專利名稱：一種鹽地堿蓬耐鹽基因SsPSI及其編碼蛋白和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到植物基因工程領(lǐng)域，具體的說明是利用DNA分離技術(shù)獲得功能顯著提高的植物基因& 31，本發(fā)明還涉及到利用此基因培育轉(zhuǎn)基因耐鹽植物。
背景技術(shù)：
鹽脅迫是植物生長發(fā)育的重要限制因子，它可使作物尤其是灌溉農(nóng)業(yè)的作物減產(chǎn)。鹽漬土由于其惡劣的理化性質(zhì)限制了絕大多數(shù)植物的生長，長期以來被認(rèn)為是一種嚴(yán)重的災(zāi)害性土地資源。由于大多數(shù)作物都是非鹽生植物，其生長發(fā)育更容易受到土壤鹽分的影響。然而，近年的研究表明，鹽漬土上分布著豐富的鹽生植物資源。鹽生植物是鹽漬土上唯一能夠生長的植物區(qū)系，據(jù)不完全統(tǒng)計，全世界有鹽生植物沈00余種，其中很大一部分在非鹽漬土上很難生長，它代表了一類鹽漬化生境中專有的、不可替代的基因資源，是生物多樣性的重要組成部分。目前，隨著對植物耐鹽機(jī)理及相關(guān)途徑的研究分析，已成功克隆獲得許多耐鹽相關(guān)基因，而且發(fā)現(xiàn)這些基因通過相互作用實行網(wǎng)狀調(diào)控來有效的實現(xiàn)植物對鹽分的耐受。今后，傾向于將多個耐鹽主效基因?qū)χ参锕厕D(zhuǎn)化，從而盡可能的提高植物對高鹽的耐受。因此，在已有的相關(guān)耐鹽基因及其功能研究的基礎(chǔ)上，選擇合適的材料，如在高鹽生境下生長的植物，克隆其耐鹽基因、分析其耐鹽機(jī)制，系統(tǒng)的了解鹽生植物的耐鹽機(jī)理，以更好地提高植物尤其是經(jīng)濟(jì)作物的耐鹽性，以及改良土壤都有著極其重要的研究意義。植物受到鹽脅迫時其體內(nèi)會經(jīng)過多種變化。植物通過多種生化途徑來體現(xiàn)自身對鹽耐受的能力。如在鹽脅迫下，植物能保水和吸水，保護(hù)葉綠體和維持離子平衡等。必要的路徑包括那些鹽脅迫下導(dǎo)致滲透活性代謝物的產(chǎn)生，特殊的蛋白和一些清除自由基的抗氧化物酶和分子伴侶以控制植物體內(nèi)的離子平衡和水分流向。鹽脅迫是由滲透脅迫和離子脅迫組成的。在鹽脅迫下，植物的外部形態(tài)和內(nèi)部的生理生化特性都發(fā)生了一系列的變化，有些變化是鹽脅迫傷害的結(jié)果，是植物對逆境條件的消極反應(yīng)，有些則是植物對逆境的積極反應(yīng)，有益于對不利環(huán)境的適應(yīng)。植物在受到鹽脅迫時，其生理生化代謝方面表現(xiàn)出復(fù)雜的機(jī)制，尤其在分子機(jī)制即基因轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)節(jié)是植物鹽脅迫應(yīng)答過程中極其重要的一環(huán)，植物中許多重要功能基因的表達(dá)受鹽脅迫誘導(dǎo)或抑制，基因表達(dá)調(diào)控方面的研究備受研究者的關(guān)注，已成為近年來植物抗逆研究的熱點。將主要參與植物鹽應(yīng)答的分子機(jī)制劃分為兩類一類為效應(yīng)分子，直接參與代謝變化等生化應(yīng)答過程，產(chǎn)生耐鹽效應(yīng)；另一類為調(diào)控分子，位于效應(yīng)分子上游，介導(dǎo)信號傳遞，包括轉(zhuǎn)錄因子和位于信號級聯(lián)系統(tǒng)中的各類激酶。這些蛋白質(zhì)分子及轉(zhuǎn)錄因子均受相應(yīng)基因的控制，是的在鹽脅迫下植物體內(nèi)的應(yīng)答基因呈現(xiàn)出相關(guān)的復(fù)雜性。效應(yīng)分子主要包括滲透保護(hù)物質(zhì)生物合成的關(guān)鍵酶基因，如糖類、甜菜堿及其衍生物、醇類及各種氨基酸。P5CR和P5CS是脯氨酸生物合成過程中的兩個重要酶，而后者是限速酶，因而在過量表達(dá)脯氨酸以提高植物耐鹽性的基因工程中P5CS基因作為首選對象。1995年Kishor等人將 P5CS基因?qū)霟煵莅l(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因煙草中脯氨酸的含量明顯提高，在干早脅迫下滲透保護(hù)作用增強(qiáng)。Liu Jingpin等在研究工作中也發(fā)現(xiàn)擬南芥(Arabidopsisthaliana) SOSl突變體耐鹽性高于野生型，同時脯氨酸含量也高于野生型。