專(zhuān)利名稱(chēng)：日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株SjPP基因及其克隆、表達(dá)和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株SjPP基因的基因序列及其克隆表達(dá)方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血吸蟲(chóng)病是一種危害嚴(yán)重的人獸共患病，在世界范圍內(nèi)有6.5億人受到威脅，約1.93億人感染血吸蟲(chóng)病。抗血吸蟲(chóng)病疫苗的研究成為當(dāng)前血吸蟲(chóng)病防治研究的熱點(diǎn)之一。
東方田鼠(Microtus fortis)亦稱(chēng)米氏田鼠(Microtus Michnoi)、長(zhǎng)江田鼠、沼澤田鼠、葦田鼠，俗稱(chēng)湖鼠，屬?lài)X目(Rodentia)、倉(cāng)鼠科(Cricitidae)、田鼠亞科(Microcinae)、田鼠屬(Microcus)。分布在我國(guó)湖南、湖北、安徽、浙江、江蘇、福建、四川、貴州、廣東、黑龍江、內(nèi)蒙古、吉林、山東、陜西、甘肅、寧夏、遼寧等省份，在中蒙、中俄、中朝等邊境的湖泊沼澤地帶也有其蹤跡，是我國(guó)血吸蟲(chóng)病流行區(qū)洞庭湖湖洲廣泛分布的一種優(yōu)勢(shì)鼠種。20世紀(jì)50年代初，我國(guó)曾對(duì)南方13個(gè)省、市39種哺乳動(dòng)物進(jìn)行血吸蟲(chóng)病調(diào)查，發(fā)現(xiàn)東方田鼠是唯一一種感染日本血吸蟲(chóng)后不致病的哺乳類(lèi)動(dòng)物。其后研究發(fā)現(xiàn)，東方田鼠對(duì)日本血吸蟲(chóng)的抗性是先天的、可遺傳的，這種抗性既不因種群的地域性差別而不同，也不因相同地域內(nèi)種群的傳代而減弱。
為探討東方田鼠抗日本血吸蟲(chóng)病機(jī)制，將東方田鼠血清通過(guò)肌肉或尾靜脈注射給昆明系小鼠。與對(duì)照組相比，被動(dòng)轉(zhuǎn)移血清組小鼠體內(nèi)日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)體變小，肝、腸組織及糞卵EPG及毛蚴孵出率均明顯減少。將東方田鼠新鮮血清與體外制備的血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)體外共培養(yǎng)，獲得顯著的童蟲(chóng)死亡率。應(yīng)用間接ELISA方法分析發(fā)現(xiàn)東方田鼠血清中存在天然抗日本血吸蟲(chóng)抗體，且以抗童蟲(chóng)可溶性抗原的抗體水平最高，抗成蟲(chóng)可溶性抗原的抗體水平次之。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，東方田鼠血清中IgG3抗體可能在抗病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)東方田鼠具有抗日本血吸蟲(chóng)病的特性，利用東方田鼠陽(yáng)性血清篩選日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株成蟲(chóng)cDNA文庫(kù)，結(jié)果得到了一種日本血吸蟲(chóng)新的抗原基因SjPP，間接ELISA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SjPP的重組表達(dá)蛋白可被東方田鼠陰性血清IgG3抗體所識(shí)別。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于
公開(kāi)日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株SjPP的基因序列。
本發(fā)明公開(kāi)的日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株SjPP基因具有序列1所示的核苷酸序列和相應(yīng)的序列2的氨基酸序列。序列1的第18個(gè)至第923個(gè)核苷酸區(qū)域?yàn)樾蛄?的編碼區(qū)。
本發(fā)明應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室繁殖的洞庭湖種群東方田鼠陽(yáng)性血清和酶聯(lián)葡球菌A蛋白免疫篩選日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株成蟲(chóng)cDNA文庫(kù)，經(jīng)過(guò)初篩和3輪復(fù)篩獲得5個(gè)陽(yáng)性克隆。應(yīng)用5′端RACE實(shí)驗(yàn)技術(shù)對(duì)其中一克隆的cDNA片段進(jìn)行5′端延伸。利用blast進(jìn)行基因序列的同源性分析，結(jié)果表明該基因?yàn)橐谎x(chóng)新基因。DNA序列分析表明該基因(SjPP)的開(kāi)放閱讀框含906bp，編碼302個(gè)氨基酸，起始密碼子符合Kozak序列特征。SjPP基因編碼產(chǎn)物與人的PP6、鼠PP6、果蠅PPV等蛋白的氨基酸序列具有高度一致性，分別達(dá)72％、70％和70％，其理論分子量為34.7kDa，等電點(diǎn)(pI)為5.31。利用PSORT在線(xiàn)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)信號(hào)肽軟件分析，在N端未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽的存在。以Tmpred軟件也未預(yù)測(cè)出蛋白質(zhì)跨膜區(qū)的存在。
本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問(wèn)題在于提供上述日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株SjPP基因在大腸桿菌中的表達(dá)方法。
本發(fā)明公開(kāi)的日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株SjPP基因在大腸桿菌中的表達(dá)方法包括下列步驟1.SjPP基因的RT-PCR擴(kuò)增上游引物為5′-GCGAAGCTTCAATGGACTTGGATCAGTGG-3′下游引物為5′-CGGCTCGAGTTACAAGAAGTACGGAGTA-3′2.重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)/SjPP的構(gòu)建3.轉(zhuǎn)化BL21(DE3)表達(dá)菌后用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分析顯示，重組蛋白以包涵體形式高效表達(dá)，融合蛋白分子量大約在39kDa左右。Western-blotting顯示重組抗原具有良好的抗原性。用Ni柱純化目的蛋白。
