專利名稱：雙峰駝pepsin A蛋白基因、重組蛋白及其克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，是一種雙峰駝pepsin A蛋白基因、重組蛋白及其克隆方法。
背景技術(shù)：
胃蛋白酶(英文名稱Pepsin)是一種消化性蛋白酶，由胃部中的胃粘膜主細(xì)(gastricchiefcell)所分泌，功能是將食物中的蛋白質(zhì)分解為小的肽片段。胃蛋白酶的前體被稱為胃蛋白酶原。胃蛋白酶在不同的生物品種中有不同的胃蛋白酶成份，其分子量和氨基酸組成都不相同，存在一定差異，但也具有很大的相似性。在脊椎動物中，胃蛋白酶屬于天冬氨酸蛋白酶家族，該家族除胃蛋白酶外，還包括組織蛋白酶，腎素(血管緊張膚原酶)等，因此天冬氨酸蛋白酶家族是蛋白質(zhì)超家族。 Vincenzo Carginale等研究了胃蛋白酶基因家族的選擇性進(jìn)化和功能的多樣性的關(guān)系,他們用來自30種不同脊椎動物的胃蛋白酶的基因編碼序列來推斷基因的種系發(fā)生，從種系發(fā)生樹上能推斷出基因的復(fù)制和缺失，從基因樹和種系樹上能看出相關(guān)的結(jié)合重組信息。來自同一基因家族的胃蛋白酶盡管具有結(jié)構(gòu)上的相似性，但在功能和化學(xué)性質(zhì)上有很大的不同，這提示了伴隨基因復(fù)制的遺傳過程出現(xiàn)了功能改變的正向選擇過程.。胃蛋白酶基因家族在相關(guān)生物上所表現(xiàn)的明顯的差異性可以較好地說明種系發(fā)生的問題，基因的丟失可能只是簡單的意味著特定的基因片段不存在于序列之中，但在多數(shù)情況下是基因真正的缺失(功能的失活)，這兩種可能性并不是很容易分清。在目前的序列研究中，在兩棲動物的胎兒胃蛋白酶基因(胃蛋白酶A和F)是確定缺失，而在高等脊椎動物的缺失卻很有可能是不完全取樣造成。這個結(jié)論可用以下事實(shí)來印證，在胃蛋白酶種屬中的凝乳酶(胃蛋白酶Y)有很好的牛奶一凝乳催化活性，這與其在幼年哺乳動物中發(fā)揮營養(yǎng)功能一致。在一些哺乳動物胃蛋白酶A從未被發(fā)現(xiàn)，在不同動物種屬中胃蛋白酶的特異性與其不同的飲食適應(yīng)性有關(guān)，同樣在特定種屬中的多種胃蛋白酶A的形式也與食物種類及飲食習(xí)慣有關(guān)，蝶魚具有兩種形式的胃蛋白酶A且生活在冷水中，可推測正是由于基因的增強(qiáng)作用促使該酶產(chǎn)量提高以增加其在低溫下的消化功能。兔子雖是草食動物卻具有三種同工型的胃蛋白酶A，這提示了草本食物由于其蛋白濃度低需要更多的酶來完成其消化降解作用。從醫(yī)學(xué)的角度看，胃蛋白酶原及胃蛋白酶在消化道中具有重要的生理功能，人的胃蛋白酶原含量及胃蛋白酶活性的大小與人的消化道疾病有直接的聯(lián)系，據(jù)報(bào)道，血清中胃蛋白酶原含量的檢測在胃癌的早期診斷上有重要的臨床意義。在工業(yè)上，胃蛋白酶廣泛地應(yīng)用于方便食品.奶酪、消化藥和口香糖加工制造。近年來，該酶在啤酒，果酒等澄清方面顯示一定的應(yīng)用潛力，傳統(tǒng)的酶法干酪加工時所用凝乳酶為小牛皺胃酶，其數(shù)量有限、價格昂貴。動物性胃蛋白酶取自成年動物(如豬、牛等)的胃，因其來源廣，成本較低，故國外該酶在干酪生產(chǎn)中已得到了一定程度的應(yīng)用。胃蛋白酶作為一種重要的蛋白水解酶，其酶學(xué)性質(zhì)，底物專一性，抑制作用等都與一般的蛋白酶不同，因此，通過對P印Sin A從基因、蛋白質(zhì)、酶活性等多方面的研究，必然會為醫(yī)藥及食品等領(lǐng)域帶來新的啟示。雙峰駝有比較特殊的生理特性，尤其具有較強(qiáng)的植被適應(yīng)能力，很適合進(jìn)行消化性蛋白酶研究。本發(fā)明參考其它物種pepsin A基因序列，克隆測序獲得雙峰駝P印sin A基因的cDNA序列，并對不同物種P印sin A基因的⑶S序列進(jìn)行同源性比較，旨在了解和驗(yàn)證P印sin A基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，為今后研究P印sin A基因與雙峰駝消化系統(tǒng)的關(guān)系提供基礎(chǔ)資料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種雙峰馬它pepsin A蛋白基因、重組蛋白及其克隆方法，pepsin A蛋白即胃蛋白酶A (英文名稱=Pepsin)是一種將食物中的蛋白質(zhì)分解為小的肽片的消化性蛋白酶，克服了上述現(xiàn)有技術(shù)之不足，其能有效解決的問題。本發(fā)明的技術(shù)方案之一是通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的一種雙峰5它pepsin A蛋白基因，該基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1所示的序列。下面是對上述發(fā)明技術(shù)方案的進(jìn)一步優(yōu)化或/和改進(jìn)
