專利名稱：一種弓形蟲循環(huán)抗原雙抗夾心elisa檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物檢驗檢疫技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，構(gòu)建重組蛋白，利用重組蛋白免 疫制備的抗體，建立一種弓形蟲循環(huán)抗原雙抗夾心ELISA檢測方法。
背景技術(shù)：
弓形蟲(toxoplasma)是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生性原蟲，具有廣泛的宿主群并在世 界范圍內(nèi)流行，引起人獸共患寄生蟲病。艾滋病患者、器官移植及惡性腫瘤患者等免疫 功能損傷或抑制者，弓形蟲作為一種機(jī)會感染因子，可致患者死亡。弓形蟲病不但是醫(yī) 學(xué)上的一種重要疾病，更重要的是它是影響人類優(yōu)生優(yōu)育的一個重要生物因子。人體感染了弓形體，多數(shù)可能是無癥狀的帶蟲者，僅少數(shù)人發(fā)病。該病臨床表 現(xiàn)復(fù)雜，輕者為隱性感染，重者可表現(xiàn)為多器官的嚴(yán)重?fù)p害，如弓形蟲腦病、眼病、腎 病、肝病、肺病及弓形體心肌炎等各系統(tǒng)的病變。值得注意的是，弓形體對妊娠有很重 要的影響。被弓形體感染的孕婦，不論其有無臨床癥狀，?？赏ㄟ^胎盤將弓形蟲傳給胎 兒，從而直接影響胎兒的發(fā)育，使胎兒嚴(yán)重致畸，甚至死亡，亦可發(fā)生流產(chǎn)、死產(chǎn)、早 產(chǎn)或增加妊娠合并癥。感染發(fā)生得越早，胎兒受損越嚴(yán)重。在妊娠中三個月感染，多會 出現(xiàn)死胎、早產(chǎn)和嚴(yán)重的腦、眼疾患；在妊娠晚期，因胎兒已逐漸成熟，此時母體如受 到感染，胎兒可發(fā)育正常，亦可出現(xiàn)早產(chǎn)或出生后才出現(xiàn)癥狀，表現(xiàn)為各系統(tǒng)不同程度 的損壞。據(jù)報道，偶見孕期感染弓形蟲的胎兒在出生后數(shù)年甚至成人后才表現(xiàn)出弓形蟲 病。據(jù)統(tǒng)計全世界四分之一人口受到弓形蟲病的威脅，美國每年有400-4000例先天 性弓形蟲病發(fā)生。我國有6100多萬人感染弓形蟲病，其中育齡婦女有1300萬-1500萬， 弓形蟲是宮內(nèi)感染的病原體之一，每年約有9萬名受弓形蟲損害的新生兒出生，孕婦弓 形蟲感染率為6.6%-32.9%，通過胎盤感染胎兒，嚴(yán)重影響胎兒生長發(fā)育。在畜牧業(yè)方 面，懷孕動物出現(xiàn)流產(chǎn)，豬感染弓形蟲會引起大批死亡?？梢姽蜗x對人類危害極大，尤其是孕婦，在孕前和孕期(妊娠前三個月較好) 最好做弓形蟲的血清學(xué)檢測。ELISA是當(dāng)前診斷弓形蟲感染應(yīng)用最廣的技術(shù)，當(dāng)前商品化的試劑盒主要包括 檢測抗體和檢測循環(huán)抗原兩大類。其中抗體檢測又包括IgG檢測試劑盒和IgM檢測試劑 盒兩種。由于IgM抗體是在血清中早期出現(xiàn)，且停留時間較短，所以檢測IgM抗體被用 于多種疾病的早期診斷；而IgG出現(xiàn)較晚，是慢性期或既往感染的標(biāo)志。IgG檢測的最 大缺點在于不能判定是當(dāng)前感染還是既往感染。IgM檢測盡管與當(dāng)前感染有著很好的相 關(guān)性，但不適合免疫功能低下人群和孕期檢測，這是因為這些人群機(jī)體免疫功能低下， 檢測敏感性低，造成假陰性。循環(huán)抗原(CAG)是弓形蟲急性感染期蟲體自身排泄和裂解產(chǎn)物，在蟲體的侵入 和繁殖過程中，由蟲體分泌出來，因此檢測CAG可以更加準(zhǔn)確地診斷弓形蟲的感染。而 MIClO被證實是在蟲體感染過程中分泌的循環(huán)抗原(CAG)中的一種主要蛋白，體外培養(yǎng)時蟲體大量分泌該蛋白到培養(yǎng)基中，因此檢測該蛋白不僅可對感染定性，而且還可通過 對該蛋白定量來確定感染強(qiáng)度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明 的目的是提供重組蛋白MIC-10。