由于膽堿脫氫酶(CDH)和膽堿氧化酶 (CodA)合成甘氨酸甜菜堿，合成途徑簡單，遺傳操作方便，因而這兩種甜菜堿合成酶基因被認(rèn)為是最重要和最有希望的脅迫抗性基因之一。劉風(fēng)華等和Hidenori分別對植物進(jìn)行了 BADH基因和CodA轉(zhuǎn)基因研究，轉(zhuǎn)基因植物都獲得了較高的耐鹽性。參與重建膜內(nèi)外離子平衡的膜蛋白，如Ca+ATP酶、焦磷酸酶、H+-ATP酶和二級轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及各種通道蛋白被激活參與重建膜內(nèi)外離子平衡。其簡略的過程為Na+通過Na-K共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等通道大量“涌入”胞質(zhì)，H+-ATPase、Na7H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等被激活，協(xié)調(diào)工作以驅(qū)動Na+外排和運(yùn)入液泡，最終形成胞外、胞質(zhì)、液泡三者間的離子平衡。利用蛋白質(zhì)的生化功能分析和突變體功能互補(bǔ)等方法，目前已克隆和鑒定了許多參與重建膜內(nèi)外離子平衡的膜蛋白。編碼轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)基因可以通過對基因調(diào)控元件進(jìn)行調(diào)控下游一系列抗逆功能基因的表達(dá)進(jìn)而從多方面提高植物的抗逆性。盡管非生物脅迫是由多基因控制的，但是通過單個基因的轉(zhuǎn)化，如在轉(zhuǎn)基因植物中過量表達(dá)S0S1、NHXl基因，可以使植物鹽耐受能力明顯地提高。這些植物可以在200mmol/L NaCl鹽濃度下生長、開花，200mmol/LNacl鹽濃度對于野生植物來說是致死的。此外，這些植物也沒有在生物量上表現(xiàn)出明顯的異常和變化，NHXl基因過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因番茄和轉(zhuǎn)基因油菜結(jié)果也是一樣的。因此通過組織特異性過量表達(dá)S0S1、NHXl基因以及它們的正調(diào)控元件S0S2基因來調(diào)節(jié)離子平衡而開展的遺傳工程，將會顯著提高植物的鹽耐受?？果}堿植物是取之不盡的抗鹽堿基因庫，植物對鹽堿脅迫的應(yīng)答途徑和適應(yīng)方式很多種，與其相關(guān)的基因種類更多，這些基因在不同的植物中有差別，決定它們抗鹽堿的主要基因也有差異。在盡可能多的確定抗鹽堿相關(guān)基因，找到不同植物相應(yīng)的決定性抗鹽基因，利用較成熟的技術(shù)體系，提高植物轉(zhuǎn)基因的表達(dá)效率，進(jìn)行植物轉(zhuǎn)基因，進(jìn)而更有效地提高植物的抗鹽堿性。鹽地堿蓬生長在荒漠、半荒漠鹽堿地中，是非常耐鹽的一種鹽生植物，隸屬于黎科 (Chenopodiaceae)堿蓬屬(Suaeda Forsk ex Scop)是新疆鹽生荒漠的主要建群種，其葉片形態(tài)、大小隨土壤鹽分和水分的變化十分顯著。一般在土壤含鹽量< 80g/kg的土壤情況下都可見到其生長。由于堿蓬極度耐鹽，再加上堿蓬多數(shù)種幼苗嫩枝葉可做蔬菜，種子含油并可食用因而有著很大的開發(fā)前景，目前已被認(rèn)為是研究植物耐鹽機(jī)理的模式鹽生植物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于目前的技術(shù)現(xiàn)狀，提供一種鹽地堿蓬耐鹽基因& 31，該鹽地堿蓬耐鹽基因SsPSI由SEQ ID NO 1的核苷酸序列表定義。還提供該植物耐鹽基因SsPSI編碼蛋白，其由SEQ ID NO :2的氨基酸序列表定義。還提供該鹽植物耐鹽基因SsPSI在培育轉(zhuǎn)基因耐鹽植物中的應(yīng)用。SsPSI基因的克隆可以采用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成法等多種方法來獲得 PSI基因核苷酸全長序列或其片段。比如，基于PSI基因序列設(shè)計多核苷酸探針來從CDNA 文庫或基因組文庫中篩選目的基因，也可以用PCR擴(kuò)增方法直接從cDNA或基因組中擴(kuò)增出有關(guān)序列。
