專利名稱：晶胞粘連控制基因簇的克隆及在防止晶體降解中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬農(nóng)業(yè)微生物基因工程技術領域。具體涉及晶胞粘連表型控制基因簇的分離、克隆以及它編碼的產(chǎn)物在防止晶體蛋白降解中的應用，本發(fā)明還與微生物農(nóng)藥技術領域相關。
背景技術：
蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是ー種廣泛存在于各種生態(tài)環(huán)境中的革蘭氏陽性桿狀細菌。該物種最大的特點就是在其生長周期中能形成內(nèi)生芽胞的休眠體，并且在其芽胞形成的同時能產(chǎn)生對許多昆蟲具有特異毒性的由殺蟲晶體蛋白(Insecticidal Crystal Proteins, ICPs)組成的伴胞晶體。這些殺蟲晶體蛋白對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目等昆蟲綱10個目500多種昆蟲以及原生動物、線形動物門、扁形動物門中某些有害種類也有特異的生物活性(Schnepf H E，Crickmore N, Rie J V,Lereclus D,Baum J,Feitelson J,Zeigler D R,Dean D H. 1998. Bacillus thuringiensisand its pesticidal crystal proteins. Microbiol Mol Biol Rev, 62 :775-806)。由于蘇云金芽胞桿菌對多種昆蟲都有很高的殺蟲活性，而且具有對環(huán)境和人蓄無損害等優(yōu)點，因此被廣泛地應用于生物農(nóng)藥的開發(fā)。目前，基于蘇云金芽胞桿菌開發(fā)的生物殺蟲劑已經(jīng)成為最成功的ー種生物農(nóng)藥，占到了整個生物農(nóng)藥行業(yè)90%以上的市場，廣泛地應用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)和倉儲等害蟲的防治。B. thuringiensis的伴胞晶體是在芽胞形成期(sporulation)合成并累積而成。芽胞的形成可分為7個時期，一般在芽胞形成的第二期晶體蛋白開始表達，隨著芽胞的進ー步發(fā)育，晶體蛋白逐漸累積，并形成具有晶格結(jié)構(gòu)的伴胞晶體。當芽胞成熟以后，母細胞自溶，釋放出芽胞和伴胞晶體。在絕大多數(shù)B. thuringiensis中，伴胞晶體是在母細胞中形成的，在空間上與芽胞無關。一旦芽胞成熟并且細胞自溶后，芽胞和伴胞晶體都釋放出來，彼此相互獨立。在少數(shù)B. thuringiensis的亞種中，芽胞成熟母細胞自溶后，伴胞晶體和芽胞彼此不分離，光學顯微鏡鏡下觀察兩者是粘連在一起的(簡稱晶胞粘連)，例如幕蟲亞種U i F,Zhu Y,Ju S,Znang R,Yu Z,Sun M. 2009. Promoters of crystal protein genes donot control crystal formation inside exosporium of Bacillus thuringiensis ssp.finitimus strain YBT-020· FEMS Microbiol Lett，300(I) :11-17)。蠟狀芽胞桿菌群(包括蠟狀芽胞桿菌(B.cereus，簡稱Be)、炭疽芽胞桿菌(B. anthracis,簡稱 Ba)和蘇云金芽胞桿菌(B. thuringiensis,簡稱 Bt))與 B. subtilis相比，其芽胞結(jié)構(gòu)有一個明顯的差異，前者在芽胞衣(coat)外還有ー層芽胞外壁(,exosporium) (Henriques A O,Moran C P Jr 2007. Structure, assembly, and function ofthe spore surface layers. Annu Rev Microbiol,61 :555-588)。大多數(shù)B. thuringiensis的伴胞晶體是在芽胞外壁外側(cè)形成的，而幕蟲亞種的伴胞晶體則在芽胞外壁和芽胞衣之間形成，從而導致晶胞粘連表型的產(chǎn)生。 