所述的重組蛋白MIC-10為MIC-10A、MIC-10B或MIC-10C，其核苷酸序列依 次分別如SEQ ID No.l所示、SEQ ID No.2所示或SEQ ID No.3所示；重組蛋白Mic-IO的制備方法，它包括1)人工合成引物；制備重組蛋白MIC-10A引物為FW: GATCGGATCCGATTTTTTTAACGATTACRV: GATCAAGCTTTCATTCACGAAGTCCTCTTTTC制備重組蛋白MIC-10B引物為FW: GATCGGATCCGCCGCTGAGCGTGAGGAGAAGRV: GATCAAGCTTTCACATTGATTTCCTGCG制備重組蛋白MIC-10C引物為FW: GATCGGATCCGATTTTTTTAACGATTACRV: GATCAAGCTTTCACATTGATTTCCTGCG2)提取RH株弓形蟲基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得基因片段，克隆 至Ij PMD-18T載體上；3)將MIClOA基因片段插入表達(dá)載體PET28A中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 PET28A-MIC-10A、PET28A-MIC-10B 或 PET28A-MIC-10C ；4)將重組表達(dá)質(zhì)粒PET28A-MIC10A轉(zhuǎn)入BL21 (DE3)中進(jìn)行表達(dá)，得重組融合 蛋白MIC-10A、MIC-10B或MIC-10C，用鎳柱純化重組蛋白?？怪亟M蛋白MIC-10多克隆抗體，是由下述方法制備的用重組蛋白MIC-10免疫3月齡雌性家兔，皮下3點注射，免疫劑量500ug/只/ 次，間隔21d免疫，共免疫3次，第1次采用弗氏完全佐劑，第2、3次采用弗氏不完全 佐劑，最第三次免疫后21天，心臟放血，37°C放置1小時后，4°C過夜，次日3000轉(zhuǎn)離 心15分鐘，取上清，用protein A層析柱純化兔抗MIC10，按說明書進(jìn)行。純化后的IgG 用PBS透析3次，用BCA法測定蛋白濃度，-80°C凍存；所述的重組蛋白MIC-10為MIC-10A或MIC-10B。一種弓形蟲循環(huán)抗原雙抗夾心ELISA檢測試劑盒，它包括包被抗體、生物素 標(biāo)記的檢測抗體、陽性對照、洗滌液、封閉液、酶標(biāo)親和素、底物、終止液和樣本稀釋 液，其特征在于所述的包被抗體為兔抗重組蛋白MIC-lOAIgG、檢測抗體為兔抗重組 蛋白MIC-IOBIgG或包被抗體為兔抗重組蛋白MIC-lOBIgG、檢測抗體為免抗重組蛋白 MIC-IOAIgG ；所述的陽性對照為重組蛋白MIC-10C ；所述的封閉液為含1%BSA、10%馬血清的TBS，底物為TMB，終止液為2M硫酸。一種弓形蟲循環(huán)抗原雙抗夾心ELISA檢測試劑盒使用方法，它包括
1)加入100 μ 1純化的5ug/ml兔抗重組MIOlOAIgG，包被ELISA反應(yīng)板，4°C
孵育過夜；2)用TBST洗5次，每次5分鐘；3)每孔加入300 μ 1封閉液封閉，37°C孵育30分鐘；4)用TBST洗5次，每次5分鐘；5)每孔加入100 μ 1不同稀釋度的待檢血清樣品，37°C孵育1小時；6)用TBST洗5次，每次5分鐘；7)每孔加入100 μ 1生物素標(biāo)記的兔抗MIC-lOBIgG，37°C孵育1小時；8)用TBST洗5次，每次5分鐘；9)加入酶標(biāo)親和素，37°C孵育30分鐘；10)用TBST洗5次，每次5分鐘，孵育10分鐘；11)每孔加入IOOul底物，室溫避光顯色30分鐘；每孔加入50ul 2M硫酸終止反應(yīng)。12)讀板，記錄OD值；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算待檢血清樣品中的MIClO含量；所述的包被抗體為兔抗MIC-lOBIgG、檢測抗體為兔抗重組蛋白MIOlOAIgG。