上述基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1中32-1204位的序列。本發(fā)明的技術(shù)方案之二是通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的一種雙峰駝P印sin A蛋白基因的重組蛋白。下面是對上述發(fā)明技術(shù)方案之二的進(jìn)一步優(yōu)化或/和改進(jìn)
上述重組蛋白的氣基酸序列具有SEQ ID NO. 2所不的序列。上述重組蛋白為具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。上述重組蛋白通過設(shè)計(jì)一對引物從雙峰馬它pepsin A蛋白中得到雙峰馬它肌球蛋白基因，該引物對的核苷酸序列信息如下
正引物，SEQ ID NO. 3 (正向):5，- ATGAGGTGGCTGTTACTG -3，，
反引物，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT。本發(fā)明的技術(shù)方案之三是通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的一種雙峰5它pepsin A蛋白基因的克隆方法，其特征在于按下述步驟進(jìn)行
第一步，總RNA提取，采取雙峰駝組織樣品后，對組織樣品進(jìn)行組織總RNA提??； 第二步，引物設(shè)計(jì)及合成，引物對的核苷酸序列信息如下
正引物，SEQ ID NO. 3 (正向):5，- ATGAGGTGGCTGTTACTG -3，，
反引物，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT ；
第三步，RT-PCR擴(kuò)增，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對組織樣品中的蛋白基因進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并對待擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；
第四步，蛋白基因的克隆，首先對PCR擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行回收，然后將回收的DNA片段同T載體連接形成感受態(tài)細(xì)胞，將感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化培養(yǎng)成單菌落，取少量該單菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增后的單菌落鑒別T載體上是否含有目的DNA片段，若有目的DNA片段，將單菌落放入培養(yǎng)基中進(jìn)行過夜培養(yǎng)，最后對質(zhì)粒進(jìn)行回收。本發(fā)明中雙峰馬它pepsin A蛋白是一種具有多種生物學(xué)功能的蛋白質(zhì),它在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)消化中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，因此，通過對pepsin A從基因、蛋白質(zhì)、酶活性和抑制劑等多方面的研究，必然會為醫(yī)藥及食品等領(lǐng)域的發(fā)展帶來新的啟示，本發(fā)明參考其它物種P印sin A基因序列，克隆測序獲得雙峰駝P印sin A基因的cDNA序列，并對不同物種pepsin A基因的⑶S序列進(jìn)行同源性比較，旨在了解和驗(yàn)證P印sin A基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，為今后研究pepsin A基因與雙峰騎消化系統(tǒng)的關(guān)系提供基礎(chǔ)資料。


附圖1為雙峰駝P印sin A蛋白基因RT-PCR產(chǎn)物電泳圖。附圖2為構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹所用pepsin A蛋白氨基酸 同源性比較。附圖2為不同物種P印sin A蛋白氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步描述
實(shí)施例1，一種雙峰駝P印sin A蛋白基因，該基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1所示的序列。通過以雙峰駝肝臟組織中總RNA為模板，參考牛、人、鼠等物種的pepsin A蛋白基因的同源序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR而獲得的新基因序列。獲得的雙峰駝pepsin A蛋白基因cDNA序列見SEQ ID NO.1?？筛鶕?jù)實(shí)際需要，對上述雙峰駝P印sin A蛋白基因作進(jìn)一步優(yōu)化或/和改進(jìn) 雙峰駝P印sin A蛋白基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1中32-1204位的序列。在