目前，蘇云金芽胞桿菌應用主要包括兩個途徑，一種是將蘇云金芽胞桿菌的殺蟲晶體蛋白基因轉(zhuǎn)入植物中，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物，用于農(nóng)業(yè)害蟲的防治(Pigott CR and EllarDJ. 2007. Role of receptors in Bacillus thuringiensis crystal toxin activity.Microbiol Mol Biol Rev 71 :255-281);另一種是做成可以在環(huán)境中釋放的生物殺蟲劑。在戶外使用過程中，由于晶體蛋白本身對紫外線敏感，在環(huán)境中容易被降解掉從而降低殺蟲的活性。讓殺蟲晶體蛋白定位于芽胞外壁的內(nèi)側(cè)，制成生物囊殺蟲劑，是ー種具有潛力的防止晶體過快降解的方法；當母細胞裂解后形成晶胞粘連，在環(huán)境中釋放時由于受到芽胞外壁的保護，可以延長作用時間。對于晶胞粘連機制的研究為這種設想可以提供理論基礎。晶胞粘連表型被鑒定出來已有半個世紀之久(Hannay C L. 1961. Fowler ' sbacillus and its parasporal body. J Biophys Biochem Cytol,9 :285-298. ), Debro 等通過質(zhì)粒消除和接合轉(zhuǎn)移實驗證明晶胞粘連表型和ー個大小約98MDa的質(zhì)粒緊密連鎖，因此他們推測這個質(zhì)粒包含了控制晶胞粘連表型所需的所有基因，在這個菌株中粘連的晶體主要由大小 135kDa 的晶體蛋白組成(Debro L, Fitz-James P C, Aronson A. 1986. Twodifferent parasporal inclusions are produced by Bacillus thuringiensis subsp.finitimus. J Bacteriol, 165 :258-268)。在蘇云金芽胞桿菌幕蟲亞種B-1166VKPM菌株中共克隆到兩類晶體蛋白基因cry26Aal和cry28Aal，分別編碼大小約1163和1109個氨基酸(ffojciechowska J A, Lewitin E, Revina L P, Zalunin I A, Chestukhina G G. 1999. Twonovel delta—enaotoxin gene iamilies cry26 and cry28 irom B&ci丄丄us thuringiensisssp. finitimus. FEBS Lett,453 :46-48)。Vidal-Quist 等在對西班牙一個果園生境中分離純化得到的芽胞桿菌表型鏡檢觀察發(fā)現(xiàn)，在分離的376株芽胞桿菌中有25株表象出晶胞粘連表型，這25株菌的晶胞粘連表型可以分成4個類型，通過SDS-PAGE顯示每種類型都有不同的晶體蛋白構(gòu)成(Vidal-Quist J C, Castanera P, Gonzalez-Cabrera J. 2009.Diversity of Bacillus thuringiensis strains isolated from citrus orchards inSpain and evaluation of their insecticidal activity against Ceratitis capitata.J Microbiol Biotechnol，19 :749-759)。這說明晶胞粘連表型涉及的晶體蛋白具有多樣性Aronson(Aronson A. 2002. Sporulation and delta-endotoxin synthesis byBacillus thuringiensis. Cell Mol Life Sci, 59 :417-425)曾提出兩種機制來解釋這種現(xiàn)象第一種假設是晶體和芽胞外壁的表達在時空上的一致性；另ー種是在質(zhì)粒上的基因編碼的蛋白質(zhì)通過蛋白的相互作用將晶體蛋白定位在芽胞外壁的內(nèi)側(cè)。