本發(fā)明一種弓形蟲循環(huán)抗原雙抗夾心ELISA檢測 試劑及制備方法。弓形蟲微線 體蛋白IO(MIClO)是弓形蟲侵入宿主細(xì)胞時分泌的一種蛋白，對弓形蟲的侵入和增殖具 有重要的作用。本發(fā)明是對MIClO基因的不同區(qū)域擴(kuò)增，插入表達(dá)載體PET28A中構(gòu) 建重組表達(dá)質(zhì)粒，將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入原核細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，得到重組融合蛋白MIC10A、 MIClOB和MIC10C，將純化后的重組融合蛋白MIC10A、MIClOB分別免疫家兔，制備 高效價的多克隆抗體。用純化后的兔抗MIClOAIgG作為包被抗體，以生物素標(biāo)記的兔抗 MIClOB IgG作為檢測抗體，以純化的MIClOC作為標(biāo)準(zhǔn)抗原，以一定稀釋倍數(shù)的人和動 物的血清作為檢測樣本，建立雙抗夾心ELISA，作為對弓形蟲循環(huán)抗原的檢測方法，具 有很強(qiáng)的特異性、敏感性、可重復(fù)性、穩(wěn)定性，y = 0.0304Ln(x)-0.0567, R2 = 0.9643， 最小檢出量為50pg/ml。


圖1為MIC-10A和MlOlOB基因的PCR擴(kuò)增鑒定結(jié)果，其中1 MIC10-A， 2 MICIO-B。圖2為MIC-10A和MlOlOB重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果，其中1 MIC10-A， 2 MICIO-B。圖3為重組蛋白MIC-10A、MIOIOB、MIC-10C與MIClO全長基因(其堿基
序如SEQ IDNo.4所示)的關(guān)系圖。圖4為雙抗夾心ELISA方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實施例方式實施例1重組蛋白MIC-10A的制備1)人工合成下述引物FW: GATCGGATCCGATTTTTTTAACGATTAC
RV: GATCAAGCTTTCATTCACGAAGTCCTCTTTTC 2)提取RH株弓形蟲基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95°C預(yù) 變性2分鐘，94°C變性50秒，50°C退火1分鐘，72°C延伸1分鐘，35個循環(huán)，最后72°C 延伸6min。，獲得MIC-10A基因片段，見附圖1，克隆到PMD-18T載體上，酶切鑒定， 見附圖2，其核苷酸序列如SEQIDNal所示；3)將MIClOA基因片段插入表達(dá)載體PET28A中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 PET28A-MIC-10A ；4)將重組表達(dá)質(zhì)粒PET28A-MIC10A轉(zhuǎn)入BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)，得重組蛋白 MIC-10A,用鎳柱純化重組蛋白。實施例2重組蛋白MIC-10B的制備1)人工合成下述引物FW: GATCGGATCCGCCGCTGAGCGTGAGGAGAAGRV: GATCAAGCTTTCACATTGATTTCCTGCG2)提取RH株弓形蟲基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95°C預(yù) 變性2分鐘，94°C變性50秒，50°C退火1分鐘，72°C延伸1分鐘，35個循環(huán)，最后72°C 延伸6min，獲得MIC-10B基因片段，見附圖1，克隆到PMD-18T載體上，酶切鑒定， 見附圖2，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；3)將MIClOB基因片段插入表達(dá)載體PET28A中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 PET28A-MIC-10B ；酶切鑒定，見附圖2 ；4)將重組表達(dá)質(zhì)粒PET28A-MIC-10A轉(zhuǎn)入BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)，得重組融 合蛋白MIC-10B，用鎳柱純化重組蛋白。