耐鹽&PSI作為目的基因，可以構(gòu)建在任何植物表達(dá)載體的Ti-質(zhì)粒雙元載體中。 比如PCAMBIA2301上，其中有LB和RB的T_DNA25bp重復(fù)序列，花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S 啟動子，polyA nos終止子，還有在真核生物中作為選擇標(biāo)記使用的卡那霉素。植物表達(dá)載體中的啟動子可以是任何一種組成型啟動子、組織特異性啟動子或環(huán)境誘導(dǎo)型啟動子，如 WDiqutin啟動子等。載體中的增強(qiáng)子既可以是轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，也可以是翻譯增強(qiáng)子。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，載體中還應(yīng)有植物可選擇性標(biāo)記(如GUS基因、熒光酶素基因等)或具有抗生素等抗性的標(biāo)記物(如卡那霉素、除草劑等)。含有SsPSI基因片段的重組載體可以轉(zhuǎn)入到一種細(xì)胞或生物體內(nèi)，如細(xì)菌、酵母或植物細(xì)胞進(jìn)行篩選。例如，可以將本發(fā)明得到的基因連接到任何酵母表達(dá)載體如PREP5N 上，利用本領(lǐng)域公知的方法如乙酸鋰技術(shù)、電轉(zhuǎn)化法等轉(zhuǎn)化酵母，將酵母轉(zhuǎn)化子涂布在含高濃度NaCl的選擇性培養(yǎng)基平板中，以高鹽為選擇壓力進(jìn)行篩選，確定其耐鹽性的功能驗證。通過本領(lǐng)域公知的研究方法如凍融法、電擊法等將上述重組載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物?？赏ㄟ^微注射、基因槍、花粉管通道方法等常規(guī)生物技術(shù)方法將耐鹽新基因SsPSI轉(zhuǎn)入植物中，培育出抗鹽品質(zhì)優(yōu)良及生物學(xué)性狀得到改善的植物新品種。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物也可以是雙子葉植物，如擬南芥、煙草、棉花、 小麥、水稻、牧草等。本發(fā)明的基因?qū)τ谂嘤果}植物品種，提高農(nóng)作物產(chǎn)量，節(jié)水灌溉、改善生態(tài)環(huán)境等具有很重要的意義。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因重組載體可作為商業(yè)用途的品種、品系或作為基因資源在生產(chǎn)上直接使用或進(jìn)行農(nóng)業(yè)生物育種和轉(zhuǎn)基因植物以提高作物的抗鹽性。


圖1為耐鹽SsPSI基因轉(zhuǎn)化酵母后的耐鹽篩選，即轉(zhuǎn)化后的酵母與未轉(zhuǎn)化的酵母對照在0、600mM NaCl的培養(yǎng)基平板上的生長情況A :MM培養(yǎng)基；B :600mM NaCl+MM培養(yǎng)基；CK 轉(zhuǎn)入空載體的酵母；1-3 轉(zhuǎn)pREP5N-PSI酵母，28°C培養(yǎng)3_6天。圖2為部分轉(zhuǎn)基因植株的擴(kuò)增結(jié)果M :DL2000 plus Maker, CK-陰性對照，CK+ 陽性對照，1-15 為轉(zhuǎn)基因煙草株系圖3轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性鑒定
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。1、耐鹽基因SsPSI的克隆用TRizol試劑從鹽生植物堿蓬中抽提總RNA，以總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈。以合成的cDNA為模板，用SsPSI基因的全長引物序列，通過PCR擴(kuò)增的方法獲得目的基因。PCR反應(yīng)體系為50yL :cDNA 1 μ L，引物各1 μ L，ExTaq酶0. 5 μ L， 10XPCR Buffer (Mg2+plus) 5 μ L, dNTP Mixture 4 μ L，力口 ddH20 至 50 μ L。PCR 程序94°C 預(yù)變性 3min ；94°C變性 30s，60°C復(fù)性 30s，72°C延伸 30s, 30 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin ；4°C 保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測后用DNA回收試劑盒回收目的片段。目的片段連接到 PGEM-Teasy載體中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，克隆到的SsPSI序列通過測序來確定。