到目前為止，控制晶體定位于芽胞外壁內(nèi)側(cè)的基因還沒有被報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明對具有典型晶胞粘連表型的蘇云金芽胞桿菌菌株YBT-020為研究對象開展了相關研究，目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，獲得控制晶胞粘連表型的基因簇。本發(fā)明在異源宿主BMB171中表達晶胞粘連控制基因簇和晶體蛋白基因cry26Aa，使該菌株產(chǎn)生晶胞粘連表型，從而抑制了 Cry26Aa形成的晶體的降解。上述基因簇來源于蘇云金芽胞桿菌幕蟲亞種菌株YBT-020(菌株來源參見文獻Ji F,Zhu Y, Ju S, Zhang R,Yu Z,Sun M. 2009. Promoters of crystal protein genes donot control crystal formation inside exosporium of Bacillus thuringiensis ssp.finitimus strain YBT-020. FEMS Microbiol Lett, 300 (I) :11-17)，該菌株具有典型晶胞粘連表型，所必需的基因簇定位在內(nèi)生大質(zhì)粒PBMB28上，共有5個基因組成。在異源宿主BMB171通過形成晶胞粘連表型使晶體產(chǎn)生于芽胞外壁的內(nèi)側(cè)，可以有效的防止晶體蛋白Cry26Aa組裝形成的伴胞晶體的降解。本發(fā)明的技術方案是這樣的
申請人通過質(zhì)粒消除方法證明晶胞粘連表型和內(nèi)生質(zhì)粒pBMB28連鎖關系，通過片段互補實驗，從構(gòu)建的YBT-020穿梭基因組BAC文庫中篩選到ー個35kb片段可以在質(zhì)粒突變株BMB1150中恢復晶胞粘連表型。通過片段缺失，最終找到ー個7kb的片段是控制晶胞粘連的必需區(qū)域，申請人將這個片段命名為PBMB251B2。該片段包含ー個由5個基因組成的基因簇，申請人將其分別命名為orfl，orf2, orf3, orf4和orf5基因，它們的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所不。該基因族編碼的蛋白的氣基酸序列如序列表SEQ ID NO :2-6所示。其大小和編碼蛋白質(zhì)的性質(zhì)如下控制基因orfl編碼300個氨基酸，orf2編碼268個氨基酸，這兩個蛋白分別于晶體蛋白ND40KD和ND32KD有比較低的序列一致性；orf3編碼480個氨基酸，orf4編碼367個氨基酸，or5編碼376個氨基酸，這三個蛋白和芽胞萌發(fā)蛋白有一定的一致性；orfl和orf2組成ー個操縱子共表達，orf3, orf4和orf5組成ー個操縱子共表達。晶體蛋白Cry26Aa在異源宿主BMB171中組裝形成的游離伴胞晶體容易被降解，本發(fā)明提供的上述5個基因與cry26Aa共轉(zhuǎn)化BMB171中可以使形成的伴胞晶體定位于芽胞外壁內(nèi)側(cè)，當母細胞裂解后，由于受到芽胞外壁的保護，可以有效的防止伴胞晶體降解。為通過改造構(gòu)建工程菌，將其他種類的殺蟲晶體蛋白定位于芽胞外壁內(nèi)側(cè)，制成生物囊殺蟲劑，提供了理論基礎和很好的范例。本發(fā)明還提供了利用穿梭BAC文庫篩選控制晶胞粘連表型基因簇的方法，本方法具有一定的示范性。更詳細的技術方案參考實施例部分的描述。