SEQ ID NO.1中，RT-PCR產(chǎn)物長度為1221bp，電泳結(jié)果見附圖1，其中32-34位為起始密碼子ATG，1202-1204位為終止密碼子TGA，32-1204位為編碼蛋白質(zhì)區(qū)域(CDS)。在SEQ IDNO.1。實(shí)施例2，一種雙峰駝P印sin A蛋白基因的重組蛋白?？筛鶕?jù)實(shí)際需要，對上述雙峰駝P印sin A蛋白基因的重組蛋白作進(jìn)一步優(yōu)化或/和改進(jìn)
重組蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO. 2所示的序列。將雙峰駝P印sin A蛋白基因cDNA序列中的編碼序列(⑶S)按通用密碼子翻譯成的蛋白質(zhì)編碼序列見SEQ ID NO. 2。重組蛋白為具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。通過設(shè)計(jì)一對引物從雙峰駝pepsin A蛋白中得到雙峰駝肌球蛋白基因，該引物對的核苷酸序列信息如下
實(shí)施例3,—種雙峰騎pepsin A蛋白基因的克隆方法,其特征在于按下述步驟進(jìn)行
第一步，總RNA提取1、組織分離(Isolation)
從內(nèi)蒙古阿拉善盟采得雙峰駝，快速屠宰并取肝臟樣，將組織樣迅速放入液氮中冷凍后于一 70°C保存，拿回實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備提取組織總RNA。2、總 RNA 的分離(Total RNA isolation)
(I)提取RNA的準(zhǔn)備工作
玻璃制品用0.1M的NaOH浸泡過夜，用自來水反復(fù)沖洗，再用蒸餾水沖洗2遍，180°C烘烤4小時。勻漿器、電泳槽用3%的雙氧水浸泡20-30分鐘，再用0. 1%的DEPC水沖洗.由于未滅活的DEPC對PCR反應(yīng)有影響，可用O. 5%的SDS處理。Tip頭、EP管用O. 1%的DEPC水浸泡過夜，高壓滅菌使DEPC失活。雙蒸水和溶液用DEPC處理，即每IOOml水或溶液加O.1mlDEPC液，室溫放置過夜，高壓滅菌30分鐘DEPC失活。(2 )組織總RNA提取
取IOOmg在液氮中凍存的組織樣放入有Iml Trizol (trizal reagent, invitrogenBRL, USA)的勻漿器管中勻漿。4°C 12000g離心10分鐘。吸取上清液，15_30°C溫育5分鐘。加O. 2ml氯仿，蓋上蓋子，用手劇烈震蕩15秒。15-30°C溫育2_3分鐘。4°C 12000g離心15分鐘。吸取上清液，加O. 8ml異丙醇，混合均勻。15-30°C溫育10分鐘，4°C 12000g離心10分鐘，離心管底部白色沉淀即為RNA。倒掉上清，加Iml 75%乙醇洗滌RNA，4°C7500g離心10分鐘。自然干燥或真空干燥RNA.溶于水(RNase free)中分裝，_70°C保存。 (3)組織總RNA的鑒定
通過分光光度計(jì)上測定RNA含量并且用瓊脂糖電泳分析RNA的質(zhì)量，具體方法如下電泳槽用RNA清洗液(IOOmM NaOH, ImM EDTA)浸泡4 一 5小時，再用DEPC處理過的水反復(fù)沖洗數(shù)次后倒入I X TBE待用。瓊脂糖凝膠用IXTBE配制。在IOul上樣緩沖液(2XTBE，13%菲可，O. 1%溴酚蘭，7M尿素)中加入Iul以上組織總RNA，65°C變性10分鐘后立即放入冰水中2 — 3分鐘。點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠中電泳。第二步，引物設(shè)計(jì)及合成
根據(jù) GenBanK 發(fā)表的單峰馬它(Accession No: AJ131678.1)、人(Accession No:BC150659.1)、牛(Accession No: ΝΜ_001001600· 2)等物種的 p印sin A 蛋白基因 mRNA 序列ORF側(cè)翼同源序列，設(shè)計(jì)如下引物用于以雙峰§它pepsin A蛋白cDNA為模版的PCR擴(kuò)增，以獲得雙峰馬它pepsin A蛋白基因cDNA序列。引物用Primer Premier 5.0自行設(shè)計(jì)，由上海桑尼生物科技有限公司合成，該引物對的核苷酸序列分別為SEQ ID NO:3 (正向)和SEQID N0:4 (反向)，序列信息如下
SEQ ID NO. 3 (正向)5，- ATGAGGTGGCTGTTACTG -3，
SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT第三步，RT-PCR擴(kuò)增