本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問(wèn)題在于公開(kāi)上述日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株SjPP基因在制備防治日本血吸蟲(chóng)病重組疫苗中的應(yīng)用。
將SjPP基因亞克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-Script中，構(gòu)建成DNA疫苗pCMV-Script/SjPP。在BALB/c小鼠免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)中，重組蛋白pET28a(+)/SjPP誘導(dǎo)的減蟲(chóng)率、減雌率、肝組織減卵率、糞便減卵率分別是18.18％、19.00％、15.44％、32.23％，DNA疫苗誘導(dǎo)的相應(yīng)值為26.77％、29.63％、23.91％、31.91％。
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。


圖1pET28a(+)/SjPP重組質(zhì)粒雙酶切鑒定其中MDNA Marker 2000，1pET28a(+)/SjPP重組質(zhì)粒HindIII/XhoI雙酶切，2pET28a(+)質(zhì)粒HindIII/XhoI雙酶切圖2pET28a(+)/SjPP重組質(zhì)粒PCR鑒定MDNA Marker 2000，1pET28a(+)/SjPP重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物圖3SDS-PAGE分析IPTG誘導(dǎo)的不同表達(dá)時(shí)相的融合蛋白M蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量1，2，3，4，5，6重組質(zhì)粒pET28a(+)/SjPP在IPTG誘導(dǎo)后0h、0.5h、1h、2h、4h、6h的表達(dá)產(chǎn)物7空質(zhì)粒pET28a(+)在IPTG誘導(dǎo)后6h的表達(dá)產(chǎn)物圖4SjPP重組蛋白的Western-blottingM蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量1pET28a(+)/SjPP表達(dá)產(chǎn)物2pET28a(+)表達(dá)產(chǎn)物圖5pCMV-Script/SjPP重組質(zhì)粒檢測(cè)MDNA Marker 2000，1pCMV-Script/SjPP重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物，2pCMV-Script/SjPP重組質(zhì)粒HindIII/XhoI雙酶切具體實(shí)施方式
實(shí)施例1東方田鼠陽(yáng)性血清免疫篩選日本血吸蟲(chóng)cDNA文庫(kù)及SjPP全長(zhǎng)基因的克隆1.實(shí)驗(yàn)材料1.1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室傳代的健康東方田鼠(洞庭湖種群)由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，8周齡。新西蘭大白兔，雄性，購(gòu)自上海羅涇飛達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)，體重2.5kg。
1.2.日本血吸蟲(chóng)(中國(guó)大陸株)尾蚴(安徽品系)中國(guó)農(nóng)科院上海家畜寄生蟲(chóng)病研究所釘螺室提供。
1.3.質(zhì)粒、菌種大腸桿菌DH5α、pUCm-T載體購(gòu)自上海申能博彩生物科技有限公司，DH10B(ZIP)購(gòu)自GIBCOBRL公司。
1.4.文庫(kù)日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)cDNA文庫(kù)采用定向克隆法將目的cDNA片段插入到λZipLox載體中，雌、雄蟲(chóng)文庫(kù)庫(kù)容量分別為3.74×106、3.28×106，重組率都在96％以上，插入片段多在0.5-2kb之間。
1.5.主要試劑及工具酶酶聯(lián)葡球菌A蛋白購(gòu)自上?？菩郎锛夹g(shù)研究所。Red Taq購(gòu)自賽百盛基因技術(shù)有限公司。5′RACE試劑盒、T4 DNA連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶HindIII、XhoI、DNA Marker DL2000等均購(gòu)自TaKaRa公司。
1.6.5′RACE的引物SjPP-P 5′-(P)GTCCGCATGCTGTG-3′SjPP-S15′-ACTGCGATATCCAACAGCAA-3′SjPP-A15′-CTTCATCTGGCACAGCTTCA-3′SjPP-S25′-ACGGATCCAACAGACTGGTA-3′SjPP-A25′-GCAACATTTCCACAACGATA-3′SjPP-P、SjPP-S1、SjPP-A1、SjPP-S2、SjPP-A2為SjPP基因片段5′RACE特異的引物，SjPP-P為5′端磷酸化的反轉(zhuǎn)錄引物。引物由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成。
2.方法2.1.東方田鼠陽(yáng)性血清制備每只東方田鼠感染1000條日本血吸蟲(chóng)尾蚴，21天后摘眼球采血，室溫靜置1小時(shí)后，于4℃以4000g離心10min，取上清，然后收集血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.2.血清中抗大腸桿菌抗體預(yù)吸收制備大腸桿菌裂解液貯存于-20℃?zhèn)溆谩⒀灏?∶10稀釋到含3％牛血清白蛋白的TNT中，每1mL稀釋血清加入0.5mL大腸桿菌裂解液，混合后于室溫溫育4h。被吸收過(guò)的血清，直接用于免疫篩選或加入0.05％疊氮鈉，保存于4℃?zhèn)溆谩?br> 2.3.免疫篩選日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)cDNA表達(dá)文庫(kù)制備大腸桿菌Y1090(ZL)感受態(tài)細(xì)胞。將約3×103個(gè)噬菌體吸附于200μL Y1090(ZL)感受態(tài)細(xì)胞后加入頂層瓊脂，混勻后鋪LB平板，42℃培養(yǎng)4h。將NC膜用10mM IPTG溶液浸潤(rùn)，自然風(fēng)干后覆蓋于平板上，37℃下繼續(xù)培養(yǎng)。做好標(biāo)記，用TNT緩沖液洗去殘存的瓊脂和菌體。換液時(shí)均用TNT緩沖液洗滌。該NC膜用3％牛血清白蛋白封閉液室溫下封閉30min。將它和吸收過(guò)的東方田鼠血清室溫下作用1h后，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的葡球菌蛋白A反應(yīng)液(稀釋度1∶1000)室溫作用1.5h。再用DAB顯色液顯色10min。觀察并從平板的相應(yīng)位置挑出陽(yáng)性克隆，懸于1mL SM中，于4℃放置若干小時(shí)，得到的噬菌體顆粒以同樣方法進(jìn)行復(fù)篩。