序列表SEQ ID NO :1是本發(fā)明分離和克隆的晶胞粘連控制基因簇的核苷酸序列(基因orfl的核苷酸序列為703-1605bp ;基因orf2的核苷酸序列為1707_2513bp ;基因orf3的核苷酸序列為2878-4320bp ;基因orf4的核苷酸序列為4313_5416bp ;基因orf5的核苷酸序列為5413-6543bp)，本基因簇序列全長為7006bp。序列表SEQ ID NO :2_6是晶胞粘連控制基因簇中5個基因編碼的氨基酸序列。其中控制基因orfl編碼300個氨基酸，其如序列表SEQ ID NO 2所示；基因orf2編碼268個氨基酸，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :3所示；基因orf3編碼480個氨基酸，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 4所示；基因orf4編碼367個氨基酸，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :5所示；基因or5編碼376個氨基酸，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:6所
/Jn ο圖I:本發(fā)明的技術流程2 :本發(fā)明實施例中質(zhì)粒消除突變株的鏡檢表型；其中圖2A:質(zhì)粒突變株BMBl 150 ;圖 2B :質(zhì)粒突變株 BMB1151 ;圖 2C :菌株 YBT-020。
圖3 :是本發(fā)明實施例中質(zhì)粒PBMB251B2的構(gòu)建過程。圖4 :是本發(fā)明實施例中控制晶胞粘連必需基因簇的結(jié)構(gòu)圖。圖5 :是本發(fā)明實施例中顯微觀察Cry26Aa在BMB171的形成晶體及恢復晶胞粘連的表型；其中圖5A和圖5B BMB171中含有cry26Aa基因，培養(yǎng)36h和120h ;圖5C :BMBSCA (BMB171中含有晶胞粘連基因簇和cry26Aa基因)培養(yǎng)時間為120h。圖6 :是本發(fā)明實施例中cry26Aa在BMB171中表達SDS-PAGE檢測；其中泳道1_6分別是培養(yǎng)24h，48h，72h，94h和120h提取晶體蛋白；M為200kDa蛋白Marker。
具體實施方案以下敘述是根據(jù)本發(fā)明實施方案的實施例，詳細實驗流程參照圖I。應當說明的是，本發(fā)明的實施例對于本發(fā)明只有說明作用，而沒有限制作用。有關DNA的標準操作方法和所使用的藥品或試劑均參考J.薩姆布魯克等著的《分子克隆實驗指南》所描述的內(nèi)容(參見J.薩姆布魯克等，2002，分子克隆實驗指南，第三版，金冬雁等(譯)，科學出版社，北京)。本發(fā)明中所涉及的其他各種實驗操作，均為本領域的常規(guī)技術，文中沒有特別說明的部分，本領域的普通技術人員可以參照本發(fā)明申請日之前的各種常用工具書、科技文獻或相關的說明書、手冊■等加以實施。實施例I晶胞粘連控制基因簇的定位I、蘇云金芽胞桿菌YBT-020菌株質(zhì)粒消除突變株的篩選蘇云金芽胞桿菌YBT-020菌株共包含兩個質(zhì)粒，命名為pBMB26和pBMB28 (質(zhì)粒來源參見文獻Ji F, Zhu Y, Ju S, Zhang R, Yu Z, Sun Μ. 2009. Promoters of crystalprotein genes do not control crystal formation inside exosporium of Bacillusthuringiensis ssp. finitimus strain YBT-020. FEMS Microbiol Lett，300 (I) :11-17)。利用逐級升溫培養(yǎng)的方法消除質(zhì)粒共獲得了 2株質(zhì)粒消除的突變株其中消除質(zhì)粒pBMB26的突變株命名為BMBl 151 (菌株來源參見文獻Jv S Y，Ji F，Zhu Z M, Yu Z N, Sun M, TangZ G，Zhang R. 2007. The plasmid harboring cry26Aa may contribute to the phenomenonof spore-crystal connection in Baci丄丄us thuringiensis subsp. finitimus. Wei ShengWu Xue Bao，47(l) :88-91);消除了質(zhì)粒pBMB28的突變株命名為BMB1150。對這兩株突變株鏡檢觀察發(fā)現(xiàn)BMBl 150產(chǎn)生游離的晶體，晶胞粘連表型丟失(圖2A);而BMB1151由于沒有晶體產(chǎn)生(圖2B)。