按大連寶生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒(BcaBEST RNA PCR Kit Ver.1.1)要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液組成IOul 2XBca 1st Buffer, 4ul 25Mm MgS04, lul dNTP Mixture, 0. 5ulRnase Inhibitor (40U/ul),lul BcaBEST Polymerase(22U/ul),lul Oligo dT Primer,lul RNA Sample,1. 5ul Rnase Free dH20,總體系為 20 ul。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件65°C I 分鐘，30°C 5分鐘(15分鐘-30分鐘內(nèi)勻速升溫)，65°C 25分鐘，98°C 5分鐘，5°C 5分鐘。PCR擴(kuò)增條件97°C變性5分鐘；95°C 30秒一55°C 30秒一72°C I分鐘，如此進(jìn)行30次循環(huán)；72°C延伸10分鐘，4°C保存。第四步，蛋白基因的克隆1、PCR擴(kuò)增片段的回收片段回收按上海華舜小量膠回收試劑盒說明進(jìn)行，操作過程如下盡可能小的割下含DNA的瓊脂糖塊，放入1. 5mlEP管中。按每IOOmg瓊脂糖加入300ulSl液的比例加SI液，50°C水浴10分鐘。將溶化的瓊脂糖液移入吸附柱，IOOOOg離心I分鐘，倒掉管中液體。在吸附柱中加入500ul Wl液，IOOOOg離心15秒，倒掉管中液體。在吸附柱中加入500ul Wl液，靜置I分鐘后，IOOOOg離心15秒，倒掉管中液體。離心I分鐘。將吸附柱放入一個干凈的1. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入30ulTl液，靜置I分鐘后，IOOOOg離心I分鐘，EP管中液體即為回收的DNA。2、回收片段同T載體的連接連接用TaKaRa pMD18_T Vector試劑盒，操作過程如下在 EP 管中制備下列連接反應(yīng)液pMD 18-T Vector (50ng/ul) O. 5ul, DNA 20_40ng，Solution I 5ul，加dH20至10ul。將上述反應(yīng)液在16°C反應(yīng)30分鐘(過夜也可以)，產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。3、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化從一70°C冰箱中取出保存的感受態(tài)細(xì)胞，冰浴助溶。IOOul感受態(tài)細(xì)胞加入IOul連接產(chǎn)物，冰浴30分鐘。42°C水浴熱應(yīng)激90秒鐘，立即置入冰浴中2分鐘。加400ul液體LB培養(yǎng)基，37°C復(fù)活50分鐘。取IOOul鋪于LB平板上，平板含0. 1%(V/V)的氨節(jié)青霉Amp (100mg/ml)。37°C恒溫培養(yǎng)10-15小時。4、轉(zhuǎn)化菌落的PCR鑒定與培養(yǎng)用記號筆標(biāo)記轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的單菌落，用滅菌的牙簽 蘸取單菌落。將牙簽頭放入在加有PCR反應(yīng)液(不含模板)的EP管中晃動，使單菌落充當(dāng)模板。用獲得該片段的PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物同Marker—起進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，鑒別T載體上是否含有目的片段。若得到目的片段，可用滅菌槍頭挑取在平板上的與之對應(yīng)的單菌落，放入40 ml LB液體培養(yǎng)基中，先在液體中加入0. 1%(V/V)的青霉素鈉(lOOmg/ml)，37°C過夜搖菌培養(yǎng)，用于質(zhì)?；厥铡?、質(zhì)粒的回收質(zhì)?；厥沼蒙虾ＨA舜小量質(zhì)粒抽提純化試劑盒，操作步驟如下將轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的菌液加入1. 5mlEP管中，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心，倒掉液體獲細(xì)菌沉淀。細(xì)菌沉淀不夠時可再加一次菌液離心。在細(xì)菌沉淀中加入250ulPl液，振蕩懸浮。加入250ulP2液，溫和搖勻，室溫靜置4分鐘。加入350ulP3液，溫和搖勻。離心10分鐘，將上清液小心移入吸附柱，離心15秒，倒掉液體。在吸附柱中加入500ulWl，離心15秒，倒掉液體。在吸附柱中加入500ulWl，靜置I分鐘，離心15秒，倒掉液體。離心I分鐘。將吸附柱放入一個干凈的1. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入25-30ulTl液，靜置I分鐘后，離心I分鐘.EP管中液體即為回收的質(zhì)粒。6、質(zhì)粒的酶切鑒定為了證明回收質(zhì)粒確為插入目的片段的重組質(zhì)粒，采用雙酶切法鑒定.本研究具體操作如下根據(jù)TaKaRa pMD18_T Vector圖，選擇內(nèi)切酶Bam H I和Hin d II1.保證目的片段中無這兩種酶的切點(diǎn)。組成如下酶切反應(yīng)體系Bam H I lul,Hin d III lul，10XK Buffer 2ul, DNA ( lul，加 dH20 至 20ul。30°C反應(yīng) 3 小時。瓊脂糖凝膠電泳檢測.