2.4.陽(yáng)性克隆測(cè)序?qū)?yáng)性克隆的瓊脂塊挑出放于裝有250μL噬菌體稀釋緩沖液的離心管中，劇烈振蕩10s，隨后室溫放置5min。取25μL上清與100μL大腸桿菌DH10B(ZIP)混和，室溫放置5min。將其鋪平板于LB培養(yǎng)基(含10mM MgCl2和100μg/mL Amp)中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑選生長(zhǎng)良好的單克隆接種于3mL液體LB(含100μg/mL Amp)中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。堿裂解法小量制備重組質(zhì)粒pZL1，用Sangers雙脫氧核糖核酸末端終止法測(cè)序。并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列分析，選擇mfs-5片段進(jìn)行5′端延伸擴(kuò)增獲得SjPP基因全長(zhǎng)序列。
2.5.日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株SjPP全長(zhǎng)基因的克隆日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)體總RNA制備用日本血吸蟲(chóng)尾蚴(中國(guó)大陸株安徽品系)，按2500條/只的量感染新西蘭大白兔，6周后無(wú)菌收集蟲(chóng)體，用高壓滅菌的PBS洗2次，放入小凍存管中，液氮中速凍貯存?zhèn)溆?。按Trizol試劑盒使用說(shuō)明書(shū)提取血吸蟲(chóng)蟲(chóng)體總RNA。
5′RACE擴(kuò)增基因5′端按下面所述各步驟進(jìn)行。
cDNA第一鏈制備與環(huán)化按下屬體系加入各樣品ddH2O(DEPC處理)9μL10×RT Buffer 1.5μLRNase Inhibitor(40U/μL)0.5μLTotal RNA 2μL(5μg)SjPP-P(200μM) 1μL總反應(yīng)體系為15μL。反應(yīng)體系在30℃孵育10min，在50℃進(jìn)行60min，然后在80℃加熱2min終止反應(yīng)。在反應(yīng)體系中加入5×HybridRNA Degradation Buffer 15μL，加水補(bǔ)充至75μL后，加入60URNaseH，在30℃孵育1h，去除RNA。用乙醇沉淀獲得第一鏈cDNA。
將cDNA沉淀溶解于40μL的連接反應(yīng)體系5×RNA(ssDNA)Ligation Buffer8μL40％PEG#600020μLddH2O 12μl在上述反應(yīng)體系中加入40U T4 RNA連接酶，在16℃下孵育16h使cDNA環(huán)化，放于-20℃保存。
PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系(20μl)ddH2O 9.5μ110×Taq Buffer 2μ1dNTPs(各2.5mM) 0.5μlSjPP-S1(20μM) 1μlSjPP-A1(20μM) 1μl環(huán)化cDNA5μ1Red Taq(1U/μl) 1μl條件為94℃預(yù)變性5min；然后94℃ 42s，58℃ 42s，72℃ 1min30s，共30個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min。PCR結(jié)束后取5μL電泳檢查。
巢式PCR取巢式引物SjPP-S2和SjPP-A2，以第一輪的PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增。從20μl反應(yīng)體系中取出5μL作為第二輪PCR產(chǎn)物的模板。PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5min；然后94℃ 42s，58℃42s，72℃ 1min30s，共30個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min。將第二輪的PCR產(chǎn)物稀釋10倍后取出2μL作為模板，SjPP-S2和SjPP-A2為引物按上述條件再次進(jìn)行擴(kuò)增。PCR結(jié)束后取5μL與第一輪和第二輪的PCR產(chǎn)物一起電泳檢測(cè)。
5′RACE PCR產(chǎn)物的克隆和鑒定PCR產(chǎn)物與pUCm-T克隆載體在16℃下連接過(guò)夜，次日轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選、鑒定陽(yáng)性克隆并進(jìn)行測(cè)序。
3.結(jié)果3.1.陽(yáng)性克隆的篩選、分析及測(cè)序經(jīng)3輪復(fù)篩確定5個(gè)陽(yáng)性克隆。測(cè)序后獲得長(zhǎng)度不同的5個(gè)EST序列，分別命名為mfs-1、mfs-2、mfs-3、mfs-4、mfs-5。利用blastn搜索發(fā)現(xiàn)mfs-1、mfs-3、mfs-4、mfs-5為日本血吸蟲(chóng)新的EST序列，3′端非翻譯序列均具有多聚核苷酸化信號(hào)(AATAAA)或寡聚腺嘌呤核苷酸(polyA)。對(duì)mfs-5片段進(jìn)行5′端延伸，以獲得全長(zhǎng)基因序列。
3.1.5′RACE擴(kuò)增產(chǎn)物重組質(zhì)粒pUCm-T的鑒定利用5′RACE技術(shù)對(duì)外源片段進(jìn)行全長(zhǎng)cDNA的克隆，將第三輪PCR產(chǎn)物同pUCm-T載體連接。PCR鑒定結(jié)果表明擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為860bp；利用T載體插入位點(diǎn)兩側(cè)的EcoRI和HindIII限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)進(jìn)行酶切分析，得到插入片段大小約為860bp。
3.2.測(cè)序結(jié)果與分析測(cè)序后進(jìn)行序列拼接獲得長(zhǎng)1319bp的基因序列。分析結(jié)果表明該序列的開(kāi)放閱讀框?yàn)?06bp，編碼302個(gè)氨基酸，其理論分子量為34.7kDa，等電點(diǎn)(pI)為5.31，起始密碼子符合Kozak序列特征。Blastx蛋白質(zhì)序列同源性搜索發(fā)現(xiàn)與人的PP6、鼠PP6、果蠅PP V等蛋白的氨基酸序列具有高度一致性，分別達(dá)72％、70％和70％，故將其命名為SjPP，但未發(fā)現(xiàn)與之同源的血吸蟲(chóng)基因。利用PSORT在線(xiàn)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)信號(hào)肽軟件分析，在N端未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽的存在。以Tmpred軟件也未預(yù)測(cè)出蛋白質(zhì)跨膜區(qū)的存在。SjPP核苷酸序列見(jiàn)序列1，氨基酸序列見(jiàn)序列2。