質(zhì)粒消除實驗證明晶胞粘連控制基因位于PBMB28上。質(zhì)粒消除的具體操作方法是將蘇云金芽胞桿菌菌株YBT-020在LB(1L LB培養(yǎng)基配制蛋白胨IOg ;酵母粉5g ；NaCl IOg ；pH 7. 0-7. 2)平板上劃線分離單菌落。取單菌落接種于LB培養(yǎng)液，在30°C培養(yǎng)至對數(shù)生長中期，以1/100接種量(v/v)轉(zhuǎn)接于SCG培養(yǎng)液(1L SCG 培養(yǎng)基配制:酸水解酪素 Ig ;葡萄糖 5g ； (NH4)2SO4 2g ；K2HP04 I. 4g ；KH2PO4 5g ;梓檬酸鈉Ig ；MgS04 0. 2g ；pH 7. 0-7. 2)中，在42°C以200r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，每隔12h轉(zhuǎn)接I次，連續(xù)轉(zhuǎn)接10次后，梯度稀釋涂布SCG平板，置42°C培養(yǎng)。從中取單菌落點種于SCG平板上，在42°C溫箱中培養(yǎng)。每隔48h取其菌落的邊緣部分點種于下ー個SCG平板。將部分經(jīng)過42°C處理后的菌株，點種于SCG平板上繼續(xù)升溫至44°C培養(yǎng)，每隔48h取其菌落的邊緣部分點種于下ー個SCG平板，抽提質(zhì)粒并用電泳檢測質(zhì)粒是否消除。、
實施例2晶胞粘連控制基因族的克隆I.蘇云金芽胞桿菌菌株YBT-020基因組穿梭BAC文庫的構(gòu)建(I)外源DNA片段的制備挑取蘇云金芽胞桿菌菌株YBT-020單菌落接于5mL滅過菌的LB培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)過夜。次日按1%體積的接種量轉(zhuǎn)接于IOOmL去離子水配的滅菌的LB培養(yǎng)基中，于28°C培養(yǎng)3-4h,使OD600達到O. 2。在10, OOOrpm離心，收集菌體于無菌的5OmL離心管中，用等體積的TE緩沖液洗滌2次。TE25S緩沖液配制I %的低熔點瓊脂糖凝膠，冷卻至50°C，將菌體重懸于2mL凝膠中。用50°C凝膠將凝膠菌懸液按照2倍，4倍，6倍，8倍，10倍分別稀 釋。各個稀釋度分別澆灌模具，制備菌體凝膠包埋塊。將包埋塊浸在TE25S緩沖液(1L緩沖液配制蔗糖，102. 7g ；0. 5M EDTA, 50mL ；1MTris-Cl,5mL, pH 8. 0)中，加終濃度2mg/mL的溶菌酶，于4°C處理24h，去細胞壁。除掉TE25S 緩沖液，用 NDS 緩沖液(1L 緩沖液配制0. 5M EDTA, IOOmL ；1M Tris-Cl，IOmL ;十ニ烷基硫酸鈉(SDS)，10g,pH 8. O)洗滌包埋塊，IOmL/次，洗滌3次。將包埋塊浸在NDS緩沖液中，加入終濃度lmg/mL的蛋白酶K，放于50°C水浴鍋中處理48h，去蛋白。除掉NDS緩沖液，用 T10E10 緩沖液(1L 緩沖液配制0. 5M EDTA, 20mL ；1M Tris-Cl，10mL，pH 8. 0 ;在 121。。高壓蒸汽滅菌30min)洗滌3次，然后將包埋塊轉(zhuǎn)入另ー個50mL的離心管中，用含O. ImM苯甲基磺酰氟(PMSF)的！HlEltl緩沖液洗滌5次，每次10mL、lh，并置冰上操作。洗滌好的包埋塊可以直接酶切，或置于4°C下保存7天以上，或浸泡于70%濃度的こ醇中置_20°C保存2個月以上。脈沖電泳(I%凝膠，起始脈沖I，終止脈沖25，電壓6V/cm，轉(zhuǎn)換角度120°，電泳時間24h)檢測包埋塊DNA的含量，選取稀釋度合適的包埋塊。每個包埋塊用500 μ L BufferM(1L 緩沖液配制1M Tris-Cl，IOOmL ；1M MgCl2 IOOmL ；0. IM ニ硫蘇糖醇(DTT)，IOOmL ；5MNaCl IOOmL)浸泡，置冰上2h。除掉Buffer M，更換新鮮的Buffer M，每塊包埋塊分別用