實(shí)施例4，重組質(zhì)粒的測序取20ul重組質(zhì)粒于EP管中，封口膜密封，交生物技術(shù)公司測序。實(shí)施例5，雙峰駝P印sin A蛋白基因編碼序列同源性比較和系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建1、雙峰騎pepsin A蛋白基因編碼序列同源性比較
在Gen Bank上搜索并獲得單峰騎、牛、人、鼠等14種動物的pepsin A蛋白基因編碼蛋白序列，將其同克隆測序獲得的本發(fā)明獲得的SEQ ID NO.1序列一起，在分子生物學(xué)軟件MEGA4上進(jìn)行序列同源性比較(見附圖2)。比較結(jié)果顯示SEQ ID NO. 2序列與單峰駝pepsin A蛋白氨基酸序列同源性為99. 00%。2, pepsin A蛋白基因編碼序列系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建在GenBank上搜索并獲得單峰騎、牛、人、鼠等14種物種的14條pepsin A蛋白基因的編碼蛋白序列，加上本發(fā)明獲得的SEQ ID NO. 2序列，利用分子生物學(xué)軟件MEGA4構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹(見附圖3)。結(jié)果顯示雙峰駝pepsin A蛋白基因同單峰駝的親緣關(guān)系最近；間接證明了所得到的序列確為雙峰騎pepsin A蛋白基因。 序列表
<110>新疆旺源駝奶實(shí)業(yè)有限公司
〈120〉雙峰馬它pepsin A蛋白的蛋白編碼序列
〈160〉 4〈210〉 I
〈211〉 1221
〈212〉 DNA
〈213〉阿拉善盟雙峰駝 〈400〉 I
tagtgattga ggttgngagc cgggaagaac catgaggtgg ctgttactgc tcggcttggt60
ggcgctctcc gagtgcatca cccacaaggt cccgctcgtc aagaagaagt ccttgaggaa120
gaacctgact gagcaaggca aactgaagga cttcctgaag atccaccacc acaacctagc180
cagcaagtac ttccctgcca cctcagaggc tgccaacttc ctggacgaac agccgcttga240
gaactacctg gatacggagt actttggcac catcagcatc ggaaccccag ctcagaactt300
caccgtcatc tttgacactg gctcttccaa cctgtgggtg ccctccatct actgctccag360
ctctgcctgc accaaccaca accgcttcaa ccctgaggaa tcctccacct accagggcac420
cgacgagacg ctctccatca cctatggcac cggcagcatg acaggcatcc tcggatatga480
cactgtccag gttggaggca tcagcgatgt caaccagatc tttggcctga gtgagacaga540
gcccggctcc ttcctgtatt atgccccctt cgatggcatc ctgggtctgg cttaccccag600
catctcctcc tccggggcca cccctgtctt tgacaacatc tgggacgagg gtctgatttc660
cgaagacctc ttctctgtct acctgagctc caatgacgag agtggaagcg tggtgatatt720
tggtggcatc gattcttctt actatacagg aagcctcaac tgggtgcctg tttctgttga780
gggttactgg cagatcaccg tggacagcat caccatggaa ggagagtcca tcgcttgcag840
cagtggctgc caggccattg ttgacaccgg cacctctctg ctggccggcc caaccgacgc900
catttctaac atccagagct acatcggagc cagtgaggac tcatacggtg atatggtggt960
cagctgctcc tccatcagca gcctgcccaa catcgtcttc accatcaacg gcgtccagta1020
ccctctgtcc cccagtgcct acatcctgga gagcgacgac agctgcacca gcggcttcga1080
gggcatggac ctctccagct ccgaagagct ctggatcctg ggtgacgtct tcatccgcca1140
gtacttcacc gtcttcgaca gggcaaacaa ccaggtcggc ctggctgccg tggcccaagc1200
ctgagtctcc caccacctcc c1221
〈210〉 2 〈211〉 390 〈212〉 PRT
〈213〉阿拉善盟雙峰駝 〈400〉 權(quán)利要求