實施例3重組融合蛋白MIC-10C的制備1)人工合成下述引物FW: GATCGGATCCGATTTTTTTAACGATTACRV: GATCAAGCTTTCACATTGATTTCCTGCG2)提取RH株弓形蟲基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95°C預(yù) 變性2分鐘，94°C變性50秒，50°C退火1分鐘，72°C延伸1分鐘，35個循環(huán)，最后72°C 延伸6分鐘，獲得MIClOC基因片段；克隆到PMD-18T載體上，酶切鑒定，其核苷酸序 列如SEQ IDNo.2所示；3)將MIClOC基因片段插入表達(dá)載體PET28A中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 PET28A-MIC-10C ；4)將重組表達(dá)質(zhì)粒PET28A-MIC-10C轉(zhuǎn)入BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)，得重組融 合蛋白MIC-10C，用鎳柱純化重組蛋白。實施例4抗MIC-10A和MIC-10B兔多克隆抗體的制備免疫分別用MIC-10A和MIC-10B免疫3月齡雌性新西蘭大耳白兔，皮下3 點注射，免疫劑量500ug/只/次，間隔21d免疫，共免疫3次，第1次采用弗氏完全佐 齊U，第2、3次采用弗氏不完全佐劑，最后一次免疫后21天，心臟放血，37°C放置1小時 后，4°C過夜，第2天3000轉(zhuǎn)離心15分鐘，取上清，-80°C凍存?zhèn)溆?。實施?抗MIClOA和MIClOB兔多克隆抗體的純化
用protein A (GE公司)層析柱純化兔抗MIOlOAIgG和MlOlOB IgG,按說明
書進(jìn)行，純化后的IgG用PBS透析3次，用BCA法測定蛋白濃度。實施例6兔抗MIC-IOB IgG的生物素化將實施例5制得的兔抗MIC-IOA或B IgG，用生物素標(biāo)記，標(biāo)記試劑盒采用 EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit (Pierce，USA),按說明書進(jìn)行。實施例7雙抗夾心ELISA方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立1.加入100 μ 1純化的兔抗MIC-IOA(5ug/ml)IgG包被ELISA反應(yīng)板，4°C孵育
過夜；2、用TBST洗5次，每次5分鐘；3、每孔加入300 μ 1封閉液(1% BSA、10%馬血清的TBS)，37°C孵育30分鐘；4.用TBST洗5次，每次5分鐘5.每孔加入100 μ 1不同稀釋度的MIC-IOC (標(biāo)準(zhǔn)樣品)，37°C孵育1小時；6.用TBST洗5次，每次5分鐘7.每孔加入100 μ 1生物素標(biāo)記的兔抗MIC-lOBIgG，37°C孵育1小時；8.用TBST洗5次，每次5分鐘；9.加入酶標(biāo)親和素，37°C孵育30分鐘；10.用TBST洗5次，每次5分鐘，孵育10分鐘；注最后1次洗用TBS (不含Tween2O)11.每孔加入IOOul底物(TMB)，室溫避光顯色30分鐘；每孔加入50ul 2M硫酸
