體積比為1 5-1 50，分別采用水、體積濃度10-30%的低碳醇、體積濃度30-60%低碳醇和60-90%低碳醇洗脫，每次洗脫的體積為3-6個(gè)柱體積，流速為1-3個(gè)柱體積/小時(shí)；收集10-30%低碳醇和60-90%低碳醇洗脫組分，合并洗脫液并濃縮至相對(duì)密度為1. 10-1. 20 的浸膏；5)硅膠基質(zhì)鍵合材料分離所述硅膠基質(zhì)鍵合材料分離包括以粒徑10-100微米的硅膠基質(zhì)鍵合材料為填料，以不同體積濃度的低碳醇水溶液作為洗脫液，低碳醇的體積濃度從10-70%變化，收集目標(biāo)洗脫組分，干燥處理即為銀杏葉中總黃酮和總內(nèi)酯類化合物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)中，所述銀杏葉優(yōu)選含水量為-10%的銀杏葉；所述乙醇的加入量?jī)?yōu)選占銀杏葉重量9-11倍，更優(yōu)選9-10倍；所述乙醇的體積濃度優(yōu)選為20% -45%，更優(yōu)選30% -40% ；所述浸泡溫度優(yōu)選為30°C -50°C，更優(yōu)選30°C -400C ；所述提取次數(shù)優(yōu)選2-4次，更優(yōu)選3-4次；所述每次浸泡時(shí)間優(yōu)選1-4天，更優(yōu)選2-4天；所述低碳醇優(yōu)選甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或其混合物，更優(yōu)選甲醇和乙醇，進(jìn)一步優(yōu)選乙
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟2)中， 所述分離除去固體、膠體等操作優(yōu)選采用過(guò)濾操作； 所述冷藏靜置時(shí)間優(yōu)選15-36小時(shí)，更優(yōu)選M-36小時(shí)；所述低碳醇優(yōu)選甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或其混合物，更優(yōu)選甲醇和乙醇，進(jìn)一步優(yōu)選乙
4.如權(quán)利要求1-3之一所述的方法，其特征在于，步驟3)中， 所述體積比優(yōu)選1 6-1 9，更優(yōu)選1 :7-1:8;所述冷藏靜置時(shí)間優(yōu)選36-192小時(shí)，更優(yōu)選72-120小時(shí)； 所述分離除去固體、膠體等操作優(yōu)選采用過(guò)濾操作；所述將獲得的液體中的固體物質(zhì)去除優(yōu)選采用離心分離，所述離心分離優(yōu)選采用離心機(jī)離心分離，所述離心機(jī)優(yōu)選10000-25000轉(zhuǎn)/分鐘的高速離心機(jī)； 或所述將獲得的液體中的固體物質(zhì)去除采用過(guò)濾后進(jìn)行微濾。
5.如權(quán)利要求1-4之一所述的方法，其特征在于，步驟4)中，所述上樣量與分離材料體積比優(yōu)選為1 10-1 40，更優(yōu)選1 15-1 30; 所述低碳醇優(yōu)選甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或其混合物，更優(yōu)選甲醇和乙醇，進(jìn)一步優(yōu)選乙
6.如權(quán)利要求1-5之一所述的方法，其特征在于，步驟5)中，所述硅膠基質(zhì)鍵合材料的粒徑優(yōu)選40-100微米，更優(yōu)選40-70微米；所述低碳醇優(yōu)選甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或其混合物，更優(yōu)選甲醇和乙醇，進(jìn)一步優(yōu)選甲
7. 一種銀杏葉中總黃酮和總內(nèi)酯的提取分離制備方法，所述方法包括1)提取稱取含水量為-10%的銀杏葉，加入其重量8-12倍、濃度為10%-50% 乙醇，20-50°C浸泡提取2-5次，每次1-5天，合并提取液，將提取液濃縮得到相對(duì)密度為 1. 15-1. 25 的浸膏；2)醇沉將浸膏中加入乙醇使乙醇體積濃度達(dá)到50-70%，并充分?jǐn)嚢瑁?-4°C冷藏靜置12-36小時(shí)，過(guò)濾，將濾液濃縮至相對(duì)密度為1. 10-1. 25的浸膏；再加入乙醇使乙醇體積濃度達(dá)到70-90%，并充分?jǐn)嚢瑁?-4°C冷藏靜置12-48小時(shí)過(guò)濾，將濾液濃縮揮發(fā)除去乙醇，濃縮得到相對(duì)密度為1. 15-1. 25的浸膏；3)水沉將醇沉完的浸膏中按照1 5-1 10的體積比加入水，充分?jǐn)嚢瑁?-4°C冷藏靜置M-240小時(shí)，過(guò)濾，樣品溶液經(jīng)過(guò)10000-25000轉(zhuǎn)/分鐘的高速離心機(jī)離心，樣品濃縮至相對(duì)密度為1. 10-1. 20的浸膏；4)大孔樹(shù)脂分離將水沉完的浸膏上樣于非極性大孔樹(shù)脂柱，上樣量與分離材料體積比為1 5-1 50，分別采用水、體積濃度10-30%乙醇、體積濃度30-60%乙醇和60-90% 乙醇洗脫，每次洗脫的體積為3-6個(gè)柱體積，流速為1-3個(gè)柱體積/小時(shí)；收集10-30%乙醇和60-90%乙醇洗脫組分，合并洗脫液并濃縮至相對(duì)密度為1. 10-1. 20的浸膏；5)硅膠基質(zhì)鍵合材料分離以粒徑10-100微米的硅膠基質(zhì)鍵合材料為填料，以不同體積濃度的甲醇水溶液作為洗脫液，對(duì)大孔樹(shù)脂分離得到的浸膏進(jìn)行洗滌，甲醇的體積濃度從10-70%變化，收集目標(biāo)洗脫組分，干燥處理即為銀杏葉中的總黃酮和總內(nèi)酯類化合物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種銀杏葉中總黃酮和總內(nèi)酯類化合物的高效提取分離制備方法，其中所述提取分離物的主要成分為黃酮及其苷類、銀杏二萜內(nèi)酯類。所述制備方法包括以下步驟提取、醇沉、水沉、大孔樹(shù)脂分離和硅膠基質(zhì)鍵合材料分離。采用所述方法制備的主要成分中目標(biāo)物含量高、有機(jī)殘留低，且所述方法重現(xiàn)性好、生產(chǎn)周期短并能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07D311/30GK102295651SQ201110183259
公開(kāi)日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2011年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月1日
發(fā)明者豐加濤, 馮志瓊, 王海濤, 董麗晶 申請(qǐng)人:北京雙鶴高科天然藥物有限責(zé)任公司