實(shí)施例2日本血吸蟲(chóng)(中國(guó)大陸株)SjPP基因在大腸桿菌中的表達(dá)和純化1.實(shí)驗(yàn)材料pET28a(+)表達(dá)載體、大腸桿菌BL21(DE3)、His Bind Resin均購(gòu)自Novagen公司。
根據(jù)SjPP全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)引物
上游引物5′-GCGAAGCTTCAATGGACTTGGATCAGTGG-3′下游引物5′-CGGCTCGAGTTACAAGAAGTACGGAGTA-3′上游引物序列中增加HindIII酶切位點(diǎn)，下游引物中插入XhoI酶切位點(diǎn)。引物由上?；瞪锕竞铣?。
1.實(shí)驗(yàn)方法1.1.SjPP基因的RT-PCR擴(kuò)增按實(shí)施例1中方法收集日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株成蟲(chóng)，提取蟲(chóng)體總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。SjPP基因的RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下ddH2O 33μL10×Ex Buffer(Mg2+Plus)5μLdNTPs(2.5mM each) 4μL上游引物(20μM) 1μL下游引物(20μM) 1μLEx Taq(5U/μL) 1μLSjPP基因反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 5μL條件為94℃預(yù)變性2min，94℃ 42s、59℃ 42s、72℃ 1m30s，共30個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72℃自動(dòng)延伸10min。
2.2.重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)/SjPP的構(gòu)建將PCR產(chǎn)物及pET28a(+)質(zhì)粒分別用限制性?xún)?nèi)切酶HindIII、XhoI酶切后電泳，用3S DNA Gel Purification Kit V3.1回收試劑盒回收目的DNA片段。取3μL雙酶切質(zhì)粒pET28a(+)、3μL酶切PCR產(chǎn)物、1μL 10×Ligation Buffer、1μL T4 DNA連接酶、2μL ddH2O，總體積為10μL?；靹蚝?，16℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，將菌液涂布于含Kan的LB固體培養(yǎng)基上，37℃溫箱培養(yǎng)過(guò)夜。
2.3.重組質(zhì)粒pET28a(+)/SjPP的鑒定挑單克隆培養(yǎng)后，用PCR及雙酶切法鑒定重組質(zhì)粒，并將陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，確定外源基因片段是否正確插入pET28a(+)載體中(見(jiàn)圖1)。
2.4.誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)將含有目的基因重組質(zhì)粒的細(xì)菌在含Kan的LB平板上劃線(xiàn)培養(yǎng)。挑選生長(zhǎng)良好的單菌落接種至3mL LB培養(yǎng)基(含Kan)中，37℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜。按1∶100的比例接種到另一管LB(含Kan)培養(yǎng)基中，37℃快速振蕩培養(yǎng)至細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600＝0.6)，取1mL細(xì)菌培養(yǎng)液，離心去上清，加入1mL新配制的LB(含Kan)培養(yǎng)基，按1∶100的接種量加入到20mL LB(含Kan)的液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)3h。加入IPTG使其終濃度為0.1mM，37℃快速振蕩培養(yǎng)。分別在加入IPTG后0h、0.5h、1h、2h、4h、6h取出1mL細(xì)菌培養(yǎng)物，12000rpm離心1min，棄去上清夜，沉淀中加入100μL 1×SDS-PAGE上樣緩沖液，充分懸浮細(xì)菌，100℃煮樣品5min，離心取上清液，保存于-20℃或直接進(jìn)行SDS-PAGE電泳。將準(zhǔn)備好的樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析和Western-blotting檢測(cè)。
2.5.目的蛋白的純化將IPTG誘導(dǎo)的細(xì)菌經(jīng)反復(fù)凍融和超聲裂解后，依次用含0M、2M、4M尿素的1×Binding Buffer洗滌沉淀。最后用含8M尿素的1×Binding Buffer重懸沉淀，冰上放置1h使蛋白完全溶解。16000g離心30min去除不可溶物，并以0.45μm的NC膜過(guò)濾上清。按照His Bind Resin說(shuō)明書(shū)中包涵體的純化方法，依次加入各溶液。將收集的目的蛋白經(jīng)透析、冷凍干燥后于4℃保存。
3.結(jié)果3.1.重組質(zhì)粒pET28a(+)/SjPP的鑒定將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET28a(+)/SjPP進(jìn)行PCR鑒定，其擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量約900bp，合乎預(yù)期的分子量。進(jìn)一步用限制性?xún)?nèi)切酶HindIII、XhoI進(jìn)行酶切，結(jié)果得到約900bp左右的片段(見(jiàn)圖2)。
3.2.誘導(dǎo)SjPP基因的特異性表達(dá)從SDS-PAGE電泳結(jié)果看，表達(dá)的融合蛋白分子量在預(yù)計(jì)的39kDa左右，并且發(fā)現(xiàn)終濃度0.1mM的IPTG誘導(dǎo)2h后目的蛋白達(dá)到最高表達(dá)水平，以包涵體的形式存在(見(jiàn)圖3)。
3.3.Western-blotting