全長引物序列PSI-ORF-S :5’ -ATGGCTTCTCTAGCAACCTTTGCC-3’PSI-ORF-As :5， -TTAGATCTTGCCACGAGGTCCG-3，2、構(gòu)建轉(zhuǎn)化酵母表達(dá)的載體以全長的SsPSI基因為模板，用含MlI和NotI酶切位點的引物，通過PCR擴(kuò)增出帶酶切位點的PSI基因，用Mil和NotI雙酶切PCR產(chǎn)物和PREP5N載體，回收產(chǎn)物通過T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，經(jīng)PCR檢測、酶切鑒定后，挑選陽性克隆， 通過測序來確定，將SsPSI基因亞克隆到酵母表達(dá)載體PREP5N上，命名為pREP5N_PSI。 菌落PCR反應(yīng)體系為20yL:以菌落為模板，引物各0. 4yL，Taq酶0. 2yL，10XPCR Buffer (Mg2+plus) 2. 0 μ L, dNTP Mixture 0· 4μ L。PCR 程序94°C 預(yù)變性 3min ；94°C 變性 30s，60°C復(fù)性30s，72°C延伸30s，30個循環(huán)；72°C延伸IOmin ；4°C保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，有大小約441bp條帶的以確定為陽性克隆。引物序列PSI-S :5’ -ACGCGTCGACATGGCTTCTCTAGCAACCTTTGCC-3’PSI-As :5’ -ATTTGCGGCCGCTTAGATCTTGCCACGAGGTCCG-3‘3、轉(zhuǎn)化酵母及轉(zhuǎn)化子的篩選分別把空質(zhì)粒載體pREP5N和pREP5N_PSI用電擊法轉(zhuǎn)入裂殖酵母Sp-QOl感受態(tài)中，再將轉(zhuǎn)化子分別涂到MM培養(yǎng)基(-Leu)上，28°C培養(yǎng)3天后，可以看到長出酵母菌落。采用菌落PCR的方法對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定。反應(yīng)體系為20 μ L 以菌落為模板，引物各0. 4μ L， Taq 酶 0. 2 μ L，10 X PCR Buffer (Mg2+plus) 2. 0 μ L, dNTP Mixture 0· 4 μ L。PCR 程序-M°C 預(yù)變性 3min ；94°C變性 30s，60°C退火 30s，72°C延伸 30s，30 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin ；4°C 保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測后，有大小約441bp條帶的以確定為陽性酵母轉(zhuǎn)化子。4、酵母轉(zhuǎn)化子耐鹽性鑒定為了排除轉(zhuǎn)化子的耐鹽性是由酵母自身突變所引起的可能性，把驗證后的轉(zhuǎn)化子提質(zhì)粒與空載體PREP5N重新轉(zhuǎn)化酵母。得到的單克隆用MM液體培養(yǎng)基養(yǎng)至OD :1. 0之后稀釋10倍，取5 μ L滴在匪培養(yǎng)基和含有600mMNaCl的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3_6天，觀察生長情況。結(jié)果如圖1所示，在MM培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)化PREP5N空載體和pREP5N_PSI的酵母均可以正常生長，而在含600mM NaCl的MM培養(yǎng)基上只有轉(zhuǎn)化pREP5N_PSI的酵母可以正常生長。