1.一種雙峰駝P印sin A蛋白基因，其特征在于該基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1 所示的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙峰駝pepsinA蛋白基因，其特征在于該基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1中32-1204位的序列。
3.一種含有權(quán)利要求1或2所述的雙峰駝P印sin A蛋白基因的重組蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組蛋白，其特征在于該重組蛋白的氨基酸序列具有SEQID NO. 2所示的序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的重組蛋白，其特征在于該重組蛋白為具有SEQID NO. 2 所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的重組蛋白，其特征在于通過設(shè)計(jì)一對引物從雙峰駝 pepsin A蛋白中得到雙峰駝肌球蛋白基因，該引物對的核苷酸序列信息如下正引物，SEQ ID NO. 3 (正向):5’ - ATGAGGTGGCTGTTACTG -3，，反引物，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組蛋白，其特征在于通過設(shè)計(jì)一對引物從雙峰駝pepsinA 蛋白中得到雙峰駝肌球蛋白基因，該引物對的核苷酸序列信息如下正引物，SEQ ID NO. 3 (正向):5’ - ATGAGGTGGCTGTTACTG -3，，反引物，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雙峰駝p印sin A蛋白基因的克隆方法，其特征在于按下述步驟進(jìn)行第一步，總RNA提取，采取雙峰駝組織樣品后，對組織樣品進(jìn)行組織總RNA提??；第二步，引物設(shè)計(jì)及合成，引物對的核苷酸序列信息如下正引物，SEQ ID NO. 3 (正向):5’ - ATGAGGTGGCTGTTACTG -3，，反引物，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT ；第三步，RT-PCR擴(kuò)增，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對組織樣品中的蛋白基因進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并對待擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；第四步，蛋白基因的克隆，首先對PCR擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行回收，然后將回收的DNA片段同T載體連接形成感受態(tài)細(xì)胞，將感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化培養(yǎng)成單菌落，取少量該單菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增后的單菌落鑒別T載體上是否含有目的DNA片段，若有目的DNA片段， 將單菌落放入培養(yǎng)基中進(jìn)行過夜培養(yǎng)，最后對質(zhì)粒進(jìn)行回收。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，是一種雙峰駝pepsinA蛋白基因、重組蛋白及其克隆方法。本發(fā)明中雙峰駝pepsinA蛋白是一種具有多種生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)，它在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)消化中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用,因此,通過對pepsinA從基因、蛋白質(zhì)、酶活性和抑制劑等多方面的研究,必然會為醫(yī)藥及食品等領(lǐng)域的發(fā)展帶來新的啟示，本發(fā)明參考其它物種pepsinA基因序列，克隆測序獲得雙峰駝pepsinA基因的cDNA序列，并對不同物種pepsinA基因的CDS序列進(jìn)行同源性比較，旨在了解和驗(yàn)證pepsinA基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，為今后研究pepsinA基因與雙峰駝消化系統(tǒng)的關(guān)系提供基礎(chǔ)資料。
文檔編號C12N9/64GK103014042SQ201210478259
公開日2013年4月3日 申請日期2012年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月22日
發(fā)明者陳鋼糧 申請人:新疆旺源駝奶實(shí)業(yè)有限公司