將重組質(zhì)粒和空載體分別誘導(dǎo)表達(dá)的產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE，再轉(zhuǎn)移到NC膜上，用兔抗日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)粗抗原血清免疫雜交。結(jié)果，重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白與抗體呈陽(yáng)性反應(yīng)，而空質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物不與抗體反應(yīng)。證明該融合蛋白具有良好的抗原性(見(jiàn)圖4)。
實(shí)施例3日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株SjPP基因DNA疫苗的構(gòu)建1.實(shí)驗(yàn)材料pCMV-Script真核表達(dá)載體和菌株XL1-Blue購(gòu)自Stratagene公司。Ex Taq購(gòu)自TaKaRa公司。3S DNA Gel Purification Kit V3.1購(gòu)自上海申能博彩科技有限公司。
根據(jù)SjPP全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)引物上游引物5′-GCGAAGCTTGCAATGGACTTGGATCAGTG-3′下游引物5′-CGGCTCGAGTTACAAGAAGTACGGAGTA-3′上游引物序列中插入HindIII酶切位點(diǎn)，下游引物中插入XhoI酶切位點(diǎn)。引物由上?；瞪锕竞铣伞?br> 2.實(shí)驗(yàn)方法2.1.SjPP基因的RT-PCR擴(kuò)增按實(shí)施例1方法收集日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株成蟲(chóng)，提取蟲(chóng)體總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。SjPP基因的RT-PCR擴(kuò)增按以下體系進(jìn)行ddH2O 75.5μL10×Ex Buffer(Mg2+Plus) 10μLdNTPs(2.5mM each) 4μL上游引物(20μM)2μL下游引物(20μM)2μLEx Taq(5U/μL) 1.5μLSjPP基因反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 5μL條件為94℃預(yù)變性2min，94℃ 45s、59℃ 45s、72℃ 45s，共30個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72℃自動(dòng)延伸10min。PCR結(jié)束后，取5μL反應(yīng)產(chǎn)物于1％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢查。
2.2.小量制備真核表達(dá)載體pCMV-Script質(zhì)粒將pCMV-Script質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞，鋪在含Kan的LB平板上，37℃培養(yǎng)16h。挑單菌落于3mL LB(含Kan)培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜，用堿裂解法小量制備質(zhì)粒DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.3.DNA疫苗pCMV-Script/SjPP的構(gòu)建將PCR產(chǎn)物、pCMV-Script載體分別用限制性?xún)?nèi)切酶HindIII、XhoI酶切后電泳，用3S DNA Gel Purification Kit V3.1回收試劑盒回收目的DNA片段。取1μL雙酶切質(zhì)粒pCMV-Script、3μL酶切PCR產(chǎn)物、1μL 10×Ligation Buffer、1μL T4 DNA連接酶、4μL ddH2O，總體積為10μL。混勻后，16℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLl-Blue感受態(tài)細(xì)胞，將菌液涂布于含Kan的LB固體培養(yǎng)基上，37℃溫箱培養(yǎng)過(guò)夜。挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR、酶切鑒定。將陽(yáng)性單克隆測(cè)序，確認(rèn)SjPP基因正確插入pCMV-Script真核表達(dá)載體(見(jiàn)圖5)。
2.4.重組表達(dá)質(zhì)粒pCMV-Script/SjPP的純化將陽(yáng)性的重組質(zhì)?？寺U(kuò)大培養(yǎng)，以堿裂解法大量抽提質(zhì)粒DNA，并用QIAGEN-tip 500進(jìn)一步純化。將質(zhì)粒沉淀溶解于TE(pH8.0)，在-20℃下貯存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例4動(dòng)物免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)1.實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為BALB/c小鼠、雌性、5-6周齡，購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部。
2.實(shí)驗(yàn)方法2.1.免疫方法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為5組，每組10只。B組為空白對(duì)照，注射PBS；P0組為弗氏佐劑對(duì)照組，P1組為重組蛋白疫苗的實(shí)驗(yàn)組，劑量為20μg重組蛋白/鼠；D0和D1為DNA疫苗的對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，分別免疫質(zhì)粒pCMV-Script和pCMV-Script/SjPP，劑量為20μg/鼠。共免疫3次，每次間隔2周。末次免疫2周后，每只小鼠用腹部蓋玻片法感染尾蚴40±2條。
2.2.成蟲(chóng)回收和計(jì)數(shù)尾蚴攻擊6周后，解剖小鼠，肝門(mén)靜脈沖洗法收集成蟲(chóng)，記數(shù)。用以下公式計(jì)算減蟲(chóng)率、減雌率 2.3.肝組織蟲(chóng)卵記數(shù) 稱(chēng)取肝組織10g，剪碎后加5％KOH20mL，60℃水浴消化4h至組織呈均質(zhì)?；靹蚝笪?00μL懸液3份，鏡檢計(jì)算每克肝組織的蟲(chóng)卵數(shù)(EPG)，并計(jì)算肝組織減卵率 2.4.糞便蟲(chóng)卵記數(shù) 稱(chēng)取小鼠糞便4g，用80目銅篩和160目尼龍絹過(guò)濾，260目尼龍絹收集沉渣，放入50mL量筒，加水至20mL，加孔雀綠2滴，混勻后吸取100μL懸液3份。如上述方法計(jì)算每克糞便的減卵率。