終止反應(yīng)。12.450nm讀板，記錄OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖4。通過實驗證明，本方法測定的MIClOC濃度與吸光度值在50_5000pg/ml的范圍 存在明顯的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2 = 0.9643，y = 0.0304Ln(x)-0.0567,最小檢出量為 50pg/ml。表明本方法具有很高的敏感性，完全滿足檢測臨床樣本的需要。實施例8 一種弓形蟲循環(huán)抗原雙抗夾心ELISA檢測試劑盒它包括包被抗體、生物素標(biāo)記的檢測抗體、陽性對照、洗滌液、封閉液、酶 標(biāo)親和素、底物(TMB)、終止液，所述的包被抗體為兔抗重組蛋白MIC-lOAIgG、檢測 抗體為生物素標(biāo)記的兔抗MIC-IOBIgG或包被抗體為兔抗重組蛋白MIC-lOBIgG、檢測抗 體為生物素標(biāo)記的重組蛋白MIC-IOA ；所述的陽性對照為重組蛋白MIC-IOC ；所述的封閉液為含1%BSA、10%馬血清的TBS，底物為TMB，終止液為2M硫 酸。實施例9 一種弓形蟲循環(huán)抗原雙抗夾心ELISA檢測試劑盒使用方法1)加入100 μ 1純化的兔抗MIC-IOAIgG (5ug/ml)包被ELISA反應(yīng)板，4°C孵育 過夜；2)用TBST洗5次，每次5分鐘；3)每孔加入300 μ 1 BSA、10%馬血清的TBS封閉，37°C孵育30分鐘；4)用TBST洗5次，每次5分鐘5)每孔加入100 μ 1不同稀釋度 的待檢血清樣品，37°C孵育1小時；6)用TBST洗5次，每次5分鐘
7)每孔加入100 μ 1生物素標(biāo)記的兔抗MIC-lOBIgG，37°C孵育1小時；8)用TBST洗5次，每次5分鐘；9)加入酶標(biāo)親和素，37°C孵育30分鐘；10)用TBST洗5次，每次5分鐘，孵育10分鐘；注最后1次洗也可以用TBS (不含Tween20)11)每孔加入IOOul底 物(TMB)，室溫避光顯色30分鐘；每孔加入50ul 2M硫
酸終止反應(yīng)。12)450nm讀板，記錄OD值；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算待檢血清樣品中的MIClO含量。實施例10 —種弓形蟲循環(huán)抗原雙抗夾心ELISA檢測試劑盒使用方法包被抗體為兔抗重組蛋白MIC-lOBIgG、檢測抗體為生物素標(biāo)記的重組蛋白 MIC-IOAIgG,其它同實施例9。
權(quán)利要求
1.重組蛋白MIC-10，其特征在于其為MIC-10A、MI010B或MIC-10C，其核苷 酸序列依次分別如SEQ ID No.l所示、SEQ ID No.2所示或SEQ ID No.3所示。
2.重組蛋白MIC-10的制備方法，它包括1)人工合成引物；制備重組蛋白MIC-10A基因的引物為FW GATCGGATCCGATTTTTTTAACGATTACRV GATCAAGCTTTCATTCACGAAGTCCTCTTTTC制備重組蛋白MIC-10B基因的引物為FW GATCGGATCCGCCGCTGAGCGTGAGGAGAAGRV GATCAAGCTTTCACATTGATTTCCTGCG制備重組蛋白MIC-10C基因的引物為FW GATCGGATCCGATTTTTTTAACGATTACRV GATCAAGCTTTCACATTGATTTCCTGCG2)提取RH株弓形蟲基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得基因片段，克隆到 PMD-18T載體上；3)將MIClOA基因片段插入表達(dá)載體PET28A中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 PET28A-MIC-10A、PET28A-MIC-10B 或 PET28A-MIC-10C ；4)將重組表達(dá)質(zhì)粒PET28A-MIC-10A轉(zhuǎn)入BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)，得重組融合蛋 白MIC-10A、MIC-10B或MIC-10C，用鎳柱純化重組蛋白。