O.2U、0. 5U、1U、2U、5U、10U HindIII的酶量設置500 μ L的酶切體系，置冰上30min，然后于37°C溫育30min。酶切后用O. 5M的EDTA終止反應。脈沖電泳檢測酶切產(chǎn)物的大小，確定反應體系及目標片段(75-100kb)的泳動位置。放大反應體系，脈沖電泳，在凝膠上對應的位置切取目標片段。將含有目標片段的凝膠通過透析袋電泳(TAE緩沖液，電壓6V/cm，電泳時間2h)回收目標DNA，存于-20°C保存待用。(2)穿梭BAC載體的制備接種含有穿梭BAC質(zhì)粒pEMB0557的大腸桿菌(菌株來源參見文獻Liu X，Peng D，Luo Y，Ruan L，Yu Z，Sun M. 2009. Construction of an Escnerichia coli toBacillus thuringiensis snuttle vector for large DNA fragments. Appl Microbio丄Biotechnol，82(4) :765-772)于LB培養(yǎng)基中，加終濃度25 μ g/mL的氯霉素，37°C培養(yǎng)過夜。收集菌體，利用小量堿法抽取質(zhì)粒(質(zhì)粒抽提方法參見文獻Andrup L, Damgaard J,Wassermann K. 1993. Mooilization of small plasmids in Bacillus thuringiensissubsp. israelensis is accompanied by specinc aggregation. J Bacteriol，175 (20)6530-6536)。抽提的pEMB0557載體用限制性內(nèi)切酶HindIII完全酶切(酶切位點見圖3)。酶切后的反應體系于65°C處理lOmin，使酶失活。在已有的體系中按照I μ g質(zhì)粒加5U CIAP的酶量添加堿性磷酸酶，于37°C溫育lh，然后用苯酚/氯仿/異戊醇(體積比為25 24 I)抽提兩次。脈沖電泳(I%凝膠，起始脈沖I，終止脈沖15，電壓4. 5V/cm，轉(zhuǎn)換角度120°，電泳時間18h)檢測去磷酸化后的載體。用溴化こ啶(EB)染色的時候只切取一部分凝膠染色，用干凈的刀片在凝膠上切刻，標下載體(11.4kb)的位置。在另外沒有染色的凝膠上對應位置切下含有載體的凝膠，通過透析袋電泳(TAE緩沖液，電壓6V/cm，電泳時間2h)回收載體?；厥盏妮d體按照1μ gDNA用IU T4DNA連接酶的量設置連接體系，16°C連接過夜。脈沖電泳分離樣品，切取含有載體(11.4-kb線狀DNA)的凝膠，透析袋電泳回收，存于_20°C待用。(3)大腸桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的制備
接種大腸桿菌菌株DHlOB單菌落于5mL SOB培養(yǎng)基(1L SOB培養(yǎng)基配制蛋白胨20g，酵母粉 5g，NaCl O. 5g,0. 25M KCl，10mL;2M MgCl2, 5mL)中，37°C培養(yǎng)過夜。按 1%體積的接種量將培養(yǎng)好的大腸桿菌DHlOB菌株轉(zhuǎn)接于IOOmL SOB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)3h左右，使0D600值達到O. 6。將培養(yǎng)液迅速置冰上冷卻，然后4°C，4000rpm離心IOmin收集菌體。用10%濃度的預冷的甘油洗滌菌體3次，第一次用與培養(yǎng)基等體積的甘油，后兩次用與培養(yǎng)基一半體積的甘油。菌體重懸于2mL 10%濃度預冷的甘油中，分裝成50μ L姆管,速凍，保藏于_70°C備用。以上操作需在嚴格無菌條件的下于4°C恒溫室完成。感受態(tài)細胞涂布含有終濃度12. 5 μ g/mL氯霉素的LB平板，檢測細胞是否被污染。(4)連接與轉(zhuǎn)化用制備的穿梭BAC載體pEMB0557連接λ DNA HindIII酶切片段，電擊轉(zhuǎn)化(電壓12. 5kv/cm)制備的大腸桿菌菌株DHlOB感受態(tài)細胞，檢測載體和感受態(tài)細胞的效率。按照外源UDNA HindIII酶切片段)與載體摩爾比為10 I的比例設置連接體系，于16°C連接過夜。