3.結(jié)果表1動(dòng)物免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果B組 P0組 P1組 D0組 D1組平均成蟲(chóng)數(shù) 24.44±2.35 20.60±1.61 20.00±1.55 18.60±1.71 17.9±2.05減蟲(chóng)率*15.73％ 18.18％ 23.91％ 26.77％
平均雌蟲(chóng)數(shù) 12.22±1.18 10.20±0.92 9.90±0.81 9.00±0.83 8.60±1.05減雌率*16.55％ 19.00％ 26.36％ 29.63％每克肝臟平均蟲(chóng)卵數(shù) 4880044666.67 41266.6749733.3337133.33肝組織減卵率 8.47％ 15.44％ -1.91％ 23.91％每克糞便平均蟲(chóng)卵數(shù) 2350 2092.59 1592.59 2466.67 1600糞便減卵率 10.95％ 32.23％ -4.96％ 31.91％*進(jìn)行t-檢驗(yàn)，D1組的數(shù)值具有顯著性意義實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組的小鼠在尾蚴攻擊感染后均存活，從表1可看出，用pCMV-Script/SjPP重組質(zhì)粒免疫小鼠具有較顯著的減蟲(chóng)率和減雌率，分別為26.77％和29.63％。重組蛋白免疫組和DNA疫苗免疫組的小鼠都獲得較明顯的肝組織減卵率和糞便減卵率。
實(shí)施例5東方田鼠陰性血清IgG3抗體對(duì)SjPP蛋白的識(shí)別1.實(shí)驗(yàn)材料 原核表達(dá)純化的SjPP重組蛋白和SjTEGT重組蛋白，即日本血吸蟲(chóng)睪丸增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄本，是一種血吸蟲(chóng)性別相關(guān)蛋白。HRP-羊抗鼠IgG3購(gòu)自CALTAG公司。東方田鼠陰性血清取自健康的洞庭湖種群東方田鼠，方法如前所述。
2.實(shí)驗(yàn)方法按照ELISA的方法操作。蛋白的包被濃度是10μg/mL，東方田鼠陰性血清按1∶50的比例稀釋?zhuān)琀RP-羊抗鼠IgG3進(jìn)行1∶10000稀釋。底物用TMB，2M硫酸終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值A(chǔ)450nm。
3.結(jié)果表2 間接ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果抗原 OD1 OD2 OD平均值P/NSjPP 0.0870.0780.083 ＞2.1SjTEGT0.0400.0250.033
由表2可看出，東方田鼠陰性血清中IgG3抗體可與SjPP重組蛋白相作用，這表明SjPP可能是一種東方田鼠抗血吸蟲(chóng)病的作用因子。
序列表<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海家畜寄生蟲(chóng)病研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室上海動(dòng)物生物技術(shù)研究中心<120>日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株SjPP基因及其克隆、表達(dá)和應(yīng)用<130>說(shuō)明書(shū)、權(quán)利要求書(shū)<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1319<212>DNA<213>SjPP基因核苷酸序列<400>1gggaatttgc ccttgcaatg gacttggatc agtggataca gtctgtcaag acttgtaagt60accttccaga aaacgatctt agaaaactgt gcaactatgt tacggagttg ttgattgaag120agtgcaatgt gcaaccagtt tcttttcctg taaccatatg tggtgatatt catggacagt180tctacgatct tttgcagtta tttcgtcgag gaggaaaact gccggacaaa aattatatat240ttatggggga ttttgttgat cggggttatt acagcctcga aaccctcaca tttcttcttg300ttctcaaagc taagtatcct tcacgaataa cattattgag aggaaaccat gaaagtcggc360aagttactca gtgttatggc ttctatgatg aatgtatcaa taaatatggt aatgcgaatc420catggcatta ttgttgcaaa gtgttcgatc ttctcacaat agccgcatta gttggagaaa480
aagttctctg cgttcatgga ggcctatcac ctcaaattaa aacactcgat caaatccgga540caatcgacag acatatggaa atacccaatg aaggtccatt ttgtgacatt ttatggtcgg600atcctgatga cgtggctcat tgggctgtta gtccgcgtgg agcaggatat ttatttgggc660caaaagttac taatgaattc gttgagttaa atggtctaga atgtatttgt agagctcatc720aactcgtgca cgaaggctac aagtgcatgt tcgatggaca actaatcact atttggtcag780ctccaaatta ttgttatcgt tgtggaaatg ttgcagcgat tttggaattc caaagtccaa840cacaattcga tcctaaactt tttgaagctg tgccagatga agaacgagtc aaacctcctc900taaggattac tccgtacttc ttgtaacata ttcttcttaa acttgatcat tttcattcta960agtacaagtt ttcttgttaa ctccgattaa cactgcgata tccaacagca ataggaacat1020ttatttgcat tctaaatcca gttgtacaga tttgagtcca attatttggt tctcatacct1080aaatgtatgt attctttttg caatttttat ttaatcgaaa tgtatcaccg acactgcaat1140gattttgtct ttctgacgga tccaacagac tggtaattga tgaatataca cagcatgcgg1200acaattggaa gagtaaaatt ttcgcttaac acaccagaca agttttctcg gactagtgtg1260acgataatac atacatctta tcccaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa agggcggcg 1319<210>2<211>302<212>PRT<213>SjPP的氨基酸序列<400>2Met Asp Leu Asp Gln Trp Ile Gln Ser Val Lys Thr Cys Lys Tyr Leu1 5 10 15Pro Glu Asn Asp Leu Arg Lys Leu Cys Asn Tyr Val Thr Glu Leu Leu