5、構(gòu)建植物表達(dá)載體以全長的SsPSI基因為模板，用含BamHI和McI酶切位點的引物通過PCR擴(kuò)增出帶相應(yīng)酶切位點的SsPSI基因，用BamHI和&icl雙酶切PCR產(chǎn)物和pCAMBIA2300載體，通過凝膠回收產(chǎn)物，將目的基因和載體片段用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，經(jīng)PCR 檢測、BamHI和McI雙酶切鑒定后，挑選陽性克隆通過測序來確定將SsPSI基因亞克隆到植物表達(dá)載體PCAMBIA2300上，命名為pCAMBIA2300_PSI。引物序列PSI-CAM-S :5’ > CGGGATCCCGATGGCTTCTCTAGCAACCTTTGCC-3’PSI-CAM-As :5’ > GAGCTCTTAGATCTTGCCACGAGGTCCG-3’6、轉(zhuǎn)基因煙草的篩選提取轉(zhuǎn)基因煙草植株葉片的基因組DNA，取1 μ L通過瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性和濃度。以轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA為模板用擴(kuò)增SsPSI基因全長的引物進(jìn)行PCR，取 10 μ L產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳檢測陽性轉(zhuǎn)基因植株。部分轉(zhuǎn)基因植株的擴(kuò)增結(jié)果如圖2 所示。7、轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性鑒定將轉(zhuǎn)基因煙草植株和野生型植株分別放在MS和含250mM NaCl的固體MS培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)12天后，觀察鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的表型，從而篩選出對鹽脅迫有明顯抗性的轉(zhuǎn)基因植株。結(jié)果如圖3所示，在MS培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)基因煙草植株與野生型煙草均能正常生長，而在含250mM NaCl的MS培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因煙草植株能正常生長，野生型煙草受到明顯的抑制，生根量少且短。上述實驗結(jié)果表明，在^PSI轉(zhuǎn)基因煙草中過量表達(dá)可以增強(qiáng)植物的耐鹽性。應(yīng)當(dāng)理解的是，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變換， 而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種鹽地堿蓬耐鹽基因&PSI，其特征在于，由SEQ ID NO 1的核苷酸序列表定義。
2.鹽地堿蓬耐鹽基因SsPSI編碼蛋白，其特征在于，由SEQID NO 2的氨基酸序列表定義。
3.鹽地堿蓬耐鹽基因SsPSI在培育轉(zhuǎn)基因耐鹽植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鹽地堿蓬耐鹽基因SsPSI，該植物耐鹽基因SsPSI由SEQ ID NO1的核苷酸序列表定義。該鹽地堿蓬耐鹽基因SsPSI編碼蛋白，其由SEQ ID NO2的氨基酸序列表定義。該鹽地堿蓬耐鹽基因SsPSI在培育轉(zhuǎn)基因耐鹽植物中的應(yīng)用。
文檔編號C07K14/415GK102161994SQ20111003946
公開日2011年8月24日 申請日期2011年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月17日
發(fā)明者夏桂先, 王昉, 王海云, 郝曉燕, 黃全生 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所, 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院核技術(shù)生物技術(shù)研究所