用去離子水配制含有O. IM葡萄糖的I %的凝膠，熔膠，制備帶有可容納50 μ L液體的凹槽的凝膠柱。將連接體系置于凹槽中，4°C放置2h，除去連接體系中的鹽份。取2yL的連接產(chǎn)物與50 μ L感受態(tài)細胞混合，電擊轉(zhuǎn)化(電壓2. 5kv/cm)，然后迅速加入預熱的SOC培養(yǎng)基(100ml SOB 培養(yǎng)基中加入 IM葡萄糖 20ml ；Luo M Z,ffing R A. An improved methodfor plant BAC library construction. In Grotewold E eds. , Methods in MolecularBiology. Totowa, NJ Humana Press, 2003), 37°C恢復培養(yǎng) 40min。在含有 12. 5 μ g/mL 氯霉素的LB平板表面涂布5-溴-4-氯-3- Π引哚-β -D-半乳糖苷(X-gal)和異丙基_ β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)(每個直徑9cm的平皿涂布和)，將恢復培養(yǎng)液涂布平板，37°C培養(yǎng)16h。挑取白色單菌落，保存。(5)文庫的篩選與保存隨機挑取白色單菌落，接種于5mL LB培養(yǎng)基中，添加終濃度12. 5 μ g/mL的氯霉素，37°C培養(yǎng)過夜。收集菌體，用小量減法(文獻同前)提取質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶NotI和HindIII分別酶切BAC轉(zhuǎn)化子，脈沖電泳檢測插入片段的長度。將插入片段大小合適，陽性率高的批次的轉(zhuǎn)化子大量挑取，于含有20%濃度的甘油和12. 5 μ g/mL的氯霉素的LB培養(yǎng)基中，用細胞培養(yǎng)板96孔板(200 μ L培養(yǎng)液/孔)靜置培養(yǎng)24h。培養(yǎng)好的菌懸液用液氮速凍，然后置_80°C保存。2.覆蓋PBMB28全長克隆子的篩選從蘇云金芽胞桿菌YBT-020中克隆到晶體蛋白基因cry28Aa，經(jīng)過southern雜交證明 cry28Aa 定位在約 140kb 質(zhì)粒 pBMB28 上(參見Ji F, Zhu Y, Ju S, Zhang R, Yu Z,Sun Μ. 2009. Promoters of crystal protein genes do not control crystal formationinside exosporium of Bacillus thuringiensis ssp. finitimus strain YBT-020.FEMS Microbiol Lett, 300 (I) :11-17)。設計引物PL_t28 GGCGAATTTATCACTCAC ；PR-t28 ；CGCGAATTTAATAGCATGGA，從文庫中篩選出含有cry28Aa基因的BAC克隆子進行末端測序，用測序獲得的末端序列設計如下的引物對，該引物對的核苷酸序列如下所示引物p28-l GGGATAAGCTCACCCTAACA ；引物p28-2 :TTCCTGAGCTTTTGAGGTGG。弓丨物p28-3 GCCAACTCTGTAAGGAAGC ； 引物p28-4 :CATCTATTTGTTCCGCCAATG。在文庫中進行第二輪篩選，篩選能覆蓋第一輪末端序列的BAC克隆子，以此繼續(xù)，通過幾個BAC克隆子就可以獲得覆蓋質(zhì)粒全長。最終，篩選到4個穿梭BAC克隆子覆蓋PBMB28 全長。3.在BMB1150中恢復表達晶胞粘連表型質(zhì)粒消除實驗證明控制晶胞粘連的基因位于質(zhì)粒pBMB28上，在質(zhì)粒消除實驗中獲得了質(zhì)粒PBMB28消除突變株BMB1150，以該菌株BMB1150為受體菌，將覆蓋pBMB28的4個克隆子分別電轉(zhuǎn)化BMB1150，尋找pBMB28上控制晶胞粘連的區(qū)域。