20 25 30Ile Glu Glu Cys Asn Val Gln Pro Val Ser Phe Pro Val Thr Ile Cys35 40 45Gly Asp Ile His Gly Gln Phe Tyr Asp Leu Leu Gln Leu Phe Arg Arg50 55 60Gly Gly Lys Leu Pro Asp Lys Asn Tyr Ile Phe Met Gly Asp Phe Val65 70 75 80Asp Arg Gly Tyr Tyr Ser Leu Glu Thr Leu Thr Phe Leu Leu Val Leu85 90 95Lys Ala Lys Tyr Pro Ser Arg Ile Thr Leu Leu Arg Gly Asn His Glu100 105 110Ser Arg Gln Val Thr Gln Cys Tyr Gly Phe Tyr Asp Glu Cys Ile Asn115 120 125Lys Tyr Gly Asn Ala Ash Pro Trp His Tyr Cys Cys Lys Val Phe Asp130 135 140Leu Leu Thr Ile Ala Ala Leu Val Gly Glu Lys Val Leu Cys Val His145 150 155 160Gly Gly Leu Ser Pro Gln Ile Lys Thr Leu Asp Gln Ile Arg Thr Ile165 170 175Asp Arg His Met Glu Ile Pro Asn Glu Gly Pro Phe Cys Asp Ile Leu180 185 190Trp Ser Asp Pro Asp Asp Val Ala His Trp Ala Val Ser Pro Arg Gly195 200 205Ala Gly Tyr Leu Phe Gly Pro Lys Val Thr Asn Glu Phe Val Glu Leu210 215 220Asn Gly Leu Glu Cys Ile Cys Arg Ala His Gln Leu Val His Glu Gly225 230 235 240
Tyr Lys Cys Met Phe Asp Gly Gln Leu Ile Thr Ile Trp Ser Ala Pro245 250 255Asn Tyr Cys Tyr Arg Cys Gly Asn Val Ala Ala Ile Leu Glu Phe Gln260 265 270Ser Pro Thr Gln Phe Asp Pro Lys Leu Phe Glu Ala Val Pro Asp Glu275 280 285Glu Arg Val Lys Pro Pro Leu Arg Ile Thr Pro Tyr Phe Leu290 295 300
權(quán)利要求
1.一種日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株SjPP基因，其特征在于該基因具有如下的核苷酸序列及相應(yīng)的氨基酸序列g(shù)ggaatttgc ccttgca atg gac ttg gat cag tgg ata cag tct gtc aag 50Met Asp Leu Asp Gln Trp Ile Gln Ser Val Lys1 5 10act tgt aag tac ctt cca gaa aac gat ctt aga aaa ctg tgc aac tat98Thr Cys Lys Tyr Leu Pro Glu Asn Asp Leu Arg Lys Leu Cys Asn Tyr15 20 25gtt acg gag ttg ttg att gaa gag tgc aat gtg caa cca gtt tct ttt146Val Thr Glu Leu Leu Ile Glu Glu Cys Asn Val Gln Pro Val Ser Phe30 35 40cct gta acc ata tgt ggt gat att cat gga cag ttc tac gat ctt ttg194Pro Val Thr Ile Cys Gly Asp Ile His Gly Gln Phe Tyr Asp Leu Leu45 50 55cag tta ttt cgt cga gga gga aaa ctg ccg gac aaa aat tat ata ttt242Gln Leu Phe Arg Arg Gly Gly Lys Leu Pro Asp Lys Asn Tyr Ile Phe60 65 70 75atg ggg gat ttt gtt gat cgg ggt tat tac agc ctc gaa acc ctc aca290Met Gly Asp Phe Val Asp Arg Gly Tyr Tyr Ser Leu Glu Thr Leu Thr80 85 90ttt ctt ctt gtt ctc aaa gct aag tat cct tca cga ata aca tta ttg338Phe Leu Leu Val Leu Lys Ala Lys Tyr Pro Ser Arg Ile Thr Leu Leu95 100 105aga gga aac cat gaa agt cgg caa gtt act cag tgt tat ggc ttc tat386Arg Gly Asn His Glu Ser Arg Gln Val Thr Gln Cys Tyr Gly Phe Tyr110 115 120gat gaa tgt atc aat aaa tat ggt aat gcg aat cca tgg cat tat tgt434Asp Glu Cys Ile Asn Lys Tyr Gly Asn Ala Asn Pro Trp His Tyr Cys125 130 135tgc aaa gtg ttc gat ctt ctc aca ata gcc gca tta gtt gga gaa aaa482Cys Lys Val Phe Asp Leu Leu Thr Ile Ala Ala Leu Val Gly Glu Lys140 145 150 155gtt ctc tgc gtt cat gga ggc cta tca cct caa att aaa aca ctc gat530Val Leu Cys Val His Gly Gly Leu Ser Pro Gln Ile Lys Thr Leu Asp160 165 170caa atc cgg aca atc gac aga cat atg gaa ata ccc aat gaa ggt cca578Gln Ile Arg Thr Ile Asp