3.抗重組蛋白MIC-10多克隆抗體，是由下述方法制備的用重組蛋白MIC-10免疫3月齡雌性家兔，皮下3點注射，免疫劑量500ug/只/次， 間隔21d免疫，共免疫3次，第1次采用弗氏完全佐劑，第2、3次采用弗氏不完全佐劑， 第3次免疫后21天，心臟放血，37°C放置1小時后，4°C過夜，次日3000轉(zhuǎn)離心15分 鐘，取上清，用protein A層析柱純化兔抗MIC10，按說明書進(jìn)行，純化后的IgG用PBS 透析3次，用BCA法測定蛋白濃度，-80°C凍存；所述的重組蛋白MIC-10為MIC-10A或MI010B。
4.一種弓形蟲循環(huán)抗原雙抗夾心ELISA檢測試劑盒，它包括包被抗體、生物 素標(biāo)記的檢測抗體、陽性對照、洗滌液、封閉液、酶標(biāo)親和素、底物、終止液和樣本 稀釋液，其特征在于所述的包被抗體為兔抗重組蛋白MIC-lOAIgG、檢測抗體為 兔抗MIC-IOBIgG或包被抗體為兔抗重組蛋白MIC-lOBIgG、檢測抗體為抗重組蛋白 MIC-IOAIgG ；陽性對照為重組蛋白MIC-10C。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種弓形蟲循環(huán)抗原雙抗夾心ELISA檢測試劑盒，其特征 在于封閉液為含BSA和10%馬血清的TBS，底物為TMB，終止液為2M硫酸。
6.一種弓形蟲循環(huán)抗原雙抗夾心ELISA檢測試劑盒使用方法，它包括1)加入100μ 1純化的5ug/ml兔抗MIOlOAIgG包被ELISA反應(yīng)板，4°C孵育過夜；2)用TBST洗5次，每次5分鐘；3)每孔加入300μ 1封閉液封閉，37°C孵育30分鐘；4)用TBST洗5次，每次5分鐘；5)每孔加入100μ 1待檢血清樣品，37°C孵育1小時；6)用TBST洗5次，每次5分鐘；7)每孔加入100μ 1生物素標(biāo)記的兔抗MIC-lOBIgG，37°C孵育1小時；8)用TBST洗5次，每次5分鐘；9)加入酶標(biāo)親和素，37°C孵育30分鐘；10)用TBST洗5次，每次5分鐘，孵育10分鐘；11)每孔加入IOOul底物，室溫避光顯色30分鐘；每孔加入50ul2M硫酸終止反應(yīng)；12)讀板，記錄OD值；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算待檢血清樣品中的MIClO含量。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種弓形蟲循環(huán)抗原雙抗夾心ELISA檢測試劑盒使用方法， 其特征在于所述的包被抗體為免抗重組蛋白MIC-lOBIgG、檢測抗體為免抗重組蛋白 MIC-I OAIgG。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種弓形蟲循環(huán)抗原雙抗夾心ELISA檢測試劑及制備方法。弓形蟲MIC10是弓形蟲侵入宿主細(xì)胞時分泌的一種蛋白，對弓形蟲的侵入和增殖具有重要的作用，本發(fā)明是對MIC10基因的不同區(qū)域擴(kuò)增表達(dá)，得到重組融合蛋白MIC10A、MIC10B和MIC10C，將純化后的重組融合蛋白MIC10A、MIC10B分別免疫家兔，制備多克隆抗體，分別作為包被抗體、檢測抗體，以純化的MIC10C作為標(biāo)準(zhǔn)抗原，建立雙抗夾心ELISA，檢測血清中的弓形蟲循環(huán)抗原，具有很強(qiáng)的特異性、敏感性、可重復(fù)性、穩(wěn)定性，y＝0.0304Ln(x)-0.0567，R2＝0.9643，最小檢出量為50pg/ml。
文檔編號C07K16/06GK102010468SQ20101026425
公開日2011年4月13日 申請日期2010年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月27日
發(fā)明者向梅, 姜寧, 尹繼剛, 王海礁, 陸慧君, 陳啟軍 申請人:吉林大學(xué)