具體方法是(I)質(zhì)粒pBMB28中控制晶胞粘連區(qū)域的確定將4個覆蓋pBMB28的克隆子分別電轉(zhuǎn)入BMBl 150中，鏡檢觀測表型顯示只有ー個克隆子包含約35kb的片段可以恢復晶胞粘連表型，申請人將該含有該片段的重組質(zhì)粒命名為pBMB251 (物理圖譜見圖3)。通過片段互補實驗，確定了 pBMB28上決定晶胞粘連的區(qū)域。電轉(zhuǎn)化蘇云金芽胞桿菌的方法參考Peng D等發(fā)表的文獻報道的方法(Peng D，Luo Y，Guo S, Zeng H, Ju S, Yu Z, Sun Μ. 2009. Elaboration of an electroporation protocolfor large plasmids and wild-type strains of Bacillus thuringiensis. J ApplMicrobiol,106(6) :1849-1858)(2)控制晶胞粘連表型必需基因的確定為了確定控制晶胞粘連表型的必需基因，對35kb進行截短，連接到載體PHT304上(質(zhì)粒來源參見又獻Arantes O, Lereclus D. 1991. Construction of cloning vectorsfor Bacillus thuringiensis. Gene. 108(1) :115-119)最終確定一個約 7kb 的片段為控制晶胞粘連的最小區(qū)域，申請人將包含該片段的重組質(zhì)粒命名為pBMB251B2(質(zhì)粒構(gòu)建過程及物理圖譜見圖3)。該片段包含5個必需基因，申請人將其命名為0rfl-0rf5，基因組成見圖4。其中orfl和orf2和晶體蛋白基因有較低的序列一致性，orf3_orf5和芽胞萌發(fā)基因有序列一致性。各基因具體序列信息見表I所述。表I本發(fā)明的晶胞粘連必需基因比對分析
權利要求
1.晶胞粘連表型控制的基因族，它的核昔酸序列如序列表SEQID N0:1所不,其中 orfl基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1中第703-1605位所示； orf2基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1中第1707-2513位所示； orf3基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1中第2878-4320位所示； orf4基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1中第4313-5416位所示； orf5基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1中第5413-6543位所示。
2.晶胞粘連表型控制的基因簇編碼的蛋白，它的氨基酸序列如序列表SEQID NO :2-6所示。
3.權利要求2所述的基因簇編碼的蛋白在制備防治農(nóng)業(yè)害蟲的微生物制劑中的應用。
4.權利要求2所述的基因簇編碼的蛋白在防止蘇云金芽胞桿菌晶體降解中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物基因工程技術領域，具體公開了一種來自于蘇云金芽胞桿菌幕蟲亞種YBT-020晶胞粘連控制基因簇的分離、克隆及其在防止晶體降解中的作用。本發(fā)明從具有典型晶胞粘連表型的蘇云金芽胞桿菌YBT-020中克隆得到控制其晶胞粘連表型的基因簇，共有5個基因組成，其編碼的蛋白質(zhì)的序列如序列表SEQ ID NO2-6所示。該基因簇和晶體蛋白基因cry26Aa在無晶體突變株BMB171中共表達時，可以使晶體形成在芽胞外壁的內(nèi)側(cè)；當母細胞裂解后，由于晶體被芽胞外壁包裹，可以有效的抑制晶體蛋白的降解。
文檔編號C07K14/32GK102643833SQ20111004144
公開日2012年8月22日 申請日期2011年2月21日 優(yōu)先權日2011年2月21日
發(fā)明者付菁菁, 孫明, 尚卉, 徐承晨, 朱義廣, 朱倩, 王鵬霞, 紀芳, 鄧運 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學