Arg His Met Glu Ile Pro Asn Glu Gly Pro175 180 185ttt tgt gac att tta tgg tcg gat cct gat gac gtg gct cat tgg gct626Phe Cys Asp Ile Leu Trp Ser Asp Pro Asp Asp Val Ala His Trp Ala190 195 200gtt agt ccg cgt gga gca gga tat tta ttt ggg cca aaa gtt act aat674Val Ser Pro Arg Gly Ala Gly Tyr Leu Phe Gly Pro Lys Val Thr Asn205 210 215gaa ttc gtt gag tta aat ggt cta gaa tgt att tgt aga gct cat caa722Glu Phe Val Glu Leu Asn Gly Leu Glu Cys Ile Cys Arg Ala His Gln220 225 230 235ctc gtg cac gaa ggc tac aag tgc atg ttc gat gga caa cta atc act770Leu Val His Glu Gly Tyr Lys Cys Met Phe Asp Gly Gln Leu Ile Thr240 245 250att tgg tca gct cca aat tat tgt tat cgt tgt gga aat gtt gca gcg818Ile Trp Ser Ala Pro Asn Tyr Cys Tyr Arg Cys Gly Asn Val Ala Ala255 260 265att ttg gaa ttc caa agt cca aca caa ttc gat cct aaa ctt ttt gaa866Ile Leu Glu Phe Gln Ser Pro Thr Gln Phe Asp Pro Lys Leu Phe Glu270 275 280gct gtg cca gat gaa gaa cga gtc aaa cct cct cta agg att act ccg914Ala Val Pro Asp Glu Glu Arg Val Lys Pro Pro Leu Arg Ile Thr Pro285 290 295tac ttc ttg taacatattc ttcttaaact tgatcatttt cattctaagt963Tyr Phe Leu300acaagttttc ttgttaactc cgattaacac tgcgatatcc aacagcaata ggaacattta 1023tttgcattct aaatccagtt gtacagattt gagtccaatt atttggttct catacctaaa 1083tgtatgtatt ctttttgcaa tttttattta atcgaaatgt atcaccgaca ctgcaatgat 1143tttgtctttc tgacggatcc aacagactgg taattgatga atatacacag catgcggaca 1203attggaagag taaaattttc gcttaacaca ccagacaagt tttctcggac tagtgtgacg 1263ataatacata catcttatcc caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaagg gcggcg 1319
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株SjPP基因，其特征在于該基因是用東方田鼠陽(yáng)性血清結(jié)合酶聯(lián)葡球菌A蛋白免疫篩選日本血吸蟲(chóng)c-DNA文庫(kù)，結(jié)合5′RACE技術(shù)，獲得含完整ORF的日本血吸蟲(chóng)SjPP基因的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株SjPP基因在大腸桿菌中的表達(dá)方法，其特征在于該方法所用的宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3)，原核表達(dá)質(zhì)粒為pET28a(+)。
4.根據(jù)如權(quán)利要求1所述的日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株SjPP基因在制備防治日本血吸蟲(chóng)病重組蛋白疫苗和核酸疫苗中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于其中所述的疫苗是SjPP基因亞克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-Script中，構(gòu)建成DNA疫苗pCMV-Script/SjPP。
全文摘要
本發(fā)明涉及日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株SjPP基因的基因序列及其克隆表達(dá)方法和應(yīng)用。本發(fā)明公開(kāi)的日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株SjPP基因具有序列1所示的核苷酸序列和相應(yīng)的序列2的氨基酸序列。本發(fā)明應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室繁殖的洞庭湖種群東方田鼠陽(yáng)性血清和酶聯(lián)葡球菌A蛋白免疫篩選日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株成蟲(chóng)cDNA文庫(kù)，經(jīng)過(guò)初篩和3輪復(fù)篩獲得5個(gè)陽(yáng)性克隆。應(yīng)用5′RACE技術(shù)對(duì)其中一克隆的cDNA片段進(jìn)行5′端延伸擴(kuò)增，并利用blast進(jìn)行基因序列的同源性分析，結(jié)果表明該基因?yàn)橐谎x(chóng)新基因。本發(fā)明還公開(kāi)了SjPP在大腸桿菌中的表達(dá)方法。本發(fā)明SjPP基因可用于制備防治日本血吸蟲(chóng)病重組蛋白疫苗和DNA疫苗。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1563382SQ20041001774
公開(kāi)日2005年1月12日 申請(qǐng)日期2004年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月16日
發(fā)明者林矯矯, 姚利曉, 傅志強(qiáng), 劉金明, 朱傳剛, 馮新港, 苑純秀, 蔡幼民 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海家畜寄生蟲(chóng)病研究所, 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室, 上海動(dòng)物生物技術(shù)研究中心